JPH0380478B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0380478B2 JPH0380478B2 JP7704683A JP7704683A JPH0380478B2 JP H0380478 B2 JPH0380478 B2 JP H0380478B2 JP 7704683 A JP7704683 A JP 7704683A JP 7704683 A JP7704683 A JP 7704683A JP H0380478 B2 JPH0380478 B2 JP H0380478B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- hydrogen peroxide
- nadh
- substrate
- peroxidase
- Prior art date
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、過酸化水素を検出系に用いる基質又
は酵素の測定法の改良に関する。
は酵素の測定法の改良に関する。
従来、過酸化水素を検出系に用いる基質又は酵
素の測定法において、生成した過酸化水素を定量
する方法としては、ペルオキシダーゼの存在下で
４−アミノアンチピリンとフエノール、Ｐ−クロ
ロフエノール、ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルメタトルイジン、TOOS（Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンナトリウム）等とを酸化縮合反応させて
発色せしめ、これを比色定量する手法が知られて
いる。この比色定量は所謂可視部領域における測
定をおこなうものであつた。しかし、このような
従来法によれば、チユーブやセルが着色してしま
い、使用後の液を廃棄すると公害の原因となり、
また相対的な測定しかできないから試薬ブランク
の変動に対して安定したデータがえられないとい
う欠点を有するものであつた。
素の測定法において、生成した過酸化水素を定量
する方法としては、ペルオキシダーゼの存在下で
４−アミノアンチピリンとフエノール、Ｐ−クロ
ロフエノール、ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルメタトルイジン、TOOS（Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンナトリウム）等とを酸化縮合反応させて
発色せしめ、これを比色定量する手法が知られて
いる。この比色定量は所謂可視部領域における測
定をおこなうものであつた。しかし、このような
従来法によれば、チユーブやセルが着色してしま
い、使用後の液を廃棄すると公害の原因となり、
また相対的な測定しかできないから試薬ブランク
の変動に対して安定したデータがえられないとい
う欠点を有するものであつた。
本発明者は、従来法の上記欠点を解消すべく鋭
意研究した結果本発明に到達したもので、生成し
た過酸化水素を可視部領域でなく紫外部領域で測
定するようにした点に本発明の一つの特徴が存在
する。
意研究した結果本発明に到達したもので、生成し
た過酸化水素を可視部領域でなく紫外部領域で測
定するようにした点に本発明の一つの特徴が存在
する。
一般的にいえば、紫外部領域での測定法とは、
脱水素酵素によつて変化するNAD（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）又はNADP（ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート）
→NADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド還元型）又はNADPH（ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート還元型）、若しく
はNADH又はNADPH→NAD又はNADPの吸光
度の増加もしくは減少を測定する方法を指称する
ものである。しかし、この方法は測定コストが高
くなるという不利があつた。なお、紫外部領域で
の脱水素酵素を用いた測定法の具体例を下記(1)(2)
(3)に示すが、その他に非常に多くの例が知られて
いる。
脱水素酵素によつて変化するNAD（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）又はNADP（ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート）
→NADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド還元型）又はNADPH（ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート還元型）、若しく
はNADH又はNADPH→NAD又はNADPの吸光
度の増加もしくは減少を測定する方法を指称する
ものである。しかし、この方法は測定コストが高
くなるという不利があつた。なお、紫外部領域で
の脱水素酵素を用いた測定法の具体例を下記(1)(2)
(3)に示すが、その他に非常に多くの例が知られて
いる。
(1) 乳酸脱水素酵素
(2) グルコースの定量
(3) アミラーゼの定量
マルトースペンタオースアミラーゼ
――――――→
マルトース＋トリオース
マルトース、トリオースα−グルコシターゼ
―――――――――――→
Ｄ−グルコース
上記式中、マルトースペンタオースはG5（グル
コースが５個結合したもの）であり、マルトース
はG2及びトリオースはG3である。又ATPはアデ
ノシントリホスフエート、ADPはアデノシンジ
ホスフエートである。
コースが５個結合したもの）であり、マルトース
はG2及びトリオースはG3である。又ATPはアデ
ノシントリホスフエート、ADPはアデノシンジ
ホスフエートである。
更に、本発明者は、過酸化水素とNADHの反
応がペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアン
チピリンを加えることによつてその反応性を著し
く増加するということを見いだし本発明を完成し
たものである。
応がペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアン
チピリンを加えることによつてその反応性を著し
く増加するということを見いだし本発明を完成し
たものである。
本発明の目的は、分子吸光係数による測定が
でき、チユーブやセルの着色の虞がなく測定機
械を傷つけることがない、着色物質が生成しな
いため公害の心配がない、試薬ブランクの変動
に対して安定なデータがえられる、従来の
NADHペルオキシダーゼを用いる方法よりもコ
ストが安く、従来法の脱水素酵素を用いる場合
よりもコストが低くなるようにした基質又は酵素
の測定法を提供することである。
でき、チユーブやセルの着色の虞がなく測定機
械を傷つけることがない、着色物質が生成しな
いため公害の心配がない、試薬ブランクの変動
に対して安定なデータがえられる、従来の
NADHペルオキシダーゼを用いる方法よりもコ
ストが安く、従来法の脱水素酵素を用いる場合
よりもコストが低くなるようにした基質又は酵素
の測定法を提供することである。
本発明の要旨は、過酸化水素を検出系に用いる
基質又は酵素の測定法において、ペルオキシダー
ゼと４−アミノアンチピリンの存在下に生成した
過酸化水素とNADH又はNADPHとを反応させ
てNAD又はNADPを生成させ該NADH又は
NADPHの変化量により該生成した過酸化水素
を定量することによつて基質又は酵素を測定する
ようにしたことを特徴とする基質又は酵素の測定
法に存する。
基質又は酵素の測定法において、ペルオキシダー
ゼと４−アミノアンチピリンの存在下に生成した
過酸化水素とNADH又はNADPHとを反応させ
てNAD又はNADPを生成させ該NADH又は
NADPHの変化量により該生成した過酸化水素
を定量することによつて基質又は酵素を測定する
ようにしたことを特徴とする基質又は酵素の測定
法に存する。
本発明の測定例としては下記のごときものがあ
る。
る。
(1) グルコースの定量
α−グルコースムタロターゼ
―――――――→
β−グルコース
上式中、4AAは４−アミノアンチピリンで
ある。
ある。
(2) アミラーゼの定量
()
マルトペンタオースアミラーゼ
――――――→
マルトース＋マルトトリオース
マルトース、マリトトオース
α−グルコシダーゼ
―――――――――――→
α−グルコース
α−グルコースムタロダーゼ
―――――――→
β−グルコース
なお、上式中、ムタロターゼとグルコース
オキシダーゼの代わりにピラノースオキシダ
ーゼを用いることができる。
オキシダーゼの代わりにピラノースオキシダ
ーゼを用いることができる。
また、血清、尿中の内因性のグルコースを
消去するために次の反応を用いることができ
る。
消去するために次の反応を用いることができ
る。
(a) カタラーゼによる消去法
α−グルコースムタロダーゼ
―――――――→
β−グルコース
なお、上式中、ムタロターゼとグルコー
スオキシダーゼの代わりにピラノースオキ
シダーゼを用いることができる。また、内
因性グルコースを消去後、NaN3とマルト
ペンタオースを含む試薬でアミラーゼ反応
をスタートさせる。NaN3によつてカタラ
ーゼの反応を止めることもできる。
スオキシダーゼの代わりにピラノースオキ
シダーゼを用いることができる。また、内
因性グルコースを消去後、NaN3とマルト
ペンタオースを含む試薬でアミラーゼ反応
をスタートさせる。NaN3によつてカタラ
ーゼの反応を止めることもできる。
(b) 水素供与体による消去法
ムタローゼとグルコースオキサダーゼに
よつて生成したH2O2をペルオキシダーゼ
の存在下でTOOSのような水素供与体で消
去する。４−アミノアンチピリンとマルト
ペンタオースを含む試薬でアミラーゼ反応
をスタートさせる。
よつて生成したH2O2をペルオキシダーゼ
の存在下でTOOSのような水素供与体で消
去する。４−アミノアンチピリンとマルト
ペンタオースを含む試薬でアミラーゼ反応
をスタートさせる。
(c) ヘキソキナーゼによる消去法
この例では、基質としてマルトペンタオ
ース（G5）を用いた場合を示したが、そ
の他の基質、例えばG4、G6、G7等のオリ
ゴ糖、また次に示すごとく修飾デンプンを
用いることもできる。
ース（G5）を用いた場合を示したが、そ
の他の基質、例えばG4、G6、G7等のオリ
ゴ糖、また次に示すごとく修飾デンプンを
用いることもできる。
()
修飾デンプンアミラーゼ
――――――→
ｎ−グルコース
ｎ−グルコースグルコアミラーゼ
――――――――――→
β−グルコース
なお、上記の説明ては、ベルオキシダーゼ
と４−アミノアンチピリンとを組み合わせて
用いる方法を述べたが、４−アミノアンチピ
リンを加えることなくNADHペルオキシダ
ーゼ単独で同様の反応を行わせることも可能
である。
と４−アミノアンチピリンとを組み合わせて
用いる方法を述べたが、４−アミノアンチピ
リンを加えることなくNADHペルオキシダ
ーゼ単独で同様の反応を行わせることも可能
である。
(3) 尿酸の定量
尿酸ウリカーゼ
――――――→
アラントイン＋H2O2
その他、本発明は、コレステロールエステラ
ーゼとコレステロールオキシダーゼを組み合わ
せる総コレステロールの定量、コレステロール
オキシダーゼを用いる遊離コレステロールの定
量、リポプロテインリパーゼとグリセロキナー
ゼとＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを組
み合わせる中性脂肪の定量、ベンゾイルコリン
を基質としてコリンオキシダーゼを用いるコリ
ンエステラーゼの定量、ホスホリパーゼＤ又は
ホスホリパーゼＣとコリンオキシダーゼを用い
るリン脂質の定量に適用可能である。
ーゼとコレステロールオキシダーゼを組み合わ
せる総コレステロールの定量、コレステロール
オキシダーゼを用いる遊離コレステロールの定
量、リポプロテインリパーゼとグリセロキナー
ゼとＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを組
み合わせる中性脂肪の定量、ベンゾイルコリン
を基質としてコリンオキシダーゼを用いるコリ
ンエステラーゼの定量、ホスホリパーゼＤ又は
ホスホリパーゼＣとコリンオキシダーゼを用い
るリン脂質の定量に適用可能である。
以下に、本発明の実施例を挙げてさらに説明す
る。
る。
実施例 １
過酸化水素の定量
試薬組成
リン酸緩衝液 ……100ｍＭ、PH7.0
ペルオキシダーゼ ……2.4U／ml
４−アミノアンチピリン ……0.5ｍＭ
NADH ……1.5ｍＭ
試薬３mlに各濃度のH2O250μlを添加し、37℃
で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化を
340nｍで測定し、H2O2量に対する直線性を調べ
た。その結果を第１図に示したが良好な直線性を
示した。
で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化を
340nｍで測定し、H2O2量に対する直線性を調べ
た。その結果を第１図に示したが良好な直線性を
示した。
実施例 ２
グルコースの測定
試薬組成
リン酸緩衝液 ……100ｍＭ、PH7.0
４−アミノアンチピリン ……0.5ｍＭ
NADH ……1.5ｍＭ
ペルオキシダーゼ ……2.4U／ml
ムタロターゼ ……0.5U／ml
グルコースオキシダーゼ ……60U／ml
試薬３mlに各濃度のグルコースを20μl添加し、
37℃で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化
を340nｍで測定し、グルコース量に対する直線
性を調べた。その結果を第２図に示したが良好な
直線性を示した。
37℃で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化
を340nｍで測定し、グルコース量に対する直線
性を調べた。その結果を第２図に示したが良好な
直線性を示した。
実施例 ３
尿酸の測定
試薬組成
リン酸緩衝液 ……100ｍＭ、PH7.0
４−アミノアンチピリン ……0.5ｍＭ
NADH ……1.5ｍＭ
ペリルオキシダーゼ ……2.4U／ml
ウリカーゼ ……0.076U／ml
試薬３mlに各濃度の尿酸を100μl添加し、37℃
で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化を
340nｍで測定し、尿酸量に対する直線性を調べ
た。その結果を第３図に示したが良好な直線性を
示した。
で10分間反応させた。反応前後の吸光度変化を
340nｍで測定し、尿酸量に対する直線性を調べ
た。その結果を第３図に示したが良好な直線性を
示した。
実施例 ４
アミラーゼの測定
試薬組成
Ｒ・１液
リン酸緩衝液 ……100ｍＭ、PH7.0
グルコースオキシダーゼ ……60U／ml
ムタロターゼ ……0.5U／ml
ペルオキシダーゼ ……2.4U／ml
α−グルコシダーゼ ……30U／ml
CaCl2 ……0.6ｍＭ
４−アミノアンチピリン ……0.5ｍＭ
Ｒ・２液
マルトペンタオース ……３ｍＭ
NADH ……0.45ｍＭ
リン酸緩衝液 ……100ｍＭ、PH7.0
Ｒ・１液２mlに試料（アミラーゼ）20μlを添加
し、37℃で５分間程度加温した後、Ｒ・２液を
0.5ml添加し、反応をスタートさせる。Ｒ・２液
添加後340nｍでΔE／minを読み、アミラーゼ量
に対する直線性を調べた。その結果を第４図に示
したが良好な直線性を示した。なお、第５図にブ
ランクと２種類の試料について反応の経時変化を
示した。
し、37℃で５分間程度加温した後、Ｒ・２液を
0.5ml添加し、反応をスタートさせる。Ｒ・２液
添加後340nｍでΔE／minを読み、アミラーゼ量
に対する直線性を調べた。その結果を第４図に示
したが良好な直線性を示した。なお、第５図にブ
ランクと２種類の試料について反応の経時変化を
示した。
第１図は過酸化水素量に対する直線性を示す図
面、第２図はグルコース量に対する直線性を示す
図面、第３図は尿酸量に対する直線性を示す図
面、第４図はアミラーゼ量に対する直線性を示す
図面及び第５図はアミラーゼの測定についての経
時変化を示す図面である。
面、第２図はグルコース量に対する直線性を示す
図面、第３図は尿酸量に対する直線性を示す図
面、第４図はアミラーゼ量に対する直線性を示す
図面及び第５図はアミラーゼの測定についての経
時変化を示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 過酸化水素を検出系に用いる基質又は酵素の
測定法において、ペルオキシダーゼと４−アミノ
アンチピリンの存在下に生成した過酸化水素と
NADH又はNADPHとを反応させてNAD又は
NADPを生成させ該NADH又はNADPHの変化
量により該生成した過酸化水素を定量することに
よつて基質又は酵素を測定するようにしたことを
特徴とする基質又は酵素の測定法。 ２ 基質としてマルトペンタオース等のオリゴ糖
及び修飾デンプン等を用いかつ酵素として酸化酵
素とペルオキシダーゼを用い、生成した過酸化水
素を定量することによつてアミラーゼの活性を測
定するようにしたことを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7704683A JPS59203500A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 基質又は酵素の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7704683A JPS59203500A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 基質又は酵素の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59203500A JPS59203500A (ja) | 1984-11-17 |
| JPH0380478B2 true JPH0380478B2 (ja) | 1991-12-25 |
Family
ID=13622830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7704683A Granted JPS59203500A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 基質又は酵素の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59203500A (ja) |
-
1983
- 1983-04-30 JP JP7704683A patent/JPS59203500A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59203500A (ja) | 1984-11-17 |
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