【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、重合性リン脂質の製造法に関する。
更に詳しくは、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリ
ン（以下Ｌ−α−GPCと略す。）と一般式
R1CH＝CHCH＝CHCOOH
（R1はC5〜C17のアルキル基）
で表わされるアルカジエンカルボン酸（以下ジエ
ンカルボン酸を縮合剤存在下に直接縮合させ一般
式
（R1はC5〜C17のアルキル基）
で表わされるＬ−１，２−ビス（２，４−アルカ
ジエノイル）−３−ホスホリルコリン（以下ジエ
ンレシチンと略す。）を製造する方法である。
このジエンレシチンは、例えばコンタクトレン
ズ表面に塗布した後、重合することにより、湿潤
性のあるコンタクトレンズの作成が可能であり、
又人工臓器表面へ、塗布重合することにより、生
体適合性のよい人工臓器を製造できるなどに利用
される。
また、このジエンレシチンからリポソームを調
製し、そのリポソームを重合することにより、保
存安定性の優れたリポソームの調製ができる。さ
らにこのリポソームに薬剤を封入することにより
保存安定性に優れた薬剤徐放システム担体として
利用できる等、このジエンレシチンは、生体適合
性材料として非常に有用な化合物である。
このジエンレシチンの合成法としては、
「Makromol.Chem.，182，247（1981）」で既に知
られている。しかしこの方法では、グリセリンよ
り出発し、８工程の反応を行わなければならず、
ジエンレシチンの工業的製造法としては問題があ
る。
レシチンの合成法としては、グリセリンを出発
原料とする純合成法と、天然レシチンを加水分解
し容易に得られるGPCとカルボン酸誘導体から
合成する半合成法が知られている。しかし前述の
如く純合成法は、反応工程が長く工業的製法とし
ては好ましいものではない。
一方半合成法としては(1)ピリジン類の存在下
GPCと酸塩化物を反応させる方法(2)GPCと酸無
水物をその酸のアンモニウム塩存在下で反応させ
る方法および(3)ピリジン誘導体存在下にGPCと
酸無水物を反応する方法等が知られている。
しかし、これらの半合成方法でジエンレシチン
合成を行う場合は長鎖ジエンカルボン酸を酸塩化
物、酸無水物等に誘導しなければならず、また一
方、これらの長鎖ジエンカルボン酸およびその誘
導体は、光あるいは熱で容易に重合が進行するた
め、反応収率も悪く、その精製も非常に難しい等
の問題がある。
本発明者は、長鎖ジエンカルボン酸とGPCを
直接縮合させる方法について鋭意研究を行つた結
果、天然レシチン、例えば卵黄レシチンを加水分
解して得られるＬ−α−GPCあるいはその塩化
カドミウム錯体と長鎖ジエンカルボン酸をクロロ
ホルム中Ｎ，Ｎ−ジアルキルピリジン触媒存在下
ジシクロヘキシルカーボジイミドと反応を行う
と、一段階でジエンレシチンを製造できることを
見い出し本発明に到つた。
また「Angew.Chem.Int.Ed.，17，522（1978）｝
には、カルボン酸のエステル化について記載され
ているが、本発明とは目的物も異なり、また、触
媒量も異なる。事実本発明法のGPCとジエンカ
ルボン酸の反応においては比較例にも示したが、
この方法では目的のジエンレシチンは全く単離で
きなかつた。この原因は明らかではないが、一般
に共役不飽和カルボン酸のエステル化に対する反
応性は非常に低いことが知られている。従つて、
共役不飽和カルボン酸とジシクロヘキシルカーボ
ジイミドから生成した反応中間体は非常に活性化
されており触媒のＮ，Ｎ−ジアルキル−４−アミ
ノピリジンが少ないと容易にＮ−アシル尿素体等
に変化することが考えられ、それ故GPCとジエ
ンカルボン酸とのエステル化が進行しなかつたも
のと考えられる。
本発明に用いるGPCとしては例えば卵黄レシ
チンを加水分解して容易に得られるＬ−α−
GPCあるいはその塩化カドミウム錯体を用いる
ことができる。
長鎖ジエンカルボン酸としては、一般式
R1CH＝CHCH＝CHCOOH
（R1はC5〜C17のアルキル基）
で表わされるα，β，γ，δ一不飽和カルボン酸
を用いることができる。このようなジエンカルボ
ン酸として、２，４−デカジエン酸、２，４−ウ
ンデカジエン酸、２，４−トリデカジエン酸、
２，４−テトラデカジエン酸、２，４−ペンタデ
カジエン酸、２，４−ヘキサデカジエン酸、２，
４−ヘプタデカジエン酸、２，４−オクタデカジ
エン酸、２，４−ノナデカジエン酸、２，４−エ
イコサジエン酸、２，４−ヘンエイコサジエン
酸、および２，４−ドコサジエン酸の全ての幾何
異性体を挙げることができる。
ジエンカルボン酸の量は、化学量論量以上、す
なわち、GPC1モルに対しジエンカルボン酸２モ
ル以上用いればよい。
溶媒としては、乾燥したクロロホルム、好まし
くは、エタノールを含有しない乾燥クロロホルム
である。
反応系にエタノールが存在するとエタノールと
ジエンカルボン酸の反応が進行し、目的のジエン
レシチンの収率が低下する原因となり、好ましく
ない。
溶媒量は、ジエンカルボン酸が完全に溶解し、
かつ、GPCあるいはGPCの塩化カドミウム錯体
および反応中に析出する尿素が存在しても円滑な
反応液の撹拌が可能な量であればよく、ジエンカ
ルボン酸１重量部に対し溶媒10容量部以上であれ
ばよい。
ジシクロヘキシルカーボジイミド量は、ジエン
カルボン酸１モルに対し、１モル以上、好ましく
は、１，２モル以上である。
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−４−アミノピリジンとし
ては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、
Ｎ−ピペラジノ４−ピリジン等を挙ることができ
る。
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−４−アミノピリジン量
は、反応を円滑に行うために特に重要であり、ジ
シクロヘキシルカーボジイミド１モルに対しＮ，
Ｎ−ジアルキル−４−アミノピリジン0.2モル以
上好ましくは0.4モル〜１モルを用いなければな
らない。
反応は、室温下、30時間程度で終了するが、ク
ロロホルムの分解およびジエンレシチン類の重合
を抑へるため、窒素雰囲気下、かつ遮光下に行う
ことが好ましい。ジエンレシチンは、上記反応混
合物を既存の方法で処理することにより単離精製
が可能である。
本発明に従へば、生体適合性材料として有用な
ジエンレシチンを天然由来のGPCと長鎖ジエン
カルボン酸から１段階で容易に製造できる。
さらに本発明により、飽和カルボン酸およびカ
ルボニル基に対して非共役は不飽和結合を有する
カルボン酸残基を有するレシチン合成も容易に行
へる。
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明す
る。
実施例 １
2E，4E−オクタジエン酸10ｇ、Ｌ−α−グリ
セロホスホリルコリン塩化カドミウム錯体6.3ｇ
およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン
2.2ｇの乾燥クロロホルム200ml溶液に窒素気流中
氷冷下にジシクロヘキシルカーボジイミド8.8ｇ
の乾燥クロロホルム20ml溶液を滴下した。
滴下終了後、５分間氷冷下で反応を行つた後、
窒素雰囲気下、室温で30時間撹拌を行つた。
反応終了後、ジパルミトイルホスホリルコリン
（DPPCと略す）を対照物質としてシリカゲル薄
層クロマトによる分析（展開液クロロホルム：メ
タノール：水＝65：25：４）を行なつたところ
DPPCとほぼ同じRf値をもつスポツトが主成分と
して認められた。
この反応液の溶媒を減圧下に留去した後、残渣
にクロロホルム：メタノール：水＝５：４：１か
らなる溶液を100ml加へ、不溶物をグラスフイル
ターにより別した。
液を同体積のイオン交換樹脂「Amberite
IRA−45およびIRC−50」よりなる混床イオンク
ロマト処理を行つた。展開溶液は、クロロホル
ム／メタノール／水＝５／４／１を用いた。イオ
ンクロマト留出液は、溶媒を減圧下に留去し、残
渣は、クロロホルム／メタノール／水＝65：25：
１に溶かしシリカゲルカラムにかけた。溶媒組成
比クロロホルム／メタノール／水＝５：４：１の
展開液留出分よりジエンレシチンが得られた。こ
のジエンレシチン溶液のシリカゲル薄層分析（展
開液．クロロホルム／メタノール／水＝５：４：
１）を行なつたところ紫外線およびリンモリブデ
ン酸による検出でワン・スポツトであつた。
上記ジエンレシチン留分の溶媒を留去しＬ−
１，２−ビス（2E，4E−オクタデカジエノイル）
−３−グリセロホスホリルコリン（以下C18−ジ
エンレシチンと略す）2.3ｇを得た。
実施例 ２
Ｌ−α−GPCの塩化カドミウム錯体の代りに
Ｌ−α−GPC3.8ｇを用いた以外は、実施例１と
同様な方法により反応を行つた。反応終了後、溶
媒を留去し、残渣を「トヨパールHW40」（東洋
曹達工業(株)製商品名、展開液；クロロホルム：メ
タノール＝１：４）のゲルクロマトにかけC18−
ジエンレシチン4.5ｇを得た。
比較例 １
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを0.2
ｇとした以外は、実施例１と同様な方法により反
応を行つた。反応終了後実施例１と同様な薄層ク
ロマト分析を行つたところジエンレシチンに相当
するスポツトは全く認められなかつた。
比較例 ２
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンを0.6
ｇとした以外は実施例１と同様な方法に反応を行
つた。反応終了後、薄層クロマト分析を行つたと
ころジエンレシチンに相当するスポツトが若干認
められた。その後、実施例１と同様な後処理を行
つたが、ジエンレシチンを単離することができな
かつた。
実施例 ３〜５
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンの量を
変えた以外は、実施例１と全く同様にして、反応
を行つたその結果を表１に示す。
The present invention relates to a method for producing polymerizable phospholipids.
More specifically, L-α-glycerophosphorylcholine (hereinafter abbreviated as L-α-GPC) and an alkadiene carbon represented by the general formula R 1 CH=CHCH=CHCOOH (R 1 is a C 5 to C 17 alkyl group) An acid (hereinafter referred to as dienecarboxylic acid) is directly condensed in the presence of a condensing agent to form the general formula ( R1 is a C5 to C17 alkyl group) This is a method for producing L-1,2-bis(2,4-alkadienoyl)-3-phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as diene lecithin). This diene lecithin can be applied to the surface of a contact lens and then polymerized to create a wet contact lens.
It can also be used to manufacture artificial organs with good biocompatibility by coating and polymerizing the surface of artificial organs. Moreover, by preparing liposomes from this diene lecithin and polymerizing the liposomes, liposomes with excellent storage stability can be prepared. Furthermore, by encapsulating a drug in this liposome, it can be used as a carrier for a sustained drug release system with excellent storage stability, making this diene lecithin a very useful compound as a biocompatible material. The method for synthesizing this diene lecithin is as follows:
It is already known from "Makromol.Chem., 182 , 247 (1981)". However, this method requires an eight-step reaction starting from glycerin.
There are problems with the industrial production method of diene lecithin. Known methods for synthesizing lecithin include a pure synthesis method using glycerin as a starting material and a semi-synthesis method involving synthesis from GPC and carboxylic acid derivatives, which are easily obtained by hydrolyzing natural lecithin. However, as mentioned above, the pure synthesis method requires long reaction steps and is not preferred as an industrial production method. On the other hand, as a semi-synthetic method, (1) in the presence of pyridines
A method of reacting GPC with an acid chloride, (2) a method of reacting GPC with an acid anhydride in the presence of an ammonium salt of the acid, and (3) a method of reacting GPC with an acid anhydride in the presence of a pyridine derivative are known. It is being However, when synthesizing diene lecithin using these semisynthetic methods, it is necessary to convert long chain diene carboxylic acids into acid chlorides, acid anhydrides, etc. Because polymerization easily proceeds with light or heat, the reaction yield is poor and purification is extremely difficult. As a result of intensive research into a method for directly condensing long-chain dienecarboxylic acids with GPC, the present inventors discovered that long-chain dienecarboxylic acids and L-α-GPC obtained by hydrolyzing egg yolk lecithin or its cadmium chloride complex were combined with long-chain diene carboxylic acids and GPC. The inventors have discovered that diene lecithin can be produced in one step by reacting chain diene carboxylic acid with dicyclohexyl carbodiimide in the presence of an N,N-dialkylpyridine catalyst in chloroform, leading to the present invention. Also “Angew.Chem.Int.Ed., 17 , 522 (1978)}
describes the esterification of carboxylic acids, but the target object and the amount of catalyst are different from those of the present invention. In fact, in the reaction of GPC and dienecarboxylic acid in the method of the present invention, as shown in the comparative example,
By this method, the target diene lecithin could not be isolated at all. Although the cause of this is not clear, it is generally known that the reactivity of conjugated unsaturated carboxylic acids to esterification is very low. Therefore,
The reaction intermediate produced from conjugated unsaturated carboxylic acid and dicyclohexyl carbodiimide is highly activated and easily changes to N-acylurea etc. if the catalyst N,N-dialkyl-4-aminopyridine is insufficient. Therefore, it is considered that esterification of GPC and dienecarboxylic acid did not proceed. As GPC used in the present invention, for example, L-α-
GPC or its cadmium chloride complex can be used. As the long-chain diene carboxylic acid, an α, β, γ, δ monounsaturated carboxylic acid represented by the general formula R 1 CH=CHCH=CHCOOH (R 1 is a C 5 to C 17 alkyl group) can be used. . Such dienecarboxylic acids include 2,4-decadienoic acid, 2,4-undecadienoic acid, 2,4-tridecadienoic acid,
2,4-tetradecadienoic acid, 2,4-pentadecadienoic acid, 2,4-hexadecadienoic acid, 2,
All geometric isomers of 4-heptadecadienoic acid, 2,4-octadecadienoic acid, 2,4-nonadecadienoic acid, 2,4-eicosadienoic acid, 2,4-heneicosadienoic acid, and 2,4-docosadienoic acid I can lift my body. The amount of dienecarboxylic acid may be a stoichiometric amount or more, that is, 2 moles or more of dienecarboxylic acid per 1 mole of GPC. The solvent is dry chloroform, preferably ethanol-free dry chloroform. The presence of ethanol in the reaction system is undesirable because the reaction between ethanol and diene carboxylic acid progresses, causing a decrease in the yield of the target diene lecithin. The amount of solvent is such that the dienecarboxylic acid is completely dissolved and
In addition, even if GPC or the cadmium chloride complex of GPC and urea precipitated during the reaction are present, the amount may be sufficient to allow smooth stirring of the reaction solution, and the amount of solvent should be at least 10 parts by volume per 1 part by weight of dienecarboxylic acid. Good to have. The amount of dicyclohexylcarbodiimide is 1 mol or more, preferably 1.2 mol or more, per 1 mol of dienecarboxylic acid. N,N-dialkyl-4-aminopyridine includes N,N-dimethyl-4-aminopyridine,
N-piperazino 4-pyridine and the like can be mentioned. The amount of N,N-dialkyl-4-aminopyridine is particularly important for smooth reaction.
More than 0.2 mol, preferably 0.4 mol to 1 mol of N-dialkyl-4-aminopyridine should be used. The reaction is completed in about 30 hours at room temperature, but it is preferably carried out under a nitrogen atmosphere and shielded from light in order to suppress the decomposition of chloroform and the polymerization of diene lecithins. Diene lecithin can be isolated and purified by treating the above reaction mixture using existing methods. According to the present invention, diene lecithin useful as a biocompatible material can be easily produced in one step from naturally derived GPC and long-chain diene carboxylic acid. Furthermore, according to the present invention, lecithin having a saturated carboxylic acid and a carboxylic acid residue having a non-conjugated unsaturated bond to a carbonyl group can be easily synthesized. The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below. Example 1 10 g of 2E,4E-octadienoic acid, 6.3 g of L-α-glycerophosphorylcholine cadmium chloride complex
and N,N-dimethyl-4-aminopyridine
Add 8.8 g of dicyclohexyl carbodiimide to a solution of 2.2 g in 200 ml of dry chloroform under ice cooling in a nitrogen stream.
A solution of 20 ml of dry chloroform was added dropwise. After completing the dropwise addition, the reaction was carried out under ice cooling for 5 minutes, and then
Stirring was performed at room temperature for 30 hours under a nitrogen atmosphere. After the reaction was completed, analysis was performed using silica gel thin layer chromatography (developing solution: chloroform: methanol: water = 65:25:4) using dipalmitoylphosphorylcholine (abbreviated as DPPC) as a reference substance.
Spots with almost the same Rf value as DPPC were recognized as the main component. After the solvent of this reaction solution was distilled off under reduced pressure, 100 ml of a solution consisting of chloroform:methanol:water=5:4:1 was added to the residue, and insoluble materials were separated using a glass filter. Pour the same volume of ion exchange resin “Amberite” into the solution.
A mixed bed ion chromatography process consisting of ``IRA-45 and IRC-50'' was performed. The developing solution used was chloroform/methanol/water=5/4/1. The solvent of the ion chromatography distillate was distilled off under reduced pressure, and the residue was a mixture of chloroform/methanol/water = 65:25:
1 and applied to a silica gel column. Diene lecithin was obtained from the distillate of the developing solution with a solvent composition ratio of chloroform/methanol/water = 5:4:1. Silica gel thin layer analysis of this diene lecithin solution (Developing solution: Chloroform/methanol/water = 5:4:
When 1) was carried out, one spot was detected by ultraviolet light and phosphomolybdic acid. The solvent of the diene lecithin fraction was distilled off and L-
1,2-bis(2E,4E-octadecadienoyl)
2.3 g of -3-glycerophosphorylcholine (hereinafter abbreviated as C18 -diene lecithin) was obtained. Example 2 A reaction was carried out in the same manner as in Example 1, except that 3.8 g of L-α-GPC was used instead of the cadmium chloride complex of L-α-GPC. After the reaction, the solvent was distilled off and the residue was subjected to gel chromatography using "Toyopearl HW40" (trade name, manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd., developing solution: chloroform:methanol = 1:4) .
4.5 g of diene lecithin was obtained. Comparative Example 1 N,N-dimethyl-4-aminopyridine at 0.2
The reaction was carried out in the same manner as in Example 1, except that g was used. After the reaction was completed, thin layer chromatography analysis similar to that in Example 1 was performed, and no spots corresponding to diene lecithin were observed. Comparative Example 2 0.6 N,N-dimethyl-4-aminopyridine
The reaction was carried out in the same manner as in Example 1, except that g was used. After the reaction was completed, thin layer chromatography analysis revealed some spots corresponding to diene lecithin. Thereafter, the same post-treatment as in Example 1 was carried out, but diene lecithin could not be isolated. Examples 3 to 5 The reaction was carried out in exactly the same manner as in Example 1 except that the amount of N,N-dimethyl-4-aminopyridine was changed. The results are shown in Table 1.
【表】
実施例 ６
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジンの代り
にＮ−ピロリジノ−４−ピリジン2.6ｇを用いた
以外は、実施例１と同様な方法により、ジエンレ
シチン2.1ｇを得た。
実施例 ７
ジエンカルボン酸を換えた以外は実施例１と同
様の方法によりジエンレシチンを得たその結果を
表２に示す。[Table] Example 6 2.1 g of diene lecithin was obtained in the same manner as in Example 1, except that 2.6 g of N-pyrrolidino-4-pyridine was used instead of N,N-dimethyl-4-aminopyridine. . Example 7 Diene lecithin was obtained in the same manner as in Example 1 except that the diene carboxylic acid was changed. The results are shown in Table 2.
【表】
比較例 ３
ジムロート、窒素導入管、滴下ロート・温度計
をつけた200ml四つ口フラスコに、2E，4E−オク
タデカジエン酸0.9ｇ、トリエチルアミン0.4mlお
よびTHF50mlを入れた。反応フラスコを食塩−
氷浴で冷却した。反応液温度−５℃でクロルギ酸
エチル0.4mlを加え、更に、−５℃で15分間撹拌を
行つた。その後、2E，4E−オクタデカジエン酸
0.9ｇ、トリエチルアミン0.4ml、THF50mlからな
る溶液を−５℃で滴下した。滴下終了後反応液は
室温にもどし、一夜撹拌を行つた。析出固体を
別し液の溶媒を減圧留去した。残渣に水を加
へ、エーテル抽出を行つた。抽出液を硫酸マグネ
シウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をシリカ
ゲルクロマトにかけ、酸無水物0.88ｇを得た。
50mlナス型フラスコに、該酸無水物0.8ｇ、Ｌ
−α−グリセロホスホリルコリン塩化カドミウム
錯体0.3ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリ
ジン0.16ｇおよびクロロホルム20mlを入れ、室
温、窒素雰囲気中30時間撹拌を行つた。
反応終了後、実施例１と同様な操作を行ない、
C18−ジエンレシチン15mgを得た。[Table] Comparative Example 3 0.9 g of 2E,4E-octadecadienoic acid, 0.4 ml of triethylamine, and 50 ml of THF were placed in a 200 ml four-necked flask equipped with a Dimroth, nitrogen inlet tube, dropping funnel, and thermometer. Salt the reaction flask.
Cooled in an ice bath. 0.4 ml of ethyl chloroformate was added to the reaction mixture at a temperature of -5°C, and the mixture was further stirred at -5°C for 15 minutes. Then, 2E,4E-octadecadienoic acid
A solution consisting of 0.9 g, triethylamine 0.4 ml, and THF 50 ml was added dropwise at -5°C. After completion of the dropwise addition, the reaction solution was returned to room temperature and stirred overnight. The precipitated solid was separated and the solvent of the liquid was distilled off under reduced pressure. Water was added to the residue and extracted with ether. The extract was dried over magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The residue was subjected to silica gel chromatography to obtain 0.88 g of acid anhydride. In a 50ml eggplant-shaped flask, add 0.8g of the acid anhydride, L
0.3 g of -α-glycerophosphorylcholine cadmium chloride complex, 0.16 g of N,N-dimethyl-4-aminopyridine and 20 ml of chloroform were added, and the mixture was stirred at room temperature in a nitrogen atmosphere for 30 hours. After the reaction was completed, the same operation as in Example 1 was carried out,
15 mg of C18 -diene lecithin was obtained.