JPH04335899A - Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等におけるＬ−グリセロール−３−リン酸またはジ
ヒドロキシアセトンリン酸の酵素サイクリング反応を用
いた新規な高感度定量法および定量用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、臨床検査分野において、成分分析
には化学法に代わり、より特異性の高い酵素法が普及し
つつある。Ｌ−グリセロール−３−リン酸を測定する方
法としては、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（
ＥＣ　　１．１．３．２１）を用いて、生じた過酸化水
素をペルオキシダーゼ反応等を用いて検出可能な物質に
変換する方法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ホスフエート）（ＮＡＤ（Ｐ））の存在下にグリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．
１．８、ＥＣ　　１．１．１．９４）を用いて還元型補
酵素の３４０ｎｍにおける吸収を分光学的に測定する方
法等が知られており、これらの方法は、例えば血清中の
トリグリセライドやグリセロールを測定する際に、Ｌ−
グリセロール−３−リン酸を生成する他の酵素反応系と
併せて、共役反応系として用いられている。

【０００３】このうち、グリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼは下記の反応を触媒する酵素である。

【化２】 この反応は、平衡が大きく左側に偏っているため、Ｌ−
グリセロール−３−リン酸を定量するときのように、正
反応の方向に反応を進行させるためには、反応液のｐＨ
を９〜１０のアルカリ側にし、しかも、生成物であるジ
ヒドロキシアセトンリン酸を反応系から除去することが
必要になる。このためには、反応液にヒドラジンやセミ
カルバジド等の捕捉剤を加え正反応を促進させなければ
ならない。また、生成した還元型ＮＡＤ（Ｐ）をジアホ
ラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを用いてホルマザ
ン色素とし、測定する方法もあるが、この色素は不溶性
であり、自動分析器には適さない。グリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼは、その逆反応を利用して、ジ
ヒドロキシアセトンリン酸の定量のためにも用いられる
。この反応系はアルドラーゼ（ＥＣ　　４．１．２．１
３）、トリオ−スリン酸イソメラーゼ（ＥＣ　　５．３
．１．１）活性測定等に活用されている。

【０００４】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行われ、
この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象
物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普及し
ているが、これも感度上に限界があり、測定対象物の含
量が少ない場合適さないという欠点があった。そこで、
測定対象物の含量が少ない場合や、測定対象物を含む被
検体が少量の場合等は、分光分析よりも感度の優れた蛍
光分析、発光分析等が行われている。しかしながら、こ
れらの方法も臨床検査等の汎用検査においては、機器の
普及という点からはあまり適したものではなかった。

【０００５】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる場合、
２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆる酵
素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡＤサイ
クリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリングな
どがあるが、これらの方法は臨床検査等のルーチン分析
においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられていない
のが現状であった。しかしながら、最近、グリセロール
−３−リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼを組合せた、操作の簡便な酵素サイ
クリング反応によるＬ−グリセロール−３−リン酸また
はジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法が報告さ
れているが（特公平２−２０２３９号）、これらは具体
的には、該サイクリング反応によって減少する還元型Ｎ
ＡＤの量または増加する過酸化水素量を検出するもので
あり、還元型ＮＡＤの３４０ｎｍにおける吸光度の減少
を分光学的に測定する以外には、別の検出のための反応
系を組み合わせて、これらの変化量を検出しなければな
らない。

【０００６】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができる
。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を増
やすことも可能である。更に、検体が人血液である場合
などは、採血量を減らすことができるため、被採血者へ
の心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の減
少により環境汚染を軽減することに貢献することにもな
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとくＬ−グリ
セロール−３−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸
の酵素を用いた測定について種々の方法が知られており
、酵素サイクリング法による高感度な測定法も報告され
ているが、それらの欠点を有さない更に簡便で高感度な
方法が望まれている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、Ｌ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の定量におい
て、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下、チオＮＡＤ類という）およびチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート類（以下、チオＮＡ
ＤＰ類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類と
いう）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）からなる群よ
り選ばれた一つの補酵素に作用するグリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼおよびチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮ
ＡＤ（Ｐ）類との２種の補酵素を用いることにより、サ
イクリング反応を形成せしめることを見出し、かつその
反応後における吸光度の測定に際し、ＮＡＤ（Ｐ）類の
アナログであるチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類の
還元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ
付近と異なつていることを利用し、他物質の吸収波長の
混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、高
感度な測定が可能であることを確認し、本発明を完成す
るに至った。

【０００９】即ち、グリセロール−３−リン酸デヒロゲ
ナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに当り
、上記二種類の補酵素の一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類を使
用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別定量
するものであり、その結果、Ｌ−グリセロール−３−リ
ン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を高感度に測定
できるものである。

【００１０】本発明は、上記のような知見に基づいて完
成されたものであって、Ｌ−グリセロール−３−リン酸
またはジヒドロキシアセトンリン酸を含有する被検液に
、（１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡ
Ｄ類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下Ｎ
ＡＤＰ類という）及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチオド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ば
れる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール
−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸
を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する
試薬を作用せしめて、次の反応式

【００１１】

【化１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類
、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元
型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチ
オＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡ
Ｄ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元
型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリン
グ反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２また
はＢ１の量を測定することを特徴とするＬ−グリセロー
ル−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高
感度定量法を提供するものである。

【００１２】更にまた本発明は、次の成分（１）〜（３
） （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれ
た一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、（但し、Ａ１
はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮ
ＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１
はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還
元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類また
は還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有することを特徴と
するＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシ
アセトンリン酸の定量用組成物を提供するものである。

【００１３】本発明において用いられる、グリセロール
−３−リン酸デヒドロゲナーゼとは少なくともＬ−グリ
セロール−３−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）＋　＝ジヒドロキ
シアセトンリン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋　なる反応を
触媒するものであって、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡ
Ｄ類からなる群より選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類および
ＮＡＤ類からなる群より選ばれた一つを補酵素とするも
のなら特に限定されない。

【００１４】本酵素の具体例としては、ウサギ筋肉やサ
ツカロミセス　　カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）等
に由来するＮＡＤに特異的な酵素（ＥＣ　　１．１．１
．８）と、ＮＡＤおよびＮＡＤＰ両方の補酵素に作用す
る大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の酵素（ＥＣ　　１．１
．１．９４）が知られている（酵素ハンドブツク、ｐ３
、ｐ３５、朝倉書店（１９８３）。このうち、ウサギ筋
肉由来の酵素は例えば、ベーリンガーマンハイム社、シ
グマ社より市販されており、補酵素に対する相対活性は
１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．５）ではＮＡＤを用い
た時を１００％とすると、チオＮＡＤで２％程度であり
、ＮＡＤＰには作用しない。ＮＡＤＰについては、逆反
応で１０％程度の活性を示すという報告もある（臨床酵
素ハンドブツク、ｐ２６０、講談社（１９８２））。他
の起源の酵素についても適宜系に使用可能であり、使用
する酵素の補酵素ＮＡＤ（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類
に対する特異性としては、基質であるＬ−グリセロール
−３−リン酸に対して反応性を有するものであればよく
、そのような酵素の性質はこれら補酵素と基質を用いて
確認できるものである。

【００１５】又、Ａ１およびＢ２で示される補酵素はチ
オＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を
示すが、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、
例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチドホスフエート、およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げ
られる。

【００１６】又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、
例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、ニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエー
ト（デアミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニン
ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒ
ポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサ
ンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられる
。

【００１７】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ１の関係
において一つのチオ型補酵素を使用するものである。又
、定量に用いるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、上
述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるグリセ
ロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ
Ｐ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤＰ類
及びＮＡＤＰ類より、また用いるグリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び（チオ）
ＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合は、上述のチオＮＡ
Ｄ類およびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類およびＮＡ
ＤＰ類より適宜選択して用いればよい。

【００１８】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されているＬ−グリセロール−３−リ
ン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測定すること
ができるが、更に、これらの物質を遊離または生成する
酵素系における基質や、その酵素活性を測定することも
できる。更に、本発明の高感度定量法を用いれば、上記
のようなＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロ
キシアセトンリン酸を遊離、または生成する酵素系と連
結し得る、単一の、もしくは複数の工程からなる酵素系
における基質や、その酵素活性をも測定することができ
る。これらの酵素系は、特に限定されるものではないが
、例えば以下に示す種々の酵素の反応系が挙げられる。

【００１９】Ｌ−グリセロール−３−リン酸を遊離生成
する酵素反応系： （１）ＡＴＰ、グリセロールとグリセロキナーゼ（ＥＣ
　　２．７．１．３０）の酵素反応系によって遊離、生
成するＬ−グリセロール−３−リン酸を定量するための
もの。 グリセロール＋ＡＴＰ→Ｌ−グリセロール−３−リン酸
＋ＡＤＰ （２）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロールが
ホスフアチジルグリセロールとホスホリパーゼＤ（ＥＣ
　　３．１．４．４）の酵素反応系由来である場合ホス
フアチジルグリセロール＋Ｈ２　Ｏ→グリセロール＋ホ
スフアチジン酸 （３）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロールが
、モノ、ジまたはトリグリセライドとリパーゼ（ＥＣ　
　３．１．１．３）の酵素反応系由来である場合

【００
２０】グリセライド＋ｎＨ２　Ｏ→ｎ脂肪酸＋グリセロ
ール （４）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰとクレアチンキナーゼ（ＥＣ　　
２．７．３．２）の酵素反応系由来である場合クレアチ
ンリン酸＋ＡＤＰ→クレアチン＋ＡＴＰ（５）上記（１
）の酵素反応系におけるＡＴＰが、ホスフオエノールピ
ルビン酸、ＡＤＰとピルビン酸キナーゼ（ＥＣ　　２．
７．１．４０）の酵素反応系由来である場合 ホスフオエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋Ａ
ＴＰ （６）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、アセ
チルリン酸、ＡＤＰと酢酸キナーゼ（ＥＣ　　２．７．
２．１）の酵素反応系である場合 アセチルリン酸＋ＡＤＰ→酢酸＋ＡＴＰ

【００２１】ジ
ヒドロキシアセトンリン酸を遊離、生成する酵素反応系
： （７）フルクトース−１，６−ジリン酸とフルクトース
ジリン酸アルドラーゼ（ＥＣ　　４．１．２．１３）の
酵素反応系によって遊離、生成するジヒドロキシアセト
ンリン酸を定量するためのもの フルクトース−１，６−ジリン酸→Ｄ−グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸＋ジヒドロキシアセトンリン酸（８）
Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とトリオースホス
フエートイソメラーゼ（ＥＣ　　５．３．１．１）の酵
素反応系由来である場合 Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸→ジヒドロキシア
セトンリン酸

【００２２】Ａ１およびＢ１の量は被検体中のＬ−グリ
セロール−３−リン酸とヒドロキシアセトンリン酸の合
計量に比較して過剰量であること、かつグリセロール−
３−リン酸デヒドロゲナーゼのＡ１及びＢ１それぞれに
対するＫｍ値に比較して過剰量であることが必要であり
、特にＬ−グリセロール−３−リン酸とジヒドロキシア
セトンリン酸の合計量の２０〜１００００倍モルが好ま
しい。本発明のＬ−グリセロール−３−リン酸またはジ
ヒドロキシアセトンリン酸定量用組成物においては、Ａ
１及びＢ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０
５〜２０ｍＭが好ましく、グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの量は１０〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２
０〜４００ｕ／ｍｌが好ましいが、その量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。

【００２３】また本発明にはその変形例として、以下の
方法も包含するものである。即ち、本発明はＬ−グリセ
ロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸
を含有する被検液に、（１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮ
ＡＤ類からなる群より選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及び
ＮＡＤ類からなる群より選ばれる一つとを補酵素とし、
少なくともＬ−グリセロール−３−リン酸を基質として
ジヒドロキシアセトンリン酸を生成する可逆反応をなす
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ
１、（３）Ｂ１または／およびＢ２、（４）Ｌ−グリセ
ロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２からＢ１への反応
を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ及び該第二のデヒ
ドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、
次の反応式

【００２４】

【化３】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を、Ｂ２はＢ１の酸
化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応はＢ２を補酵
素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１を生成する酵
素反応を示す）で表されるサイクリング反応を形成せし
め、該反応によって変化するＡ２の量を測定することを
特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒド
ロキシアセトンリン酸の高感度定量法である。

【００２５】本発明に包含される上記の方法においては
、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤ
類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合、２つの補酵
素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組
合せ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤ
Ｐ類との組合せを選んだときには、さらに、被検体に（
４）成分のＬ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、
Ｂ２からＢ１への反応を形成する第二のデヒドロゲナー
ゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめる
ことにより、後記反応式（ＩＩ）のごとく、Ｂ１とＢ２
の間にＢ１の再生のための反応系を付与せしめることに
より当該サイクリング反応を形成させるのである。

【００２６】この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＡ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ａ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができる。定量に際して
は反応により生成したＡ２の量を測定する。

【００２７】

【化４】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
ときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ
１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１の
酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応はＢ２を補
酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示す）

【００２８
】上記の成分（４）を用いるＬ−グリセロール−３−リ
ン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸定量用組成物に
おいて、Ａ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．
０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／及びＢ１の濃
度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μＭが好
ましい。Ｌ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２０〜５００
ｕ／ｍｌが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ２に
対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）
以上になるように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ
／ｍｌが好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質
は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これ
らの量は被検体の種類等により適宜決定することができ
、これ以上の量を用いることもできる。

【００２９】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。又、Ｂ１の代わりにＢ２あるいは
Ｂ１とＢ２の混合物を用いて反応を行つてもよい。この
場合、Ｂ１または／及びＢ２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以下が
好ましい。

【００３０】第二のデヒドロゲナーゼ及びその基質とし
ては、例えばＢ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１
．１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（
ＥＣ　　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリ
セロール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１
．１１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リン
ゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ　　１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、
Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸と
リン酸。

【００３１】Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類の
ときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ　　１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコース−
６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　
１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエ
ン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．
１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｏｘａｌａｔ
ｉｃｕｓ由来）ＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．４４）（
ラツト肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホス
ホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ　　１．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸
、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．２
．１．７）（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。

【００３２】さらに、本発明の別の変形例としては、以
下の各方法もまた本発明に包含される。即ち、本発明は
Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセ
トンリン酸を含有する被検液に、（１）チオＮＡＤＰ類
及びチオＮＡＤ類からなる群より選ばれた一つと、ＮＡ
ＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群より選ばれる一つとを補
酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−３−リン酸を
基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を生成する可逆
反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
、（２）Ａ１または／およびＡ２、（３）Ｂ１、（５）
Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ａ２からＡ
１への反応を形成する第三のデヒドゲロゲナーゼ及び該
第三のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用
せしめて、次の反応式（ＩＩＩ）

【００３３】

【化５】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１への反応はＡ２を
補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ１を生成す
る酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応を形成
せしめ、該反応によって変化するＢ１の量を測定するこ
とを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジ
ヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法である。

【００３４】更に、本発明は次の成分（１）〜（４）（
１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群より
選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロ
ール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリ
ン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、（３）Ｂ１または／およびＢ２、（４）Ｌ
−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２からＢ１
への反応を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ及び該第
二のデヒドロゲナーゼの基質、

【００３５】（但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有することを
特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒド
ロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。

【００３６】更にまた、本発明は次の成分（１）〜（３
）および（５） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１または／および
Ａ２、（３）Ｂ１、（５）Ｌ−グリセロール−３−リン
酸に作用せず、Ａ２からＡ１への反応を形成する第三の
デヒドゲロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基
質、

【００３７】（但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有することを
特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒド
ロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。

【００３８】上記した本発明に包含される測定方法、定
量組成物においては、グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とす
る場合、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしく
はＮＡＤＰ類との組合せ、または、チオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せを選んだときには
、更に被検体に（５）成分のＬ−グリセロール−３−リ
ン酸に作用せず、Ａ２からＡ１への反応を形成する第三
のデヒドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめることにより、後記反応式（ＩＩＩ）の
ごとく、Ａ１とＡ２の間にＡ１の再生のための反応系を
付与せしめることにより当該サイクリング反応を形成さ
せるのである。

【００３９】この場合、第三のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＢ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ｂ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ｂ１とＡ２の量的関係により第三のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＢ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができ、定量に際しては
Ｂ１の消費量を測定する。

【００４０】

【化５】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類
、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元
型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはＮ
ＡＤＰ類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡ
Ｄ類を、Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還
元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１への反応
はＡ２を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を示す）

【００４１】この成分（５）を用いるＬ−グリセロール
−３−リン酸またはジドロキシアセトンリン酸定量用組
成物において、Ｂ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特
に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２または／及びＡ
１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μ
Ｍが好ましい。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２０〜５０
０ｕ／ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ２
に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位
）以上になるように調製すればよく、例えば１〜１００
ｕ／ｍｌが好ましく、また第三のデヒドロゲナーゼの基
質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましく、ま
た第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．
０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類
等により適宜決定することができ、これ以上の量を用い
ることもできる。

【００４２】第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価
な場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２ある
いはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。 この場合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＢ１の１／１０モル以
下が好ましい。

【００４３】第三のデドロゲナーゼの基質としては、例
えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　　１．１．１．１）
とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（
ＥＣ　　１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒ
ドロキシアセトン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　
　１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオ
キザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ　　１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、
酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グ
リセリン酸。

【００４４】Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類の
ときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ　　１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコノラク
トン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ　　１．２．１．１３）（植物葉緑体由
来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げら
れる。

【００４５】反応液組成については、使用するグリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相
対活性等を考慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後
正反応／逆反応の至適ｐＨ条件を酵素サイクリング反応
が効率よく進行するように設定すればよい。これら使用
する酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わ
せて用いてもよい。斯くして、調製された本発明のＬ−
グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトン
リン酸定量用組成物によって被検体中のＬ−グリセロー
ル−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測
定するには、上記成分（１）〜（３）、（１）〜（４）
、あるいは（１）〜（３）及び（５）を含有する組成物
に被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、約３７℃の温
度にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分な
いし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または
３分後と８分後の５分間における生成されたＡ２の量ま
たは消費されたＢ１の量を、それぞれの吸収波長に基づ
く吸光度の変化によつて測定すればよい。

【００４６】例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１がＮＡ
ＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増
加により測定するか、あるいはＢ１の消費を３４０ｎｍ
付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のＬ−グリ
セロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン
酸を用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中の
Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセ
トンリン酸量をリアルタイムで求めることができる。

【００４７】また、本発明定量法は、被検体中のＬ−グ
リセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリ
ン酸そのもを酵素サイクリング反応に導くものであり、
被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液の
ブランク測定を省略することができ、レイトアツセイに
よる簡便な測定を成し得る。尚、本発明においてはＡ２
またはＢ１の測定に当り、吸光度測定の代わりに他の公
知の測定法を使用して定量を行うことができる。

【００４８】

【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、また
、酵素のサイクリング反応を組合せることによつて感度
を増大させることができるため、少量の検体で迅速かつ
正確に被検体中のＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸を定量することができる。

【００４９】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例　　１ Ｌ−グリセロール−３−リン酸の定量 ＜反応液＞ ４０　　ｍＭ　　グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．
０）４　　ｍＭ　　チオＮＡＤ（シグマ社製）０．１　
　ｍＭ　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）２　
　ｍＭ　　ＥＤＴＡ ２００ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ベーリンガー社製：ウサギ筋肉由来）

【００
５０】＜操作＞上記試薬１ｍｌをキユベツトにとり、０
、２０、４０、６０、８０、１００μＭのＬ−グリセロ
ール−３−リン酸（ベーリンガー社製）溶液をそれぞれ
２０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。 反応開始後２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度
を読み取り、その差を求めた。その結果を図１に示した
。図１から明らかなように、Ｌ−グリセロール−３−リ
ン酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。

【００５１】実施例　　２ グリセロールの定量 ＜反応液（１）＞ ２０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１　
　ｍＭ　　ＡＴＰ（シグマ社製） １　　ｍＭ　　塩化マグネシウム ０．３ｕ／ｍｌ　　グリセロールキナーゼ（東洋醸造社
製：ストレプトマイセスカナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃａｎｕｓ）由来）

【００５２】＜反応液（２）＞ １００　　ｍＭ　　グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０
．０） ８　　ｍＭ　　チオＮＡＤ（シグマ社製）０．２　　ｍ
Ｍ　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）５　　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ ４００ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ベーリンガー社製：ウサギ筋肉由来）

【００
５３】＜操作＞上記の反応液（１）０．５ｍｌをキユベ
ツトにとり、０、２０、４０、６０、８０、１００μＭ
のグリセロール溶液をそれぞれ２０μｌ　添加し、３７
℃に加温した。グリセロール添加後２分目に反応液（２
）を０．５ｍｌ添加し、３７℃にて酵素サイクリング反
応を開始した。反応液（２）添加後２分目と５分目の４
００ｎｍにおける吸光度を読み取り、そのを求めた。 その結果を図２に示した。図２から明らかなように、グ
リセロール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示
した。

【００５４】実施例　　３ Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロールの定量＜
反応液（１）＞ ２０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１　
　ｍＭ　　ＡＴＰ（シグマ社製） １　　ｍＭ　　塩化マグネシウム １　　ｍＭ　　塩化カルシウム ０．３ｕ／ｍｌ　　グリセロールキナーゼ（東洋醸造社
製：ストレプトマイセスカナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃａｎｕｓ）由来） ２ｕ／ｍｌ　　ホスホリパーゼ−Ｄ（東洋醸造社製：ス
トレプトマイセスクロモフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ）由来）

【００５
５】＜反応液（２）＞ １００　　ｍＭ　　グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０
．０） ８　　ｍＭ　　チオＮＡＤ（シグマ社製）０．１６　　
ｍＭ　　還元型デアミノＮＡＤ（シグマ社製）５　　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ １３６０ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ベーリンガー社製：ウサギ筋肉由来）

【０
０５６】＜操作＞１００ｍｇ／ｍｌのＬ−α−ホスフア
チジル−ＤＬ−グリセロール溶液（クロロホルム：メタ
ノール（９８：２））（シグマ社製）をエバポレータに
て蒸発乾固し、２５００倍容の０．５％トリトンＸ−１
００（シグマ社製）溶液を用いて溶解させた（４．０μ
ｇ／ｍｌ）。このものを水で希釈し０．８、１．６、２
．４、３．２、４．０μｇ／ｍｌのＬ−α−ホスフアチ
ジル−ＤＬ−グリセロール溶液を調製した。

【００５７】上記反応液（１）０．５ｍｌをキユベツト
にとり、０．８、１．６、２．４、３．２、４．０μｇ
／ｍｌのＬ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール
溶液をそれぞれ５０μｌ　添加し、３７℃に加温した。 Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール添加後５
分目に反応液（２）を０．５ｍｌ添加し、３７℃にて酵
素サイクリング反応を開始した。反応液（２）添加後２
分目と７分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、
その差を求めた、その結果を図３に示した。図３から明
らかなように、Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセ
ロール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した
。

【００５８】実施例　　４ 血清中トリグリセリドの定量 ＜反応液（１）＞ １００ｕ／ｍｌ　　リパーゼ（東洋醸造社製：クロモバ
クテリウム・ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）由来 ５　　ｍＭ　　塩化カルシウム １％　　　　　　トライトンＸ−１００２０　　ｍＭ　
　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【００５９】＜反応
液（２）＞ ２０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１　
　ｍＭ　　ＡＴＰ（シグマ社製） １　　ｍＭ　　塩化マグネシウム ０．３ｕ／ｍｌ　　グリセロールキナーゼ（東洋醸造社
製：ストレプトマイセスカナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃａｎｕｓ）由来）

【００６０】＜反応液（３）＞ １００　　ｍＭ　　グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０
．０） ８　　ｍＭ　　チオＮＡＤ（シグマ社製）０．２　　ｍ
Ｍ　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）５　　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ ４００ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ベーリンガー社製：ウサギ筋肉由来）

【００
６１】＜操作＞上記の反応液（１）０．２ｍｌをキユベ
ツトにとり、３７℃にて予備加熱した。３種類の血清サ
ンプルをそれぞれにつき４μｌ　各キユベツトに加え、
３７℃にて反応を５分間行った。その後、反応液（２）
を０．３　ｍｌ　添加し、３７℃にて３分間反応せしめ
た後に反応液（３）を０．５ｍｌ添加し、３７℃にて酵
素サイクリング反応を開始した。反応液（３）添加後２
分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、
その差を求めた。試薬ブランクとして血清サンプルの代
わりに蒸留水を加えたものについて同様の測定を行った
。図２の標準曲線よりグリセロール量を求め、血清中の
トリグリセリド量を求めた結果を表１に示す。

【００６２】

【表１】

【００６３】実施例　　５ 血清中トリグリセリドの定量 ＜反応液（１）＞ １００ｕ／ｍｌ　　リパーゼ（東洋醸造社製：クロモバ
クテリウム・ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）由来 ５　　ｍＭ　　塩化カルシウム １％　　　　　　トライトンＸ−１００２０　　ｍＭ　
　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【００６４】＜反応
液（２）＞ ２０　　ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１　
　ｍＭ　　ＡＴＰ（シグマ社製） １　　ｍＭ　　塩化マグネシウム ０．３ｕ／ｍｌ　　グリセロールキナーゼ（東洋醸造社
製：ストレプトマイセスカナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃａｎｕｓ）由来）

【００６５】＜反応液（３）＞ １００　　ｍＭ　　グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０
．０） ８　　ｍＭ　　チオＮＡＤ（シグマ社製）０．２　　ｍ
Ｍ　　還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）５　　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ ４００ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ベーリンガー社製：ウサギ筋肉由来）

【００
６６】＜操作＞上記の反応液（１）０．２ｍｌをキユベ
ツトにとり、３７℃にて予備加熱した。３種類の血清サ
ンプルをそれぞれにつき４μｌ　各キユベツトに加え、
３７℃にて反応を５分間行った。その後、反応液（２）
を０．３　ｍｌ　添加し、３７℃にて３分間反応せしめ
た後に反応液（３）を０．５ｍｌ添加し、３７℃にて酵
素サイクリング反応を開始した。反応液（３）添加後２
分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、
その差を求めた。試薬ブランクとして血清サンプルの代
わりに蒸留水を加えたものについて同様の測定を行った
。図２の標準曲線よりグリセロール量を求め、血清中の
トリグリセリド量を求めた結果を表１に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｌ−グリセロール−３−リン酸の定量曲線であ
る。

【図２】グリセロールの定量曲線である。

【図３】Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール
の定量曲線である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　被検体に、（１）チオニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下、チオＮ
   ＡＤＰ類という）およびチオニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ類という）からなる
   群より選ばれる一つと、ニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチドホスフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）お
   よびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、
   ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる一つとを補酵
   素とし、少なくともＬ−グリセロール−３−リン酸を基
   質としてジヒドロキシアセトンリン酸を生成する可逆反
   応をなすグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、
   （２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用せしめ
   て、次の反応式 【化１】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
   を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
   類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
   Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
   ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
   の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
   形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
   量を測定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−
   リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量
   法。
2. 【請求項２】　　チオＮＡＤＰ類がチオニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチドホスフエート（チオＮＡＤＰ）
   またはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
   ドホスフエートである請求項１記載の高感度定量法。
3. 【請求項３】　　チオＮＡＤ類がチオニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチ
   ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１
   記載の高感度定量法。
4. 【請求項４】　　ＮＡＤＰ類がニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドホスフエート（ＮＡＤＰ）、アセチルピ
   リジンアデニンジヌクレオチドホスフエート（アセチル
   ＮＡＤＰ）およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
   レオチドホスフエート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群
   より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度定量法
   。
5. 【請求項５】　　ＮＡＤ類がニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
   ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）およびニコチンアミド
   ヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）から
   なる群より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度
   定量法。
6. 【請求項６】　　次の成分（１）〜（３）（１）チオＮ
   ＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれた一
   つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
   る一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
   ３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
   生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
   ドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、（式中、Ａ１
   はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１
   はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還
   元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤ
   Ｐ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類また
   は還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有することを特徴と
   するＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシ
   アセトンリン酸の定量用組成物。