JPH0381230A - 脂肪負荷試験用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は脂肪負荷試験用組成物、より詳しくは外因性脂
肪に対する個人の反応性の把握や外因性リポ蛋白の代謝
変動の検討に利用されている各種脂肪負荷試験のための
経口投与用剤に適した組成物、特に心筋梗塞等の心疾患
や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化性
疾患の発症因子としての脂質代謝異常の臨床検査乃至診
断に有用な新しい脂肪負荷試験用組成物に関する。

従来の技術 脂質代謝異常とは、リポ蛋白の合成、分泌、異化の過程
で之等のいずれかが異常をきたす状態と定義でき、これ
は先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常と
に分類される。また之等は種々の疾患、例えば心筋梗塞
等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化性
疾患等の発症の重大な因子（リスクファクター）とされ
、之等疾患の進展、予後等に重大な影響を及ぼすことか
ら、該脂質代謝異常の検出は、各種の臨床検査乃至診断
に極めて重要な成果をもたらす。

従来、上記脂質代謝異常の検出法としては、血液中の総
コレステロール値をパラメーターとする方法が最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、誤値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近年
、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との結合物を
比重により分画し、このうち特に高比重のリポ蛋白（高
密度リポ蛋白、ＨＤＬ）のコレステロール値を測定し、
このＨＤＬ−コレステロール値そのもの又は数値に対す
る総コレステロール値から数値を引いた値、所謂動脈硬
化指数を脂質代謝異常の検出パラメーターとする方法も
行なわれている。

しかしながら、現在までに蓄積された多くの免疫学的調
査の結果及び臨床的知見によれば、之等従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映せず、殊に臨床上その意義は低いことがしばしば
指摘されている。

更に、最近の知見によると実際の脂質代謝異常には、超
低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）等のリポ蛋白が生体内で異
化機能の低下に伴い血中に残留するレムナンドリポ蛋白
が、重大な影響を及ぼすという報告が種々なされている
［　Ｈｕｉ・Ｄ、　Ｙ・。

Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ、Ｔ、Ｌ、、＆　　Ｍａｈｌｅｙ
、Ｒ，Ｗ、、Ｊ、ＢｊｏｌＣｈｅｍ、、２５９，８６０
−８６９　　（１９８４）：Ｇｏｎｅｎ、Ｂ、、ｅｔａ
ｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３０．８７５　（１９８
１）等参照〕。

従って、このレムナンドリポ蛋白を検出できれば、脂質
代謝異常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をも
たらす各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発
見、進展状態、治療効果の把握等の臨床分野において非
常に有効であると考えられるが、上記レムナンドリポ蛋
白の実体は現在尚不明確でその検出手段も現在知られて
いない。

また、従来より上記の如き脂質代謝異常を始めとする各
種疾患等の診断、把握のための血漿脂質、アポ蛋白、リ
ポ蛋白等の測定に先立ち、経口脂肪１回大量投与を行な
う方法が、脂肪負荷試験として確立されているが、該試
験のための経口投与用脂肪についての研究は実質的に行
われておらず、バターや生クリーム等の材料、品質、形
状等の変動、バラツキを避は得ない食用脂肪がそのまま
用いられているに過ぎ名い。之等の利用ではその摂取量
の厳密な制御は困難で、時として高負荷による下痢等の
発生が認められたりする不利があり、勿論測定値が不正
確となる欠点は避けられない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、脂質代謝異常を正確に検出でき、該脂
質代謝異常をもたらす各種疾患の発見、進展状態、治療
効果の把握等を可能とする、臨床上非常に有効な脂肪負
荷試験用の新しい組成物を提供することにある。

本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、下記
特定の組成物が上記目的に合致する脂肪負荷試験用組成
物として非常に有効であり、該組成物の利用によれば、
血漿コレステロール、血漿トリグリセライド、血漿ビタ
ミンＡルムナントリポ蛋白コレステロール、レムナンド
リポ蛋白トリグリセライド等の経時的変動を追跡するこ
とにより、各種疾患を容易且つ確実に測定、検出できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

課題を解決するための手段 即ち、本発明は油脂１０〜６０重量％、乳化剤０．１〜
１０重量％、ビタミンＡ類１万〜２０万ＩＵ／１００ｇ
、乳化補助剤０〜１０重量％、香料０−０．５重量％、
甘味剤０〜１０重量％及び水３０〜９０重量％からなる
ことを特徴とする脂肪負荷試験用組成物に係わる。

本発明組成物は、これを患者に経口摂取させることによ
って、腸管からの吸収状態を同一条件に制御でき、また
ビタミンＡ類を添加しているためレムナンドリポ蛋白を
標識することが可能となり、更に下痢等の副作用もなく
、摂取が容易で、試験結果の信頼性も非常に高い利点が
ある。

殊にレムナンドリポ蛋白、即ち血液中縁リボ蛋白から正
常なアポ蛋白Ａ−Ｉ含有リボ蛋白及び正常なアポ蛋白Ｂ
−１００含有リポ蛋白を除いた異化機能低下時に血中に
見られるレムナンドリボ蛋白を正確に測定でき、この測
定値をパラメーターとして、脂質代謝異常の検出及びこ
れによる各種疾患の臨床検査乃至診断を行ない得る。

以下、本発明組成物及びその利用によるレムナンドリポ
蛋白の検定乃至脂質代謝異常の検定法につき詳述する。

本発明組成物を構成する油脂としては、通常の各種の食
用油脂、即ち植物性油脂、動物性油脂及び之等の水素添
加油等のいずれでもよく、之等は１種単独でも用い得、
２種以上併用もできる。

乳化剤としては、食品及び医薬品分野で許容されている
各種のもの、例えば脂肪酸エステル類、レシチン類等、
より具体的には、例えばソルビタン脂肪酸エステル、グ
リセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、大豆レ
シチン、卵黄レシチン等を１種単独で又は２種以上混合
して使用できる。之等を構成する脂肪酸としては特に限
定される訳ではないが、通常炭素数６〜２２を主とする
もの、より好ましくは同炭素数１６〜１８を主体とする
ものが好適である。

ビタミンＡ類としては、例えばビタミンＡ油、ビタミン
Ａパルミチン酸エステル、レチノール、ビタミンＡ酢酸
エステル等を１種単独で又は２種以上組み合わせて利用
できる。

乳化補助剤としては、通常のもの、例えばアラビアガム
、グアーガム、キサンタンガム、０Ｍ０１大豆蛋白質、
その酵素分解物もしくは酸分解物、グリセリンカゼイン
ナトリウム、その酵素分解物もしくは酸分解物等の増粘
効果をもつ天然及び合成の各種多糖類や蛋白質類、之等
の分解物等を使用できる。之等の乳化補助剤もその１種
を単独でも使用できまた２種以上を併用できる。

香料としては、−膜内な合成香料及び天然香料を１種単
独で又は２種以上組み合わせて使用できる。特に好適な
香料としては、例えばオレンジ、バナナ、パイナツプル
等のフルーツ系のものやバニラ系のものを例示できる。

甘味剤としては、単糖類、小糖類（例えば乳糖、蔗糖、
マルトース、マルトトリオース等）、天然甘味剤（ソー
マチン、ステビア等）、合成甘味剤（サッカリン、チク
口等）等を、同様に１種単独で又は２種以上組み合わせ
て使用できる。

本発明組成物は、上記各成分と水とから調製できる。上
記各成分の配合割合は、以下の範囲から選択されるのが
よい。

油脂　　１０〜６０１０〜３０ 乳化剤　　　　０．１〜１０　１〜３ 乳化補助剤 香料 甘味剤 水 ０〜１０ ０〜０．５ ０〜１０ ３０〜９０ １〜　３ ０、１〜０．３ ３〜　６ ６０〜８０ 本発明組成物は、上記各成分を混合して乳化することに
より調製され、その調製方法は特に制限されるものでは
ないが、好ましくはまず油脂、乳化剤及びビタミンＡを
加温溶解し、別個に乳化補助剤、香料、甘味剤及び水を
加温溶解し、之等を混合して予備乳化後、本乳化する方
法によるのが好ましい。上記予備乳化は好ましくはホモ
ミキサーにより、また本乳化は好ましくはホモジナイザ
ーによりそれぞれ実施することができる。

かくして調製される本発明の脂肪負荷試験用組成物は、
適当な容器に充填された後、レトルト殺菌（１２０℃、
２０分）して製品とされ得る。

本発明組成物は、これを利用して被験者の血漿脂質、リ
ポ蛋白、アポ蛋白等の経時的変動を測定することができ
る。該測定に当り、本発明組成物は、検体としての血液
を採取すべき被験者に予め、その所定量を経口摂取させ
ることにより実用される。該経口摂取量は、特に制限さ
れるものではないが、およそ体表面積比で５０ｇ／ｍ２
／体重程度の範囲とするのがよく、通常５０〜１００　
ｇ／体重、好ましくは約７０〜８０ｇ／体重の範囲から
選択されるのがよい。また本発明組成物は一般には空腹
時の被験者に単一間服用摂取させるのが望ましい。特に
本発明組成物は、上記服用の際に飲みやすく、しかも腸
管での吸収の状態を常に一定の条件下に保持することが
できる利点がある。

本発明組成物を利用した検定法において、検体としては
血液、特に空腹時の血清又は血漿が好ましく、之等は被
検者より採血後、常法に従い調製できる。

血液中のリポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライ
ド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質とアポ蛋白とが結合
して存在しているのであるから、レムナンドリポ蛋白と
してはその総量、その脂質のいずれか又は全部、そのア
ポ蛋白の総量等をいずれも用い得、之等のコレステロー
ル値は、例えば酵素法により測定できる。

特に、本発明組成物を用いてレムナンドリポ蛋白を検定
するに当っては、アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナ
ル抗体（抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体）及びアポ蛋白Ｂ−１０
０に対するモノクローナル抗体（抗アポ蛋白Ｂ−１００
抗体）を結合させたアフィニテイゲルの混合物をそのま
ま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに調製し、ま
た予め適当な緩衝液、例えば０．０１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）＋０．１５Ｍ　　ＮａＣ７等の緩衝液
で上記ゲルを平衡化したキットの利用が好ましい。更に
上記緩衝液には、例えばアジ化ナトリウム等の通常の保
存剤を含ませることができる。

上記で用いられるアフィニテイゲルは、通常の方法で調
製できる。つまり、抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋
白Ｂ−１００抗体のそれぞれをブロムシアン等で活性化
させたアフィニティゲルにカップリングさせ、その後両
者を混合し、適当な緩衝液にて平衡化する。ここで用い
られる抗体としては、抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル
抗体及び抗体ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体（
いずれも株式会社日本抗体研究所製造）を代表例として
例示できるが、特に之等に限定されるものではない。ま
た用いられるアフィニティゲルの代表例としては、例え
ば予めブロムシアン等で活性化されたセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）等を例示でき、カップリング反応
は上記ゲルと蛋白とのカップリング反応に慣用される常
法に従い、通常ｐＨ８〜１０の範囲でゲル１１１！当た
り約１〜１０μモルの抗体を用いて、室温（約２０〜２
５℃）下に２時間以内で実施できる。

上記キットの必須成分とする上記ゲル混合物における抗
アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白Ｂ−１００抗体の配
合割合は、特に限定されるものではなく適宜決定できる
が、通常前者に対して後者を等重量以上、好ましくは約
１〜２倍重量の範囲から選択するのが望ましい。また得
られるゲル混合物のｐＨは一般には約７〜７．５の範囲
に調整されるのが好適である。

かくして調整されるゲル混合物を必須成分とするキット
には、更に必要に応じてサッカロースやウシ血清蛋白等
の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合でき、該保存剤
としてはキットの使用に際し実験値に悪影響を与えない
もの、例えば希釈したアジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
　ａｚｉｄｅ）等を使用できる。上記キットには水溶性
もしくは水と混和し得るグリセリン、アルコール類、グ
リコール類、グリコールエーテル類等を含有させること
もできる。

上記キットを利用したレムナンドリポ蛋白の検出の好ま
しい一実施態様によれば、まずキットの必須成分とする
アフィニティゲル混合物を振盪及び遠心可能な適当なテ
ストチューブ等に入れ、適当な緩衝液で平衡化させた後
、該容器内に所定量の被検血漿を加え、室温で静置又は
振盪して反応させた後、比較的低速度（約８００〜ｉｏ
ｏ。

ｒｐｍ　）で遠心分離し、得られる上清にコレステロー
ル発色試薬を加えて所定時間インキュベートした後、該
上清の脂質又はアポ蛋白を吸光度測定器により測定する
ことにより被検血清中のレムナンドリポ蛋白量を測定で
きる。この方法における被検血清の使用量は、通常ゲル
混合物重量の約１／８重量程度、好ましくは１７４〜１
／１６重量程度とするのがよい。

発明の効果 本発明組成物の利用によれば、被験者から採取される血
液検体中のレムナンドリポ蛋白、血漿脂質等を簡便に測
定でき、それらの経時的変動をパラメーターとして被験
者の脂質代謝異常等を容易且つ有効に検出できる。殊に
、血液中のレムナンドリポ蛋白量は脂質代謝異常及びそ
の程度を的確に反映するものであり、本発明組成物を用
いた検出法によれば、前記した各種疾患の発見、進展、
治療効果の把握等、特に従来の検出法では把握できなか
った心筋梗塞等の動脈硬化性心疾患や肥満等の病態の把
握を充分且つ有効に行ない得る。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明脂肪負荷
試験用組成物の調製例を実施例として挙げ、次いでその
利用による試験例を挙げる。

尚、実施例中、％とあるは重量％を示す。

実施例　１ オリーブ油　　　　　　　　　　３０．０％ソルビタン
脂肪酸エステル　　　０．　５％グリセリン脂肪酸エス
テル　　　０．５％ビタミンＡパルミチン酸 エステル（５０万ＩＵ／ｇ）　　　０．０１％大豆蛋白
質　　　　　　　　　　５．０％合成香料　　　　　　
　　　　　０．１％ステビア　　　　　　　　　　　　
０．０５％水　　　　　　　　　　　　　　　　　６３
．８４％但し、オリーブ油としては、日本油脂社製を、
ソルビタン脂肪酸エステルとしては旭電化社製を、グリ
セリン脂肪酸エステルとしては版本薬品社製を、ビタミ
ンＡパルミチン酸エステル（５０万ｒＵ／ｇ）としては
日本ロシュ社製を、大豆蛋白質としては不二製油社製を
、合成香料としては高砂香料社製を、ステビアとしては
穿出化学工業社製をそれぞれ用いた。

上記各成分の内、オリーブ油、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、グリセリン脂肪酸エステル及びビタミンＡパルミチ
ン酸エステルのそれぞれ所定量を、６０℃に加温溶解し
、別個に大豆蛋白質、合成香料、ステビア及び水のそれ
ぞれ所定量を、同様に６０℃で加温溶解し、之等を予備
乳化（２０００〜２０００Ｏｒｐｍ）した後、本乳化（
２０００〜７０００ｐｓｉ）Ｌ、得られた混合物を容器
（金属缶もしくは耐熱性プラスチック容器もしくはレト
ルトパウチ）に充填後、レトルト殺菌（１２０℃、２０
分間）して、本発明脂肪負荷試験用組成物製品試料を得
た。

実施例　２ ひまわり油　　　　　　　　　４０．０％レシチン　　
　　　　　　　　　０．５％蔗糖脂肪酸エステル　　　
　　　０．５％ビタミンＡパルミチン酸 エステル（５０万ＩＵ／ｇ）　　　０．０１％カゼイン
ナトリウム　　　　　　１．０％天然香料　　　　　　
　　　　　０．　１％ステビア　　　　　　　　　　　
　０．０５％水　　　　　　　　　　　　　　　　　５
７．８４％但し、ひまわり油としては日本油脂社製を、
レシチンとしてはキューピー社製を、蔗糖脂肪酸エステ
ルとしては第一工業製薬社製を、カゼインナトリウムと
してはニューシーラントプーリーボード社製を、天然香
料としては高砂香料社製をそれぞれ用いた。他は実施例
１と同じである。

上記各成分の内、ひまわり油、レシチン及びビタミンＡ
パルミチン酸エステルのそれぞれ所定量を、６０℃に加
温溶解し、別個にカゼインナトリウム、蔗糖脂肪酸エス
テル、天然香料、ステビア及び水のそれぞれ所定量を、
同様に６０℃て加温溶解し、之等を予備乳化（特殊機化
工業社製ホモミキサー使用、２０００〜２００００ｒｐ
ｍ）した後、本乳化（米国ガラリン社製ホモジナイザー
使用、２０００〜７０００ｐｓｉ）Ｌ、得られた混合物
を容器（耐熱性プラスチック容器もしくはレトルトパウ
チ）に充填後、レトルト殺菌（１２０℃、２０分間）し
て、本発明脂肪負荷試験用組成物製品試料を得た。

〈脂肪負荷試験〉 （１）　　実施例１で得た本発明組成物製品試料の７５
ｇを、被験者（正常人及びコロナリーインデックスポジ
ティブの患者［冠動脈の硬化層のインデックス、冠状動
脈造影により判断、１００点満点、７５点以下を対象と
した、冠動脈疾患の患者のルーチン検査］各人それぞれ
１０人に経口摂取させた。

（２）　　上記（１）の各被験者より、本発明組成物投
与前及び投与の所定時間経過後に、それぞれ空腹時ＥＤ
ＴＡ採血し、遠心分離（２５００〜３０００ｒｐｍ）し
て血漿を得た。

得られた各血漿について、トリグリセライド（ｒＰ−Ｔ
ＧＪという）量を酵素法（メルクリピッドＴＧ、関東化
学社製）により測定した。

またコレステロール（Ｐ−ＣＨＯＪという）量を酵素法
（Ｍｅｒｃｋｏ　’ｒｅｓｔ　ＣＨＯ，関東化学社製、
２ｚＡ’／１０μｌ血漿、３７℃、１０分間インキュベ
ート）により測定（３６５ｎｍでの吸光度測定）すると
共に、ビタミンＡ　（ｒＰ−ＶＡＪという）をＨＰＬＣ
法により測定した。

（３）　　更に、上記血漿２０μｌを試験管に加え、抗
アポＡ−１モノクローナル抗体及び抗アポＢ−１００モ
ノクローナル抗体をそれぞれ結合させたアフィニティゲ
ル（ゲル１　ｚｌ当り各抗体を蛋白量として１０■ずつ
カップリング反応させたブロムシアン活性化セファロー
ス−４Ｂ）を含有する反応液（各ゲルを等量のＯ，ＯＩ
Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に混和して調製した
もの、各抗体のそれぞれ８０μｌを含む）６００μｌを
分注し、振盪を３０分間行ない、その後１５分間静置し
て上清２００μｌを分取した。

該上清にＭｅｒｃｋｏ　Ｔｅ５ｔ　ＣＨＯ（関東化学社
製）２　ｘｉを添加し、３７℃で２０分間インキュベー
ト後、該血清中のコレステロール量を３６５ｎｍでの吸
光度測定により求めた。

上記に従い、レムナンドリポ蛋白コレステロール（ｒＺ
−ＣＨＯｊという）値を、Ｍｅｒｃｋ。

Ｔｅ５ｔ　ＣＨＯ（関東化学社製）により測定し、また
レムナンドリポ蛋白トリグリセライド（ｒＺ−ＴＧＪと
いう）値を、メルクリピッドＴＧ（関東化学社製）によ
りそれぞれ測定した。

（４）　　本発明組成物投与前及び所定時間経過後のそ
れぞれにつき得られた測定結果を、被験者各１０人の平
均値にて、下記第１表（正常人）及び第２表（冠疾患患
者）に示す。

第　　　１　　　表 第 ２ 表 上記第１表と第２表との対比より明らかな通り、本発明
組成物を利用した方法によれば、正確にレムナンドリポ
蛋白量を測定できることが判ると共に、この測定法は、
それ自体容易且つ簡便であり、非常に優れたものである
ことが明らかである。

しかして、現在脂質代謝の研究が進み、殊にレムナンド
リポ蛋白が動脈硬化等の危険因子と考えられており、該
レムナンドリポ蛋白は従来法である超遠心分離では正確
に測定することはできないが、本発明組成物の利用によ
れば、該組成物自体、味が良好で飲みやすく、ロット差
がないことに加えて、上記レムナンドリポ蛋白を非常に
少ない測定誤差をもって正確に且つ簡便に測定可能であ
る。

更に、本発明組成物を利用した上記測定系では、重症度
が増すにつれてＺ−ＣＨＯのピーク時が後にずれる傾向
が明らかに認められる。またＶＡの添加の意味は、脂質
には外因性、内因性の脂質があり、ＶＡは外因性の脂質
に解けている。よって外因性脂質をＶＡでラベルした状
態になる。

脂質代謝異常の患者には程度の差があり、軽度な患者は
発見されない場合があり、負荷により積極的に脂質代謝
異常の患者を早期に発見することが可能である。

（５）　　上記と同一試験を、軽度の動脈硬化性患者５
名と、１日１こアルコール 亘って負荷した正常人１名の計６名につき、繰り返し行
った。その結果を下記第３表に示す。

第　　　３　　　表 上記第３表より明らかな通り、 対象とした各患 者（正常人を含む）は動脈硬化の程度が軽度であるため
、空腹時のＺ−ＣＨＯは負であり、本発明組成物負荷を
行わない限り、通常の測定系では負と判定され、その検
出は不可能であるが、本発明組成物負荷によれば、経時
的にＺ−ＣＨＯ値が測定可能な正の値となり、かくして
動脈硬化の危険因子の存在が明らかに検出されることが
判る。

（以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）油脂１０〜６０重量％、乳化剤０．１〜１０重量
   ％、ビタミンＡ類１万〜２０万＾Ｉ＾Ｕ／１００ｇ、乳
   化補助剤０〜１０重量％、香料０〜０．５重量％、甘味
   剤０〜１０重量％及び水３０〜９０重量％からなること
   を特徴とする脂肪負荷試験用組成物。