JPH037356B2 - - Google Patents
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- JPH037356B2 JPH037356B2 JP56092661A JP9266181A JPH037356B2 JP H037356 B2 JPH037356 B2 JP H037356B2 JP 56092661 A JP56092661 A JP 56092661A JP 9266181 A JP9266181 A JP 9266181A JP H037356 B2 JPH037356 B2 JP H037356B2
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- carboxypeptidase
- acidic
- acidic carboxypeptidase
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Description
本発明はペニシリウム属に属する酸性カルボキ
シペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養物
から採取する酸性カルボキシペプチダーゼの精製
方法に関する。 従来、味噌、醤油あるいはチーズのごとき発酵
食品の製造には、それぞれ独特の微生物が利用さ
れているがこれら微生物はタンパク質分解活性の
強いものが多い。 一般にこれら微生物の分解酵素は、エキソペプ
チダーゼとエンドペプチダーゼの混在する形で、
発酵食品の風味や組織形成に重要な作用をしてい
ることが知られている。一方、タンパク質を分解
すると、時には生成するペプチドのために不快な
苦味を呈することも、また知られている。そのた
め、積極的にタンパク質分解酵素を利用して分解
を促進しようとすれば、苦味の発生によつて食品
としてはかえつて不適な物になることがある。し
かし、伝統的なタンパク質に富む発酵食品では、
エンドペプチダーゼと苦味ペプチド分解性を持つ
各種のエキソペプチダーゼの微妙なバランスの下
に独特の味を提供し、苦味を呈することはほとん
どない。これは、エキソペプチダーゼの役割がい
かに重要であるかを再認識させるものである。 このようなエキソペプチダーゼの作用上の特性
に鑑み、エキソペプチダーゼの１種である酸性カ
ルボキシペプチダーゼをエンドペプチダーゼの全
く含まない状態で取得できれば、食品中の苦味ペ
プチドの除去あるいは食品の旨味の増強に利用し
得るようになり、更にカルボキシペプチダーゼと
エンドペプチダーゼとの活性割合を調節すること
によりこれら酵素を利用した新らしい食品の開発
をもたらすのと考えられる。 従来、カルボキシペプチダーゼは、柑橘類の果
皮、発芽小麦ならびに大麦、動物の膵臓などから
分離、精製されており（カルボキシペプチダーゼ
Ａ，Ｂ）、また、酵母や放線菌からも分離、精製
されている（酵母から分離されたものはカルボキ
シペプチダーゼＹと称せられる）。さらに、アス
ペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、ア
スペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、
ペニシリウム・ジヤンチネラム（Penicillium
janthinellum）のごとき糸状菌からのカルボキシ
ペプチダーゼの分離、精製も報告されている。 しかしながら、従来のカルボキシペプチダーゼ
の精製においてエンドペプチダーゼを含まないカ
ルボキシペプチダーゼを得るには硫安や芒硝等を
利用した塩析法や、アルコール、アセトンあるい
はジオキサンなどを利用した有機溶媒沈殿法や、
セフアデツクス又はバイオゲルなどのゲル過ク
ロマトグラフイーを組合わせて用いた多段階の精
製法が行なわれているのが現状である。したがつ
て、このような精製法は操作が煩雑なうえに費用
も嵩むので工業的に大量生産には適さない。 本発明者らは上述したごときに背景に鑑み、酸
性カルボキシペプチダーゼの工業的規模での大量
精製に適した精製方法を提供すべく検討した結
果、該カルボキシペプチダーゼの大量生産に適し
たペニシリウム属に属する酸性カルボキシペプチ
ダーゼ生産菌を培養して得られる酸性カルボキシ
ペプチダーゼの有利な大量生産に適した精製法を
見出し、本発明に至つた。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明は、ペニシリウム属に属する酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養
物の液を、カルボキシメチル−セフアデツクス
に通して上記培養物液中の酸性カルボキシペプ
チダーゼ画分を該カラムに吸着させ、ついでこの
カラムを洗浄した後上記画分を溶出することを特
徴とする。 本発明で酸性カルボキシペプチダーゼ画分の吸
着に用いるカルボキシメチル−セフアデツクス
（以下CM−セフアデツクスと称す）は弱酸性陽
イオン交換体としての特性を有するものであるこ
とが知られているが、酸性カルボキシペプチダー
ゼの吸着量が他のカチオン交換樹脂に比して顕著
に大きいことは本発明者が始めて知見したことで
ある。 本発明ではペニシリウム属に属する酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養
物の液は下記により得られる。上記酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌として例えばペニシリウ
ム・カセイコラム（Penicillum caseicolum）微
工研菌寄第6009号、又はペニシリウム・ロツクフ
オルテイ（Penicillium roqueforti）ATCC38099
を用い、糸状菌の培養に通常用いられる小麦〓を
基質とする培地中で約20〜25℃の温度下で８〜10
日間培養し、得られた培養物に７〜10倍容量の５
〜10ｍＭ酸緩衝液（PH3.0）を添加し、混合物の
PHを3.0〜4.0、好ましくは3.5に調整しながら５℃
で５時間程度培養物中の酵素の抽出を行なう。次
いでこの抽出混合物を遠心分離又は過操作によ
り固一液分離を行なつて、粗酵素を含む培養物
液（すなわち粗酵素抽出液）を得る。 次に、このようにして得た培養物の液（PH
3.0〜4.0、好ましくは3.5）を、予め10ｍＭ酢酸緩
衝液（PH3.5）で平衡化したCM−セフアデツクス
のカラムに通して、上記液中の酸性カルボキシ
ペプチダーゼ画分を吸着させる。ここで本酵素の
CM−セフアデツクス吸着容量は約25単位／ml樹
脂であるので、使用するカラム容量はこれから計
算される交換容量の少なくとも２倍以上にする。 又、カラムは流速確保のためできるだけ太く、
短い形状のものを使用し、特に直径と長さの比が
１：３〜10のものを使用することが好ましい。 上述のごとくしてCM−セフアデツクスのカラ
ムに吸着した酸性カルボキシペプチダーゼ画分を
溶出すると、得られる溶出液中のエンドペプチダ
ーゼ活性は上記粗酵素抽出液（培養物液）中に
おける活性の約1/10に減少する。すなわち、CM
−セフアデツクスカラムへの通液により粗酵素抽
出液中の酸性カルボキシペプチダーゼが選択的に
吸着されることが確認し得る。 本発明ではエンドペプチダーゼを実質上完全に
含まない高純度酸性カルボキシペプチダーゼを得
る目的で、上記溶出処理に先立つてカラムを洗浄
して該カラムに吸着されている酸性カルボキシペ
プチダーゼ画分に若干混在しているエンドペプチ
ダーゼを溶出除去する。この洗浄は、0.2M食塩
を含む10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）を用い、少な
くとも2BV（ベツドボリウム；樹脂容量）の通液
量で行なう。なお、この洗浄によつては酸性カル
ボキシペプチダーゼの溶出は全くみられない。 上記カラムの洗浄によるエンドペプチダーゼの
除去した後の吸着酸性カルボキシペプチダーゼの
溶出はイオン強度0.5M以上、PH3.0〜4.0で、例え
ば0.5M食塩を含む10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）を
用いて行なう。この溶出は１〜2BVで完全に行
ない得、得られる溶出画分にはエンドペプチダー
ゼは検出されない。 なお、CM−セフアデツクスカラムにおける上
記吸着及び溶出操作での通液流速はSV（単位時当
りの流量を樹脂容量で除したもの）２〜３で実施
することが好ましく、また、これらの操作は０〜
５℃の低温下で行なうように留意する。 上述したごとく、本発明によるとCM−セフア
デツクスカラムへの吸着、洗浄及び溶出という簡
易な操作でエンドペプチダーゼを含まない高純度
酸性カルボキシペプチダーゼを収得できる。換言
すると、本発明は従来困難視されていたエンド型
とエキソ型とのペプチダーゼの分離を効率的且つ
完全に遂行することを可能にしたものと言える。 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明す
る。なお、実施例中の酵素活性は下記測定法によ
る値で示したものである。 １ 酸性カルボキシペプチダーゼ活性： １ｍＭ、ベンジルオキシカルボニルグルタミ
ルチロシン（Ｚ−Glu−Tyr）溶液0.5ml、50ｍ
Ｍ酢酸緩衝液0.45ml（PH3.0）および酵素液0.05
mlの混合液を30℃で20分間反応させた後、
0.3M水酸化ナトリウム溶液を0.2ml添加し反応
停止を行い、20分間放置する。次に、これを
2.5％酢酸溶液0.2mlで中和後ニンヒドリン反応
をおこない、570nmの吸光度を測定する。本反
応により30℃、１分間に1μMチロシンを遊離
する酵素量を１単位として表示した。 ２ 酸性プロテアーゼ活性： 基質混液1.9ml（0.32％カゼイン、50ｍＭ乳
酸溶液、PH3.0）に酵素液0.1mlを加え、30℃で
反応後2.0mlの10％トリクロル酢酸溶液の添加
で反応を止め、30℃に30分間保持する。次いで
生成する沈殿を過し、液の280nmにおける
吸光度の増加を測定する。酵素単位は上記の測
定条件下で１分間に280nmの吸光度を１増加さ
せる酵素量を、１単位とした。 実施例 １ 小麦〓３Kgの第２りん酸カリウム10.5ｇ、硫酸
マグネシウム1.05ｇを含むイオン交換水2.1を
混合し、よくこねた後、３容三角フラスコに分
注し、121℃、１時間滅菌した。これに、あらか
じめポテトデキストロース寒天斜面で培養した
Penicillium caseicolum SBT7010（微工研菌寄
第6009号）を接種後、20℃、10日間培養した。得
られた培養物に20の５ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.0）
を加えて５時間浸漬抽出した。この間PHを塩酸で
3.5に調整し、一定に維持した。次に、これを
過し、清澄な粗酵素抽出液約17を取得した。こ
れをあらかじめ10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）で平
衡化したCM−セフアデツクスカラム（カラム容
量200ml、形状直径４cm×長さ16cm）に通し、酸
性カルボキシペプチダーゼ画分を吸着させた。な
おこの時の流速はSV2で実施した。さらにこれを
0.2M食塩を含む酢酸緩衝液400mlで洗浄し混在す
るエンドペプチダーゼを完全に溶出した。次に、
0.5M食塩を含む同緩衝液400mlで酸性カルボキシ
ペプチダーゼを溶出し、得られる活性画分を集め
た。以上ワンステツプの精製工程でエンド、エキ
ソ型ペプチダーゼを完全に分離でき、エンドペプ
チダーゼ活性を含まない酸性カルボキシペプチダ
ーゼ活性画分300mlを取得した。なお、精製過程
の各酵素活性は表１の如き結果であり、酵素活性
の回収率は91％であつた。また、上記により得ら
れた酸性カルボキシペプチダーゼは容量的には約
55倍に、比活性（活性／タンパク質量）では約22
倍に濃縮された。
シペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養物
から採取する酸性カルボキシペプチダーゼの精製
方法に関する。 従来、味噌、醤油あるいはチーズのごとき発酵
食品の製造には、それぞれ独特の微生物が利用さ
れているがこれら微生物はタンパク質分解活性の
強いものが多い。 一般にこれら微生物の分解酵素は、エキソペプ
チダーゼとエンドペプチダーゼの混在する形で、
発酵食品の風味や組織形成に重要な作用をしてい
ることが知られている。一方、タンパク質を分解
すると、時には生成するペプチドのために不快な
苦味を呈することも、また知られている。そのた
め、積極的にタンパク質分解酵素を利用して分解
を促進しようとすれば、苦味の発生によつて食品
としてはかえつて不適な物になることがある。し
かし、伝統的なタンパク質に富む発酵食品では、
エンドペプチダーゼと苦味ペプチド分解性を持つ
各種のエキソペプチダーゼの微妙なバランスの下
に独特の味を提供し、苦味を呈することはほとん
どない。これは、エキソペプチダーゼの役割がい
かに重要であるかを再認識させるものである。 このようなエキソペプチダーゼの作用上の特性
に鑑み、エキソペプチダーゼの１種である酸性カ
ルボキシペプチダーゼをエンドペプチダーゼの全
く含まない状態で取得できれば、食品中の苦味ペ
プチドの除去あるいは食品の旨味の増強に利用し
得るようになり、更にカルボキシペプチダーゼと
エンドペプチダーゼとの活性割合を調節すること
によりこれら酵素を利用した新らしい食品の開発
をもたらすのと考えられる。 従来、カルボキシペプチダーゼは、柑橘類の果
皮、発芽小麦ならびに大麦、動物の膵臓などから
分離、精製されており（カルボキシペプチダーゼ
Ａ，Ｂ）、また、酵母や放線菌からも分離、精製
されている（酵母から分離されたものはカルボキ
シペプチダーゼＹと称せられる）。さらに、アス
ペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、ア
スペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、
ペニシリウム・ジヤンチネラム（Penicillium
janthinellum）のごとき糸状菌からのカルボキシ
ペプチダーゼの分離、精製も報告されている。 しかしながら、従来のカルボキシペプチダーゼ
の精製においてエンドペプチダーゼを含まないカ
ルボキシペプチダーゼを得るには硫安や芒硝等を
利用した塩析法や、アルコール、アセトンあるい
はジオキサンなどを利用した有機溶媒沈殿法や、
セフアデツクス又はバイオゲルなどのゲル過ク
ロマトグラフイーを組合わせて用いた多段階の精
製法が行なわれているのが現状である。したがつ
て、このような精製法は操作が煩雑なうえに費用
も嵩むので工業的に大量生産には適さない。 本発明者らは上述したごときに背景に鑑み、酸
性カルボキシペプチダーゼの工業的規模での大量
精製に適した精製方法を提供すべく検討した結
果、該カルボキシペプチダーゼの大量生産に適し
たペニシリウム属に属する酸性カルボキシペプチ
ダーゼ生産菌を培養して得られる酸性カルボキシ
ペプチダーゼの有利な大量生産に適した精製法を
見出し、本発明に至つた。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明は、ペニシリウム属に属する酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養
物の液を、カルボキシメチル−セフアデツクス
に通して上記培養物液中の酸性カルボキシペプ
チダーゼ画分を該カラムに吸着させ、ついでこの
カラムを洗浄した後上記画分を溶出することを特
徴とする。 本発明で酸性カルボキシペプチダーゼ画分の吸
着に用いるカルボキシメチル−セフアデツクス
（以下CM−セフアデツクスと称す）は弱酸性陽
イオン交換体としての特性を有するものであるこ
とが知られているが、酸性カルボキシペプチダー
ゼの吸着量が他のカチオン交換樹脂に比して顕著
に大きいことは本発明者が始めて知見したことで
ある。 本発明ではペニシリウム属に属する酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌を培養して得られる培養
物の液は下記により得られる。上記酸性カルボ
キシペプチダーゼ生産菌として例えばペニシリウ
ム・カセイコラム（Penicillum caseicolum）微
工研菌寄第6009号、又はペニシリウム・ロツクフ
オルテイ（Penicillium roqueforti）ATCC38099
を用い、糸状菌の培養に通常用いられる小麦〓を
基質とする培地中で約20〜25℃の温度下で８〜10
日間培養し、得られた培養物に７〜10倍容量の５
〜10ｍＭ酸緩衝液（PH3.0）を添加し、混合物の
PHを3.0〜4.0、好ましくは3.5に調整しながら５℃
で５時間程度培養物中の酵素の抽出を行なう。次
いでこの抽出混合物を遠心分離又は過操作によ
り固一液分離を行なつて、粗酵素を含む培養物
液（すなわち粗酵素抽出液）を得る。 次に、このようにして得た培養物の液（PH
3.0〜4.0、好ましくは3.5）を、予め10ｍＭ酢酸緩
衝液（PH3.5）で平衡化したCM−セフアデツクス
のカラムに通して、上記液中の酸性カルボキシ
ペプチダーゼ画分を吸着させる。ここで本酵素の
CM−セフアデツクス吸着容量は約25単位／ml樹
脂であるので、使用するカラム容量はこれから計
算される交換容量の少なくとも２倍以上にする。 又、カラムは流速確保のためできるだけ太く、
短い形状のものを使用し、特に直径と長さの比が
１：３〜10のものを使用することが好ましい。 上述のごとくしてCM−セフアデツクスのカラ
ムに吸着した酸性カルボキシペプチダーゼ画分を
溶出すると、得られる溶出液中のエンドペプチダ
ーゼ活性は上記粗酵素抽出液（培養物液）中に
おける活性の約1/10に減少する。すなわち、CM
−セフアデツクスカラムへの通液により粗酵素抽
出液中の酸性カルボキシペプチダーゼが選択的に
吸着されることが確認し得る。 本発明ではエンドペプチダーゼを実質上完全に
含まない高純度酸性カルボキシペプチダーゼを得
る目的で、上記溶出処理に先立つてカラムを洗浄
して該カラムに吸着されている酸性カルボキシペ
プチダーゼ画分に若干混在しているエンドペプチ
ダーゼを溶出除去する。この洗浄は、0.2M食塩
を含む10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）を用い、少な
くとも2BV（ベツドボリウム；樹脂容量）の通液
量で行なう。なお、この洗浄によつては酸性カル
ボキシペプチダーゼの溶出は全くみられない。 上記カラムの洗浄によるエンドペプチダーゼの
除去した後の吸着酸性カルボキシペプチダーゼの
溶出はイオン強度0.5M以上、PH3.0〜4.0で、例え
ば0.5M食塩を含む10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）を
用いて行なう。この溶出は１〜2BVで完全に行
ない得、得られる溶出画分にはエンドペプチダー
ゼは検出されない。 なお、CM−セフアデツクスカラムにおける上
記吸着及び溶出操作での通液流速はSV（単位時当
りの流量を樹脂容量で除したもの）２〜３で実施
することが好ましく、また、これらの操作は０〜
５℃の低温下で行なうように留意する。 上述したごとく、本発明によるとCM−セフア
デツクスカラムへの吸着、洗浄及び溶出という簡
易な操作でエンドペプチダーゼを含まない高純度
酸性カルボキシペプチダーゼを収得できる。換言
すると、本発明は従来困難視されていたエンド型
とエキソ型とのペプチダーゼの分離を効率的且つ
完全に遂行することを可能にしたものと言える。 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明す
る。なお、実施例中の酵素活性は下記測定法によ
る値で示したものである。 １ 酸性カルボキシペプチダーゼ活性： １ｍＭ、ベンジルオキシカルボニルグルタミ
ルチロシン（Ｚ−Glu−Tyr）溶液0.5ml、50ｍ
Ｍ酢酸緩衝液0.45ml（PH3.0）および酵素液0.05
mlの混合液を30℃で20分間反応させた後、
0.3M水酸化ナトリウム溶液を0.2ml添加し反応
停止を行い、20分間放置する。次に、これを
2.5％酢酸溶液0.2mlで中和後ニンヒドリン反応
をおこない、570nmの吸光度を測定する。本反
応により30℃、１分間に1μMチロシンを遊離
する酵素量を１単位として表示した。 ２ 酸性プロテアーゼ活性： 基質混液1.9ml（0.32％カゼイン、50ｍＭ乳
酸溶液、PH3.0）に酵素液0.1mlを加え、30℃で
反応後2.0mlの10％トリクロル酢酸溶液の添加
で反応を止め、30℃に30分間保持する。次いで
生成する沈殿を過し、液の280nmにおける
吸光度の増加を測定する。酵素単位は上記の測
定条件下で１分間に280nmの吸光度を１増加さ
せる酵素量を、１単位とした。 実施例 １ 小麦〓３Kgの第２りん酸カリウム10.5ｇ、硫酸
マグネシウム1.05ｇを含むイオン交換水2.1を
混合し、よくこねた後、３容三角フラスコに分
注し、121℃、１時間滅菌した。これに、あらか
じめポテトデキストロース寒天斜面で培養した
Penicillium caseicolum SBT7010（微工研菌寄
第6009号）を接種後、20℃、10日間培養した。得
られた培養物に20の５ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.0）
を加えて５時間浸漬抽出した。この間PHを塩酸で
3.5に調整し、一定に維持した。次に、これを
過し、清澄な粗酵素抽出液約17を取得した。こ
れをあらかじめ10ｍＭ酢酸緩衝液（PH3.5）で平
衡化したCM−セフアデツクスカラム（カラム容
量200ml、形状直径４cm×長さ16cm）に通し、酸
性カルボキシペプチダーゼ画分を吸着させた。な
おこの時の流速はSV2で実施した。さらにこれを
0.2M食塩を含む酢酸緩衝液400mlで洗浄し混在す
るエンドペプチダーゼを完全に溶出した。次に、
0.5M食塩を含む同緩衝液400mlで酸性カルボキシ
ペプチダーゼを溶出し、得られる活性画分を集め
た。以上ワンステツプの精製工程でエンド、エキ
ソ型ペプチダーゼを完全に分離でき、エンドペプ
チダーゼ活性を含まない酸性カルボキシペプチダ
ーゼ活性画分300mlを取得した。なお、精製過程
の各酵素活性は表１の如き結果であり、酵素活性
の回収率は91％であつた。また、上記により得ら
れた酸性カルボキシペプチダーゼは容量的には約
55倍に、比活性（活性／タンパク質量）では約22
倍に濃縮された。
【表】
次に上述のごとくして得られた酸性カルボキシ
ペプチダーゼを用い、苦味ペプチド分解性につい
て検討した。カゼインの苦味ペプチド調製は、５
％カゼイン溶液に0.01％の結晶トリプシンを添
加、PH7.5、25℃で24時間分解し、分解液中の苦
味画分をｎ−ブタノールで抽出後、酸処理（PH
5.4）による除タンパクを行い、凍結乾燥して苦
味ペプチドを得た。ここで得られた苦味ペプチド
の１％溶液１mlにたいして、0.3単位の本酵素標
品を添加し、25℃、PH3.0で反応させ、苦味の軽
減を官能評価により調べた。官能評価は、パネラ
ー５人を用い、酵素液及び苦味ペプチドと酵素混
合液の反応前後の３種につき、苦味の強弱を比較
した。この結果は、表２にみられるごとく、明ら
かに本酵素は苦味ペプチド分解活性が存在し、有
効なものであると判断された。
ペプチダーゼを用い、苦味ペプチド分解性につい
て検討した。カゼインの苦味ペプチド調製は、５
％カゼイン溶液に0.01％の結晶トリプシンを添
加、PH7.5、25℃で24時間分解し、分解液中の苦
味画分をｎ−ブタノールで抽出後、酸処理（PH
5.4）による除タンパクを行い、凍結乾燥して苦
味ペプチドを得た。ここで得られた苦味ペプチド
の１％溶液１mlにたいして、0.3単位の本酵素標
品を添加し、25℃、PH3.0で反応させ、苦味の軽
減を官能評価により調べた。官能評価は、パネラ
ー５人を用い、酵素液及び苦味ペプチドと酵素混
合液の反応前後の３種につき、苦味の強弱を比較
した。この結果は、表２にみられるごとく、明ら
かに本酵素は苦味ペプチド分解活性が存在し、有
効なものであると判断された。
【表】
実施例 ２
小麦〓10Kgとイオン交換水８Kgを混合し、この
混合物を麹培養専用トイレに入れ、121℃、30分
間減菌した。これにあらかじめポテトデキストロ
ース寒天培地で培養した、Penicillium
roqueforti ATCCNo.38099を接種後、25℃、湿度
100％の室で８日間培養した。 培養物を集め、80の５ｍＭ酢酸緩衝液（PH
3.0）を加え、途中PHを3.5に調整しつつ、10℃、
４時間の浸漬抽出を行つた。 浸漬抽出後、まず、ふるいを用い〓及び大きな
固型物を取り除き、次に連続高速遠心分離機（シ
ンマルエンタープライズ製）によつて沈殿物を完
全に取り除き、清澄な粗酵素液65を得た。別に
10ｍＭ酢酸緩衝波（PH3.5）で平衡化したCM−セ
フアデツクスカラム（直径３cm、長さ20cmの形状
を有するカラムが10本たばねられたもので１本当
りのカラム容量は100ml）を用意し、これに粗酵
素抽出液を同時にカラム１本当り6.5づつ流し、
酸性カルボキシペプチダーゼを吸着させた。 次に実施例１と同様に0.2M食塩を含む10ｍＭ
酢酸緩衝液（2BV）での洗浄、つづいて0.5M食
塩を含む同緩衝液（2BV）による酸性カルボキ
シペプチダーゼの溶出を行つた。 精製結果を表３に示す。表３にみられるごと
く、カルボキシペプチダーゼとエンドペプチダー
ゼを完全に分離することができた。 なお、活性画分は1.2を取得でき、容量では
54倍に比活性では21倍に濃縮された。
混合物を麹培養専用トイレに入れ、121℃、30分
間減菌した。これにあらかじめポテトデキストロ
ース寒天培地で培養した、Penicillium
roqueforti ATCCNo.38099を接種後、25℃、湿度
100％の室で８日間培養した。 培養物を集め、80の５ｍＭ酢酸緩衝液（PH
3.0）を加え、途中PHを3.5に調整しつつ、10℃、
４時間の浸漬抽出を行つた。 浸漬抽出後、まず、ふるいを用い〓及び大きな
固型物を取り除き、次に連続高速遠心分離機（シ
ンマルエンタープライズ製）によつて沈殿物を完
全に取り除き、清澄な粗酵素液65を得た。別に
10ｍＭ酢酸緩衝波（PH3.5）で平衡化したCM−セ
フアデツクスカラム（直径３cm、長さ20cmの形状
を有するカラムが10本たばねられたもので１本当
りのカラム容量は100ml）を用意し、これに粗酵
素抽出液を同時にカラム１本当り6.5づつ流し、
酸性カルボキシペプチダーゼを吸着させた。 次に実施例１と同様に0.2M食塩を含む10ｍＭ
酢酸緩衝液（2BV）での洗浄、つづいて0.5M食
塩を含む同緩衝液（2BV）による酸性カルボキ
シペプチダーゼの溶出を行つた。 精製結果を表３に示す。表３にみられるごと
く、カルボキシペプチダーゼとエンドペプチダー
ゼを完全に分離することができた。 なお、活性画分は1.2を取得でき、容量では
54倍に比活性では21倍に濃縮された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ペニシリウム属に属する酸性カルボキシペプ
チダーゼ生産菌を培養して得られる培養物の濾液
をカルボキシメチル−セフアデツクスのカラムに
通して上記培養物濾液中の酸性カルボキシペプチ
ダーゼ画分を該カラムに吸着させ、ついでこのカ
ラムを洗浄した後上記画分を溶出することを特徴
とする酸性カルボキシペプチダーゼの精製方法。 ２ 培養物の濾液をイオン強度0.2M以下、PH3.0
−4.0でカラムに通液し、且つカラムに吸着した
酸性カルボキシペプチダーゼ画分をイオン強度
0.5M以上、PH3.0〜4.0で溶出する、特許請求の範
囲第１項記載の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56092661A JPS57208988A (en) | 1981-06-16 | 1981-06-16 | Purification of acidic carboxypeptidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56092661A JPS57208988A (en) | 1981-06-16 | 1981-06-16 | Purification of acidic carboxypeptidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57208988A JPS57208988A (en) | 1982-12-22 |
| JPH037356B2 true JPH037356B2 (ja) | 1991-02-01 |
Family
ID=14060651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56092661A Granted JPS57208988A (en) | 1981-06-16 | 1981-06-16 | Purification of acidic carboxypeptidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57208988A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009080484A1 (en) * | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Dsm Ip Assets B.V. | Accelerated fungal growth |
| CN108275369A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-07-13 | 东莞市厚威包装科技股份有限公司 | 一种包装盒的菌丝包装衬垫 |
-
1981
- 1981-06-16 JP JP56092661A patent/JPS57208988A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57208988A (en) | 1982-12-22 |
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