JPH0375552A

JPH0375552A - 酵素電極

Info

Publication number: JPH0375552A
Application number: JP1211907A
Authority: JP
Inventors: Isao Taniguchi; 功谷口; Koichi Takizawa; 滝澤　耕一
Original assignee: Omron Corp; Omron Tateisi Electronics Co
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1989-08-17
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1991-03-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、検体中の生化学物質の濃度を酵素反応を利
用して電気的に測定するための酵素電極に関する。

（ロ）従来の技術従来、検体中の生化学物１ｆ濃度を測定するのに、この
生化学物質を基質とする酵素を利用して、生化学物質と
酵素との反応生成物の濃度を電気的に測定す、る、いわ
ゆる酵素電極が用いられている。

この酵素電極は、アンペロメトリック型とポテンショメ
トリック型の２種類に大別することができる。

アンペロメトリック型の酵素電極は、作用電極、対照電
極を有し少なくとも作用電極感応部に固定化酵素膜を装
着したものである。この酵素電極は：電極間に所定の電
圧を印加した状態で検体中に浸漬し、酵素反応に伴う電
流変化を検出して、測定対象の生化学物質の濃度を知る
ものである。

一方、ポテンショメトリック型の酵素電極は、電極とイ
オン選択膜とを有し、イオン選択膜の検体側に固定化酵
素膜を形成してなるものであり、酵素反応に伴うイオン
濃度変化を電極間の電位差として検出し、検体中の生化
学物質の濃度を知るものである。現在、イオン選択膜と
してガラスを用いたものが市販されている。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記アンペロメトリック型の酵素電極は、以下に列記す
る問題点を有している。

■作用電極感応部に対して対照電極感応部は一定面積以
上なければ安定した電流変化が得られない。

また、汚れによる感応部面積の減少に対処するためにも
、ある程度以上の電極感応部面積が必要である。従って
、酵素電極の小型化が困難である。

■固定化酵素膜あるいは電極など高インピーダンス部分
を通して信号を取り出しているため、その信号が小さく
、外来ノイズや高人力抵抗による障害を受けやすい。こ
のため、測定回路にこれら障害を除去する手段が要求さ
れ、また酵素電極に定電圧を印加する機能も必要である
ので、測定回路が複雑化する。

■検体中の干渉物質を排除する選択性透過膜が必要であ
り、作用電極の構造が複雑化し、その製作も困難となる
。

■生化学物質濃度の測定可能な範囲が狭い。

■測定回路に電源を投入してから、酵素電極の出力（バ
ックグラウンド）が安定するのに要する時間（エージン
グ）が長い。

一方、従来のポテンショメトリック型酵素電極は、以下
に列挙する問題点を有している。

■イオン選択膜が必要で、その検体側にさらに固定化酵
素膜を設けているから、やはり構造が複雑で、製作が困
難である。

■応答が遅く、電極出力にドリフトが生しる。

■使用耐久性が低く、実用性に欠ける。

■生化学物質濃度の測定可能範囲が狭い。

この発明は上記に鑑みなされたものであり、小型化、高
性能化、製作容易化等を図った酵素電極の提供を目的と
している。

（ニ）課題を解決するための手段及び作用上記課題を解
決するため、この発明の酵素電極は、少なくとも１対の
電極と、これら電極間を橋絡する導電性有機高分子膜と
、この導電性有機高分子膜上に形威され、検体中の生化
学物質と反応する酵素を固定化した固定化酵素膜とを備
え、この固定化酵素膜内での酵素反応の生成物により、
前記導電性高分子膜が酸化又は還元されて、その導電率
が変化するものであり、この導電率の変化をとらえて検
体中の生化学物１１８度を知ることができる。

この発明の酵素電極では、電極出力は電極間隔（ギャッ
プ）によって決まり、電極面積に依存しないので、電極
の小型化を図ることが可能となる。

また、この酵素電極は、電流計測でも電位差計測でもな
く、導電率を検出するものであり、アンペロメトリック
型、ポテンショメトリック型の測定性能上の問題点を解
消することができる。

さらに、イオン選択性膜、選択性透過膜が不要であり、
電極の構成が簡単となり製造が容易であると共に、耐久
性も向上する。

（Ａ）実施例この発明の一実施例を図面に基づいて説明する。

この実施例は、この発明をグルコース測定に適用したも
のであり、第１図は実施例酵素電極１を示す図、第２図
は、同酵素電極１の製作中の一過程を示す図である。以
下、製作工程を追いながら、実施例酵素電極１を説明す
る。

まず、絶縁性の基板２を用意する（第２図参照）。

この実施例では、大きさ２０ｍｍＸ１０ｍｍのガラス板
を用いているが、基板の大きさ、材料はこれに限定され
るものではない。

次に電極金属として金（Ａｕ）薄膜３を真空蒸着により
形威しく厚さ１００μｍ）、この金薄膜３をグイシング
ソウあるいはより簡便にはカミソリ刃を用いて溝４を形
威し、２つの電極３ａ、３ｂに分離する。この溝４の幅
は約１００μｍであり、電極３ａ、３ｂ間の電気的導通
は皆無である。

これら電極３ａ、３ｂには、それぞれ銀ペースト６．６
を用いてリード線７．７が接続される。なお、電極３ａ
、３ｂを構成する金属は、金に限定されるものではなく
、適宜設計変更可能である。

さらに、電極（露出）面３ｃを定め、他を絶縁性膜５で
被覆する。この絶縁性膜５を形成するのには、基板２上
に感光性樹脂（例えば感光性ポリイミド）を塗布し、こ
れをホトマスク（図示せず）を使用して露光して現像し
、電極面３ｃ上の感光性樹脂を除去する方法、あるいは
電極面３ｃ上の部分を除いてエポキシ樹脂で被覆する方
法がある。

この実施例では、後者の方法によっており、電極面３Ｃ
の大きさは３　ｍｍ　Ｘ　６　ｍｍとしている。なお、
電極面３ｃの面積はそれほど厳密に定める必要はない。

次に、電極面３Ｃ上にポリアニリン膜（導電性有機高分
子膜）８を電解重合により形成する。使用する電解液は
、０．１モル硫酸１１あたり０．１モルのアニリンを含
むもので、この電解液中に対照電極（図示せず）と共に
第２図の電極ｌｏを浸漬し、電極面３Ｃの１　ｃ４あた
り０．５〜１．０ｍＡの一定電流となるよう、電極３ａ
及び３ｂと対照電極との間に電圧を印加する。電圧を印
加する時間は、電極面３ｃの１　ｃｔｌあたりの電荷が
０．５クローンとなるように調整する。このポリアニリ
ン膜８により、溝４の部分が満たされていることを確認
した。

さらにポリアニリン膜８上に固定化層９を形成して酵素
電極ｌが完成するわけであるが、その前にポリアニリン
膜８を形成した電極がＨ，０，の濃度に対応した電極出
力があるか否かを６１１！ｌでおかなければならない。

なぜならば、固定化層９内では、グルコースオキシダー
ゼ（ＣＯＤ）による以下の（１）式の反応が生じ、その
生成物であるＨ、Ｏ□によりポリアニリン膜８が酸化さ
れ、その導電率の変化によりグルコース濃度を知ること
ができるからである。

そこで、後述の測定系１１を用い、電極３ａ、３ｂ間に
０．２Ｖの電圧を印加して、種々の濃度のＨｚ　Ｏｚを
流入させると、第４図に示すような電極出力が得られた
。この第４図の結果より、このポリアニリン膜８を形成
した電極がグルコース濃度測定に適用できることが明ら
かとなる。

次に、ポリアニリン膜８上にグルコースオキシダーゼを
固定化して、固定化層９を形成する。リン酸緩衝液（又
は蒸留水）を溶媒として１％のグルタルアルデヒドの溶
液を調製し、このグルタルアルデヒド溶液に、グルコー
スオキシダーゼを１ｍあたり１　ｍｇ溶解した酵素溶液
を用意する。この酵素溶液中に、少なくともポリアニリ
ン膜８の部分を浸漬し、４°Ｃで一昼夜おけば、固定化
層９が形成され酵素電極１として完成する。

第３図は、この実施例酵素電極１が適用される測定系１
１を示す図である。この測定には、０．１モルリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）１２を用いており、１３はこのリン
酸緩衝液１２を貯溜する容器である。１４．１５は、そ
れぞれ窒素ガスの流入口、流入出口である。これは、リ
ン酸緩衝液１２中に窒素ガスをバブリングして、リン酸
緩衝液１２中の酸素を除くためである。

リン酸緩衝液１２は、ペリスクリックボンブ１６により
、フローライン１７を循環させることができる。フロー
ライン１７上には、リン酸緩衝液１２の流れる方向に、
試料注入口１８、反応Ｉｆ９、試料排出口２０、反応槽
２１が配設される。

反応槽１９内には、酵素電極１が、反応槽２１内には白
金よりなる対極２２及び銀／塩化銀より成る対照電極２
３が入れられている。反応槽１９．２１は、リン酸緩衝
液により電気的に接続（液路）しており、酵素電極１、
対極２２及び対照電極２３の３つの電極を用いる、いわ
ゆる三電極方式により測定が行われる。反応槽を２つに
わけたのは、単に実験上の都合によるものである。

上記酵素電極１、対極２２及び対照電極２３は、電圧を
印加したり電極出力を検出するポテンシオスタット２４
に接続されており、さらにこのポテンシオスタット２４
には、電極出力を記録するためのレコーダ２５が接続さ
れている。酵素電極１の電極３ａ、３ｂ間には先と同様
、０．２Ｖの電圧が印加され、これら画電極３ａ、３ｂ
間の電流が電極出力として記録される。

測定を行う際には、先ずリン酸緩衝液１２をフローライ
ン１７に循環させておき、酵素電極１の出力を安定させ
ておく。次に、試料注入口１８より試料をフローライン
１７に注入する。この試料は、反応槽１９内に流入し、
酵素電極１の固定化層９内で前記（１）式の反応を生じ
させる。この（１）式の反応で生じたＨｚＯｚにより、
ポリアニリン膜８が酸化されてその導電率が変化し、そ
れに伴って電極出力も変化する。

電極出力の変化が得られたならば、試料排出口２０のコ
ックを操作し、試料を排出させる。試料が排出されたな
らば、再び試料排出口２０を閉じ、リン酸緩衝液がフロ
ーライン１７を循環するようにされる。この間、酵素電
極１は循環するリン酸緩衝液で洗浄されると共に、電極
３ａ、３ｂ間に印加される電圧（０，２Ｖ　）によりポ
リアニリン膜８が還元されていく。電極出力が安定した
ならば、次の測定を行うことができる。

第５図は、グルコース濃度が既知の試料を用いて得られ
た電極出力（ｎＡ）を白丸（０）でプロットしたもので
あり、このプロットを結んで得られた曲線を、未知試料
のグルコース濃度を測定する際の検Ｍ線として使用する
ことができる。

なお、上記実施例では、酵素としてグルコースオキシダ
ーゼを使用しているが、他の酵素を使用して、異なる生
化学物質の濃度を測定することも可能である。また、酵
素電極の形状も上記実施例のものには限定されない。

（へ）発明の詳細な説明したように、この発明の酵素電極は、少なくとも
１対の電極と、これら電極間を橋絡する導電性有機高分
子膜と、この導電性高分子膜上に形成され、検体中の生
化学物質と反応する酵素を固定化した固定化酵素膜とを
備え、この固定化酵素膜内での酵素反応の生成物により
、前記導電性有機高分子膜が酸化又は還元されてその導
電率が変化するものであり、以下に列挙する効果を有し
ている。

■電極出力は電極間のギャップにより定まり、電極面積
に依存しないから、酵素電極を微小化できる。

■導電率の測定であるから、測定回路が簡単となり、そ
のインテリジェント化も容易である。

■アンペロメトリーではないので干渉物質の影響を受け
ることなく、またボテンショメトワーでもないので、導
電性有機高分子膜を酸化あるいは還元する強力な酸化剤
又は還元剤を除いて妨害イオンの影響を受けない。

■導電率の検出であるため、応答が速くまた測定可能な
濃度範囲が広い。

■電位差検出ではなく導電率の検出であるから、測定精
度が優れており、電極出力が安定して測定可能になるま
、での時間がきわめて短い。

■イオン選択膜、選択性透過膜が不要であり、電極の構
成が簡単で製造が容易で、耐久性に優れている。

■導電性有機高分子膜は電解重合法という簡易な方法で
、しかも限られた部分（電極面）にのみ形成することが
できるから、効率よく酵素電極を製作することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は、この発明の一実施例に係る酵素電極の
平面図、第１図６）は、同酵素電極の第１図（ａ）中１
−１における断面図、第２図（ａ）は、同酵素電極の製
作工程の一過程における平面図、第２図（ｂ）は、同酵
素電極の第２図（ａ）中■−■線における断面図、第３
図は、同酵素電極に適用される測定系を説明する図、第
４図は、同酵素電極の過酸化水素に対する特性を示す図
、第５図は、同酵素電極−のグルコース濃度に対する電
極出力を説明する図である。３ａ・３ｂ：電極、８：ポリアニリン膜、９：固定化層
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも１対の電極と、これら電極間を橋絡す
る導電性有機高分子膜と、この導電性有機高分子膜上に
形成され、検体中の生化学物質と反応する酵素を固定し
た固定化酵素膜とを備え、この固定化酵素膜内での酵素
反応の生成物により前記導電性有機高分子膜が酸化又は
還元されて、その導電率が変化する酵素電極。