JPH0380800B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヨードチロニン化合物の誘導体および
遊離ヨードチロニン化合物の分析にそれを使用す
る方法に関する。本発明の新規誘導体はエチレン
ジアミンテトラ酢酸またはジエチレントリアミン
ペンタ酢酸とトリヨードチロニンまたはチロキシ
ンのアミドの沃素−125ラベル付け誘導体である。 上記本発明の誘導体は下記一般式を有する化合
物である。 式中X¹，X²，X³およびX⁴の各々は独立にＩま
たはＨである。ただしX³および／またはX⁴はＩ
−125である。ＲはOHであり、Ｚは独立に−
（CH₂）_oNZ₂または−CH₂CORであり、ｎは１，
２または３である。 意図するヨードチロニン化合物には下記のもの
を含む。

【表】 意図するアミノ酢酸化合物には下記のものを含
む。

【表】 アミンペンタ酢
酸
特に興味ある重要なものはチロキシンと
EDTAのアミド（以下T4・EDTAと称する）で
ある。 これらの化合物は不整炭素原子を有し、従つて
光学的に活性である。本発明はＬ−異性体、Ｄ−
異性体および両者の混合物を目的とする。天然に
生成するヨードチロニン化合物はＬ−異性体であ
る。以下に説明する方法に使用するため、本発明
による化合物のＤ−異性体は特に有利な性質を有
する。 ヨーロツパ特許第0026103号明細書には１種以
上の天然バインダーに結合した甲状腺ホルモンも
含有する生物学的流体中の遊離甲状腺ホルモンの
濃度を測定する方法が記載されており、この方法
は、 (a) 流体の試料を甲状腺ホルモンのラベル付き誘
導体および甲状腺ホルモンに対する特定バイン
ダーと混合し、 (b) 遊離甲状腺ホルモン、そのラベル付き誘導体
および特定バインダーの間で反応を行なわせ、 (c) 必要ならば特定バインダーに結合して来た甲
状腺ホルモンおよびそのラベル付き誘導体の部
分をかく結合していない部分から分離し、 (d) 特定バインダーに結合しているまたは結合し
ていない甲状腺ホルモンのラベル付き誘導体の
量を測定し、 (e) 生物学的流体中の遊離甲状腺ホルモンの濃度
測定のため上記測定値を使用する ことによつて行ない、甲状腺ホルモンのラベル付
き誘導体を、添加した特定バインダーに対し強力
に結合するが、生物学的流体中の天然バインダー
に対しては全く結合しないか、甲状腺ホルモンに
対するよりも非常に弱く結合するよう選択するこ
とよりなる。 甲状腺ホルモンはチロキシンおよびトリ−ヨー
ドチロニンから選択する。 特定バインダーは一般に甲状腺ホルモンに対す
る抗体であるか、多分適当な生物学的材料から分
離した天然に生成する蛋白質バインダーである。 甲状腺ホルモンのラベル付き誘導体は天然甲状
腺ホルモンバインダーに結合するのを阻止するた
め化学的に変性し、一方では特定分析用バインダ
ーには結合するその能力を残しておく。同時に、
この誘導体はまた放射性原子（または原子群）の
如き物理的マーカーも含有するかまたはそれに結
合している。放射性ラベル付けを使用するとき、
沃素−125が好適な同位体である。この甲状腺ホ
ルモンのラベル付き誘導体は、添加した特定分析
用バインダーに対するよりも生物学的試料を天然
の甲状腺ホルモンバインダーに対して非常に強く
なく結合する（あるいは全く結合しない）ことが
必須の要件である。しかし、生物学的試料中の天
然の甲状腺ホルモンバインダーの少量の弱く結合
する成分に対する甲状腺ホルモンのラベル付き誘
導体の結合はこの方法を必ずしも無効にすること
はない。 ラベル付き誘導体は天然結合性蛋白質に対して
有意に結合しないから、特定バインダーとの反応
のため遊離甲状腺ホルモンと競争させるのに実質
的に全部を利用できる。そのため特定バインダー
の低濃度の使用が可能であり、しかもなお満足で
きる投与量応答曲線を得ることができる。特定バ
インダーの低濃度の使用は、それが系中の天然蛋
白質バインダーからの甲状腺ホルモンの著しい除
去をもたらすことのないことで有利である。 チロキシン（T4）は、３種の天然に生成する
T4−結合性蛋白質TBG、TBPAおよびアルブミ
ンに主として結合した人間の血液流中に移送され
る。これらの各々に結合したT4の百分率はそれ
ぞれ約70％、20〜25％および５〜10％である。こ
の特定分析のためのトレーサーの合成に当つて、
分析におけるTBGおよびTBPAに対するトレー
サーの結合は零であるか、またはこれらの二つの
蛋白質に対するT4の結合よりも非常に少ないこ
とが重要である。この特定分析において、血清ア
ルブミンとのトレーサーの結合必要量は、厳密性
が少ない。何故なら少ない百分率のT4がアルブ
ミンに結合するだけであり、空のアルブミン結合
位置の数は、それらに結合したT4を有する位置
の数に比して非常に大であるからである。これは
トレーサーの実質的な量が、結合しているT4に
置換なしに血清アルブミンに結合できることを意
味する。 チロキシン分子の多くの可能な変性が上述した
ヨーロツパ特許第7933072号に論じられているが、
実施例中で試験されている化合物はＩ−125でラ
ベル付けしたＮ−アセチル−チロキシン−メチル
エステルである。ここにT4・EDTAがＩ−125で
ラベル付けしたとき、上記試験において使用する
ためのＮ−アセチル−チロキシン−メチルエステ
ルの性質よりも驚いたことに大きくすぐれている
性質を有することを見出した、そしてこれが本発
明の基礎をなす。これらについて特記すると次の
とおりである。 １ Ｎ−アセチル−チロキシン−メチルエステル
は、分析バツフアー中への稀釈時間中にのみ有
用な分析結果を与えるだけである。水と接触し
たとき加水分解するようであり、従つてキツト
中の液体試薬として供給できない。一方T4・
EDTAは水中で安定である。 ２ Ｎ−アセチル−チロキシン−メチルエステル
はポリスチレン分析管に対しかなり結合する。
これは所望以上の高いブランク結果を生ぜしめ
る。一方T4・EDTAは分析管に結合する著し
い傾向は示さない。 ３ Ｎ−アセチル−チロキシン−メチルエステル
はかなりTBGに結合し、またはアルブミンに
対しても結合すると思われる。一方T4・
EDTAはTBGに対する著しい結合傾向は示さ
ない（後掲実施例２参照） ４ 血清試料を水またはバツフアーで稀釈し、次
いで全T4分析で分析したとき、測定される全
T4値は試料の稀釈に比例して減少する。 人間血清試料の遊離T4濃度は一定限界内で稀
釈によつて影響を受けないことが理論的に示され
ている（J.H.H.OppenheimerおよびM.I.Surks
の、J.Clin.Endocrinology and Metabolism第24
巻第785頁〜第794頁1964年参照）。 このことをヨーロツパ特許第7933072号の分析
法を用いて試験したとき、Ｎ−アセチル−チロキ
シン−メチルエステルに対しては僅かにこれが当
てはまるだけであつたが、T4・EDTAに対して
は非常に正確に当てはまることが判つた。 従つて本発明はヨーロツパ特許第0026103号の
方法において、ラベル付けした後本発明の化合物
を使用することも含む。 本発明による化合物は既知の方法で容易に作ら
れる。アミノ酢酸化合物を酸無水物の形に変換
し、これをヨードチロニン化合物のアミノ基と反
応させることができる。生成物は酸性溶液中で沈
澱させ、クロマトグラフイーで精製できる。エス
テルおよびアミドは標準化学反応を用いて作るこ
とができる。 下記実施例は本発明を説明する。 実施例 １ １，２−ビス（２，６−ジオキソ−４−モルホ
リニル）エタンの製造 磁気撹拌機、コンデンサーおよび乾燥管（塩化
カルシウム）を備えた250ml丸底フラスコ中に80
mlのピリジン（水酸化カリウムから蒸溜して乾燥
した）を加えた。29.12ｇのエチレンジアミンテ
トラ酢酸を加え、続いて37.6mlの無水酢酸を加え
た。懸濁液を７時間65〜80℃で撹拌加熱した。混
合物を一昼夜冷却し白色固体を別した。固体を
１回20c.c.の乾燥ピリジンで洗浄し、40mlずつ４回
エーテルで洗浄した。白色固体をマニホールドで
乾燥し、デシケーター中に保存した。収量18ｇ、
融点193〜197℃（分解）。 １−｛3′，5′−ジ−ヨード−4′−（3″，5″−ジ−
ヨード−4″−ヒドロキシフエノキシ）−フエニ
ル｝−２−カルボキシ−６，９−ジカルボキシ
メチル−４−オキソ−３，６，９−トリアザウ
ンデカン酸−11（T4・EDTA）の製造 10mlの乾燥ピリジン中に1.5ｇのチロキシンナ
トリウム塩五水塩を懸濁し、烈しく攪拌した。 三ツ口フラスコに、栓、温度計および乾燥管
（塩化カルシウム）を備えたコンデンサーを設け
た。100mlの乾燥ピリジンを加え、溶媒を烈しく
攪拌し、95℃に加熱した。 2.0ｇの１，２−ビス−（２，６−ジオキソ−４
−モルホリニル）−エタンを熱溶媒中に溶解した。
攪拌しつつ、広口管を用いて５分間でほぼ８等分
したチロキシンナトリウム塩５水塩の懸濁液を熱
溶液に加えた。溶液を更に３分間95℃で保ち、次
いで室温に冷却した。 15c.c.の水を加え、エチレンジアミンテトラ酢酸
の沈澱を開始させた。混合物を一夜放置し、過
し、残渣をピリジンで洗浄した。液および洗浄
液を一緒にし、ロータリー蒸発機上に圧送して乾
燥し、次いでマニホルドに圧送して痕跡量のピリ
ジンを除去した。形成された固体を1Mのアンモ
ニア35ml中に再溶解し、溶液を遠心分離して不溶
性材料を除去した。透明黄色溶液を15ml以下の濃
塩酸でPH１に調整し、固体を沈澱させた。白色沈
澱を過し、液がPH＞４となるまで水洗した。
固体を凍結乾燥した。 T4・EDTAのクロマトグラフ精製 粗製生成物1.5853mgを2MのNH₃水溶液（約300
mg／ml）5.5mlに溶解した。2MのNH₃水溶液の最
初の添加時に白色固体は黒色に変り始めた、しか
し更に2MのNH₃水溶液を加えると、黄色／褐色
着色透明溶液となつた。 粗製生成物を32メルクシリカ5717分取プレート
に付与し、プレート１個について粗製生成物50mg
となるようにした。各プレートをｎ−ブタノー
ル／水／酢酸（60／25／15）中にとおした。プレ
ートを上から２分の1in内に入つたとき、それら
をタンクから取り出し、室温の空気流中に入れ乾
燥した。 紫外線の下で４または５個の帯が見られ、一つ
は基線上にあり一つはRf0.75（これはT4であつ
た）にあり、２または３個の帯の群がその間にあ
り、それはこの群の上の二つの間で区別するのは
難かしかつた。所望の帯を、中央群の最も遅いと
ころを取り出した。 取り出したシリカを0.2MのNH₃水溶液（１プ
レートについて10mlの0.2MのNH₃水溶液）で洗
浄した。これは洗浄に全体で320mlの0.2MのNH₃
水溶液を必要とした、そして黄色の透明溶液が得
られた。次いで溶液を濃HClでPH２の酸性にし、
かくして白色沈澱を生成させ、溶液の脱色を行な
つた、沈澱を遠心分離して得、20mlの水で３回洗
浄するか、上澄液のPHが約７になるまで洗浄し
た。次いで白色固体を真空マニホルドで凍結乾燥
した。乾燥生成物の収量は855mgであつた。 上記生成物を３mlの2MのNH₃水溶液に溶解
し、16個のセルロース（アナケム、アビセルＦ、
厚さ1000μm）分取プレートに付与した。各プレ
ートをｎ−ブタノール／水／酢酸（60／25／15）
中にとおした。これらのプレートはシリカ分取プ
レートよりもかなり早く処理した。プレートを処
理したとき、それらを室温で空気流中で乾燥し
た。紫外線の下で唯一つの帯が見られた、しかし
紫外線下に見える帯の直上に、裸眼で見える黄色
帯が存在した。紫外線下に見える帯を除去し、セ
ルロースを各プレート毎に10mlの0.2MのNH₃水
溶液で洗い、全体で160mlの3MのNH₃水溶液を
用いた。集めた黄色溶液を次いで濃HClを用いて
PH２の酸性にし、白色沈澱を生起させ、溶液の脱
色を行なつた。沈澱を遠心分離し、上澄液を捨
て、沈澱を一緒にし、管１個について20mlの水で
洗浄した。一緒にした沈澱を上澄液のPHが約７に
なるまで洗浄した。残つた白色固体を凍結乾燥し
た。この材料は、ｎ−ブタノール／水／酢酸
（60／25／15）で処理したときシリカTLCで単一
スポツトを与えた。収量89.2mg。

【表】 分光データは化合物の構造を確認した。紫外線
スペクトルはチロキシンのスペクトルと同じであ
つた。IRスペクトルは次の如き特徴を有してい
た。

【表】

【表】 実施例 ２ １，５−ビス−（２，６−ジオキソ−４−モル
ホリニル−３−アザ−３−カルボキシメチル）
ペンタンの製造 乾燥管（塩化カルシウム）を備えたフラスコ中
の9.5mlの無水酢酸および8.4mlのピリジン中の
6.35ｇのジエチレントリアミンペンタ酢酸の懸濁
液を時々攪拌しながら５日間室温で保つた。黄色
生成物を別し、50mlのジエチルエーテルで洗浄
し、乾燥した。 生成物はIR分光分析で表記化合物として同定
した。融点175〜180℃、収量4.56ｇ。 ２−カルボキシ−６，９，12−トリカルボキシ
メチル−１−｛3′，5′−ジ−ヨード−4′−〔（3″，
5″−ジ−ヨード−4″−ヒドロキシ）−フエノキ
シ〕−フエニル｝−４−オキソ−３，６，９，12
−テトラアザテトラデカン酸−11（T4・
DTPA）の製造および精製 チロキシンナトリウム塩（100mg）を50mlのピ
リジン中に懸濁し、攪拌し、90℃に加熱した。大
部分の固体が溶解した。DTPA486mgから誘導さ
れたビス酸無水物を加え、急速に溶解し、混合物
を10分間90℃で保つた。次いで混合物を室温に冷
却した。2.5時間後、２mlの水を加え、混合物を
一夜放置した。小さい沈澱を別し、捨てた。溶
媒を蒸発させて黄白色固体を得た。 精製はTLCプレート数を減じてT4・EDTAに
対する精製法と同じ方法で行なつた。収量6.3mg。 生成物はシリカゲルプレート上で、ブタン−１
−オール／水／酢酸（60／25／15）で処理して
0.19のRfを有していた。 化合物はそのIRおよびUVスペクトルで同定し
た。 実施例 ３ ２−カルボキシ−６，９−ジカルボキシメチル
−１−〔3′，5′−ジ−ヨード−4′−（3″−ヨード
−4″−ヒドロキシ）−フエノキシ〕−フエニル−
４−オキソ−３，６，９−トリアザウンデカン
酸−11（T3・EDTA）の製造 この製造は2.006ｇのEDTAビス酸無水物（実
施例１参照）および1.496ｇのT3（そのナトリウ
ム塩として）を用い、T4・EDTAの製造と同じ
方法で行なつた。 得られた収量の約半分の粗製生成物700mgを用
い、またシリカゲルとセルロースTLCプレート
の比例的に減少した数を用い実施例１に記載した
如くしてクロマトグラフ精製も行なつた、収量
32.5mg。 化合物はIRおよびUVスペクトル分析で同定し
た、前述した如きT4・EDTAのスペクトルと殆
んど区別ができないスペクトルを与えた。化合物
の種類は、化合物がT3自体に等しいかそれより
良好な結合である抗血清（低いT4交叉反応度を
有する）に対するその結合によつて確認した。 実施例 3A ¹²⁵I−T3・EDTAの製造 下記試薬を初めに作つた： (a) 蒸溜水中８mg／mlの濃度でのクロラミンＴ、
及び (b) 蒸溜水中20mg／mlの濃度でメタ重亜硫酸ナト
リウム。 水酸化ナトリウム水溶液中の沃化ナトリウム
（ ¹²⁵I、50mCi）の小瓶を破り、この中に、ホス
フエート／アジド／エタノール緩衝溶液中に含有
されたT3・EDTA（実施例３に記載した如くして
作つた）120μを加えた。クロラミンＴ試薬溶
液25μを加え、溶液全体を60秒間混合した。次
にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液25μを加え、５
秒間混合した。形成された放射性ラベル付け共役
生成物を次いで逆相高圧液相クロマトグラフイで
イオン対法を用いて試薬及び他の生成物から分離
した。 他の放射沃素ラベル付け共役生成物は同じ方法
でそれぞれの共役生成物から作ることができる。 放射性ラベル付け共役生成物を製造するに当つ
て種々の方法が可能であり、二つの基本的に可能
な方法は、現存する沃素原子のＩ−125原子での
交換である、即ちT4・EDTAから出発して ¹²⁵I
−T4・EDTAを作ることである、或いは例えば
T3・EDTAからT4・EDTAの合成中にＩ−125
原子を付加することである、即ちT3・EDTAに
Ｉ−125原子を付加することである。 ¹²⁵I原子はX³又はX⁴の位置にある。しかしなが
らこれらの位置は同じであり、 ¹²⁵IがX³である
かX⁴であるかは重要でない、エーテル結合及び
−CH₂結合は回転自由であり、従つて例えばX⁴
の代りにX³での置換は異性体を生ぜしめないか
ら化合物は何れの場合においても同じである。 実施例 ４ T4の結合強度に対するTBGおよびプレアルブ
ミンに対するT4・EDTA結合強度の評価方法 １ 方法の原理 TBGまたはプレアルブミンに対する予備沈
澱した抗血清（結合試薬）をTBGまたはプレ
アルブミンの血清源で培養した。かくして結合
試薬上にT4結合性蛋白質を遊離させた。形成
された錯体にトレーサー ¹²⁵I−T4を加え、か
くして精製した。TBGまたはプレアルブミン
からの、T4およびT4・EDTAの濃度を変える
ことによるトレーサー ¹²⁵I−T4の置換を研究
することができた。結果は二つのT4結合性蛋
白質に対するT4とT4・EDTAの間の結合親和
性の差を評価するため使用できる。 ２ 方法 2.1 ¹²⁵I−T4：TBG：抗TBG結合試薬の製造 2.1.1 結合試薬製造 ホスフエートバツフアー＋0.05％BSA中
の15％ドンキーアンチシープおよび２％
TBG抗血清 上記溶液の同量を混合し、４℃で一夜回
転し、かくして結合剤試薬の最終濃度を
7.5％のドンキーアンチシープと１％の
TBG抗血清とした。900rpmで遠心分離
し、傾瀉し、新しいバツフアー中に再懸濁
して２回試薬の洗浄を行なつた。 2.1.2 TBG：抗TBG結合試薬の形成 樹脂除去人間血清１mlおよび上記結合試
薬20mlを室温で１時間混合した。遠心分
離、傾瀉および新しいバツフアー（ホスフ
エート＋0.5％BSA）中への再懸濁を２回
行なつた。 2.1.3 ¹²⁵I−T4：TBG：抗TBG結合試薬の形成 10mlのTBG：抗TBG結合試薬、28mlの
ホスフエートバツフアー＋0.05％BSAおよ
び２mlの ¹²⁵I−T4トレーサー溶液（ホス
フエートバツフアー＋0.05％BSA1mlにつ
いて0.1μCi高比放射能T4）を室温で１時
間混合した。遠心分離、傾瀉および新しい
バツフアー（ホスフエート＋0.05％BSA）
中への再懸濁を２回繰返した。一度作つた
トレーサーT4：TBG：抗TBG結合試薬を
直ちに使用した。 2.1.4 T4およびT4・BDTA濃度 ストツク溶液をホスフエート＋0.005％
BSAで稀釈した。使用したT4濃度の範囲
は2000−2ng／ml（100−0.1pモル／
管）であつた。使用したT4・EDTA濃度
の範囲は8000−8ng／ml（400〜0.4pモ
ル／管）であつた。 2.2 ¹²⁵I−T4：TBPA：抗TBPA結合試薬の製
造 2.2.1 結合試薬製造 これは同容量の30％ドンキーアンチラビ
ツト二次抗体および４％TBPA抗血清溶
液を混合して15％ドンキーアンチラビツト
と２％抗TBPAの最終濃度とした以外は
抗TBG結合試薬と同じようにして作つた。 2.2.2 TBPA：抗TBPA結合試薬の形成 600μの血清および20mlの抗TBPA結
合試薬を室温で１時間混合した。試薬の洗
浄は、使用したバツフアーがホスフエート
＋0.005％BSAであることを除いてTBGに
対するのと同じである。 2.2.3 ¹²⁵I−T4：TBPA：抗TBPA結合試薬の
形成 上記TBPA：抗TBPA結合試薬20ml、
ホスフエートバツフアー＋0.005％BSA16
mlおよび ¹²⁵I−T4トレーサー溶液４ml
（ホスフエート＋0.005％BSA中0.2μCi／ml
の高比放射能T4）を室温で１時間混合し
た。錯体の洗浄はホスフエートバツフアー
＋0.005％BSAを用いた以外トレーサー
TBG錯体に対するのと同じにした。一度
形成した ¹²⁵I−T4：TBPA：抗TBPA結
合試薬錯体を直ちに使用した。 2.2.4 T4およびT4・EDTA濃度 ストツク溶液をホスフエートバツフアー
＋0.005％BSAで稀釈した。使用したT4濃
度範囲は8000−8ng／ml（400−0.4pモ
ル／管）であつた。使用したT4・EDTA
濃度範囲は8000−8ng／ml（400−0.4p
モル／管）を使用した。 2.3 TBGおよびプレアルブミンの両者に対する
分析法 50μのT4またはT4・EDTA稀釈液 1000mlのトレーサー：結合試薬錯体 渦 37℃で１時間 渦 37℃で１時間 渦 ＞1500rpmで遠心分離、傾瀉、計数。 かくして別のT4およびT4・EDTA濃度で
トレーサーの結合百分率を二つの系で測定で
きる。 ３ 結果の計算 T4およびT4・EDTA濃度に対し、トレーサ
ー結合百分率をプロツトし、これらの曲線か
ら、非比結合の評価をすることができた。次い
でデータを再計算し、このブランク修正を用
い、プロツトし、トレーサー結合百分率値の範
囲に相当するT4およびT4・EDTA濃度を曲線
から読みとることができた。トレーサーの同じ
置換を与えるT4とT4・EDTAの濃度の間の比
を下記式によつて表わす。 X_T4

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ エチレンジアミンテトラ酢酸またはジエチレ
   ントリアミンペンタ酢酸とトリヨードチロニンま
   たはチロキシンのアミドの沃素−125ラベル付け
   誘導体。