JPH037589A - 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、合成ホスファチジルコリンを酵素分解する方
法、詳しくは合成ホスファチジルコリンの脱アシル化に
より、１−アシル−リゾホスファチジルコリンを得る方
法に関する。

（従来の技術） ホスホリパーゼＡｔは、系統名でホスファタイド２−ア
シルバイトラーゼとも呼ばれ、リン脂質の５ｎ−２位に
エステル結合している脂肪酸を位置特異的に加水分解す
る酵素である。

この酵素はホスファチジルコリンに比ベホスファチジル
エタノールアミンを加水分解し易く、その際ｐＨ８〜１
０に緩衝液で調整し、その緩衝液４度を５０ｍＭから２
００ｍＭの範囲にすると、この濃度によって最適ｐ）Ｉ
が変化する（Ｍ、　Ｗａｉｔｅ　＆　Ｐ、　５ｉｓｓｏ
ｎ。

１０、２３７７、１９７１）　、生体を起源とする種々
のホスホリパーゼＡ２が知られているが、この酵素によ
る分解は、いずれも、最適ｐ）Ｉ範囲とカルシウムイオ
ンを要求する条件で、水溶液とリン脂質溶液との乳化に
よる界面反応で起きる。事実、従来、次の様な酵素分解
方法が知られている。

■　エイチ・オクヤマら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
　ＩＬ　４３９２　（１９７２） ■　ド・ハラス・ジー・エイチら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１９５．１０５　（
１９６Ｂ）■　エム・カテ、脂質研究法・生化学実験法
５、ｐ２５５、東京化学同人社、１９７５、東京■　特
開昭６３−４４８９３号、「リン脂質の酵素分解法」 ■　特開昭６３−３０２９２９号、「乳化剤組成物の製
造法」 しかるに、これら従来の酵素分解方法では次の様な問題
が生じる。■の方法は、処理量が１■と少量であり工業
的に利用できない。さらに、ｐＨｊＮ整用、のトリス／
塩酸緩衝液とカルシウム供給用の塩化カルシウム溶液を
使用する乳化系反応であり、反応生成物の精製が難しい
。また、この方法は反応収率が精々８５％程度で限界が
ある。■の方法は、処理量が１■と少量である。さらに
緩衝液でｐＨ８に調整し、塩化カルシウム濃度を６ｍＭ
に調整する必要がある。そのため、この方法も乳化系反
応であり、反応生成物の精製が難しい。■の方法は、処
理量が５■と少量であり、工業的に利用できない。さら
に、ｐＨ１１整用のホウ酸緩衝液とカルシウム供給用の
酢酸カルシウム溶液を使用する乳化系反応であり、反応
生成物の精製が難しい。また、この方法は反応収率が低
く、未反応リン脂質から遊離脂肪酸とりプリン脂質を分
離しなければならない。■の方法は、リン脂質またはリ
ン脂質と油脂の混合物に０．１〜１．０重量部の水を加
えた乳化系反応であり、脱水が難しい。しかも、この水
にはｐＨ１１整用の緩衝液とカルシウム供給用の塩化カ
ルシウムを添加する必要がある。■の方法は、リン脂質
と油脂の混合物に分解酵素としてホスホリパーゼＡ２と
リパーゼを使用し、反応時にｐＨ調整用の水酸化ナトリ
ウム溶液とカルシウム供給用の塩化カルシウム溶液を使
用する乳化系反応であり、反応収率が低く反応生成物の
精製が難しい。

（発明が解決しようとする課題） 本発明では、工業的に大量生産が可能な合成ホスファチ
ジルコリンの酵素分解による１−アシル−リゾホスファ
チジルコリンの合成法を検討した。

工業的な生産方法に拡大するには、従来法では次のよう
な三つの問題点がある。第−点は、リン脂質を溶解した
有機溶媒と水溶液との界面反応であり、単位容積光たり
の反応面積を保持するため、反応中は激しい撹拌を続け
る必要があり、それでも反応収率は８０〜９０％程度で
、収率に限界があることである。第二点は、反応生成物
のリゾリン脂質が強い親水性界面活性を示すため、反応
液からの脱水に際し、リゾリン脂質が水中にミセルとし
て可溶化し、リゾリン脂質の収量が低下することである
。第三点はリン脂質が含水系で発泡性を示すため、反応
液からの減圧脱水に際し、著しい発泡現象が生じて脱水
が面倒である。

また、従来法は水溶液としてｐＨ調整用の緩衝液やカル
シウム供給用の塩類溶液を使用するため、次のような二
つの′問題点がある。第−点は上記の水溶液に用いる無
機物質が反応生成物に混入することである。反応規模を
拡大すると、この混入物の処理工程が必要となるが、現
在、リン脂質中に混入する無機物質の効率良い除去方法
は確立されていない。第二点は、カルシウム塩溶液を用
いた大量の分解反応では、水に可溶でクロロホルム／メ
タノール系溶媒に不溶な物質が、反応生成物中にしばし
ば出現することである。この物質はリゾリン脂質と水に
対する挙動が類似しているため、反応生成物中から除去
することが難しい。

即ち、本発明の目的は、上記課題を解決し、合成ホスフ
ァチジルコリンから、１−アシル−リゾホスファチジル
コリンを、酵素分解方法を用いて収率よく製造し、しか
も反応生成物の精製が容易な工業的製法を提供すること
である。

（課題を解決するための手段） 本発明の酵素分解方法は、合成ホスファチジルコリンを
ホスホリパーゼＡ２酵素を用いて加水分解する際に、ア
ルミナ処理したエーテル、炭化水素、エステルの群から
選ばれる有機溶媒に０．０１〜１容量％の水を加えた反
応液中で反応させ１−アシル−リゾホスファチジルコリ
ンを得ることを特徴とする。

本発明に−おいて用いる合成ホスファチジルコリンは、
例えばグリセロホスホコリン１モルに対して脂肪酸の無
水物または脂肪酸の酸ハロゲン化物３．５〜６モルを、
エステル化触媒の存在下に非プロトン性高極性溶媒中で
反応させることによって得られる。この反応において、
エステル化触媒はピリジン誘導体または第三アミンから
選ばれ、具体的にはジメチルアミノピリジンやトリイソ
プロピルアミン等が挙げられる。非プロトン性高極性溶
媒としては、例えばジメチルスルホキシド、ヘキサメト
キシホスホロアミドが挙げられる。また脂肪酸誘導体の
アルキル基に関し、単一種の脂肪酸を原料に使用すると
、単酸基ホスファチジルコリンが得られ、複数種以上の
脂肪酸を原料に使用すると混酸基ホスファチジルコリン
が得られる。

この合成ホスファチジルコリンの脂肪酸種が、後述する
１−アシル−リゾホスファチジルコリンの脂肪酸種を決
定する。

本発明に用いられるホスホリパーゼＡ２は、ヘビ毒由来
、ハチ毒由来、細菌由来及び牛や豚の膵臓由来の公知の
ものが何れも使用出来る。この中でもホスホリパーゼＡ
２活性の力価、酵素の価格および除去の筒便さから、豚
膵臓由来のものが好ましい。

本発明における加水分解は、例えば合成ホスファチジル
コリン１部を後述する有機溶媒１０〜５００部に溶解し
、これにホスホリパーゼＡ２を加えて行われる。酵素量
はホスホリパーゼＡ２の種類、酵素純度および力価によ
って変化するが、通常は合成ホスファチジルコリン１ｇ
に対し２〜１００■程度でよい。反応温度は、１０℃か
ら使用する有機溶媒の沸点の範囲で任意に選択できるが
、反応効率を考えると、室温から５０℃までの温度が望
ましい。また、この方法は酵素の熱安定性が良く、例え
ば豚膵臓起源のホスホリパーゼＡ２は７０℃でも活性を
示す。反応時間は酵素量や反応温度によって異なるが、
通常１〜１０時間程度である。また、従来の大量の水を
使用する界面反応においては、撹拌速度が反応進行率に
大きな影響を与えたが、本発明では通常６０〜１５０ｒ
ｐｍの低速撹拌で充分に反応が進行する。また従来のホ
スホリパーゼＡ２の反応では、反応進行にカルシウム塩
溶液やｐＨ調整用の緩衝液の添加が必要であったが、本
発明では、これらの溶液を必要としないため反応終了後
の精製も容易である。

本発明における酵素反応は加水分解反応であるため、加
水分解に必要な最少量の水の添加が望ましい。水は有機
溶媒中に０．０１〜１容量％になるように添加する。こ
の範囲の水量では、反応終了後の溶媒による再沈、乾燥
濃縮、濾過剤処理等の精製手段により容易に脱水され、
特別な脱水工程を必要としない。水の添加が０．０１容
量％未満では充分に加水分解が行われず、１容量％を超
えると、水除去に伴う反応液の発泡現象、反応生成物の
損失等を生じ、また、余分な脱水工程が必要になり、コ
ストと時間がかかってしまう。

本発明に用いられる有機溶媒は、反応の進行速度を上げ
るためにアルミナ処理してから使用する。

このアルミナには活性度■に調整したカラムクロマトグ
ラフィー用の中性アルミナが好ましい。アルミナ処理は
、有機溶媒を反応直前に、常温でアルミナを充填したガ
ラスカラムに通すだけで良い。

溶媒の種類や酵素添加量によって異なるが、アルミナ処
理溶媒での反応は、溶媒中に不溶性のりゾホスファチジ
ルコリンの出現時間が早くなることが観察される。例え
ば、ジオキサンを反応溶媒とした反応例では、処理溶媒
中に反応開始１０分後にリゾホスファチジルコリンによ
る濁りが生じたが、未処理溶媒中では３０分〜２時間経
過後に濁りが生じていた。有機溶媒のアルミナ処理で、
水分や硫黄、またホスホリパーゼＡ２の活性を抑制する
因子が除去される。

本発明に用いられる有機溶媒は、エーテル、炭化水素、
エステルの群から選ばれる。具体例としては、エーテル
としてジエチルエーテル、イソプロピルエーテル ン等、炭化水素としてｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン、石
油エーテル、シクロヘキサン等、エステルとして酢酸メ
チル、酢酸エチル等が挙げられる。

これら有機溶媒は非イオン性無極性溶媒であり、酵素は
これら溶媒との接触により活性が低下しない。また基質
であるホスファチジルコリンを溶解することが出来、酵
素が溶解している水層と攪拌により微小界面を形成し反
応を進行させることが出来る。この溶媒中で反応物のり
ヅホスファチジルコリンは微少の水層に移行し、恰もこ
の水は相間移動触媒の役割を果たすことが出来る。これ
ら以外の有機溶媒では、例えば、ハロゲン化炭化水素や
アプロチックな非イオン性極性溶媒では酵素の活性が発
揮出来ない。ジクロルエタン、クロロホルム等のハロゲ
ン化炭化水素中では酵素が失活する。メタノール、エタ
ノール等は酵素の阻害剤であり、アセトン、アセトニト
リル、ジメチルスルホオキサイド、ジメチルホルムアミ
ド等の非イオン性極性溶媒は蛋白質である酵素を一部溶
解し、酵素の構造を変化させ活性を失わせる恐れがある
。

反応終了後は、エーテル洗浄とアセトンによる再沈、乾
燥濃縮、濾過助剤による脱酵素等の公知の精製手段によ
り容易に目的物が単離出来る。−船釣には理論収率は８
５％以上、特に反応溶媒と酵素量の選択により理論収率
は９０％と極めて良好である。

（作用） 従来のホスホリパーゼＡ２を使用する界面反応では、ホ
スホリパーゼＡ！の窒素末端の疎水性部分が基質の界面
と結合して加水分解が進行する。

一方、本発明においては、基質とホスホリパーゼＡｔの
疎水性部分が有機溶媒に溶解し均−系に近い反応で進行
し、その際、ホスホリパーゼＡ２の活性は有機溶媒中で
も保持される。また、微量に加えられた水は有機溶媒中
に分散される。

（発明の効果） 本発明によれば、下記のような効果が得られる。

（１）　　温和な反応条件で高収率並びに高純度で目的
化合物が製造できる。

（２）　　反応液中に無機物を添加しないため、反応生
成物の精製が容易である。

（３）　　水添加量が微量なため、水除去に伴う反応液
の発泡現象、反応生成物の損失、エネルギーの大量消費
が防止出来る。

（４）　　有機溶媒中の均−系に近い反応のため、溶媒
の種類によって反応の進行に伴い生成物が容器の底部に
堆積し、反応状況が肉眼で観察出来る。

以上の効果により、本発明方法は１−アシル−リゾホス
ファチジルコリンの工業的製造法として極めて好適であ
る。

（実施例） 以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。尚、
各例中、％は重量基準である。

参考例 反応溶媒のアルミナ処理 シグマ社製のカラムクロマトグラフィー用アルミナ（活
性度Ｉ、タイプＷ　Ｎ　−３：　Ｎｅｕｔｒａｌ）５０
０ｇを１１０℃の恒温槽で２時間乾燥し、水分２％以下
とした。このアルミナ１４０ｇを内径４ｃｍのガラスカ
ラムに充填した。充填容積は１２５ｃｍ’であった。反
応に用いる有機溶媒は、反応直前に常温で上記アルミナ
カラムを５９ｄ／ｍｉｎの流速で通した。

実施例１ ナス型フラスコ中に、化学合成したジパルミトイルホス
ファチジルコリン１ｇ１エチルエーテル１５〇−及び豚
膵臓起源のホスホリパーゼＡ　ｚ　（Ｎｏｖ。

Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ製、　Ｌｅｃｉｔａｓｅ　ｌ
０Ｌ）の１．５ｍｆｆ１　（ホスホリパーゼＡｇ７５ｍ
ｇ）を添加し、撹拌子で緩やかに撹拌しながら蒸留水を
数滴加えた。室温で１０時間おいた。経時後、エチルエ
ーテルをデカンテーションで除去し、新しいエチルエー
テル１４０ｄを加えて撹拌し、再度、デカンテーション
でエチルエーテルを除去し、さらに冷アセトンＩＯＭで
２回撹拌とデカンテーションを繰り返し、粗生成物を乾
燥濃縮した。この濃縮物をクロロホルム・メタノール同
量混液１００−に溶解し、この溶液中に濾過助剤（ダイ
カライド・オリエント社製、商品名ダイカライド・パー
ライト）Ｉｇを添加し、撹拌後、濾過して、その母液を
蒸留乾燥して０．６６ｇ【収率９５％）の白色粉末を得
た。

白色粉末の分析値は下記の通りであった。

■　ＴＬＣ メルク社製Ｔ　Ｌ　Ｃ（Ｐｌａｔｅｓ　５ｉｌｉｃａ　
Ｇｅｔ　６０）　２０Ｘ２Ｑａａ、厚さ０．２５鶴、展
開液：クロロホルム／メタノール／水　６５／２５／４
　（ｖ／ｖ／ｖ）　Ｒｆ（！０．１１、発色剤：２’＋
７’−ジクロロフルオレラセン試薬　橙色、ディトマー
レスター試薬　青色■　ＴＬＣ−ＦＩＤ（イヤトロスキ
ャン法）展開液：ＴＬＣと同様 １−バルミトイル−リゾホスファチジルコリン（以下、
ＬＰＧと略記）９６％ 不明　　　　　　　　　　　　　　　　　　４％■　Ｆ
ＡＢ−ＭＳ （Ｐｏｓ、）、　Ｔ　Ｅ　Ａ　ＣＭ　＋　Ｈ）”　：　
４９６〔バルミトイルＬ　Ｐ　Ｇ　＋　Ｈ）”　：　４
９６（Ｎｅｇ、）、ＴＥＡ　ＣＭ−Ｈ）　：　２５５（
Ｃｌｓ　Ｈ３１ＣＯＯ−）即ちパルミチン酸−二２５５
実施例２ ナス型フラスコ中に、化学合成したジオレイルホスファ
チジルコリン１ｇ１エチルエーテル４００−およびヘビ
毒起源のホスホリパーゼＡ！（シグマ社製、Ｃｒｏｔａ
ｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）２０ｍｇを添加し、撹
拌子で緩やかに撹拌しながら蒸留水を数滴加え、キャッ
プで密栓し３７℃で２時間反応させた。後の処理は実施
例１に従い、０．６２ｇ　（収率９４％）の黄色油状物
を得た。

黄色油状物の分析値は下記の通りであった。

■　ＴＬＣ 実施例１と同様の結果であった。

■　ＴＬＣ−ＦＩＤ　（、イヤトロスキャン法）展開液
：ＴＬＣと同様 Ｌ　Ｐ　０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９７
％不明　　　　　　　　　　　　　　３％■　ＦＡＢ−
ＭＳ （Ｐｏｓ、）、　Ｔ　Ｅ　Ａ　（Ｍ　＋　Ｈ）”　：　
５２２（オレオイルＬＰＧ＋Ｈ）ゝ：５２２ （Ｎｅｇ、）、　Ｔ　Ｅ　Ａ　（Ｍ　−Ｈ）　：　２８
１（Ｃ＋ｙＨ３２ＣＯＯ−）即ちオレイン酸−；２８１
実施例３ 実施例１の反応溶媒をｎ−ヘキサン１００ｍｆ、豚膵臓
起源のホスホリパーゼＡ２を２．　Ｑ　ｍｌに変更し、
以下同様に操作し０．６８ｇ（収率９８％）の白色粉末
を得た。

白色粉末の分析値は下記の通りであった。

■　ＴＬＣ 実施例１と同じ条件 Ｒｆ値：０．１３に強＜　、０．５３に弱い発色が認め
られた。

■　ＴＬＣ−ＦＩＤ　（イヤトロスキャン法）展開液：
ＴＬＣと同様 Ｌ　Ｐ　Ｇ　　　　　　　　　　　　　９３％ホスファ
チジルコリン　　　　　５％ 不明　　　　　　　　　　　　　２％ ■　ＦＡＢ−ＭＳ （Ｐｏｓ、）、　Ｔ　Ｅ　Ａ　ＣＭ　＋　Ｈ）”　：　
４９６（強）と７３３（弱）〔バルミトイルホスファチ
ジルコリン＋Ｈ）”　：　７３３以上の結果から、収率
の高い理由は未分解の微量のホスファチジルコリンが反
応生成物に存在するためと思われる。

実施例４ 実施例１のジパルミトイルホスファチジルコリンをシリ
ルイルホスファチジルコリン、反応溶媒をジオキサン２
００ｍ１に変更して、キャップで密栓し５０℃で５時間
反応させた。後の処理は実施例１に従い０．７１ｇ　（
理論収率以上）の濃黄色油状物を得た。

濃黄色油状物の分析値は下記の通りであった。

■　ＴＬＣ 実施例１と同じ条件 Ｒｆ値：０．１３に強＜　、０．５５に弱い発色が認め
られた。

■　ＴＬＣ−ＦＩＤ（イヤトロスキャン法）展開液：Ｔ
ＬＣと同様 ＬＰＧ　　　　　　　　　　　　　９０％ホスファチジ
ルコリン　　　　　７％ 不明　　　　　　　　　　　　　　３％■　ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ （Ｐｏｓ、）、　Ｔ　Ｅ　Ａ　（Ｍ　＋　Ｈ）”　：　
５１９（強）と７８３（弱）（リルイルホスファチジル
コリン＋Ｈ〕”ニア８３以上の結果から、収率が理論量
を越えた理由は未分解の少量のホスファチジルコリンが
反応生成物に存在するためと思われる。

実施例５ 実施例１の反応溶媒を酢酸エチル５０−に変更し、以下
同様に操作し、０．７４ｇ（理論収量以上）の白色粉末
を得た。

白色粉末の分析値は下記の通りである。

■　ＴＬＣ 実施例１と同じ条件 Ｒｆ値：Ｏ，ＸＯに強＜　、０．５２に弱い発色が認め
られた。

■　ＴＬＣ−Ｆ■Ｄ　（イヤトロスキャン法）展開液：
ＴＬＣと同様 Ｌ　Ｐ　Ｇ　　　　　　　　　　　　　８６％ホスファ
チジルコリン　　　　　１１％不明　　　　　　　　　
　　　　　３％■　ＦＡＢ−ＭＳ （Ｐｏｓ、）、ＴＥＡ　（Ｍ＋Ｈ）　”　　：４９６（
強）と７３３（弱）〔バルミトイルホスファチジルコリ
ン 以上の結果から、収率が理論量を越えた理由は未分解の
少量のホスファチジルコリンが反応生成物に存在するた
めと思われる。

比較例１ ナスフラスコ中に、化学合成したジパルミトイルホスフ
ァチジルコリン１ｇ１エチルエーテル／エタノール溶液
（９５１５　ｖ／ｖ）　１５０ａ＋ｆｆｉ、ハブ毒（日
本蛇族学術研究所製）２０■を溶解した０．０５Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）１０ｍｆ、１０ｍＭの
塩化カルシウム水溶液３０−を添加し、撹拌子で激しく
撹拌しながら、３７℃で２時間反応させた。減圧下に溶
媒を留去し、さらに連続的に脱水を試みたが、反応液に
発泡現象が認められた。そのためベンゼン１０−を加え
ての減圧蒸留を３回繰り返して脱水した。この蒸留残香
を冷アセトン１００１ｄｌで２回撹拌とデカンテーショ
ンを行い、粗生成物７６０ｒｒｇを得た。この粗生成物
をクロロホルム／メタノール同量混液１０Ｍに溶解した
が、この溶媒に不溶な物質が出現した。この物質は脱水
前の反応溶媒には認められなかった。この粗生成物の溶
液をカラムクロマト用シリカゲル（フナコシ薬品製、商
品名フナゲル）が充填されたガラスカラム（３Ｘ３０ａ
ａ、充填量９０ｇ）に注入した。溶離溶媒はクロロホル
ムとメタノールを４対１に混合し、３ｍ１７ｍ＋ｎで通
液し、ＴＬＣで脂肪酸とホスファチジルコリンの流出を
確認後、メタノール比率を高めて、最終的には１対１で
ＬＰＧを溶出した。ＬＰＧの収量は５４１■で理論収量
は８０％であった。

以上のように従来法では厳しい反応条件が要求され、さ
らに反応生成物の脱水や精製に特別な工程が必要である
。

比較例２ 実施例４の反応条件のうち、ジオキサンのみをアルミナ
未処理ジオキサンに変えた。反応開始４０分後、反応溶
媒中に反応生成物による濁りが生じ始めた。処理溶媒で
は反応開始１０分後に濁りが生じていた。

以上の様にアルミナ未処理の反応溶媒では実施例４に比
較して反応の進行速度が遅い。

以上の結果より、合成ホスファチジルコリンは微量水分
を含むアルミナ処理の有機溶媒中でホスホリパーゼＡ２
により効率良く加水分解され、１−アシル−リゾホスフ
ァチジルコリンに変換され、その反応生成物の精製も容
易であることが判明した。特に反応溶媒や酵素の選択条
件によって９０％以上の理論収量で、純度９０％以上の
１−アシルリゾホスファチジルコリンが製造出来る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 合成ホスファチジルコリンをホスホリパーゼＡ＿２酵素
   を用いて加水分解する際に、アルミナ処理したエーテル
   、炭化水素、エステルの群から選ばれる有機溶媒に０．
   ０１〜１容量％の水を加えた反応液中で反応させ１−ア
   シル−リゾホスファチジルコリンを得ることを特徴とす
   る合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法。