JPH0621080B2

JPH0621080B2 - 脂肪負荷試験用組成物

Info

Publication number: JPH0621080B2
Application number: JP1217037A
Authority: JP
Inventors: 克行中嶋; 三男江本
Original assignee: NIPPON KOTAI KENKYUSHO KK; OOTSUKA SHOKUHIN KK
Current assignee: NIPPON KOTAI KENKYUSHO KK; OOTSUKA SHOKUHIN KK
Priority date: 1989-08-22
Filing date: 1989-08-22
Publication date: 1994-03-23
Anticipated expiration: 2009-03-23
Also published as: JPH0381230A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は脂肪負荷試験用組成物、より詳しくは外因性脂
肪に対する個人の反応性や把握や外因性リポ蛋白の代謝
変動の検討に利用されている各種脂肪負荷試験のための
経口投与用剤に適した組成物、特に心筋梗塞等の心疾患
や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化性
疾患の発症因子としての脂質代謝異常の臨床検査乃至診
断に有用な新しい脂肪負荷試験用組成物に関する。

従来の技術脂質代謝異常とは、リポ蛋白の合成、分泌、異化の過程
で之等のいずれかが異常をきたす状態と定義でき、これ
は先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常と
に分類される。また之等は種々の疾患、例えば心筋梗塞
等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化性
疾患等の発症の重大な因子（リスクファクター）とさ
れ、之等疾患の進展、予後等に重大な影響を及ぼすこと
から、該脂質代謝異常の検出は、各種の臨床検査乃至診
断に極めて重要な成果をもたらす。

従来、上記脂質代謝異常の検出法としては、血液中の総
コレステロール値をパラメーターとする方法が最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、該値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近
年、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との結合物
を比重により分画し、このうち特に高比重のリポ蛋（高
密度リポ蛋白、ＨＤＬ）のコレステロール値を測定し、
このＨＤＬ−コレステロール値そのもの又は該値に対す
る総コレステロール値から該値を引いた値、所謂動脈硬
化指数を脂質代謝異常の検出パラメーターとする方法も
行なわれている。

しかしながら、現在までに蓄積された多くの免疫学的調
査の結果及び臨床的知見によれば、之等従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映せず、殊に臨床上その意義は低いことがしばしば
指摘されている。

更に、最近の知見によると実際の脂質代謝異常には、超
低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）等のリポ蛋白が生体内で異
化機能が低下に伴い血中に残留するレムナントリポ蛋白
が、重大な影響を及ぼすという報告が種々なされている
［Hui,D.Y.,Innerarity,T.L.,& Mahley,R.W.,J.Biol.Ch
em.,259,860-869(1984):Gonen,B.,et al.,Diabetes,30,
875(1981)等参照〕。

従って、このレムナントリポ蛋白を検出できれば、脂質
代謝異常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をも
たらす各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発
見、進展状態、治療効果の把握等の臨床分野において非
常に有効であると考えられるが、上記レムナントリポ蛋
白の実体は現在尚明確でその検出手段も現在知られてい
ない。

また、従来より上記の如き知質代謝異常を始めとする各
種疾患等の診断、把握のための血漿脂質、アポ蛋白、リ
ポ蛋白等の測定に先立ち、経口脂肪１回大量投与を行な
う方法が、脂肪負荷試験として確立されているが、該試
験のための経口投与用脂肪についての研究は実質的に行
われておらず、バターや生クリーム等の材料、品質、形
状等の変動、バラツキを避け得ない食用脂肪がそのまま
用いられているに過ぎ名い。之等の利用ではその摂取量
の厳密な制御は困難で、時として高負荷による下痢等の
発生が認められたりする不利があり、勿論測定値が不正
確となる欠点は避けられない。

発明が解決しようとする課題本発明の目的は、脂質代謝異常を正確に検出でき、該脂
質代謝異常をもたらす各種疾患の発見、進展状態、治療
効果の把握等を可能とする、臨床上非常に有効な脂肪負
荷試験用の新しい組成物を提供することにある。

本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、下記
特定の組成物が上記目的に合致する脂肪負荷試験用組成
物として非常に有効であり、該組成物の利用によれば、
血漿コレステロール、血漿トリグリセライド、血漿ビタ
ミンＡ、レムナントリポ蛋白コレステロール、レムナン
トリポ蛋白トリグリセライド等の経時的変動を追跡する
ことにより、各種疾患を容易且つ確実に測定、検出でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

課題を解決するための手段即ち、本発明は油脂１０〜６０重量％、乳化剤０．１〜
１０重量％、ビタミンＡ類１万〜２０万ＩＵ／１００
ｇ、乳化補助剤０〜１０重量％、香料０〜０．５重量
％、甘味剤０〜１０重量％及び水３０〜９０重量％から
なることを特徴とする脂肪負荷試験用組成物に係わる。

本発明組成物は、これを患者に経口摂取させることによ
って、腸管からの吸収状態を同一条件に制御でき、また
ビタミンＡ類を添加しているためレムナントリポ蛋白を
標識することが可能となり、更に下痢等の副作用もな
く、摂取が容易で、試験結果の信頼性も非常に高い利点
がある。

殊にレムナントリポ蛋白、即ち血液中総リポ蛋白から正
常なアポ蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白及び正常なアポ蛋白Ｂ
−１００含有リポ蛋白を除いた異化機能低下時に血中に
見られるレムナントリポ蛋白を正確に測定でき、この測
定値をパラメーターとして、脂質代謝異常の検出及びこ
れによる各種疾患の臨床検査乃至診断を行ない得る。

以下、本発明組成物及びその利用によるレムナントリポ
蛋白の検定乃至脂質代謝異常の検定法につき詳述する。

本発明組成物を構成する油脂としては、通常の各種の食
用油脂、即ち植物性油脂、動物性油脂及び之等の水素添
加油等のいずれでもよく、之等は１種単独でも用い得、
２種以上併用もできる。

乳化剤としては、食品及び医薬品分野で許容されている
各種のもの、例えば脂肪酸エステル類、レシチン類等、
より具体的には、例えばソルビタン脂肪酸エステル、グ
リセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、大豆レ
シチン、卵黄レシチン等を１種単独で又は２種以上混合
して使用できる。之等を構成する脂肪酸としては特に限
定される訳ではないが、通常炭素数６〜２２を主とする
もの、より好ましくは同炭素数１６〜１８を主体とする
ものが好適である。

ビタミンＡ類としては、例えばビタミンＡ油、ビタミン
Ａパルミチン酸エステル、レチノール、ビタミンＡ酢酸
エステル等を１種単独で又は２種以上組み合わせて利用
できる。

乳化補助剤としては、通常のもの、例えばアラビアガ
ム、グアーガム、キサンタンガム、ＣＭＣ、大豆蛋白
質、その酵素分解物もしくは酸分解物、グリセリンカゼ
インナトリウム、その酵素分解物もしくは酸分解物等の
増粘効果をもつ天然及び合成の各種多糖類や蛋白質類、
之等の分解物等を使用できる。之等の乳化補助剤もその
１種を単独でも使用できまた２種以上を併用できる。

香料としては、一般的な合成香料及び天然香料を１種単
独で又は２種以上組み合わせて使用できる。特に好適な
香料としては、例えばオレンジ、バナナ、パイナップル
等のフルーツ系のものやバニラ系のものを例示できる。

甘味剤としては、単糖類、小糖類（例えば乳糖、蔗糖、
マルトース、マルトトリオース等）、天然甘味剤（ソー
マチン、ステビア等）、合成甘味剤（サッカリン、チク
ロ等）等を、同様に１種単独で又は２種以上組み合わせ
て使用できる。

本発明組成物は、上記各成分と水とから調製できる。上
記各成分の配合割合は、以下の範囲から選択されるのが
よい。

本発明組成物は、上記各成分を混合して乳化することに
より調製され、その調製方法は特に制限されるものでは
ないが、好ましくはまず油脂、乳化剤及びビタミンＡを
加温溶解し、別個に乳化補助剤、香料、甘味剤及び水を
加温溶解し、之等を混合して予備乳化後、本乳化する方
法によるのが好ましい。上記予備乳化は好ましくはホモ
ミキサーにより、ただ本乳化は好ましくはホモジナイザ
ーによりそれぞれ実施することができる。

かくして調製される本発明の脂肪負荷試験用組成物は、
適当な容器に充填された後、レトルト殺菌（１２０℃、
２０分）して製品とされ得る。

本発明組成物は、これを利用して被験者の血漿脂質、リ
ポ蛋白、アポ蛋白等の経時的変動を測定することができ
る。該測定に当り、本発明組成物は、検体としての血液
を採取すべき被験者に予め、その所定量を経口摂取させ
ることにより実用される。該経口摂取量は、特に制限さ
れるものではないが、およそ体表面積比で５０ｇ／ｍ^２
／体重程度の範囲とするのがよく、通常５０〜１００ｇ
／体重、好ましくは約７０〜８０ｇ／体重の範囲から選
択されるのがよい。また本発明組成物は一般には空腹時
の被験者に単一回服用摂取させるのが望ましい。特に本
発明組成物は、上記服用の際に飲みやすく、しかも腸管
での吸収の状態を常に一定の条件下に保持することがで
きる利点がある。

本発明組成物を利用した検定法において、検体としては
血液、特に空腹時の血清又は血漿が好ましく、之等は被
験者より採血後、常法に従い調製できる。

血液中のリポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライ
ド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質とアポ蛋白とが結合
して存在しているのであるから、レムナントリポ蛋白と
してはその総量、その脂質のいずれか又は全部、そのア
ポ蛋白の総量等をいずれも用い得、之等のコレステロー
ル値は、例え酵素法により測定できる。

特に、本発明組成物を用いてレムナントリポ蛋白を検定
するに当っては、アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナ
ル抗体（抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体）及びアポ蛋白Ｂ−１０
０に対するモノクローナル抗体（抗アポ蛋白Ｂ−１００
抗体）を結合させたアフィニテイゲルの混合物をそのま
ま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに調製し、ま
た予め適当な緩衝液、例えば０．０１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）＋０．１５ＭＮａＣｌ等の緩衝液で
上記ゲルを平衡化したキットの利用が好ましい。更に上
記緩衝液には、例えばアジ化ナトリウム等の通常の保存
剤を含ませることができる。

上記で用いられるアフィニテイゲルは、通常の方法で調
製できる。つまり、抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋
白Ｂ−１００抗体のそれぞれをブロムシアン等で活性化
させたアフィニティゲルにカップリングさせ、その後両
者を混合し、適当な緩衝液にて平衡化する。ここで用い
られる抗体としては、抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル
抗体及び抗体ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体
（いずれも株式会社日本抗体研究所製造）を代表例とし
て例示できるが、特に之等に限定されるものではない。
また用いられるアフィニティゲルの代表例としては、例
えば予めブロムシアン等で活性化されたセファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）等を例示でき、カップリング反
応は上記ゲルと蛋白とのカップリング反応に慣用される
常法に従い、通常ｐＨ８〜１０の範囲でゲル１ml当たり
約１〜１０μモルの抗体を用いて、室温（約２０〜２５
℃）下に２時間以内で実施できる。

上記キットの必須成分とする上記ゲル混合物における抗
アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白Ｂ−１００抗体の配
合割合は、特に限定されるものではなく適宜決定できる
が、通常前者に対して後者を等重量以上、好ましくは約
１〜２倍重量の範囲から選択するのが望ましい。また得
られるゲル混合物のｐＨは一般には約７〜７．５の範囲
に調整されるのが好適である。

かくして調整されるゲル混合物を必須成分とするキット
には、更に必要に応じてサッカロースやウシ血清蛋白等
の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合でき、該保存剤
としてはキットの使用に際し実験値に悪影響を与えない
もの、例えば希釈したアジ化ナトリウム(sodium azide)
等を使用できる。上記キットには水溶性もしくは水と混
和し得るグリセリン、アルコール類、グリコール類、グ
リコールエーテル類等を含有させることもできる。

上記キットを利用したレムナントリポ蛋白の検出の好ま
しい一実施態様によれば、まずキットの必須成分とする
アフィニティゲル混合を振盪及び遠心可能な適当なテス
トチューブ等に入れ、適当な緩衝液で平衡化させた後、
該容器内に所定量の被検血漿を加え、室温で静置又は振
盪して反応させた後、比較的低速度（約８００〜１００
０rpm）で遠心分離し、得られる上清にコレステロール
発色試薬を加えて所定時間インキュベートした後、該上
清の脂質又はアポ蛋白を吸光度測定器により測定するこ
とにより被検血清中のレムナントリポ蛋白量を測定でき
る。この方法における被検血清の使用量は、通常ゲル混
合物重量の約１／８重量程度、好ましくは１／４〜１／
１６重量程度とするのがよい。

発明の効果本発明組成物の利用によれば、被験者から採取される血
液検体中のレムナントリポ蛋白、血漿脂質等を簡便に測
定でき、それらの経時的変動をパラメーターとして被験
者の脂質代謝異常等を容易且つ有効に検出できる。殊
に、血液中のレムナントリポ蛋白量は脂質代謝異常及び
その程度を的確に反映するものであり、本発明組成物を
用いた検出法によれば、前記した各種疾患の発見、進
展、治療効果の把握等、特に従来の検出法では把握でき
なかった心筋梗塞等の増脈硬化性心疾患や肥満等の病態
の把握を充分且つ有効に行ない得る。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明脂肪負荷
試験用組成物の調製例を実施例として挙げ、次いでその
利用による試験例を挙げる。

尚、実施例中、％とあるは重量％を示す。

実施例１オリーブ油３０．０％ソルビタン脂肪酸エステル０．５％グリセリン脂肪酸エステル０．５％ビタミンＡパルチミン酸エステル（５０万ＩＵ／ｇ）０．０１％大豆蛋白質５．０％合成香料０．１％ステビア０．０５％水６３．８４％但し、オリーブ油としては、日本油脂社製を、ソルビタ
ン脂肪酸エステルとしては旭電化社製を、グリセリン脂
肪酸エステルとしては阪本薬品社製を、ビタミンＡパル
ミチン酸エステル（５０万ＩＵ／ｇ）としては日本ロシ
ュ社製を、大豆蛋白質としては不二製油社製を、合成香
料としては高砂香料社製を、ステビアとしては守田化学
工業社製をそれぞれ用いた。

上記各成分の内、オリーブ油、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、グリセリン脂肪酸エステル及びビタミンＡパルミチ
ン酸エステルのそれぞれ所定量を、６０℃に加温溶解
し、別個に大豆蛋白質、合成香料、ステビア及び水のそ
れぞれ所定量を、同様に６０℃て加温溶解し、之等を予
備乳化（２０００〜２００００rpm）した後、本乳化
（２０００〜７０００psi）し、得られた混合物を容器
（金属缶もしくは耐熱性プラスチック容器もしくはレト
ルトパウチ）に充填後、レトルト殺菌（１２０℃、２０
分間）して、本発明脂肪負荷試験用組成物製品試料を得
た。

実施例２ひまわり油４０．０％レシチン０．５％蔗糖脂肪酸エステル０．５％ビタミンＡパルミチン酸エステル（５０万ＩＵ／ｇ）０．０１％カゼインナトリウム１．０％天然香料０．１％ステビア０．０５％水５７．８４％但し、ひまわり油としては日本油脂社製を、レシチンと
してはキューピー社製を、蔗糖脂肪酸エステルとしては
第一工業製薬社製を、カゼインナトリウムとしてはニュ
ージーランドデーリーボード社製を、天然香料としては
高砂香料社製をそれぞれ用いた。他は実施例１と同じで
ある。

上記各成分の内、ひまわり油、レシチン及びビタミンＡ
パルミチン酸エステルのそれぞれ所定量を、６０℃に加
温溶解し、別個にカゼインナトリウム、蔗糖脂肪酸エス
テル、天然香料、ステビア及び水のそれぞれ所定量を、
同様に６０℃て加温溶解し、之等を予備乳化（特殊機化
工業社製ホモミキサー使用、２０００〜２００００rp
m）した後、本乳化（米国ガウリン社製ホモジナイザー
使用、２０００〜７０００psi）し、得られた混合物を
容器（耐熱性プラスチック容器もしくはレトルトパウ
チ）に充填後、レトルト殺菌（１２０℃、２０分間）し
て、本発明脂肪負荷試験用組成物製品試料を得た。

＜脂肪負荷試験＞ (1)実施例１で得た本発明組成物製品試料の７５ｇを、
被験者（正常人及びコロナリーインデックスポジティブ
の患者「冠動脈の硬化層のインデックス、冠状動脈造影
により判断、１００点満点、７５点以下を対象とした、
冠動脈疾患の患者のルーチン検査］各人それぞれ１０人
に経口摂取させた。

(2)上記(1)の各被験者より、本発明組成物投与前及び投
与の所定時間経過後に、それぞれ空腹時ＥＤＴＡ採血
し、遠心分離（２５００〜３０００rpm）して血漿を得
た。

得られた各血漿について、トリグリセライド（「Ｐ−Ｔ
Ｇ」という）量を酵素法（メルクリピッドＴＧ、関東化
学社製）により測定した。またコレステロール（Ｐ−Ｃ
ＨＯ」という）量を酵素法（Mercko Test CHO、関東化
学社製、２ml／１０μ血漿、３７℃、１０分間インキ
ュベート）により測定（３６５ｎｍでの吸光度測定）す
ると共に、ビタミンＡ（「Ｐ−ＶＡ」という）をＨＰＬ
Ｃ法により測定した。

(3)更に、上記血漿２０μを試験管に加え、抗アポＡ
−Ｉモノクローナル抗体及び抗アポＢ−１００モノクロ
ーナル抗体をそれぞれ結合させたアフィニティゲル（ゲ
ル１ml当り各抗体を蛋白量として１０mgずつカップリン
グ反応させたブロムシアン活性化セファロース−４Ｂ）
を含有する反応液（各ゲルを等量の０．０１Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に混和して調製したもの、各抗
体のそれぞれ８０μを含む）６００μを分注し、振
盪を３０分間行ない、その後１５分間静置して上清２０
０μを分取した。

該上清にMercko Test CHO（関東化学社製）２mlを添加
し、３７℃で２０分間インキュベート後、該血清中のコ
レステロール量を３６５ｎｍでの吸光度測定により求め
た。

上記に従い、レムナントリポ蛋白コレステロール（「Ｚ
−ＣＨＯ」という）値を、Mercko Test CHO（関東化学
社製）により測定し、またレムナントリポ蛋白トリグリ
セライド（「Ｚ−ＴＧ」という）値を、エルクリピッド
ＴＧ（関東化学社製）によりそれぞれ測定した。

(4)本発明組成物投与前及び所定時間経過後のそれぞれ
につき得られた測定結果を、被験者各１０人の平均値に
て、下記第１表（正常人）及び第２表（冠疾患患者）に
示す。

上記第１表と第２表との対比より明らかな通り、本発明
組成物を利用した方法によれば、正確にレムナントリポ
蛋白量を測定できることが判ると共に、この測定法は、
それ自体容易且つ簡便であり、非常に優れたものである
ことが明らかである。

しかして、現在脂質代謝の研究が進み、殊にレムナント
リポ蛋白が動脈硬化等の危険因子と考えられており、該
レムナントリポ蛋白は従来法である超遠心分離では正確
に測定することはできないが、本発明組成物の利用によ
れば、該組成物自体、味が良好で飲みやすく、ロット差
がないことに加えて、上記レムナントリポ蛋白を非常に
少ない測定誤差をもって正確に且つ簡便に測定可能であ
る。更に、本発明組成物を利用した上記測定系では、重
症度が増すにつれてＺ−ＣＨＯのピーク時が後にずれる
傾向が明らかに認められる。またＶＡの添加の意味は、
脂質には外因性、内因性の脂質があり、ＶＡは外因性の
脂質に解けている。よって外因性脂質をＶＡでラベルし
た状態になる。

脂質代謝異常の患者には程度の差があり、軽度な患者は
発見されない場合があり、負荷により積極的に脂質代謝
異常の患者を早期に発見することが可能である。

(5)上記と同一試験を、軽度の動脈硬化性患者５名と、
１日にアルコール５０ｇを１０日間に亘って負荷した正
常人１名の計６名につき、繰り返し行った。その結果を
下記第３表に示す。

上記第３表から明らかな通り、対象とした各患者（正常
人を含む）は動脈硬化の程度が軽度であるため、空腹時
のＺ−ＣＨＯは負であり、本発明組成物負荷を行わない
限り、通常の測定系では負と判定され、その検出は不可
能であるが、本発明組成物負荷によれば、経時的にＺ−
ＣＨＯ値が測定可能な正の値となり、かくして動脈硬化
の危険因子の存在が明らかに検出されることが判る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】油脂１０〜６０重量％、乳化剤０．１〜１
０重量％、ビタミンＡ類１万〜２０万^IU／１００ｇ、乳
化補助剤０〜１０重量％、香料０〜０．５重量％、甘味
剤０〜１０重量％及び水３０〜９０重量％からなること
を特徴とする脂肪負荷試験用組成物。