JPH0771509B2

JPH0771509B2 - ヒトβ−ＮＧＦの発現法

Info

Publication number: JPH0771509B2
Application number: JP63171863A
Authority: JP
Inventors: 文男菱沼; 正文西澤; 栄子金谷; 貴子木村; 史子小澤; 啓子平井
Original assignee: 工業技術院長
Priority date: 1988-07-12
Filing date: 1988-07-12
Publication date: 1995-08-02
Anticipated expiration: 2010-08-02
Also published as: JPH0223883A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）ヒトβ−NGFの発現法に関する。詳しくは遺伝子組換え
技術によりヒトβ−NGFを発現させる方法に関するもの
である。

（発明が解決しようとする課題） NGF（神経成長因子 nerve growth factor）は交感神経
節や知覚神経節等の末梢神経の分化や成長を促進する作
用をもつポリペプチドとして知られているが、近年NGF
が脳内の中枢神経系にも存在し機能していることが解明
されると共に、アルツハイマー型老人性痴呆症との関連
性が注目されている。また、NGFはα_２βγ_２の複合体
からなり、これ等サブユニットの中で神経突起を伸長さ
せる活性はβ−NGF（以下便宜上β−NGFと記す）のみに
あって、α−NGF及びγ−NGFには活性が無いことが知ら
れているが、ヒトNGFの生理作用に関する研究は報告さ
れておらず、NGFとアルツハイマー型老人性痴呆症との
関係も今後の研究の進展に委ねられている。

ヒトβ−NGFの構造については、1983年に遺伝子配列が
決定され、マウスβ−NGFと極めて高い相同性を有する
ことが報告されているが［NATURE,Vol.303,30 JUNE,821
〜825（1983）］、これを遺伝子組換え技術により発現
させること、特に酵母を宿主として分泌させることにつ
いては全く報告されていない。

（課題を解決するための手段）本発明等は上記の事情に鑑み、NGFの今後の研究の進展
と応用に寄与するため、とくにヒトβ−NGFを遺伝子組
換え技術により有利に取得することを目的として鋭意検
討した結果、酵母のαフェロモン（性フェロモン）遺伝
子のリーダー配列を含み、その直後に合成ヒトβ−NGF
遺伝子を組み込んだプラスミドを使用し、これにより形
質転換した酵母がヒトβ−NGFの分泌能を有することを
確認し本発明を達成した。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明に使用されるサッカロマイセスセレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）のαフェロモン遺伝子MFα１
のリーダー配列の直後に合成ヒトβ−NGF遺伝子を含有
するプラスミドは、例えば以下に述べる方法により構築
される。

［プラスミドの構築］（１）プラスミドpRE1078（7.5kb）の作製（第１図参
照）特開昭63−133987号公報及びMolecular and Celluar Bi
ology,７,3185〜3193（1987）に記載されている方法で
作製した、サッカロマイセスセレビシエのαフェロモ
ン遺伝子MFα１のプロモーター配列、リーダー（分泌シ
グナル）配列、ターミネーター配列並びにTRP1、２μｍ
及びpBR322のoriとアンピシリン耐性遺伝子（Ap^r）を有
し、かつリーダー配列とターミネーター配列との間にヒ
トβ−エンドルフィン遺伝子が挿入されている公知のプ
ラスミドpRE1059を使用し、そのプロモーター配列をホ
スフォグリセレートキナーゼ（PGK）のプロモーター配
列で置換したプラスミドpRE1078を作製する。

即ち、PGKのプロモーター配列とターミネーター配列を
含む公知のプラスミドpMA91［Gene,24,1〜14（1983）］
をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼＩで平滑末端とし
た後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配列を含む
1.5kbのEcoR I−（Bgl II）断片（Ｉ）を単離する。

一方、前記のpRE1059をHinf Iで切断し、末端を充填し
た後、Sal Iで切断してMFα１の５′非翻訳領域とリー
ダー配列を含む337bpの断片（II）を単離する。また、p
PE1059のヒトβ−エンドルフィン遺伝子を含むSal I−A
gt II断片（III）と、TRP1、２μｍ及びpBR322のori並
びにAp^r領域を含むEcoR I−Aat II断片（IV）とを夫々
の制限酵素で切断して得る。

上記で得られる（Ｉ）〜（IV）を同時に結合することに
よりpRE1078（7.5kb）を作製する。

（２）プラスミドpSSE2（7.5kb）の作製（第２図参照）
pRE1078中のMFα１のリーダー配列の86番目のグルタミ
ン酸コドンGAGAを部位特異的変異導入（site directed
mutagenesis）によりTCTに変え、ここにBgl II切断部位
が導入されたプラスミドpSSE2（7.5kb）を作製する。

即ち、pRE1078をEcoR I及びBamH Iで切断して、PGKのプ
ロモーター配列とMFα１のリーダー配列とを含むEcoR I
−BamH I断片（1.6kb）を採取し、これを既知のファー
ジベクターM13mp18（東洋紡績社カタログ61頁記載）に
クローンし、一本鎖のファージDNAと変異用DNA（５′AG
C TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′）をアニールさせた後、
Amersham社のキット（RPN.2322）を用いてハンドブック
（Oligonucleo−tide directed in vitro mutagenesis
system）記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が
導入されたDNAを得る。このように処理して得られたBgl
II切断部位が導入されたEcoR I−BamH I断片を、pRE10
78のEcoR I−BamH I断片（5.7kb）と結合してpSSE2（7.
5kb）を作製する。

（３）プラスミドpSSE9（7.7kb）の作製（第２図参照）
上記で得られたpSSE2をBgl II及びBamH Iで切断し、こ
の切断部位に下記塩基配列からなる合成ヒトβ−NGF遺
伝子を結合することにより、pRE1078中のMFα１のリー
ダー配列の86番目から90番目のコドンとリンカー配列に
由来する７アミノ酸残基に相当するコドン及びβ−エル
ドルフィン遺伝子の代りに、合成ヒトβ−NGF遺伝子が
挿入されたpSSE9（7.7kb）を作製する。

なお、下記塩基配列の合成ヒトβ−NGF遺伝子は、前記N
ATURE,Vol.303,30 JUNE,821〜825（1983）に記載されて
いるヒトβ−NGF遺伝子配列のアミノ酸配列は変えず
に、酵母で強く発現している蛋白質の遺伝子でよく使わ
れているコドンに変えるため、ヒトβ−NGF遺伝子配列
中の85個の塩基を変えて合成したものである。

上記の方法により作製したプラスミドpSSE9でサッカロ
マイセスセレビシエを通常の方法により形質転換株は
ヒトβ−NGFの分泌能を有し、後記実施例に示すよう
に、形質転換株の培養液上清からヒトβ−NGFが取得さ
れる。そして得られたヒトβ−NGFは、例えばクローン
化されたラット副腎髄質褐色細胞株由来のPC12細胞の神
経突起を伸長する作用を有することが観察された。

（発明の効果）本発明によれば、活性ヒトβ−NGFを発現させることが
できるので、今後のNGF研究の進展と応用に寄与すると
ころが大きい。

（実施例）以下本発明は実施例について更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施例に限定さ
れるものではない。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次のＩ〜Ｖの方法によった。

Ｉ［制限酵素によるDNAの切断と回収］制限酵素による切断用緩衝液は、下記３種類を用い
（１）〜（３）の使い分けは、Advanced Bacterial Gen
tics（1981）（Cold spring Harbor,New York）に従っ
た。また切断条件は２単位／μg DNAの制限酵素を用い3
7℃または65℃で30分間処理する。

次いでTE緩衝液（10mMのトリス塩酸（pH8.0）及び1mMの
EDATからなる）で飽和したフェノールで１回抽出し、エ
ーテルでフェノールを除き、２倍容のエタノールを加え
て−20℃で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回収
する。

（１）低塩濃度緩衝液 10mMのトリス塩酸（pH7.4）、10mMの硫酸マグネシウム
及び1mMのジチオスレイトールからなる。

（２）中塩濃度緩衝液 50mMのNaCl、10mMのトリス塩酸（pH7.4）、10mMの硫酸
マグネシウム及び1mMのジチオスチトールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 100mMのNaCl、50mMのトリス塩酸（pH7.4）及び10mMの硫
酸マグネシウムからなる。

II［大腸菌（E.coli）らのプラスミドDNAの調製］（１）ミニ調製法（mini prep法）Nucleic Acids Res.
７,1513〜1523（1979）］大腸菌を宿主とし、0.5mlのＬ−ブロス（10gのペプト
ン、5gのイースン・エキス、1gのグルコース、5gのNaCl
/1からなるpH7.2）を用いて一夜間培養し、遠心分離し
て集菌した菌体を100μｌの溶液Ａ（50mMのグルコー
ス、10mMのEDTA、25mMのトリス塩酸（pH8.0）及びリゾ
チーム2mg/mlからなる）に懸濁し室温で30分間放置す
る。

次いで氷水中で200μｌの溶液［１％のSDS（ドデシン硫
酸ナトリウム）を含む0.2NのNaOH］を加えて振盪し同時
にDNAの変性を行う。150μｌの3M酢酸ソーダ溶液を加え
氷冷後、遠心分離し、上清に冷エタノールを加え、−20
℃で冷却して遠心分離し沈澱を集める。

沈澱を溶液Ｃ（50mMのトリス塩酸及び0.1Mの酢酸ソーダ
からなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エタノールを
加え、沈澱するDNAを洗浄し減圧下乾燥し−20℃で保存
する。

（２）大量調製法 200mlのＬ−ブロス（薬剤耐性プラスミド場合は薬剤を
含む）に大腸菌HB101を植菌し、一夜間培養して集菌
後、15mlのSTES緩衝液［TES緩衝液（10mMのトリス塩酸
（pH7.4）、1mMのEDTA及び50mMのNaClからなる）に25％
のサッカロースを添加したもの］に懸濁し、EDTA、リゾ
チーム及びリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を夫々30
mM,600μg/ml及び50μg/ml加え、更に氷水中でプロナー
ゼＥを500μg/ml添加する。次いでSDSを１％となるよう
に加え37℃で振盪し、氷水中に戻しNaClを終濃度1Mとな
るように添加した後、遠心分離した上清に２倍容の冷エ
タノールを加え−20℃に保持し遠心分離してDNAを沈澱
として回収し減圧下乾燥し−20℃で保存する。

III［T4 DNAリガーゼによる連結］連結する２個のDNA断片は、１μg/10μｌになるように
連結用緩衝液［66mMのトリス塩酸（pH7.5）、6.6mMの塩
化マグネシウム、10mMのジチオスレイトールからなる］
に溶解し65℃で10分間処理した後、４℃で66μＭのATP
（アデノシントリフォスフェート）を加え、更にT4リガ
ーゼを粘着末端の場合は0.1単位／μgDNA、または平滑
末端の場合は１単位／μgDNAになるように加えて４℃で
18時間反応させた後、65℃で10分間処理する。

IV［大腸菌の形質転換（Advanced Bacterial Genetics
（1981）（Cold Spring Havor,New York）］ 5mlのＬ−ブロスに大腸菌を植菌し、一夜間培養する。
この0.2mlを20mlのＬ−ブロスに植え37℃でクレットユ
ニットが60に達するまで振盪培養する。菌体を集め氷冷
した50mMの塩化カルシウムと10mMのトリス塩酸（pH8.
0）とからなる緩衝液10mlに懸濁し30分間氷冷する。遠
心分離した菌体を1mlの塩化カルシウム溶液に懸濁し、
その0.1mlを10μｌのDNA溶液と混合し０℃で30分間、42
℃で２分間インキュベートした後、1.5mlのＬ−ブロス
を加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に植
える。

Ｖ［粘着末端の充填］１μｇのDNAを30μｌの50mMトリス塩酸（pH7.2）、10mM
の硫酸マグネシウム、0.1mMのジチオスレイトール、50
μg/mlの牛血清アルブミン（BSA）及び0.2mMのdNTPに溶
かし、1.25単位のklenow断片（大腸菌のDNAポリメラー
ゼＩをトリプシンで処理して得られる大きな断片）を加
え室温で30分間反応させる。次いで１μｌの0.5M EDTA
（pH8.0）を加えて反応を停止させ、フェノール及びエ
ーテルで逐次抽出しフェノールを除去し、DNAをエタノ
ール沈澱により回収する。

実施例１（１）プラスミドpRE1078（7.5kb）の作製（第１図）PG
Kのプロモーター配列とターミネーター配列を含むプラ
スミドpMA91をBgl IIで切断し、DNAポリメラーゼＩで平
滑末端した後、EcoR Iで切断してPGKのプロモーター配
列を含む1.5kbのEcoR I−（Bgl II）断片（Ｉ）を単離
した。

一方、pRE1059をHinf Iで切断し、末端を充填した後、S
al Iで切断してMFα１の５′非翻訳領域とリーダー配列
を含む337bpの断片（II）を単離した。また、pRE1059の
β−エルドルフィン遺伝子を含むSal I−Aat II断片（I
II）と、TRP1、２μｍ及びpBR322のori、Ap^rを含むEcoR
I−Aat II断片（IV）とを、夫々の制限酵素で切断した
後、アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のバン
ドを溶出することにより得た。上記で得た（Ｉ）〜（I
V）の断片を同時にT4 DNAリガーゼで結合してpRE1078
（7.5kb）を作製した。

（２）プラスミドpSSE2（7.5kb）の作製（第２図）pRE1
078をEcoR I及びBamH Iで切断し、PGKのプロモーター配
列とMFα１のリーダー配列を含むEcoR I−BamH I断片
（1.6kb）を採取し、これをファージベクターM13mp18に
クローンし一本鎖のファージDNAと変異用DNA（５′AGC
TTC AGC AGA TCT TTT ATC3′）をアニールさせた後、Am
ersham社のキット（RPN.2322）を用いハンドブック（Ol
igonucleotide directed in vitro mutagenesis syste
m）記載の方法に従って処理してBgl II切断部位が導入
されたDNAを得た。得られたBgl II切断部位が導入され
たEcoR I−BamH I断片を、pRE1078のEcoR I−BamH I断
片（5.7kb）と結合してpSSE2（7.5kb）を作製した。

（３）プラスミドpSSE9（7.5kb）の作製（第２図）上記で得たpSSE2をBgl II及びBamH Iで切断し、この切
断部位に前記塩基配列の合成ヒトβ−NGF遺伝子を結合
して、pRE1078中のβ−エルドルフィン遺伝子の代り
に、βNGF遺伝子が挿入されたpSSE9（7.7kb）を作製し
た。

（４）［pSSE9によるサッカロマイセスセレビシエ20B
−12株の形質転換］サッカロマイセスセレビシエ20B−12株をYPD培地（１
％酵母エキス、２％バクトペプトン及び２％グルコース
からなる）で一夜間培養した培養液0.5mlを20mlのYPD培
地に植え、30℃でクレットユニット60まで振盪培養し
た。この10mlを遠心分離し、菌体を10mlのTE緩衝液で洗
浄後1mlのTE緩衝液に懸濁した。この0.5mlに0.5mlの0.2
M酢酸リチウム、10mMのトリス塩酸（pH7.5）及び1mMのE
DTAを加え、30℃で１時間保持した後、氷水中で冷却し
た。

得られた菌体懸濁液100μｌに、上記（３）で得たpSSE9
の溶液10μｌを加え、０℃で30分間保持した後、集菌し
水0.5mlで洗浄後0.3mlの水に懸濁し、プレート１枚に0.
1mlを植えた。

（５）ヒトβ−NGFの分泌量と活性の測定上記（４）で得た形質転換菌体をYCD培地（１％酵母エ
キス、２％カザミノ酸及び２％のグルコースからなる）
で30℃で２日間培養し、培養液を遠心分離し、得られた
上清をホローファイバー（アミコン社HIP10−20）で10
〜60倍量に濃縮して、ヒトβ−NGFの同定と活性の測定
に供した。

［ヒトβ−NGFの分泌量］上記の濃縮液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた後、抗NGF抗体を用いたウエスタンブロッティン
グ（Western blotting）により測定した結果、β−NGF
の分泌量は約10μg/lであった。

［ヒトβ−NGFの活性］ PC12細胞（1975年、GreeneとTischlerによりクローン化
されたラット副腎髄質褐色細胞腫［Proceedings of the
National Academy of Sciences,of the U.S.A.,73,242
4〜2428（1976）］由来のPC12の細胞神経突起伸長反応
の有無を調べた。

次の処方により分化誘導培地を調製した。即ち、DME培
地（Gibco社製）とF12培地（Gibco社製）の1000ml用試
薬を1:1の割合で混合し、これにヘペス（Hepes）7.15
g、亜セレン酸ナトリウム10.36μｇ、重炭酸ナトリウム
3.7g、ペニシリンG10万単位及び硫酸ストレプトマイシ
ン200mgを加え、水で合計2000mlとする。以下これをDF
培地という。

準胎児牛血清及び熱非働化馬血清を、夫々５％濃度とな
るようにDF培地に添加し、この培地を用いてPC12細胞を
２×10⁴cell/mlとなるように希釈し、これを予めコラー
ゲンでコートした24穴のウエルに入れる。このウエル
に、ヒトβ−NGFを含む前記の濃縮上清を加え、５％CO₂
を含むインキュベター中で３〜５日間培養して顕微鏡で
観察したところ、明らかな神経突起の伸長が認められ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々プラスミドpRE1078及びpSSE9の
構成ルートを示す模式図である。図中ＡはAat IIを、Ｂ
はBamH Iを、BgはBgl IIを、ＥはEcoR Iを、ＨはHind I
IIを、HfはHinf Iを、ＳはSal Iを夫々示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−84299（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−132892（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−248488（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サッカロマイセスセレビシエのαフェロ
モン遺伝子MFα１のリーダー配列の直後に、下記の塩基
配列で示される合成ヒトβ−NGF遺伝子を含有するプラスミ
ドでサッカロマイセスセレビシエを形質転換し、得ら
れた形質転換株を培養してヒトβ−NGFを分泌させるこ
とを特徴とする活性型ヒトβ−NGFの発現法。