JPH0753106B2 - ペプチド製造用酵素剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は苦味のないペプチドを製造するためのリゾプス
属由来の酵素剤、それを用いる苦味のないペプチドの製
造方法、及びそれを用いる苦味の消去方法に関するもの
である。

本発明によって調製されたペプチドは苦味を有しないの
で、非常に食べ易くなり、ペプチドが本来有する栄養価
を充分に利用することができる。

したがって本発明は、食品、栄養食品、医療、飼料、微
生物工業等の各種工業において広範且つ有利に利用する
ことができる。

（従来の技術） 蛋白質を分解してペプチドとする方法において、酵素を
用いる方法はマイルドな条件で操作が出来る等の利点が
あるために工業的に多用されている。しかしながら、こ
のような方法によって製造したペプチド、つまり酵素分
解ペプチドには苦味が付随しており、これを栄養食とし
て投与しても極端な場合には幼児や病人等によっては吐
き出してしまう場合もあって、結局投与することができ
ないこととなり、ペプチドが本来有する栄養性その他の
特性が利用できないことがしばしば生じる。

これを改良する目的で、例えば苦味を生じないような酵
素をスクリーニングする方法が従来より行われており、
例えばペニシリウム・シトリナム等ペニシリウム属由来
の中性及び／又はアルカリ性プロテアーゼを利用する方
法が本発明者らによって開発されている（特開昭62−14
796号）。

しかしながら、本発明のようにリゾプス（Rhizopus）属
菌由来の酵素、しかもプロティナーゼとペプチダーゼを
含む複合酵素を用いて苦味を消去したペプチドを製造す
る技術は従来全く知られておらず、新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上記した技術の現状に鑑みてなされたもので
あって、従来の酵素分解ペプチドの致命的欠陥であると
ころの苦味を除去する技術を開発する目的でなされたも
のである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記目的を達成するためになされたものであ
って、各方面から検討の結果、反応条件がマイルドであ
り、比較的容易に分解度をコントロールすることができ
て目的とするペプチドが自由に得られる等の利点がある
ことから、生物学的方法、特に微生物を用いる方法に着
目した。

そこで各種の微生物について鋭意スクリーニングを行っ
た結果、ある種のリゾプス属菌に苦味のないペプチドを
生成する作用があることを発見した（第１表）。

そして上記作用は１種の酵素ではなく複合酵素が関与し
ていること、そして更に苦味のないペプチドを直接的に
蛋白質から生成する作用のほかに、他の酵素によって生
成した苦味を有するペプチドから苦味を除去する作用も
ある、という新規にして有用な知見も得た。

そしてこれらの新知見に基づき更に検討の結果、上記酵
素がプロティナーゼとペプチダーゼを含む複合酵素であ
り、またこれらの酵素を産生して苦味を除去しうる微生
物がリゾプス・シュードキネシス（Rhizopus pseudochi
nesis）、リゾプス・フォルモサエンシス（R.formosaen
sis）、リゾプス・ペーカ（R.peka）、リゾプス・ハン
ショウ（R.hangchow）、リゾプス・ジャバニクス（R.ja
vanicus）、リゾプス・ニベウス（R.niveus）等のリゾ
プス属菌であることも併せ確認した（第２表）。

本発明は、これらの新規知見を基礎とし、更に研究の結
果完成されたものであって、リゾプス属菌が生成する複
合酵素（プロティナーゼ、ペプチダーゼ）によるペプチ
ドからの苦味除去システムに関するものである。

本発明に係る複合酵素剤を製造するには、リゾプス属菌
を培養し、培養物から酵素を取得すればよい。これらの
処理は常法によって行えばよく、例えばリゾプス属菌の
培養は、▲麩▼等を用いる固体培養法あるいは液体培養
法といった糸状菌において常用される培養技術が適宜用
いられる。

培養によって産生された酵素は常法によって取得するこ
とができる。つまり酵素が菌体内に産生蓄積される場合
には菌体を分離した後これを破壊した後、また菌体外酵
素の場合には培養液から酵素を抽出し、常法にしたがっ
た塩析、限外濾過、逆滲透膜、分子篩、イオン交換樹脂
等の処理を行って精製する。

このようにして得られた酵素はそのままで、あるいは乾
燥した後、酵素剤として使用する。また場合によって
は、精製することなく粗製酵素ないし粗製酵素液とし
て、粗製のまま酵素剤として使用してもよい。必要ある
場合には他の酵素を添加したり、あるいは酵素製剤上容
認される成分を常法にしたがって添加配合することも可
能である。またこれとは逆に各酵素を各々分離してお
き、必要に応じてこれを併用してもよい。

本発明の酵素剤は、蛋白質を分解して苦味を生成しない
特徴を有しているが、その特徴を明確にする為に酵素剤
中に含まれるプロティナーゼ及びペプチダーゼを各々精
製しその特性について検討を行なった。なお、用いた酵
素粉末ペプチダーゼはプロティナーゼ１単位当り24.3単
位混在していた。

（１）プロティナーゼの特性 酵素粉末を酢酸緩衝液（pH4.0）に溶解後、ペプチダー
ゼを失活させる為に50℃で30分間加温を行ない、その後
透析を行なった。リン酸緩衝液（pH7.0）にて緩衝化し
たDEAEセファロースに吸着させ、洗浄後NaClにて濃度勾
配法で溶離をし、活性画分を分取し分子量10,000分画の
限外濾過膜にて濃縮し精製した。

この標品の夾雑ペプチダーゼはプロティナーゼ１単位当
り0.016単位であり約1500倍純度が上がった。

得られた標品を用いて酸カゼインの分解を行い、ペプチ
ダーゼ活性を多く含むカビ起源の市販酵素剤である「プ
ロテアーゼＰ」（天野製薬（株）製）と、分解物の分子
量分布の比較を行なった。分子量分布の結果を第１図に
示した。この図面から明らかなように、ペプチダーゼを
含まない本発明の酵素剤に含まれるプロティナーゼ
（Ｂ）は、ペプチダーゼを多く含む市販酵素剤（Ａ）よ
り蛋白質をより低分子化する作用が強い事が判る。

（２）ペプチダーゼの特性 酵素粉末を精製水に溶解し透析をした後、リン酸緩衝液
（pH8.0）にて緩衝化したDEAEセファロースカラムに吸
着させ、洗浄後NaClにて濃度勾配法で溶離を行なった。
活性画分を分取し、その後プロティナーゼを失活させる
為にpH9.0で50℃、30分加温処理を行い、透析後エバポ
レーターで濃縮し精製した。

この標品の夾雑プロティナーゼはペプチダーゼ１単位当
り換算で約3000倍純度が上がった。

このペプチダーゼ（リゾプス・ハンショウNo.3545菌ペ
プチダーゼ）の酵素的性質に関して、至適pH、pH安定
性、至適濃度、温度安定性について検討を行い、第２図
の結果を得た。この結果から明らかなように、この酵素
は、pH及び温度安定性にすぐれ、至適pH及び至適温度域
も広くて、使用しやすい酵素であり工業的用途に適して
いることが判る。

次に、得られた標品を用いて、苦味の消去実験を行なっ
た。

市販酵素剤である「プロテアーゼＡ（天野製薬（株）社
製）」を用いて酸カゼインを分解し、苦味を生成させた
後、本標品を4000単位添加し45℃で３時間反応した結
果、ペプチダーゼ無添加では（＋２）の苦味であったの
が本ペプチダーゼを添加した場合は苦味が無くなった。

以上記したように、本発明の酵素剤に含まれるプロティ
ナーゼは蛋白質を低分子化する作用が強く、また同時に
含まれるペプチダーゼは苦味を消去する作用が強いとい
う特色を持っており、その両者の作用で蛋白質を高度に
分解しても従来検討されてきた酵素剤に比較して、苦味
の生成が無い理由であろうと考えられる。

本発明に係る複合酵素剤を蛋白質に作用させれば、苦味
のない蛋白分解物つまりペプチドを直接得ることができ
る。処理対象蛋白質としては、カゼインその他の乳蛋
白、魚肉蛋白、畜肉蛋白等の動物性蛋白；大豆蛋白、小
麦蛋白、米蛋白、落花生蛋白、菜種蛋白、ヒマワリ蛋白
等の植物性蛋白；酵母蛋白等の微生物蛋白その他すべて
の蛋白が単用又は併用できる。

これらの蛋白質は、変性したものでも未変性のものでも
よいし、精製されたものでも粗製のものでもよく、また
更に不純物を多く含んだ例えば豚肉の煮汁のようなので
もよい。

また、本発明に係る酵素剤は、これを、他の酵素によっ
て製造した苦味を有するペプチドに作用させれば、これ
から苦味を除去することができる。

酵素剤を作用させる条件については格別の限定はなく、
通常、蛋白ないしペプチド濃度として約１〜30％、温度
は30〜58℃程度が適当であって、酵素濃度は酵素力価及
び基質濃度等によって適宜選択すればよい。

以下、本発明を試験例及び実施例により更に詳しく説明
する。

試験例１ （蛋白質の部分分解における苦味生成の比較実験） ５％酸カゼイン溶液（pH7.0）に市販酵素剤（天野製薬
（株）製）及び本発明の菌株よりえられた粗製酵素を添
加し、45℃で１時間反応させた分解率15％の部分分解溶
液を得、苦味を官能試験して第３表の結果を得た。

分解率は反応液を酢酸でpH4.6に調整し可溶画分をケル
ダール定量し、全体に対する比率として表わした。又、
苦味の判定はカフェインによる苦味を指標として、カフ
ェイン濃度0.10％の苦味を（＋５）、0.08％を（＋
４）、0.06％を（＋２）、0.02％を（＋１）そして苦味
無しを（０）と表示した。

第３表の酸カゼインの部分分解物の苦味試験の結果から
も明らかなように、市販酵素剤での酸カゼイン分解液は
苦味があったが、本発明の菌株の産生する酵素での分解
液は、苦味が無かった。

試験例２ （蛋白質の高度分解における苦味生成の比較試験） ５％酸カゼイン及び５％大豆蛋白溶液（pH7.0）に市販
酵素剤及び本発明により得られた粗製酵素を蛋白質1g当
りプロティナーゼ活性で300単位添加し、45℃で16時間
反応した。苦味を官能試験して第４表の結果を得た。

第４表の各種蛋白質の高度分解における苦味生成の比較
実験結果からも明らかなように、市販酵素剤による分解
液は苦味があったが、本発明の酵素による分解液は苦味
が酸カゼイン、大豆蛋白とも無かった。

試験例３ （苦味の消去実験） ５％酸カゼイン（pH7.0）に「プロテアーゼＡ」、「プ
ロテアーゼＰ」、「プロテアーゼＳ」、「プロレザー」
及び「パンクレアチン」（各々天野製薬（株）製）を酸
カゼイン1g当りプロティナーゼ活性で200単位添加し、4
5℃で16時間反応した。反応液の苦味を官能試験した結
果、（＋５）から（＋２）の苦味であった。各々の分解
液に本発明の酵素をペプチダーゼ活性として、酸カゼイ
ン1g当り2000単位、4000単位、8000単位添加し、45℃に
て３時間反応した結果、第５表に示した様に顕著な苦味
の消去が認められた。

（実施例１） ▲麩▼180gに水を150ml添加し殺菌後、Rhizopus pseudo
chinesis IMA 6042の種麹を接種し25℃で４日間培養し
た。培養後得られた麹に20mM、pH7、リン酸バッファー
を500ml加え、低温室にて一夜抽出を行い300mlの粗製酵
素液を得た。遠心分離後、凍結乾燥を行い酵素粉末3.6g
を得た。

この粉末の酵素活性はプロティナーゼ125u/gであり、ペ
プチダーゼは37500u/gであった。

（実施例２） グルコース0.5％、大豆蛋白2.0％、ポリペプトン0.2
％、酵母エキス0.2％、リン酸二カリウム0.1％、硫酸マ
グネシウム0.05％の組成の培地100mlにRhizopus javani
cus No.3553の胞子を接種し30℃で３日間振とう培養を
行なった。遠心分離により菌体分離をし、酵素溶液を得
た。この溶液の酵素活性はプロティナーゼ2.4u/ml、ペ
プチダーゼ20.4u/mlであった。

（実施例３） ▲麩▼1800gに水を1500ml添加し殺菌後、Rhizopus hang
chow No.3545の種麹を接種し30℃で３日間培養した。得
られた麹に20mM、pH7リン酸バッファーを10を加え低
温室にて一夜抽出を行い7350mlの粗製酵素液を得た。遠
心分離後、ホローファイバー（旭化成（株）AIL−101
0）を用いて濃縮を行なった後、凍結乾燥をし酵素粉末1
5.5gを得た。この粉末の酵素活性はプロティナーゼ2100
u/gであり、ペプチダーゼは93500u/gであった。また、
活性収率は各々68％、61％であった。

（実施例４） 「酸カゼインの分解」 ５％酸カゼイン溶液（pH7）90mlに「実施例３」で得た
酵素粉末640mgを10mlの精製水に溶解した酵素液を添加
し（酸カゼイン1g当りプロティナーゼ活性で300単
位）、45℃にて16時間静置反応した。反応後100℃で10
分間加熱した後、遠心分離を行い清澄な溶液を得た。こ
の溶液について苦味を官能試験で測定したところ、苦味
は無かった。またファルマシア社製FPLCシステム（カラ
ム；スーパーロース12）を用いて、分子量分布を分析し
た結果を第３図に示したが、ほとんど分子量1000以下の
ペプチド及びアミノ酸であった。

（実施例５） 「大豆蛋白の分解」 ５％大豆蛋白溶液（pH7）1000mlに「実施例３」で得た
酵素粉末7.1gを添加し、45℃にて17時間攪拌しつつ反応
した。反応後100℃で10分間加熱した後遠心分離を行い
清澄な液を得、ついで凍結乾燥を行い42.5gの微黄色の
粉末を得た。この粉末について苦味を官能試験した結
果、苦味は無かった。また「実施例４」と同様に分子量
分布を分析した結果を第４図に示したが、ほとんど分子
量1000以下のペプチド及びアミノ酸であった。

（実施例６） 「肉煮汁の分解」 豚肉の煮汁（蛋白質濃度10％）1000mlに「実施例３」で
得られた酵素粉末を480mg添加した後、55℃で４時間反
応した。反応後酵素の失活と殺菌の目的で100℃で10分
間加熱後、官能試験したところ苦味は感じられなかっ
た。

（実施例７） 「苦味の消去」 ５％酸カゼイン溶液（pH7）90mlに「プロテアーゼＰ−
１」（天野製薬（株）製）90mgを10mlの精製水に溶解し
た溶液を添加し（酸カゼイン1g当りプロティナーゼ活性
で200単位）、45℃にて16時間静置反応した。反応後
「実施例３」で得られた酵素粉末を190mg添加し（酸カ
ゼイン1g当りペプチダーゼ活性として4000単位）、45℃
で５時間更に反応した。反応後加熱処理を行なった後、
苦味を官能試験した。その結果、本発明の酵素添加前の
溶液は＋４の苦味であったが、酵素添加処理後は苦味は
無かった。

なお本明細書において、酵素活性及び分子量分布の測定
は、それぞれ次のようにして行った。

酵素活性測定法 1.プロティナーゼ 0.75％ミルクカゼイン（メルク社製）を基質として37℃
で反応し、0.4モルのトリクロロ酢酸を反応液と等量添
加し、濾紙で濾過後（東洋濾紙No.131）濾液についてフ
ォーリン試薬で発色させた。濾液1ml当り60分間に100マ
イクログラムのチロシン相当量の発色量を１単位とし
た。

2.ペプチダーゼ 0.125mMロイシン・グリシル・グリシンを基質とし（pH
7.0）、30℃にて反応しニンヒドリン法にて行なった。
１分間に１マイクロモルのアミノ酸生成量を１単位とし
た。

分子量分布の測定法 ファルマシア社製「スパーロース12」ゲル濾過用カラム
を用いた。なお分子量の標準としては、25000はキモト
リプシノーゲン、12300はチトクロームＣ、6500はトリ
プシンインヒビターをまた1450はバシトラシンを用い
た。

（発明の効果） 本発明は、リゾプス属菌は産生するプロティナーゼ及び
ペプチダーゼを有効成分とする酵素剤を開発することに
はじめて成功したものであって、本発明による各種蛋白
質から苦味のないペプチドを直接製造することができる
ほか、他の酵素によって生成した苦味を有するペプチド
から苦味を除去することもできる。

このように本発明によれば苦味のないペプチドを効率よ
く調製することができるので栄養性その他の有用性を有
するペプチドであっても苦味を有するが故に自由に使用
することができなかった飲食品、経口投与剤、栄養剤、
飼餌料等にも広く利用することができ、ペプチドの用途
が飛躍的に拡大される。

その具体的例としては、医療食、経腸栄養剤、乳児食、
低アレルギー育児粉乳、バランス栄養食、健康食品、機
能性食品といったヒト用の栄養源のほか、飼料、餌料、
培地用ペプトンといったヒト以外の栄養源が挙げられ
る。したがって本発明によれば、ペプチドを投与して
も、乳幼児や病弱者が苦味の故にこれを吐き出してしま
うというようなこともなくなり、人類の健康や医療に本
発明は大いに寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は酸カゼイン分解物の分子量分布を図示したもの
であるが、（Ａ）はプロテアーゼＰによる分解物、
（Ｂ）は本発明のプロティナーゼによる分解物の分子量
分布を図示したものである。第２図はRhizopus hangcho
w No.3545菌由来のペプチダーゼの酵素的性質を図示し
たものである。 第３図及び第４図は、酸カゼイン分解物及び大豆蛋白質
分解物の分子量分布をそれぞれ図示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/58 Ｃ１２Ｒ 1:845） (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:845） (72)発明者 宿野部 幸孝 埼玉県川越市古谷上6083―８、Ｂ２―205 (56)参考文献 特開 昭48−52967（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リゾプス属菌が生産し、苦味のないペプチ
   ドを生成することのできる、プロティナーゼ及び下記の
   理化学的性質を有するペプチダーゼを含む複合酵素を有
   効成分とするペプチド製造用酵素剤。 ペプチダーゼの理化学的性質 1.苦味のないペプチドを生成する。 2.至適pHは６〜８である。 3.pH7.0、60分の至適温度は35〜47℃である。 4.37℃、60分、pH5以上で80％以上の残存活性を示す。 5.pH7.0、60分、50℃以下で90％以上の残存活性を示
   す。