JPH0378106B2

JPH0378106B2 -

Info

Publication number: JPH0378106B2
Application number: JP22068483A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Inoe; Yoshiharu Kimura; Kazuhiko Sato
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1983-11-25
Filing date: 1983-11-25
Publication date: 1991-12-12
Also published as: JPS60114187A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はミコバクテリウム属に属する新規な微
生物に関する。ジカルボン酸は合成樹脂、高級潤滑油、可塑
剤、香料等の製造原料として有用な物質である
が、合成法により製造されていたジカルボン酸は
炭素数にも限度があり、炭素数12個以上のジカル
ボン酸を製造することは困難であつた。そこで近
年、微生物を利用した発酵法によるジカルボン酸
の製造法が注目されてきた。従来、微生物によるジカルボン酸の製造法とし
てはキヤンデイダ（Candida）属（特公昭50−
19630号等）、ピキア（Pichia）属（特公昭45−
24392号等）等の酵母によるものが多く、細菌に
よるものではコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属（特公昭56−17075号等）
しか見出されていなかつた。特に45℃付近で培養
できる菌は皆無であつた。そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑み、ノ
ルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を対
応するジカルボン酸に変換する能力を有する菌を
自然界より広く検索した結果、ミコバクテリウム
（Mycobacterium）属に属する微生物の中に斯か
る能力を有するものがあることを見出し、本発明
を完成した。すなわち、本発明はミコバクテリウム属に属
し、ノルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導
体を資化してジカルボン酸を生産する能力を有す
る新規なミコバクテリウム・エスピー・KSM−
Ｂ−33（微工研菌寄第7310号）に関するものであ
る。次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌
学的性質を詳述する。 (a) 形態わずかに湾曲した短桿菌で、運動性はなく胞
子も形成しない。グラム染色陽性。抗酸性はあ
まり強くないが認められる。菌糸状には発育し
ない。 (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地：生育は豊富であり、淡橙色の凸状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は豊富であり、橙色のしわ状のコロニ
ーを生じる。光沢はない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、ピンク色の凸状のコ
ロニーを生じる。コロニーの周縁ははつきり
しない。 (4) スターチ寒天培地：生育は中程度であり、橙色の凸状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (5) チロシン寒天培地：生育は中程度であり、うすい橙色のコロニ
ーを生じる。コロニーの周縁ははつきりしな
い。光沢はない。 (6) 栄養寒天培地：生育は中程度であり、淡橙色の凸状のコロ
ニーを生じる。にぶい光沢がある。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、濃橙色の凸状の大
きなコロニーとなり、光沢がある。 (8) オートミール寒天培地：生育は豊富であり、橙色のしわ状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度23〜51℃（最適35〜50℃） PH2.8〜9.3（最適5.3〜8.5） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：± イノシトール：− Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニトール：± (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：＋（ガスは生成しない）ソルビトール：＋（ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso型糖：アマビノース、ガラクトース (g) ミコール酸（TLC分析）：あり (h) 抗酸性：あり (i) 分離源：土壌以下の菌学的性質を有する菌についてバージエ
イのマニユアル（Bargey ｓ Manual of
Determinative Bacteriology）第８版（1975年）
に基づいて検索した結果、本菌株はミコバクテリ
ウム（Mycobacterium）属に属する新菌株と認
め、ミコバクテリウム・エスピー・KSM−Ｂ−
33（Mycobacterium sp.KSM−Ｂ−33）と命名
した。なお、本菌株は、微工研菌寄第7310号とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパ
ラフイン含有培地を用い常法で行なつた。本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用す
る菌株が良好に生育し、ノルマルパラフイン、脂
肪酸又は脂肪酸誘導体からのジカルボン酸の生産
を順調に行なわしめるために適当な炭素源、窒素
源あるいは有機栄養源、無機塩などからなる。炭
素源としては、炭水化物（例えば、グルコース、
フラクトース、シユクロース、マンニトール等）、
有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸、脂肪酸及
びそのエステル等、炭化水素（例えば、ｎ−ドデ
カン、ｎ−ヘキサデカン等）など資化されるもの
ならばいずれも使用できる。また、窒素源あるい
は有機栄養源としては、例えば、硝酸ナトリウ
ム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩
類、酵母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられ
る。また、無機塩としては各種リン酸塩、硫酸マ
グネシウムなどが使用できる。さらに微量の重金
属塩類が使用されるが、天然物を含む培地では必
ずしも添加を必要としない。また栄養要求を必要
とする変異株を用いる場合には、その栄養要求を
満たす物質を培地に添加しなければならない。培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種
し、40〜50℃で３〜５日振盪又は通気撹拌すれば
良い。PHは6.5〜８程度に調整すると良い結果が
得られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合
には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界
面活性剤を培地に添加することも可能である。叙上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液より
分離する場合は、通常の固液分離手段が用いられ
る。このように分離された生菌体及びその処理物
（凍結乾燥菌体等）も酵素源としてもちいること
ができる。ノルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体
を反応基質として本菌株を上記の如く培養すると
ジカルボン酸が生産される。該基質は炭素数12〜
18のものが特に適当であり、脂肪酸誘導体として
は脂肪酸の低級アルキルエステルが好ましい。これらの培養液から目的物質であるジカルボン
酸の採取および精製は、一般の有機化合物の採取
および精製の手段に準じて行うことができる。た
とえば培養液から菌体等を除去したろ液もしくは
培養液そのものを酸性とし、エチルエーテル、酢
酸エチル又はクロロホルム−メタノール混液等の
有機溶媒で抽出する。この抽出物をカラムクロマ
トグラフイーあるいは再結晶などの方法を用いて
ジカルボン酸を単離することができる。以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１採取した土壌サンプル約0.5ｇを滅菌水10mlに
懸濁し充分撹拌後、この土壌懸濁液0.2mlを下記
組成の液体培地（）10ml（50ml容試験管にて）
に接種し、30℃にて４日間振盪培養を行なう。

【表】上記培養により増殖を示した培養液は、滅菌水
により適度に希釈した後、肉汁寒天培地（栄研化
学製；普通寒天培地）に移し、30℃にて２日間培
養し、生じた複数のコロニーが相互間に相異しな
いことを肉眼的及び顕微鏡的に確認できるまで、
肉汁寒天培地への移植を繰り返す。上記コロニーのうち10個のコロニーをそれぞれ
下記組成の斜面寒天培地（）に接種し、30℃で
３日間培養し、10本の斜面培地上の菌株が肉眼的
及び顕微鏡的に同一菌株であることを確認し、ま
た、これら10菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質が同一であることを確認した。

【表】上記菌株の培地上の性状及び生理学的性質は前
述した通りである。上記試験の結果、各10本の培
養菌はすべて自然界より純粋に分離された単一菌
株であることが判る。次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株から一白金耳を、滅菌した10％グリセリン水溶
液（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに懸濁
し、−80℃にて凍結保存する。かくして３ケ月凍
結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金
耳を肉汁寒天培地に蘇生後、前期と同条件下に各
培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果、
凍結前とは変化が認められなかつた。また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り
返した菌株について同様に、各培地上での性状及
び生理学的性質を調べた結果、変化は認められな
かつた。次いで、本菌株を利用してジカルボン酸を製造
した例を参考例として挙げる。参考例１パルミチン酸メチル50ｇ、リン酸二アンモニウ
ム10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウ
ム（７水塩）0.2ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）0.02
ｇ、硫酸亜鉛（７水塩）0.016ｇ、硫酸マンガン
（４〜６水塩）0.016ｇ、酵母エキス２ｇを水道水
に溶かして１にし、PHを7.0に調製した。この
液体培地５mlを50ml容振盪試験官に仕込み、120
℃で15分間蒸気滅菌した後、ミコバクテリウム・
エスピー・KSM−Ｂ−33（Mycobacterium・sp.
KSM−Ｂ−33）を一白金耳接種し、45℃で120時
間振盪培養した。培養終了後、この培養液に9N硫酸１mlを加え
PHを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：１）混液20mlで抽出した。この抽出液を減
圧下濃縮した後メタノールBF₃触媒でメチル化
し、ガスクロマトグラフイーにて生成物の定量を
行なつた。その結果、培養液１当り13mgのα、
ω−テトラデカンジカルボン酸が得られることが
わかつた。なお生成物のガス−マス（GC−MS）データ
は標品のそれと一致し、α、ω−テトラデカンジ
カルボン酸であることが確認された。参考例２パルミチン酸メチル50ｇ、リン酸二アンモニウ
ム10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウ
ム（７水塩）0.2ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エ
キス２ｇを水道水に溶かして１にし、PHを7.0
に調製した。この液体培地100mlを500ml容振盪フ
ラスコに仕込み、120℃で15分間蒸気滅菌した後、
ミコバクテリウム・エスピー・KSM−Ｂ−33
（Mycobacterium・sp.KSM−Ｂ−33）を一白金
耳接種し、45℃で132時間振盪培養した。培養終了後、この培養液に9N硫酸10mlを加え
PHを強酸性として、エチルエーテル100mlで抽出
した。この抽出液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥
した後、減圧下濃縮し、メタノール−BF₃触媒で
メチル化して、ガスクロマトグラフイーにて生成
物の定量を行なつた。その結果、培養液１当り
13mgのα、ω−テトラデカンジカルボン酸が得ら
れることがわかつた。なお生成物のガス−マス
（GO−MS）データは標品のそれと一致し、α、
ω−テトラデカンジカルボン酸であることが確認
された。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の性質を有する微工研菌寄第7310号とし
て寄託された新規なミコバクテリウム・エスピ
ー・KSM−Ｂ−33株。 (a) 形態わずかに湾曲した短桿菌で、運動性はなく胞
子も形成しない。グラム染色陽性。抗酸性はあ
まり強くないが認められる。菌糸状には発育し
ない。 (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地：生育は豊富であり、淡橙色の凸状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は豊富であり、橙色のしわ状のコロニ
ーを生じる。光沢はない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、ピンク色の凸状のコ
ロニーを生じる。コロニーの周縁ははつきり
しない。 (4) スターチ寒天培地：生育は中程度であり、橙色の凸状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (5) チロシン寒天培地：生育は中程度であり、うすい橙色のコロニ
ーを生じる。コロニーの周縁ははつきりしな
い。光沢はない。 (6) 栄養寒天培地：生育は中程度であり、淡橙色の凸状のコロ
ニーを生じる。にぶい光沢がある。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、濃橙色の凸状の大
きなコロニーとなり、光沢がある。 (8) オートミール寒天培地：生育は豊富であり、橙色のしわ状のコロニ
ーを生じる。にぶい光沢がある。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度23〜51℃（最適35〜50℃） PH2.8〜9.3（最適5.3〜8.5） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：± イノシトール：− Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニトール：± (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：＋（ガスは生成しない）ソルビトール：＋（ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso型糖：アマビノース、ガラクトース (g) ミコール酸（TLC分析）：あり (h) 抗酸性：あり。