JPH0379059B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、水性相中単層脂質顆粒の製造方法
に関する。 脂質顆粒については文献中に多くの記載が見ら
れる。この製造及び使用は多くの研究の対象とな
つている。１つの脂質二重膜を有する単層脂質顆
粒は、球状に配置された複数の脂質二重膜を有す
る多層脂質顆粒から区別される。 単層脂質顆粒は１つの球状被膜を有し、そして
例えば約200〜50000Å、好ましくは約200〜30000
Åの直径を有する。球状被膜は、脂質成分、例え
ば両親媒性脂質、例えば燐脂質、例えばホスフア
チジン酸、レシチン又はケフアリン、そして場合
によつては中性脂質、例えばコレステロールの二
重膜から成る。この二重膜は、１つの水性相から
成る内部空間を包囲している。単層脂質顆粒は
又、「小胞」とも称される。 脂質顆粒の、種々の活性物質の担体としての医
薬への使用に大きな関心が寄せられている。すな
わち、脂質顆粒は、蛋白質、例えば抗体もしくは
酸素、ホルモン、ビタミン又は遺伝子の担体とし
て、あるいは標識された化合物の担体として分析
目的への使用が提案されている。例えば、米国特
許第3993754号においては、担体として脂質顆粒
を使用する腫瘍細胞の処理による化学療法が記載
されている。 所定の活性物質は、脂質顆粒の形成の際に又は
その後拡散により封入する。脂質顆粒の形成と活
性物質の封入は種々の方法により行われ、
Carcer Treatment Reviews（1981）８、27〜50
のスタンレ−B.カイエ（St.B Keye）等の総説
「Liposomea−Problems and promise
asselective drug carriers」に記載されている。
同様に、活性物質の封入を目的とする脂質顆粒の
多くの製造方法が、バレンホルツ（Barenholz）
等によるBiochemistry、第16巻、第12号、2806
〜2810、並びに独国特許公開（DOS）第2818655
号、同第2902672号、同第2532317号及び同第
2842608号、米国特許第4053585号明細書、及びヨ
ーロツパ特許出願第36676号明細書に記載されて
いる。 例えば、脂質成分、例えば燐脂質、例えばホス
フアチジン酸、レシチン又はケフアリン、及び場
合によつては中性脂質、例えばコレステロールを
有機溶媒、例えばクロロホルム又はベンゼンに溶
解する。蒸発の後、該当する脂質成分の均質層、
例えば膜層が残留する。次にこの脂質成分を、例
えば撹拌しながら、所定の活性物質を含有する水
性層に分散せしめる。これに続く超音波処理によ
り活性物質を封入した単層脂質顆粒が形成され
る。 多くの常用法においては、単層脂質顆粒及び多
層脂質顆粒の混合物を伴なう水性相であつて、該
脂質顆粒の構造及び大きさが不ぞろいであつて、
ほとんど影響を受けず、そして著しく変化する可
能性のあるものが得られる。この発明の方法によ
れば、簡単な方法で多くの、そしてほとんど定量
的な量の単層脂質顆粒を伴なう水性相を形成する
ことができ、この脂質顆粒には、直径約200〜600
Åを有する小形単層脂質顆粒（KUL）及び直径
約600〜3000Åを有する大形単層脂質顆粒
（GUL）が含まれる。この発明の方法の特有の利
点は、相対的に均一な大きさのKUL及びGULを
得ることができ、そして分散相中のKULとGUL
の量比を変えることができる点にある。適当な分
離手段、例えばゲル過法又は限外過法により
大形単層脂質顆粒から小形単層脂質顆粒を分離す
ることができる。 この発明は、 a1 次の式(A) 〔式中、ｍは１であり；基R₁及びR₂の内の
１つは水素又はヒドロキシ基であり他方の基は
それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、ア
ルケニル基、アルコキシ基もしくはアルケニル
オキシ基、又は炭素原子数10〜20個のアシルオ
キシ基であり；R₃は水素であり；そしてR₄は
水素、炭素原子数１〜７個のアルキル基、又は
炭素原子数１〜７個のアルキル基（カルボキ
シ、スルホ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ
−低級アルキルアミノ、カルボキシ及びアミ
ノ、遊離もしくはエステル化されたヒドロキ
シ、ハロゲン、低級アルコキシカルボニル、又
は低級アルカンスルホニルにより置換されてい
る）である〕で表わされる脂質及び適当な追加
の脂質をPH値が11より高い水性相に分散せし
め、あるいは、 a2） ｍが１であり；R₁及びR₂が相互に独立し
て、それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル
基、アルケニル基、アルコキシ基もしくはアル
ケニルオキシ基又は炭素原子数10〜20個のアシ
ルオキシ基であり；R₃及びR₄が水素である式
(A)の脂質及び場合によつては適当な追加の脂質
をPH値が11より高い水性相に分散せしめ、ある
いは、 b1） ｍが１であり；基R₁及びR₂の内の１つが
水素又はヒドロキシ基であつて他方の基がそれ
ぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、アルケ
ニル基、アルコキシ基もしくはアルケニルオキ
シ基、又は炭素原子数10〜20個のアシルオキシ
基であり；R₃が水素であり；そしてR₄はアン
モニオ基で置換された低級アルキル基である式
(A)の脂質、及び場合によつては追加の脂質をPH
値が１より低い水性相に分散せしめ、あるい
は、 b2） ｍが１であり；R₁及びR₂が相互に独立に、
それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、ア
ルケニル基もしくはアルケニルオキシ基、又は
炭素原子数10〜20個のアシルオキシ基であり；
R₃が水素であり；そしてR₄がアンモニオ低級
アルキルアンモニオ基で置換された低級アルキ
ル基である式(A)の脂質、及び適当な追加の脂質
をPH値が１より低い水性相に分散せしめ、 そして必要であれば、前記ａ）又はｂ）段階の
後、水性相を中和し、そして所望により得られた
単層脂質顆粒を濃縮しそして／又は分離すること
を特徴とする単層脂質顆粒の製造方法に関する。 本発明によれば、前記（a1），（a2），（b1）及
び（b2）に示す脂質の組合わせにおいて、（a1）
及び（a2）においては水性相のPHを11より高く
し、そして（b1）及び（b2）においては水性相
のPHを１より低くした場合に、単層脂質顆粒の比
率の高い分散体が得られる。 この明細書において、前記のそして後記の一般
的記載は次の意味を有する。 方法（a1）及び（a2） アルキル基R₁又はR₂は、好ましくはｎ−デ
シル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基
（ラウリル基）、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラ
デシル基（ミリスチル基）、ｎ−ペンタデシル
基、ｎ−ヘキサデシル基（セチル基）、ｎ−オ
クタデシル基（ステアリル基）又はｎ−エイコ
シル基（アラキニル基）、さらにはｎ−ヘプタ
デシル基又はｎ−ノナデシル基である。 アルケニル基R₁又はR₂は、好ましくは９−
シス−ドデセニル基（ラウロレイル基）、９−
シス−テトラデセニル基（ミリストレイル基）、
９−シス−ヘキサデセニル基（パルミトレイニ
ル基）、６−シス−オクタデセニル基（ペトロ
セリニル基）、６−トランス−オクタデセニル
基（ペトロセライジニル基）、９−シス−オク
タデセニル基（オレイル基）、９−トランス−
オクタデセニル基（エライジニル基）又は９−
シス−エイコセニル基（ガドレイニル基）、さ
らに１−デセニル基、１−ウンデセニル基、１
−ドデセニル基、１−トリデセニル基、１−テ
トラデセニル基、１−ペンタデセニル基、１−
ヘキサデセニル基、１−ヘプタデセニル基、１
−オクタデセニル基、９−シス−12−トランス
−オクタデカジエニル基（リノリル基）、９−
トランス−12−トランス−オクタデカジエニル
基（リノライジニル基）、９−シス−12−シス
−オクタジエニル基（リノレイル基）、９−シ
ス−11−トランス−13−トランス−オクタデカ
トリエニル基（β−エロイステアリニル基）、
９−シス−12−シス−15−シス−オクタデカト
リエニル基（リノレニル基）、９−，11−，13
−，15−オクタデカテトラエニル（パリナリル
基）、１−ノナデセニル基、１−エイコセニル
基、５−，11−，14−エイコサトリエニル又は
５−，８−，11−，14−エイコサテトラエニル
基（アラキドニル基）である。 アルコキシ基R₁又はR₂は、好ましくはｎ−
デシルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基（ラウ
リルオキシ基）、ｎ−テトラデシルオキシ基
（ミリスチルオキシ基）、ｎ−ヘキサデシルオキ
シ基（セチルオキシ基）、ｎ−オクタデシルオ
キシ基（ステアリルオキシ基）、又はｎ−エイ
コシルオキシ基（アラキニルオキシ基）、さら
にｎ−ウンデシルオキシ基、ｎ−トリデシルオ
キシ基、ｎ−ペンタデシルオキシ基、ｎ−ヘプ
タデシルオキシ基又はｎ−ノナデシルオキシ基
である。 アルケニルオキシ基R₁又はR₂は、好ましく
は９−シス−ドデセニルオキシ基（ラウロレイ
ルオキシ基）、９−シス−テトラデセニルオキ
シ基（ミリストレイルオキシ基）、９−シス−
ヘキサデセニルオキシ基（パルミトレイニルオ
キシ基）、６−シス−オクタデセニルオキシ基
（ペトロセリニルオキシ基）、６−トランス−オ
クタデセニルオキシ基（ペトロセライジニルオ
キシ基）、９−シス−オクタデセニルオキシ基
（オレイルオキシ基）、９−トランス−オクタデ
セニルオキシ基（エライジニルオキシ基）、又
は９−シス−エイコセニル基（ガドレイニルオ
キシ基）、さらには１−デセニルオキシ基、１
−ウンデセニルオキシ基、１−ドデセニルオキ
シ基、１−トリデセニルオキシ基、１−テトラ
デセニルオキシ基、１−ペンタデセニルオキシ
基、１−ヘキサデセニルオキシ基、１−ヘプタ
デセニルオキシ基、１−オクタデセニルオキシ
基、９−シス−12−トランス−オクタデカジエ
ニルオキシ基（リノリルオキシ基）、９−トラ
ンス−12−トランス−オクタデカジエニルオキ
シ基（リノライジニルオキシ基）、９−シス−
12−シス−オクタジエニルオキシ基（リノレイ
ルオキシ基）、９−シス−11−トランス−13−
トランス−オクタデカトリエニルオキシ基（β
−エレオステアリニルオキシ基）、９−シス−
12−シス−15−シス−オクタデカトリエニルオ
キシ基（リノレニルオキシ基）、９−，11−，
13−，15−オクタデカテトラエニルオキシ基
（パリナリルオキシ基）、１−ノナデセニルオキ
シ基、１−エイコセニルオキシ基、５−，11
−，14−エイコサトリエニルオキシ基又は５
−，８−，11−，14−エイコサテトラエニルオ
キシ基（アラキドニルオキシ基）である。 アシルオキシ基R₁又はR₂は、好ましくはア
ルカノイルオキシ基、例えばｎ−デカノイルオ
キシ基、ｎ−ドデカノイルオキシ基（ラウロイ
ルオキシ基）、ｎ−テトラデカノイルオキシ基
（ミリストイルオキシ基）、ｎ−ヘキサデカノイ
ルオキシ基、ｎ−ヘキサデカノイルオキシ基
（パルミトイルオキシ基）、ｎ−オクタデカノイ
ルオキシ基（ステアロイルオキシ基）又はｎ−
エイコソイルオキシ基（アラキノイルオキシ
基）、さらにはｎ−ウンデカノイルオキシ基、
ｎ−トリデカノイルオキシ基、ｎ−ペンタデカ
ノイルオキシ基、ｎ−ヘプタデカノイルオキシ
基又はｎ−ノナデカノイルオキシ基である。 アシルオキシ基R₁又はR₂は、好ましくはア
ルケノイルオキシ、例えば９−シス−ドデセニ
ルオキシ基（ラウロレオイルオキシ基）、９−
シス−テトラデセノイルオキシ基（ミリストレ
オイルオキシ基）、９−シス−ヘキサデセノイ
ルオキシ基（パルミトレイノイルオキシ基）、
６−シス−オクタデセノイルオキシ基（ペトロ
セリノイルオキシ基）、６−トランス−オクタ
デセノイルオキシ基（ペテロセライジノイルオ
キシ基）、９−シス−オクタデセノイルオキシ
基（オレオイルオキシ基）、９−トランス−オ
クタデセノイルオキシ基（エライジノイルオキ
シ基）又は９−シス−エイコセノイル基（ガド
レイノイルオキシ基）、さらに９−シス−12−
トランス−オクタジエノイルオキシ基（リノロ
イル基）、９−トランス−12−トランス−オク
タデカジエノイルオキシ基（リノライジノイル
オキシ基）、９−シス−12−シス−オクタジエ
ノイルオキシ基（リノレオイルオキシ基）、９
−シス−11−トランス−13−トランス−オクタ
デカトリエノイルオキシ基（リノレノイルオキ
シ基）、９−，11−，13−，15−オクタデカテ
トラエノイルオキシ基（パリナロイルオキシ
基）、５−，11−，14−エイコサトリエノイル
オキシ基、又は５−，８−，11−，14−エイコ
サテトラエノイルオキシ基（アラキドノイルオ
キシ基）である。 炭素原子数１〜７個を有する低級アルキル基
R₄は、例えばメチル基、エチル基、イソプロ
ピル基、ｎ−プロピル基、イソブチル基又はｎ
−ブチル基である。 置換された炭素原子数１〜７個の低級アルキ
ル基R₄は、好ましくはカルボキシ低級アルキ
ル基、例えばカルボキシメチル基、２−カルボ
キシエチル基もしくは３−カルボキシ−ｎ−プ
ロピル基、アミノ低級アルキル基、例えばアミ
ノメチル基、２−アミノエチル基もしくは３−
アミノ−ｎ−プロピル基、低級アルキルアミノ
低級アルキル基、例えばメチルアミノメチル基
もしくはエチルアミノメチル基、２−メチルア
ミノエチル基、もしくは３−メチルアミノ−ｎ
−プロピル基、ジ低級アルキルアミノ低級アル
キル基、例えばジメチルアミノメチル基もしく
はジエチルアミノメチル基、２−ジメチルアミ
ノエチル基、もしくは３−ジメチルアミノ−ｎ
−プロピル基、ω−アミノ−ω−カルボキシ低
級アルキル基、例えば２−アミノ−２−カルボ
キシエチル基もしくは３−アミノ−３−カルボ
キシ−ｎ−プロピル基、ヒドロキシ低級アルキ
ル基、例えば２−ヒドロキシエチル基もしくは
２，３−ジヒドロキシプロピル基、低級アルコ
キシ低級アルキル基、例えばメトキシメチル基
もしくはエトキシメチル基、２−メトキシ−エ
チル基、もしくは３−メトキシ−ｎ−プロピル
基、又はハロゲン低級アルキル基、例えば塩化
メチル基もしくは臭化メチル基、２−クロロエ
チル基もしくは２−ブロモエチル基、２−もし
くは３−クロロ−ｎ−プロピル基、もしくは２
−もしくは３−ブロモ−ｎ−プロピル基であ
る。 適当な追加の脂質は、例えばｍが１であり、
R₁及びR₂が相互に独立に、それぞれ炭素原子
数10〜20個のアルキル基、アルケニル基、アル
コキシ基又はアルケニルオキシ基、又は炭素原
子数10〜20個のアシルオキシ基であり、そして
R₃が水素である。 R₁，R₂及びR₃は前述の意味を有する。R₄に
はトリ低級アルキルアンモニオ基、例えばトリ
メチルアンモニオにより置換された低級アルキ
ル基、例えば２−トリメチルアンモニオエチル
基（コリニル基）がある。 適当な追加の脂質には、例えば、R₁及びR₂
がアシルオキシ基であり、R₃が水素であり、
そしてR₄が２−トリメチルアンモニオエチル
基又は２−アミノエチル基である式(A)の脂質が
ある。 これらの追加の脂質は、R₄が２−トリメチ
ルアンモニオエチル基である場合には天然レシ
チン、例えば卵−レシチン又は大豆レシチンで
あり、R₄が２−アミノエチル基である場合に
は天然ケフアリン、例えば卵−ケフアリン又は
大豆ケフアリンである。 このほかに、追加の脂質として、式(A)の合成
レシチン類（R₄＝２−トリメチルアンモニオ
エチル基）及び合成ケフアリン類（R₄＝２−
アミノエチル基）を挙げることができ、これら
は好ましくは、R₁及びR₂が同一のアシルオキ
シ基、例えばラウロイルオキシ基、オレオイル
オキシ基、リノイルオキシ基、リノレオイルオ
キシ基もしくはアラキノイルオキシ基を表わす
例えばジラウロイル−、ジミリストイル−、ジ
パルミトイル−、ジステアロイル−、ジアラキ
ノイル−、ジオレオイル−、ジリノイル−、ジ
リノレオイル−、もしくはジアラキノイルレシ
チンもしくは−ケフアリン、R₁及びR₂が異る
アシルオキシ基、例えばR₁がパルミトイルオ
キシ基でR₂がオレオイルオキシ基である例え
ば１−パルミトイル−２−オレオイル−レシチ
ンもしくは−ケフアリン、R₁及びR₂が同一の
アルコキシ基、例えばテトラデシルオキシ基も
しくはヘキサデシルオキシ基である例えばジテ
トラデシル−もしくはジヘキサデシル−レシチ
ンもしくは−ケフアリン、R₁がアルケニル基
でありR₂がアシルオキシ基である例えばプラ
ズマローゲン（R₄＝トリメチルアンモニオエ
チル基）、又はR₁がアシルオキシ基、例えばミ
リストイルキシ基もしくはパルミトイルオキシ
基でありR₂がヒドロキシル基である例えば天
然もしくは合成リソレシチンもしくはリソケフ
アリン、例えば１−ミリストイル−もしくは１
−パルミトイルソレシチンもしくは−ケフアリ
ンであり、これらにおいてR₃は水素である。 好ましくは、水性分散体には、ｍが０であ
り；R₁がアルキル基、例えばｎ−ドデシル基
（ラウリル基）、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラ
デシル基（ミリスチル基）、ｎ−ペンタデシル
基、ｎ−ヘキサデシル基（セチル基）、ｎ−ヘ
プタデシル基もしくはｎ−オクタデシル基（ス
テアリル基）、アルコキシ基、例えばｎ−ドデ
シルオキシ基（ラウリルオキシ基）、ｎ−テト
ラデシルオキシ基（ミリスチルオキシ基）、ｎ
−ヘキサデシルオキシ基（セチルオキシ基）も
しくはｎ−オクタデシルオキシ基（ステアリル
オキシ基）、又はアシルオキシ基、例えばラウ
ロイルオキシ基、ミリストイルオキシ基、パル
ミトイルオキシ基もしくはステアロイルオキシ
基であり；R₂が水素又はヒドロキシ基であ
り；R₃が水素又は低級アルキル基、例えばメ
チル基であり；そしてR₄は水素、低級アルキ
ル基、例えばメチル基もしくはエチル基、カル
ボキシル基及びアミノ基により置換された低級
アルキル基、例えばω−アミノ−ω−カルボキ
シ低級アルキル基、例えば２−アミノ−２−カ
ルボキシエチル基もしくは３−アミノ−３−カ
ルボキシ−ｎ−プロピル基、ヒドロキシ低級ア
ルキル基、例えば２−ヒドロキシエチル基もし
くは２，３−ヒドロキシプロピル基、ハロゲン
化低級アルキル基、例えば２−クロロ−もしく
は２−ブロモエチル基である式(A)の脂質、及び
R₁及びR₂がアシルオキシ基、例えばラウロイ
ルオキシ基、ミリストイルオキシ基、パルミト
イルオキシ基又はステアロイルオキシ基であ
り；R₃が水素であり；そしてR₄が２−トリメ
チルアンモニオエチル基もしくは２−アミノエ
チル基である式(A)で示される追加の脂質を含有
せしめる。又は、水性分散体には、R₁及びR₂
がアシルオキシ基、例えばラウロイルオキシ
基、ミリストイルオキシ基、パルミトイルオキ
シ基もしくはステアロイルオキシ基であり、
R₃が水素であり、そしてR₄が水素である式(A)
の脂質、及び場合によつては、R₁及びR₂がア
シルオキシ基、例えばラウロイルオキシ基、ミ
リストイルオキシ基、パルミトイルオキシ基又
はステアロイルオキシ基であり、R₃が水素で
あり、そしてR₄が２−トリメチルアンモニオ
エチル基、又は２−アミノエチル基である式(A)
で示される追加の脂質を含有せしめることがで
きる。 好ましくは、水性媒体にはトリホスフアチジ
ン酸、例えば天然リソホスフアチジン酸、例え
ば卵−リソホスフアチジン酸、もしくは合成リ
ソホスフアチジン酸、例えば１−ラウロイル−
リソホスフアチジン酸、１−ミリストイルリソ
ホスフアチジン酸もしくは１−パルミトイルリ
ソホスフアチジン酸、リソホスフアチジルセリ
ン、例えば天然リソホスフアチジルセリン、例
えば牛脳リソホスフアチジルセリン、もしくは
合成リソホスフアチジルセリン、例えば１−ミ
リストイルリソホスフアチジルセリンもしくは
１−パルミトイルリソホスフアチジルセリン、
リソホスフアチジルグリセリン、又はリソホス
フアチジルイノシトール、そしてさらに、レシ
チン、例えば天然レシチン、例えば卵−レシチ
ン、同一のアシルオキシ基を有するレシチン、
例えばジミリストイルレシチンもしくはジパル
ミトイルレシチン、異なるアシルオキシ基を有
するレシチン、例えば１−パルミトイル−２−
オレオイルレシチン、又はさらにケフアリン、
例えば天然ケフアリン、例えば卵−ケフアリ
ン、もしくは異なるアシルオキシ基を有するケ
フアリン、例えば１−パルミトイル−２−オレ
オイルケフアリンを含有せしめる。 好ましくは水性分散体には、天然ホスフアチ
ジン酸、例えば卵−ホスフアチジン酸、合成ホ
スフアチジン酸、例えばジラウロイルホスフア
チジン酸、ジミリストイルホスフアチジン酸、
ジパルミトイルホスフアチジン酸もしくは１−
パルミトイル−２−オレオイルホスフアチジン
酸、そして場合によつてはさらに、レシチン、
例えば天然レシチン、例えば卵−レシチン、同
一のアシルオキシ基を有するレシチン、例えば
ジミリストイルレシチンもしくはジパルミトイ
ルレシチン、もしくは異なるアシルオキシ基を
有するレシチン、例えば１−パルミトイル−２
−オレオイルレシチン、又はケフアリン、例え
ば天然ケフアリン、例えば卵−ケフアリン、も
しくは異なるアシルオキシ基を有するケフアリ
ン、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル
ケフアリンを含有せしめることができる。 単層脂質顆粒を製造するために、まず脂質成
分の均質層を調製する。均質層の調製は、それ
自体公知の方法により行うことができ、この明
細書において、「脂質成分の均質層の調製」の
項に詳細に記載する。 均質層を水性相に分散せしめ、そして次に１
種類のみの脂質成分、例えば純ホスフアチジン
酸を分散せしめた水性相のPHを約11以上に上昇
せしめる。この操作は、例えば、斑点法又はPH
メータによりPH値を監視しながら、生理的に許
容される塩基性溶液、例えば約0.01〜0.2N、好
ましくは約0.1Nの水酸化ナトリウム又は水酸
化カリウム希水溶液を添加することにより行
う。 好ましい態様においては、脂質成分の均質層
を、７より高いPHを有する水性相、例えば生理
的に許容される塩基性溶液、例えば約0.01〜
0.2N、特に0.1Nの水酸化ナトリウム又は水酸
化カリウム希水溶液に分散せしめる。１つの脂
質成分、例えば純ホスフアチジン酸は約12以下
のPHを有する水性相に分散せしめる。 方法b1及びb2 ｍが１であり、基R₁及びR₂の内の１つが水素
又はヒドロキシル基であつて他方の基がそれぞ
れ炭素原子数10〜20個を有するアルキル基、ア
ルケニル基、アルコキシ基もしくはアルケニル
オキシ基であり、R₃が水素であり、そしてR₄
がアンモニオ基により置換された低級アルキル
基である式(A)の脂質において、R₁及びR₂は方
法（a1）及び（a2）においてすでに記載した
意味を有する。 アンモニオ基により置換された低級アルキル
基R₄は、例えば、トリ低級アルキルアンモニ
オ基、例えばトリメチル−又はトリエチルアン
モニオ基により置換された低級アルキル基、例
えば２−トリメチルアンモニオエチル基又は２
−トリエチルアンモニオエチル基である。 ｍが１であり、R₁及びR₂が相互に独立に、
それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、ア
ルケニル基、アルコキシ基、もしくはアルケニ
ルオキシ基、又は炭素原子数10〜20のアシルオ
キシ基であり、R₃が水素であり、そしてR₄が
アンモニオ低級アルキルアンモニオ基により置
換された低級アルキル基である式(A)の脂質にお
いて、R₁及びR₂は好ましくは方法（a1）及び
（a2）において詳細に記載した特定の意味を有
する。 アンモニオ低級アルキルアンモニオ基により
置換された低級アルキル基は、例えば、２−
〔Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキル−Ｎ−（２−N′，N′，
N′−トリ低級アルキルアンモニオエチル）−ア
ンモニオ〕−エチル基、例えば２−〔Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−Ｎ−（２−N′，N′，N′−トリメチルア
ンモニオエチル）−アンモニオ〕−エチル基であ
る。 適当な追加の脂質は、方法（a1）及び（a2）
において詳細に記載した追加の脂質である。 好ましくは、水性分散体には、ｍが１であ
り、R₁がアシルオキシ基、例えばラウロイル
オキシ基、ミリストイルオキシ基、パルミトイ
ルオキシ基又はステアロイルオキシ基であり、
R₂がヒドロキシ基であり、R₃が水素であり、
そしてR₄が２−トリメチルアンモニオエチル
基である式(A)の脂質、並びにR₁及びR₂がアシ
ルオキシ基、例えばラウロイルオキシ基、ミリ
ストイルオキシ基、パルミトイルオキシ基又は
ステアロイルオキシ基であり、R₃が水素であ
り、そしてR₄が２−アミノエチル基又は２−
トリメチルアンモニオエチル基である式(A)の適
当な追加の脂質を含有せしめる。又、水性分散
体には好ましくは、R₁及びR₂がアシルオキシ
基、例えばラウロイルオキシ基、ミリストイル
オキシ基、パルミトイルオキシ基、又はステア
ロイルオキシ基であり、R₃が水素であり、そ
してR₄が２−〔Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−
N′，N′，N′−トリメチルアンモニオエチル）−
アンモニオ〕−エチル基である式(A)の脂質、並
びに場合によつては、R₁及びR₂がアシルオキ
シ基、例えばラウロイルオキシ基、ミリストイ
ルオキシ基、パルミトイルオキシ基又はステア
ロイルオキシ基であり、R₃が水素であり、そ
してR₄が２−アミノエチル基又は２−トリメ
チルアンモニオエチル基である式(A)の追加の脂
質を含有せしめることができる。 好ましくは、水性分散体にはリソホスフアチ
ジルコリン（リソレシチン）及び天然レシチ
ン、例えば卵−レシチンを含有せしめる。好ま
しくは、水性分散体にはホスフアチジル−２−
〔Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−N′，N′，N′−
トリメチルアンモニオエチル）−アンモニオ〕−
エチルクロリド、及び場合によつては天然レシ
チン、例えば卵−レシチンを含有せしめる。 単層脂質顆粒を製造するために、まず、脂質
成分、例えばリソレシチン又はホスフアチジル
−２−〔Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−N′，N′，
N′−トリメチルアンモニオエチル）−アンモニ
オ〕−エチルクロリドの均質層を調製する。 均質層の調製はそれ自体公知の方法により行
うことができ、この明細書の「脂質成分の均質
層の調製」の項で詳細に記載する。 均質層を水性相に分散せしめ、そして、例え
ば斑点法又はPHメータによりPH値を調製しなが
ら、PHを約１又はそれより低く下げる。この操
作は例えば生理的に許容される酸、例えば鉱酸
の希水溶液、例えば硫酸、塩酸又は燐酸の希水
溶液を添加することにより行う。 好ましい態様においては、脂質成分の均質層
を、PH約１又はそれより低い範囲の水性相、例
えば鉱酸希水溶液、例えば硫酸、塩酸又は燐酸
の希水溶液に、PH値を同時的に調整しながら添
加する。 次に行う水性相の中和は、方法（a1）及び
（a2）においてPH値を11より高くした場合、又は
方法（b1）及び（b2）においてPH値を５より低
くした場合に必須である。この操作は、PH値の上
昇又は低下の直後に塩基性又は酸性条件下で活性
物質及び／又は脂質顆粒が破壊されるのを防止す
るために行う。塩基性化した水性相は、適当な生
理的に許容される酸又は緩衝液、例えばPH７〜８
の燐酸緩衝液により中和する。適当な酸として
は、例えば前記の鉱酸水溶液及び弱有機酸、例え
ば蟻酸、又は酢酸が挙げられる。酸性水性相は、
塩基性水溶液、例えば水酸化ナトリウム又は水酸
化カリウムの希水溶液を添加することにより中和
する。中和はPH値の同時的調整の下で行う。 脂質は、水性相中に70％より多くまでの濃度で
分散せしめる。濃度範囲は約１％〜約20％とする
のが好ましい。室温又はそれより高い温度、例え
ば約60℃までの温度で行うのが好都合である。封
入すべき活性物質の感受性のために必要がある場
合には、冷却下、そして場合によつては不活性気
体雰囲気下、例えば窒素雰囲気下で行う。 方法（a1）及び（a2）並びに（b1）及び（b2）
のいずれにおいても、単層脂質顆粒の形成は自発
的に（自発的顆粒形成）、すなわち外部から追加
のエネルギーを加えることなく、そして大きな速
度で行われる。 得られた単層脂質顆粒は水性相中で比較的大き
な安定性を有する。例えば、水性相中に存在する
卵−ホスフアチジン酸、又は卵−ホスフアチジン
酸と卵−レシチンとから成る単層脂質顆粒は、４
℃にて14日以上置いても安定に維持される。この
発明の方法に従つて製造された脂質顆粒を有する
水性相は、ヨーロツパ特許出願第0065292号に記
載されている方法により貯蔵安定にされる。 単層脂質顆粒の形成と水性相中におけるその量
は、それ自体公知の方法により、種々の方法、例
えば電子顕微鏡による視覚的観察、分析用超遠心
分離による質量測定、そして特にスペクトル法、
例えば核共鳴スペクトル（¹H、¹³C及び³¹P）に基
いて測定することができる。例えば、核共鳴スペ
クトルの鋭いシグナルは小形単層脂質顆粒の形成
と関連する。系における小形単層脂質顆粒の比率
はシグナルの強度から算出することができる。陽
子核共鳴スペクトルにおいて、ホスフアチジン酸
から形成された小形単層脂質顆粒の場合δ＝
1.28ppmにおける鋭いメチレンシグナルとδ＝
0.89ppmにおける鋭いメチルシグナルが特異的で
ある。ホスフアチジン酸及びレシチンから形成さ
れた小形単層脂質顆粒からは、同様にメチレンシ
グナル及びメチルシグナルであるδ＝1.28ppm及
び0.89ppmのシグナルと、さらにレシチンのトリ
メチルアンモニオ基に帰属するδ＝3.23ppmのメ
チルシグナルが生ずる。 形成された単層脂質顆粒の大きさは、特に脂質
成分の構造、脂質成分の混合比、これらの脂質成
分の水性相中での濃度、及び封入すべき活性物質
の量と構造に依存する。従つて、例えば、水性相
中の脂質成分の濃度を変えることによつて、高い
比率で小形単層脂質顆粒又は大形単層脂質顆粒を
製造することができる。例えば、分散相に卵−ホ
スフアチジン酸を添加することにより小形単層脂
質顆粒（KUL）の比率を高めることができる。
又、分散相中の大形単層脂質顆粒（GUL）の比
率は、塩、例えばNaCl又はKClを添加すること
により高めることができる。例えばホスフアチジ
ン酸、又はホスフアチジン酸とレシチンとから形
成されたKULは約200〜600Åの直径を有する。
このような大きさを有するKULの封入容量は加
えた脂質成分の１モル当たり約0.5〜１である。 KULの他に大形単層脂質顆粒（GUL−直径約
50000Å以下）も形成される。このものは加えた
脂質成分１モル当たりより大きな封入容量を有
し、このため、より大きな収率で封入するのに適
し、そして容積の大きい材量、例えばウイルス、
細菌又は細胞器管を封入するのに適する。 GULからKULの分離は、常用の分離法、例え
ばゲル過法、例えばセフアローズ4Bを担体と
して使用するゲル過法、又は160000ｇの超遠心
によるGULの沈降により行うことができる。例
えば、前記の重力場において数時間、例えば約３
時間遠心分離することによりGULが沈降し、他
方KULは分離したままであり、デカントにより
取り出すことができる。 さらに、ゲル過により、水性相中に存在する
直径が600Åより大きいすべての脂質顆粒、例え
ばGUL又は多層脂質顆粒、並びに封入されてい
ない活性物及び残存し分散している脂質を分離
し、そして大きさが比較的均一なKUL区分を伴
う水性相を得ることができる。 この発明の脂質顆粒（KUL及びGUL）は、適
当な担体系であつて、この担体系は親脂性物質、
例えば脂溶性色素の水性相中への可溶化、加水分
解感受性化合物、例えばプロスタグランジンの安
定化、害虫駆除剤の封入、例えばジクロロホスの
活性スペクトルの変更、食品添加物の封入、例え
ばビタミンもしくは色素の吸収性を変えることを
目的とする場合、又は封入された活性物質、例え
ば酵素、抗体、ホルモン、遺伝子、ウイルス、ビ
タミンもしくは細胞器官の培養細胞への導入に使
用される。 活性物質を封入したこの発明の脂質顆粒を含有
する水性相は投薬系を構成し、場合によつては、
例えば超遠心分離により顆粒の濃縮又は分離を行
つた後、経口（P.O）投与、非経口（静脈内、筋
肉内、もしくは腹腔内）投与、又は局所投与のた
めの医療目的に適する。 経口投与において、脂質顆粒に基礎を置く投薬
系により、消化管中で不安定な活性物質例えばイ
ンスリンは保護され、又はその吸収が改善され
る。 経口投与のためには、脂質顆粒含有水性相は、
医薬として許容される希釈剤もしくは担体、又は
常用の添加剤、例えば色素もしくは嗜好剤と混合
して、シロツプ又はカプセルの形で投与すること
ができる。 非経口投与の場合、脂質顆粒に基礎を置く投薬
系により、例えばデスフエリオキサミン〔グイル
メツテ（Guilmetle）R.A等、Life Sci.22(4)、313
〜320、1978年〕又はゲンタマイシン〔シエルド
（Scheld）W.M.等、Clin.Res.26，No.１、59A、
1978年〕の体内滞留時間が延長される。同様に、
封入されたキレート剤、例えばEDTA（エチレン
ジアミンテトラ酢酸）の体内滞留時間が長びきこ
れにより、キレート形成により、特に肝臓、脾
臓、又は腎臓から重金属を除去することができる
〔ラーマン（Rahmann）等、Science、Vol 180、
300〜302、1973年、及びJ.Lab.Clin.Med.640〜
647、1974年〕。脂質顆粒に基礎を置く投薬法によ
り活性物質を心筋中に濃縮することができる〔ラ
ンデスマン（Landesmann）等、Science
Vol.198、737〜738、1977年〕。抗炎症作用剤、例
えばコーチゾル（Nature271、No.5643、372〜73、
1978年）、又はプロテアーゼ阻害剤（Anal.
Biochem.89、No.２、400〜07、1978年）を関節液
中に、静細胞剤を腫瘍組織中に〔Cancer
Treatment Reviews8、27〜50、1981年のカイエ
（Kaye）SL.B.の総説、及びそこで引用されてい
る４つの文献〕濃縮することができる。ガン治療
における多くの化学療法剤は、それを脂質顆粒に
封入して投与した場合、毒性がより少なくなり、
さらに体に対して穏和になる。例えば脂質顆粒に
封入されたアリチノマイシンＤ〔ラーマン
（Rahman）等、Proceedings of the Society
for Exprimental Biology、及びMedicine146、
1173〜1176、1974年〕、メソトレキセート〔レザ
ーマン（Lesermann）L.D.等、Proc.Natl.Acad.
Sci.77、No.７、4089〜93、1980年〕、ビンブラス
チン、ダウノマイシン又はシトシンアラビノシド
〔ミユーレンシーペン（Mu¨hlensiepen）等、
Cancer Res.41、No.５、1602〜07、1981年〕がそ
うである。脂質顆粒は、活性成分、例えば酵素、
ペプチドホルモン、遺伝子又はウイルスの生体細
胞の細胞質中への導入に、例えばアスパラギナー
ゼ〔J.Lipid Research、Vol19、1978年、289〜
303中のフインケルスタイン（Finkelstein）Ｍ及
びワイスマン（Weismann）G.の総説〕、アミロ
グルコシダーゼ〔グレゴリアジス（Gregoriadis）
G.及びリマン（Ryman）B.E.、Eur.J.
Biochem.24（1972年）、481〜491〕、又はニユーロ
ミニダーゼ〔グレゴリアジス等、Biochem.J.
（1974年）140、232〜330〕の導入に、特異的識別
分子、例えば種々の標的細胞に選択的に導入する
ためのモノクローン抗体を固定するために〔レー
ゼルマン（Lesermann）等、Nature292（5829）、
226〜228、1981年〕、例えばリーシユマニアに対
する接種の際のアジユバントとして免疫刺激のた
めに〔ニユー（New）R.R.C.等Nature272（5648）
55〜56、1978年〕、又は、例えば炎症を起した組
織における温度の上昇、又はPH値の変化のごとき
信号により活性物質の遊離を誘導するために使用
される。非経口投与のために、濃縮した又は分離
した脂質顆粒を、適当な担体液、例えば殺菌した
蒸留水又は生理的食塩水溶液中に懸濁することも
できる。 脂質成分の均質層の調製 脂質成分の均質層の調製は、それ自体公知の方
法により行うことができる。例えば、まず、式(A)
の脂質又は脂質混合物、例えば純粋な卵−ホスフ
アチジン酸、又は卵−ホスフアチジン酸と卵−レ
シチンとの混合物を、場合によつては、脂質顆粒
の形成の際に脂質層に封入される親脂性活性物
質、例えば蛋白質と共に、有機溶剤中に溶解す
る。好ましくは真空中、又は不活性気体、例えば
窒素の通気により有機溶材を除去することにより
脂質成分の均質層を得る。 溶剤の選択は、それに溶解する脂質成分の溶解
度に依存して行う。適当な溶剤としては、例えば
置換されていない又は置換されている、例えばハ
ロゲン化された、脂肪族の、環状脂肪族の、芳香
族の又は芳香族−脂肪族の炭化水素、例えばベン
ゼン、トルエン、塩化メチレン、もしくはクロロ
ホルム、アルコール、例えばメタノールもしくは
エタノール、低級アルカンカルボン酸エステル、
例えば酢酸エチル、エーテル、例えばジエチルエ
ーテル、ジオキサンもしくはテトラヒドロフラ
ン、又はこれらの溶剤の混合物を挙げることがで
きる。 前記した脂質は公知のものであり、又はそれが
新規のものである場合には、ナイト（Knight）
C.G.の標準的方法（Liposomes、Elsevier1981
年、第３章）中に記載されている処方に従つてそ
れ自体公知の方法により製造することができる。
記載したすべての脂質は、水性分散体中で光学的
に活性な誘導体又はラセミ体として存在し得る。
次に例によりこの発明を詳細に説明するが、これ
によりこの発明の範囲を限定するものではない。
温度は０℃で表わし、混合比は容量比である。 例 １ (a) クロロホルム／メタノール混合液（２：１）
20mlに１ｇの卵−ホスフアチジン酸を溶解し、
そして真空条件下ロータリー蒸発装置で溶剤を
蒸発せしめる。膜状の残渣を、５分間撹拌しな
がら20mlの蒸留水に分散せしめ、PHを約３に調
整する。次に、単層脂質顆粒を形成するため
に、PHメーターで監視しながら室温において、
PHが11になるまで分散相に0.1N水酸化ナトリ
ウム溶液を加える。次に、0.1NHClを添加す
ることにより水性相のPHを11から約７に調整す
る。こうして薄乳白色を有する水性相を得る。 形成された単層脂質顆粒は電子顕微鏡で観察
することができる。次に、脂質顆粒分散体を常
用の冷凍分離法（凍結分別法）にかける。直径
によつて次のように区別される単層脂質顆粒の
主たる２種類の集団が得られる。すなわち、 １ 小形単層脂質顆粒（KUL）：直径約200〜
600Å、及び ２ 大形単層脂質顆粒（GUL）：直径約1000〜
10000Å、 である。KULは、陽子−NMR−スペクトルに
おいてシグナルδ＝1.28（メチレン）及びδ＝
0.89ppm（メチル）により確認される。KULの
収量はシグナルの強度により評価される。約56
％である。 (b) 例１(a)と同様にして、クロロホルム／メタノ
ール混合液（２：１）0.2mlに10mgの卵−ホス
フアチジン酸を溶解したものを４個用意し、そ
して溶剤を真空蒸発せしめる。膜状の残渣を、
５分間撹拌しながら１mlの蒸留水に分散せしめ
る。単層脂質顆粒を形成せしめるため、PHメー
タで監視しながらそれぞれの分散相に0.1N水
酸化ナトリウム溶液を加え、PHをそれぞれ６、
８、11.3及び11.6とする。KULの収率はそれぞ
れのPHにおいて５％、24％、57％及び60％であ
る。 例 ２ (a) クロロホルム／メタノール混合液（２：１）
20mlに１ｇの卵−ホスフアチジン酸を溶解し、
そしてこの溶剤を真空蒸発せしめる。膜状残渣
を0.01N水酸化ナトリウム溶液に50mlに撹拌し
ながら分散せしめる。水性相のPHは約12とな
る。次に水性分散体のPHを0.1N塩酸溶液を添
加することにより約７〜８に調整する。KUL
の収率は約100％である。 (b) 例２(a)と同様に、クロロホルム／メタノール
混合液（２：１）0.2mlに10mgの卵−ホスフア
チジン酸を溶解する。これを４個用意し、溶剤
を真空蒸発せしめる。これらの試料を、それぞ
れPHが7.3、8.0、9.4及び10.0となるように
0.01N水酸化ナトリウム溶液と蒸留水とを撹拌
しながら分散せしめる。KULの収率はそれぞ
れのPHについて、33％、46％、65％及び81％で
ある。 例 ３ クロロホルム／メタノール混合液（２：１）５
mlに0.1ｇのジラウリルホスフアチジン酸を溶解
し、そして溶剤を真空蒸発せしめる。膜状残渣を
50mlの0.01N水酸化ナトリウム溶液に撹拌しなが
ら分散せしめる。これにより生成した分散体のPH
は約12となる。次に、0.1N塩酸溶液を加えるこ
とにより水性分散体のPHを約７〜８に調整する。
KUL（直径約300〜800Å）の収率は73％である。 例 ４ (a) クロロホルム／メタノール混合液（２：１）
0.5mlに３mgの卵−ホスフアチジン酸と７mgの
卵−レシチンを溶解し、溶剤を真空蒸発せしめ
る。室温にて５分間撹拌することにより、膜状
の残渣を１mlの蒸留水に分散せしめる。これに
よりPHは約３となる。次に単層脂質顆粒を形成
せしめるために、PHメータにて監視しながら室
温において、PHが約11.2になるように0.1N水酸
化ナトリウム溶液を加える。次に、燐酸緩衝液
を加えることにより水性層のPHを約７に調整す
る。こうして、薄い乳白色を有する水性相を得
る。単層脂質顆粒の生成は、NMR−スペクト
ルにおけるシグナルδ＝1.28（メチレン）、δ＝
0.89（メチル）及びδ＝3.23（Ｎ−CH₃）により
確認される。電子顕微鏡観察により、直径によ
つて区別される単層脂質顆粒の主たる２種類の
集団が確認される。すなわち、 １ KUL：直径約200〜800Å、及び ２ GUL：直径約1000〜10000Å、 である。KULの収率は45％である。 (b) (a)に記載した方法に従つて、クロロホルム／
メタノール混合液（２：１）0.5mlに種々の濃
度になるように卵ホスフアチジン酸及び卵レシ
チンをそれぞれ溶解し、そしてこれらの溶液を
真空濃縮する。５分間振とうすることにより、
それぞれの膜状残渣を１mlの水に分散せしめ
る。PHメータでの監視下で振とうしながら、最
終PHを約11.2にするのに十分な量の0.1N水酸化
ナトリウム溶液をそれぞれの分散相に加えるこ
とにより単層脂質顆粒を形成する。卵−ホスフ
アチジン酸の濃度を増加するに従つてKULの
収率は次のようになる。

【表】 例 ５ (a) 0.3ｇの卵−ホスフアチジン酸と0.7ｇの卵−
レシチンをクロロホルム／メタノール混合液
（２：１）10mlに溶解し、そして溶液を真空濃
縮する。振とうしながら、残渣を0.01N水酸化
ナトリウム溶液10mlに分散せしめる。こうして
生成した分散体は約12のPH値を有する。次に、
0.1N塩酸を加えることにより水性分散体のPH
を約７〜８に下げる。KULの収率は約30％で
ある。 (b) (a)の方法に従つて、種々の量の卵−ホスフア
チジン酸と卵−レシチンの試料（脂質の合計量
10mg）をそれぞれクロロホルム／メタノール混
合液（２：１）0.5mlに溶解し、そして溶液を
真空濃縮する。それぞれの膜状残渣を、振とう
しながら１mlの0.01N水酸化ナトリウム溶液に
分散せしめる。この分散体のPHは約12である。
各水性媒体のPHを約７〜８に下げる。卵−ホス
フアチジン酸の濃度が増加するに従つて各試料
のKULの収率は次のようになる。

【表】 例 ６ 0.7ｇの卵−レシチン、0.3ｇの牛脳−ホスフア
チジルセリン及び２ｇの卵−ホスフアチジン酸を
クロロホルム／メタノール混合液（２：１）20ml
に溶解し、そしてこの溶液をロータリーエバポレ
ータにて真空濃縮する。室温にて５分間振とうす
ることにより、膜状残渣を0.01N水酸化ナトリウ
ム溶液100mlに分散せしめる。分散体のPHは約12
である。1N塩酸により水性層のPHを約７に調整
する。薄乳白色の水性相が得られる。 単層脂質顆粒の形成は例１(a)の場合のようにス
ペクトル法により例えばNMR又は電子顕微鏡に
より確認することができる。 (b) (a)の方法に従つて、種々の卵−ホスフアチジ
ン酸濃度と同一量の卵−レシチン及びホスフア
チジルセリン濃度を有する試料（脂質の合計量
は10mg）をそれぞれクロロホルム／メタノール
混合液（２：１）0.5mlに溶解し、そしてこれ
らの溶液を真空濃縮した。残渣のそれぞれを
0.1N水酸化ナトリウム溶液1.0mlに振とう分散
せしめる。生成した分散体のPHは約12となる。
0.1N塩酸を加えることにより水性分散体のPH
を約７〜８に下げる。卵−ホスフアチジン酸濃
度が上昇するに従つて各試料のKULの収率は
次のようになる。

【表】 例 ７ １ｇのアソレクチン（主としてレシチン、セパ
リン、ホスフアチジルセリン及びホスフアチジル
イノシトールを含んで成る燐脂質の混合物）と
0.2ｇの卵−ホスフアチジン酸をクロロホルム／
メタノール混合液（２：１）20mlに溶解し、そし
てこの溶液を真空濃縮する。室温にて５分間振と
うすることにより、膜状残渣を0.01N水酸化ナト
リウム溶液100mlに分散せしめる。こうして生成
した分散体のPHは約12である。1Nの塩酸を添加
することにより水性相のPHを約７に下げる。薄乳
白色の水性相が得られる。 単層脂質顆粒の形成は、例１(a)の場合と同様に
スペクトル法により、例えばNMR又は電子顕微
鏡により確認することができる。KUL及びGUL
は電子顕微鏡写真中に見ることができる。 (b) 例６(a)の方法に従つて種々の濃度の卵−ホス
フアチジン酸と同一量のアソレクチン（脂質の
合計量10mg）を含む試料をそれぞれクロロホル
ム／メタノール混合液（２：１）0.5mlに溶解
し、そしてこれらの溶液を真空濃縮する。各残
渣を0.01N水酸化ナトリウム溶液１mlに振とう
分散せしめる。この分散体のPHは約12である。
0.1N塩酸を加えることにより水性分散体のPH
を約７〜８に下げる。卵−ホスフアチジン酸の
濃度の増加に従つて各試料のKULの収率は次
のようになる。

【表】 例 ８ (a) 卵−レシチンとコレステロールとの混合物
（モル比１：１）0.1ｇと卵−ホスフアチジン酸
0.1ｇとをクロロホルム／メタノール混合液
（２：１）10mlに溶解し、そしてこの溶液を真
空濃縮する。室温にて５分間振とうすることに
より、膜状残渣を0.01N水酸化ナトリウム10ml
に分散せしめる。こうして生成した分散体のPH
は約12である。次に、1N塩酸の添加により水
性相のPHを約７に下げる。薄乳白色の水性相が
得られる。 単層脂質顆粒の形成は例１(a)の場合のように
スペクトル法的に、例えばNMR又は電子顕微
鏡により確認することができる。 (b) 例８(a)の方法に従つて、種々の濃度の卵−ホ
スフアチジン酸と同一量の卵−レシチン及びコ
レステロール（脂質の合計量10mg）とを含む試
料をそれぞれクロロホルム／メタノール混合液
（２：１）0.5mlに溶解し、そしてこの溶液を真
空濃縮する。次に、各残渣を0.01N水酸化ナト
リウム溶液1.0mlに振とう分散せしめる。この
分散体のPHは約12に上昇する。次に0.1N塩酸
を加えることにより水性分散体のPHを約７〜８
に下げる。卵−ホスフアチジン酸の濃度が増加
するに従つて各試料のKULの収率は次のよう
になる。

【表】 例 ９ 0.5ｇの卵−ホスフアチジン酸と0.5ｇのジミリ
ストイルレシチンをクロロホルム／メタノール混
合液（２：１）10mlに溶解し、そしてこの溶液を
真空濃縮する。膜状残渣を0.01N水酸化ナトリウ
ム溶液50mlに分散せしめる。この分散体のPHは約
12である。次に0.1N塩酸を加えて水性分散体の
PHを約７〜８に下げる。KULの収率は36％であ
る。 例 10 例９の方法に従つて、0.5ｇの卵−ホスフアチ
ジン酸と0.5ｇのジパルミトイルレシチン又はジ
ステアロイルレシチンとを含む脂質顆粒の混合物
を製造する。KULの収率は10％である。 例 11 例９の方法に従つて、0.5ｇのジパルミトイル
ホスフアチジン酸と0.5ｇの卵−レシチンとを含
む脂質顆粒の混合物を製造する。KULの収率は
10％である。 例 12 ５mgのリソレシチンと５mgの卵−レシチンを１
mlのクロロホルム／メタノール混合液（２：１）
に溶解し、そしてこの溶液を真空濃縮する。５分
間振とうすることにより膜状残渣を１mlの蒸留水
に分散せしめる。分散体のPHは約５〜７である。
水性相のPHを0.5に下げるのに十分な量の0.1N塩
酸をPHメータで監視しながら室温にて水性分散体
に加えることにより単層脂質顆粒が生成する。こ
れに続いて、0.1N水酸化ナトリウム溶液を加え
ることによりPHを７に上げる。 単層脂質顆粒の形成は例１(a)と同様にしてスペ
クトル法により、例えばNMR又は電子顕微鏡に
より確認することができる。KULとGULが電子
顕微鏡写真中に観察される。KULの収率は50％
である。 例 13 例12の方法に従つて、塩化ホスフアチジル２−
〔Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−N′，N′，N′−ト
リメチルアンモニオエチル）アンモニオ〕エチル
（この製造方法はC.G.ナイト、Liposomes、第３
章、Elsevier1981年に記載されている）と５mgの
卵−レシチンとを含む脂質顆粒の混合物を製造す
る。 単層脂質顆粒の形成は例１(a)のようにスペクト
ル法により、例えばNMR又は電子顕微鏡により
確認することができる。電子顕微鏡により、直径
250ÅのKULと直径約600〜10000ÅのGULを観
察することができる。KULの収率は50％である。 例 14 (a) 例１(a)及び１(b)の方法に従つて、卵−ホスフ
アチジン酸を含み、KULの比率が66％である
脂質顆粒の混合物を調製する。脂質顆粒混合物
中のGULの比率を増加せしめるために、新た
に調製した単層脂質顆粒を含有する分散相に
0.5Mの塩化ナトリウム溶液を加える。KULの
含有量は、分散相中のNaClの濃度が増加する
に従つて次のように低下する。

【表】 (b) 脂質顆粒混合物中のGULの含有量を増加せ
しめるために、卵−ホスフアチジン酸のみから
なる新たに調製した単層脂質顆粒を含有する分
散相に0.5M塩化カリウム溶液を加える。分散
相中のKCl濃度が増加するに従つてKULの濃
度は次のように低下する。

【表】 例 15 例１〜14の方法に従つて、ジミリストイルホス
フアチジン酸とジミリストイルレシチン、ジパル
ミトイルホスフアチジン酸と１−パルミトイル−
２−オレオイルレシチン、１−パルミトイル−２
−オレオイルホスフアチジン酸とジパルミトイル
レシチン、１−パルミトイル−２−オレオイルホ
スフアチジン酸と１−パルミトイル−２−オレオ
イルレシチン、卵−リソホスフアチジン酸と卵−
レシチン、１−ミリストイル−リソホスフアチジ
ン酸と１−パルミトイル−２−オレオイルレシチ
ン、１−パルミトイル−リソホスフアチジン酸と
１−パルミトイル−２−オレオイルレシチン、牛
脳−リソホスフアチジルセリンと卵−レシチン、
１−パルミトイル−リソホスフアチジルセリン、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスフアチ
ジルセリンと１−パルミトイル−２−オレオイル
レシチン、及び牛脳−リソホスフアチジルセリン
と卵−ケフアリンから単層脂質顆粒を製造するこ
とができる。 例 16 0.1mgのＮ−アセチルラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（1′，
2′−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3′−ホスフ
オリル）エチルアミド、７mgのクロマトグラフ的
に純粋な卵−アルブミンレシチン及び３mgの卵−
ホスフアチジン酸をクロロホルム／メタノール混
合液（２：１）２mlに溶解する。この溶液を真空
濃縮し、そして残渣として透明な脂質膜が残留す
る。振とうすることによりこの膜を無菌蒸留水２
mlに分散せしめ、そして0.1％チモールフタレイ
ン溶液１滴を滴加する。色が変わるまで0.1N水
酸化ナトリウム溶液を加える。これにより自発的
な顆粒化が生ずる。次に、燐酸緩衝化（注射用燐
酸緩衝液）塩化ナトリウム等張液の10倍濃度のも
の0.2mlを加えることによりPHを7.4近くに緩衝化
する。こうして得られる分散体は細胞培養中又は
ラツトの生体内で胞状マクロフアージを活性化す
るのに直接使用するのに適する。 例 17 0.15ｇのＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニル−２−（1′，
2′−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3′−ホスフ
オリル）エチルアミド、97％のホスフアチジルコ
リンを含む卵−レシチン27ｇ、及び３ｇの卵−ホ
スフアチジン酸を200mlのクロロホルムと20mlの
メタノールの混合物に溶解し、200mlのtert−ブ
タノールを加え、そして溶液を180mlに濃縮する。
この溶液を、無菌条件下0.2μｍのフイルターで
過し、エタノール／ドライアイス混合物中で急激
に凍結し、そして次に凍結乾燥する。激しく撹拌
しながら、細砕した凍結乾燥物を300mlの無菌の
0.01N水酸化ナトリウム溶液に加え、そして完全
に分散せしめる。水性相を0.1NHClで中和し、
乳白色の分散体を、限外過板の代りに、ポリカ
ーボネート製の孔径0.1μｍの均一孔過板〔ヌク
レオポア（Nucleopore） 〕（粒子が付着してい
ないように洗浄したもの）を装着した撹拌限外
過セル〔アミコン（Amicon） 〕に入れる。わ
ずかな加圧下で、ドウルベコ（DuL becco）の
無菌緩衝溶液（PH7.4、Ca及びMgを含まない）
を、セル中の液量が300mlより少なくならないよ
うに連続的に加えながら分散体を過する。３
の液が通過した後、すべてのKULが分離され、
上に残つたGULの分散体はアンプルに詰め、そ
して治療試験に使用することができる。 例 18 15mgのＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニル−２−（1′，
2′−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3′−ホスホ
リル）エチルアミド、0.6ｇの純卵−レシチン及
び2.4ｇの卵−ホスフアチジン酸を20mlのクロロ
ホルムと２mlのメタノールとの混合液に溶解す
る。この溶液を、0.2μｍのフイルターを通して無
菌条件下で過し、そして無菌フイルターで空気
を遮断し、そして粒子が付着していないように洗
浄したロータリーエバポレーターを用いて、500
ml丸型フラスコ中で濃縮し、フラスコの壁に好ま
しくは単一の膜が形成されるように脂質混合物を
乾燥する。残渣を高真空下で一夜乾燥した後、無
菌の0.01N水酸化ナトリウム30mlを加え、そして
フラスコを封じ、５分間振とうする。こうして得
た乳白色の水性相のPHを、無菌の0.1N塩酸を加
えることにより7.4に調整する。この分散体を例
23に記載したように撹拌フイルターセル（全容
100ml）に入れ、そして過する。この間に、粒
子を含有しなくなるまで過した無菌水を、液
が500ml得られるまで加える。この液を、限外
過板、例えばアミコン（Amicon）U10 を装
着した撹拌過セルに連続的に供給し、そして30
mlまで濃縮する。濃縮された分散体は小形単層脂
質顆粒を含有しており、そしてドウルベコの燐酸
緩衝液（PH7.4、Ca及びMgを含有しない）を加
えた後アンプルに詰め、そして治療試験に使用す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ a1） 次の式(A) 〔式中、ｍは１であり；基R₁及びR₂の内の
   １つは水素又はヒドロキシ基であり他方の基は
   それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、ア
   ルケニル基、アルコキシ基もしくはアルケニル
   オキシ基、又は炭素原子数10〜20個のアシルオ
   キシ基であり；R₃は水素であり；そしてR₄は
   水素、炭素原子数１〜７個のアルキル基、又は
   炭素原子数１〜７個のアルキル基（カルボキ
   シ、スルホ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ
   −低級アルキルアミノ、カルボキシ及びアミ
   ノ、遊離もしくはエステル化されたヒドロキ
   シ、ハロゲン、低級アルコキシカルボニル、又
   は低級アルカンスルホニルにより置換されてい
   る）である〕で表わされる脂質及び適当な追加
   の脂質をPH値が11より高い水性相に分散せし
   め、あるいは、 a2） ｍが１であり；R₁及びR₂が相互に独立し
   て、それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル
   基、アルケニル基、アルコキシ基もしくはアル
   ケニルオキシ基、又は炭素原子数10〜20個のア
   シルオキシ基であり；R₃及びR₄が水素である
   式(A)の脂質及び場合によつては適当な追加の脂
   質をPH値が11より高い水性相に分散せしめ、あ
   るいは、 b1） ｍが１であり；基R₁及びR₂の内の１つが
   水素又はヒドロキシ基であつて他方の基がそれ
   ぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、アルケ
   ニル基、アルコキシ基もしくはアルケニルオキ
   シ基、又は炭素原子数10〜20個のアシルオキシ
   基であり；R₃が水素であり；そしてR₄はアン
   モニオ基で置換された低級アルキル基である式
   (A)の脂質、及び場合によつては追加の脂質をPH
   値が１より低い水性相に分散せしめ、あるい
   は、 b2） ｍが１であり；R₁及びR₂が相互に独立に、
   それぞれ炭素原子数10〜20個のアルキル基、ア
   ルケニル基もしくはアルケニルオキシ基、又は
   炭素原子数10〜20個のアシルオキシ基であり；
   R₃が水素であり；そしてR₄がアンモニオ低級
   アルキルアンモニオ基で置換された低級アルキ
   ル基である式(A)の脂質、及び適当な追加の脂質
   をPH値が１より低い水性相に分散せしめ、 そして必要であれば、前記a1），a2），b1）又
   はb2）段階の後、水性相を中和し、そして所望
   により得られた単層脂質顆粒を濃縮しそして／又
   は分離することを特徴とする単層脂質顆粒の製造
   方法。 ２ 水性分散体が、ｍが１であり、R₁が炭素原
   子数10〜20個のアルキル基、炭素原子数10〜20個
   のアルコキシ基又は炭素原子数10〜20個のアシル
   オキシ基であり、R₂が水素又はヒドロキシ基で
   あり、R₃が水素であり、そしてR₄が水素、炭素
   原子数１〜４個の低級アルキル基、カルボキシ及
   びアミノ基により置換された炭素原子数１〜５個
   の低級アルキル基、ヒドロキシ−低級アルキル
   基、低級アルキレンジオキシ−低級アルキル基、
   又はハロ−低級アルキル基である式(A)の脂質、並
   びにR₁及びR₂が炭素原子数10〜20個のアシルオ
   キシ基であり、R₃が水素であり、そしてR₄が２
   −トリメチルアンモニオエチル基又は２−アミノ
   エチル基である式(A)の追加の脂質を含有する特許
   請求の範囲第１項記載のa1の方法。 ３ 水性分散体が、R₁及びR₂がラウロイルオキ
   シ基、ミリストイルオキシ基、パルミトイルオキ
   シ基ももくはステアロイルオキシ基であり、R₃
   が水素であり、そしてR₄が水素である式(A)の脂
   質、及び場合によつては、R₁及びR₂がラウロイ
   ルオキシ基、ミリストイルオキシ基、パルミトイ
   ルオキシ基又はステアロイルオキシ基であり、
   R₃が水素であり、そしてR₄が２−トリメチルア
   ンモニオエチル基、２−アミノエチル基、又はω
   −アミノ−ω−カルボキシ低級アルキル基である
   式(A)で示される追加の脂質を含有する特許請求の
   範囲第１項記載のa2の方法。 ４ 水性分散体が天然リソホスフアチジン酸もし
   くは合成リソホスフアチジン酸、天然リソホスフ
   アチジルセリンもしくは合成リソホスフアチジル
   セリン、又はリソホスフアチジルグリセロール、
   そしてさらに天然レシチン、同一のアシルオキシ
   基を有する合成レシチン、異なるアシルオキシ基
   を有する合成レシチン、又はさらに天然セフアリ
   ンもしくは異なるアシルオキシ基を有する合成セ
   フアリンを含有する特許請求の範囲第１項記載の
   a1の方法。 ５ 水性分散体が天然ホスフアチジン酸、合成ホ
   スフアチジン酸及び場合によつては、さらに天然
   レシチン、同一のアシルオキシ基を有する合成レ
   シチンもしくは異なるアシルオキシ基を有する合
   成レシチン、又は天然セフアリンもしくは異なる
   アシルオキシ基を有する合成セフアリン、又は天
   然ホスフアチジルセリンもしくは合成ホスフアチ
   ジルセリンを含有する特許請求の範囲第１項記載
   のa2の方法。