JPH038513B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

広い種類の分析対象物の定量のための新しい融
通性のある方法を開発しようとする努力は、連続
して行なわれている。それらの方法は、新しい情
況、新しい装置、簡単化した原理、より高い感度
などに関連している。多くの場合に、ミクロタイ
ター板における競合的蛋白質結合分析を遂行しう
ることが望ましい。洗浄工程を行なう必要がなく
て、凹所中の全部の試薬と試料を結び付けること
ができ、且つ充分な時間後に信号を読むことがで
きることもまた望ましい。 多孔性粒子と２酵素を用いる免疫学的検定方法
は、米国特許願第964099号、現在では米国特許第
4318707号中に記されている。均一媒体中のチヤ
ンネル形免疫学的検定の記述については、米国特
許第4233402号をも参照すべきである。 競合的蛋白質結合分析は、特異的結合対の１メ
ンバーと第一の酵素を固体の非多孔性表面、特に
容器の壁、たとえばミクロタイター板に結合させ
る場合に用いられる。特異的結合対の相補メンバ
ーに結合する第二の酵素と結合する試薬を用意す
るが、その場合に固体表面に結合する酵素結合体
の量は水性分析媒体中の分析対象物の量に関係す
る。他の酵素によつて生じる基質の一酵素による
入れ代わりの結果として生成する検出しうる生成
物の量は、媒体中の分析対象物の量に関係する。 特異的結合対の１メンバーと酵素を結合させる
ために固体非多孔性表面を使用する競合的蛋白質
結合分析を提供する。固体表面は、試料からの分
析対象物及び酵素の結合体である試薬並びに媒体
中の分析対象物の量に応じて表面に結合する特異
的結合対の１メンバーを含有している水性の分析
媒体と接触する。更に、検出可能な信号を与える
物質を生成させるために必要な基質すなわち反応
物をも包含する。 液状媒体中の各分析関与物は、分析対象物と試
薬の性質に依存して異なる順序で加えることによ
つて、異なるプロトコールを提供することができ
る。２種の酵素と補助材料が検出可能な生成物を
与える信号発生系の成分である。未知の試料によ
つて生じる検出可能な生成物の量を、既知量の分
析対象物によつて生じる検出可能な生成物の量と
比較して関係づけることによつて、試料中の分析
対象物の濃度を測定することができる。 分析対象物は、配位子とその対応受容体から成
る特異的結合対の１メンバーである。特異的結合
対の中の一方のメンバーは、直接または間接的
に、共有結合的にまたは非共有結合的に、固体非
多孔性表面に対して安定に結合する。特定の配位
子に対する特定のタイプの受容体が分析対象物で
ある場合に、３特異的結合成分、すなわち、受容
体、固体表面に結合することができる、抗受容体
または配位子、及び、酵素の標識付けのために用
いる、それぞれ配位子または抗受容体、を必要と
する例外もある。かくして、分析対象物としての
受容体は、多くの選択可能な結合体の存在を許容
する。加うるに、信号発生系の中の一酵素は特異
的結合対の相反メンバーに結合するかまたは結合
するようになる。特異的結合対結合体の適当な選
択によつて、固体表面に結合する酵素結合体の量
を分析媒体中の分析対象物の量に関係づけること
ができる。 この方法の遂行に当つては、予め表面に対して
特異的結合対の１メンバーと第一の酵素を結合さ
せることによつて準備してある固体表面、通常は
容器壁、を用いて出発する。分析対象物の本質及
び信号発生系の各成分の本質に依存して、種々の
プロトコールを用いることができる。もつとも一
般的には、表面に結合する酵素結合体の量を試料
中の分析対象物の量に関係づけることを確実にす
るために試料と試薬を緩衝した水性媒体中で混合
する。信号発生系の１成分は、基質として他の酵
素の生成物を使用する酵素の入れ代わりに関連す
る量で検出可能な信号を提供する物質の生成をも
たらす。信号の量を測定することによつて、その
信号を媒体中の分析対象物の量に関係づけること
ができる。 定 義 分析対象物（Analyte）−測定すべき化合物ま
たは組成物、これはモノ−またはポリ−エピトピ
ツク、抗原性またはハプテン性である配位子、単
独の化合物または少なくとも１の共通のエピトピ
ツクまたは結合サイトを共有する複数の化合物、
あるいは受容体とすることができる。 特異的結合対−異なる２分子であつて、その中
の一分子は表面上または空腔中に他の分子の特定
の空間的及び極性的機構に特異的に結合する区域
を有している。特異的結合対のメンバーを配位子
及び受容体（抗配位子）と呼ぶ。特異的結合対
は、配位子としてはハプテンと抗原を指し、受容
体としては抗体を指すことが多い。その範囲で、
これらのグループは免疫学的対のメンバー
（members of an immunological pair）とみな
される。頭字語は“ミツプ”（mip）であるから、
免疫学対的であろうがなかろうが、特異的結合対
を包含すべき包括的な意味で、ミツプという術語
を使用する。 配位子−それに対する受容体が、天然に存在す
るかまたは調製可能である有機化合物。 受容体（抗配位子）−分子の特定の空間的及び
極性組織たとえばエピトピツクサイトを認識する
ことができる化合物または組成物。代表的な受容
体は、天然に産する受容体、たとえばチロキシン
結合グロブリン、抗体、酵素、フアブ（Fab）断
片、レクチンなどを包含する。 配位子類似体−受容体に対して類似配位子と競
争することができる修飾した配位子、修飾は配位
子類似体を別の分子に結合させるための手段を提
供する。配位子類似体は通常は配位子とは配位子
類似体を中枢（hub）または標識につなぐ結合に
よる水素の置換以上によつて配位子とは異なつて
いる。 ポリ（配位子−類似体）−通常は中枢核に共有
結合的に結合する複数の配位子または配位子類似
体。中枢核は通常は重合体状の、普通には複数の
官能基、たとえば、ヒドロキシ、アミノ、メルカ
プト、エチレン性不飽和などの基を結合のための
場所として有している、多官能性物質。中枢核は
水溶性でも非水溶性でもよいが、水溶性であるこ
とが好ましく、且つ通常は少なくとも約35000の
分子量であり、1000万以上の分子量であつてもよ
いが、普通には600000以下、より普通には300000
以下である。代表的な中枢核としては、多糖類、
蛋白質を包含するポリペプチド、核酸、イオン交
換樹脂などがある。水の不溶性の中枢核は粒子に
対して示したものと同一とすることができる。 固体表面−固体表面は、共有結合または非共有
結合的に、その表面へのミツプ及び酵素の結合を
許す多孔質固体表面である。結合は、たとえば、
特異的結合対の中介による直接または間接的なも
のとすることができる。固体表面は、分析の必要
成分の表面への結合を助けるため、または表面へ
の成分の非特異的結合を抑制するために、被覆し
てあつても被覆していなくてもよい。多くの場合
に、固体表面は、容器の壁または容器中の翼板で
あり、固体非多孔性粒子もまた、それ自体で、あ
るいは容器壁と組み合わせて、使用することがで
きる。粒子は100nm乃至約１mmの範囲の大きさと
することができるが、通常は約10μを超えること
はない。 信号発生系−信号発生系は、その基礎として一
方の生成物が他方の基質であるという関係をもつ
２酵素を有している。それ故、２酵素がきわめて
近似しているときは、系列中の第一の酵素の生成
物の系列中の第二の酵素によるより大きな入れ代
わりが予想される。それ故、信号発生系の部分と
して、少なくとも１化合物が存在し、その化合物
を第一の酵素によつて変性することによつて生じ
る生成物は、第二の酵素による変性によつて、直
接的または間接的に、検出可能な信号を提供する
第二の生成物を与えることができる。しかしなが
ら、信号発生系中には、酵素的触媒反応のためま
たは第二の酵素の生成物と作用してまたは反応し
て検出可能な信号を与えるために必要な多くの他
の成分を含有していてもよい。多くの場合に、信
号は通常は紫外または可視の範囲の電磁放射線の
吸収または発光であるが、電気化学的変化、熱的
変化、濁度的な変化などもまた、応用することが
できる。 ミツプ−酵素−結合体−信号発生系の成分であ
る２酵素の中の一方と結合する結合体配位子ある
いは受容体。ミツプは分析対象物またはその相補
対メンバーであつても、そうでなくてもよい。結
合体は配位子−酵素−結合体または受容体−酵素
−結合体を指すことが適切である。 方 法 本発明の分折は、一般には最適分析感度に近
い、適度はΩの水性の区域中で、分折成分または
生成物の分離なしに、遂行する。分析対象物の定
量のための分折区域は、通常は緩衝した、適当な
水性媒体、事前の処理を施してあつてもよい未知
試料、ミツプと酵素を結合せしめる固体表面、ミ
ツプ−酵素−結合体、検出可能な信号を発生する
ための信号発生系に対して必要な残りのすべての
材料、並びに必要に応じミツプまたはミツプ類似
体を使用することによつて調製する。 未知試料中の分析対象物の存在は、固体表面と
分析媒体中の全溶液の間のミツプ−酵素−結合体
の分配に影響する。 分析の遂行においては、通常は水性の媒体を使
用する。アルコール、エーテルなどを包含する、
通常は１〜６、さらに通常は１〜４の炭素原子の
酵素含有有機溶剤を含むその他の極性溶剤をも含
有させることができる。通常はこれらの共溶剤は
約40重量％未満、さらに普通には約20重量％未満
の量で存在させる。 媒体に対するΩは通常は約４〜11の範囲、さら
に普通には約５〜10の範囲、好ましくは約6.5〜
9.5の範囲とする。Ωは受容体による特異的な結
合の有意な水準を保つと共に信号発生効率を最適
化するように選ぶ。場合によつては、考慮すべき
これらの要件の間で歩み寄りを行なう。望ましい
Ωを達成し且つ定量の間のΩを維持するために、
種々の緩衝剤を使用することができる。代表的な
緩衝剤は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタールなどを包含する。使用する特定
の緩衝剤は本発明に対して重大なことではない
が、個々の分折に対して特定の緩衝剤が他のもの
よりも好適なことがある。 分析の遂行に対しては通常は適度な温度を使用
し、且つ通常は、特に速度の測定に対しては、測
定時間中で一定の温度を使用する。測定のための
温度は、一般には約10〜15℃、さらに普通には約
15〜40℃の範囲である。 分析することができる分析対象物の濃度は一般
に約10^-4〜10^-8M、さらに通常は約10^-6〜10^-18M
の範囲で変えることができる。分析が定性、半定
量的または定量的の何れであるかということ、特
定の検出方法及び対象とする分析物の濃度という
ような考慮すべき条件によつて、他の試料の濃度
を決定する。 分析媒体中の各試薬の濃度は一般に、分析対象
物について関与する濃度範囲によつて決定される
けれども、各試薬の最終濃度は通常は、関与する
範囲にわたつて分析の感度を最適化するように、
経験的に決定する。分析対象物に対して相補的な
特異的結合対のメンバーの全結合サイトは、分析
対象物の結合サイトに基づいて関与する最低濃度
の約0.1倍よりも少ないことはなく、通常は関与
する最大濃度の約0.1〜100倍、さらに普通には約
0.3〜10倍である。ここでいう濃度は、可能な濃
度、すなわち、飽和における濃度を意味し、特異
的結合対のメンバーを結合に対して同様に利用し
得ないこともある実際の濃度である必要はない。 試薬の本質、及びプロトコールに依存して、
個々の試薬の濃度を広く変えることができる。た
とえば、分析対象物が抗原であり、且つ固体表面
に結合したミツプとミツプ−酵素−結合体が何れ
も抗原に対する受容体である場合には、抗原の全
量と比較して表面上に著るしく大過剰のミツプを
有することができる。普通は、固体表面に結合し
た酵素の生成物の寿命がきわめて短かいかあるい
は全溶液中の生成物の濃度をきわめて低い水準に
保つために全溶液中で捕捉剤を用いる場合を除け
ば、大過剰のミツプ−酵素−結合体を存在せしめ
ることはない。 各成分の添加の順序は、平衡方式または速度方
式の何れを用いるかということ、及び使用するミ
ツプの本性に依存して、変えることができる。 多くの受容体においては、ミツプの会合は分析
中の間中ほとんど非可逆であるから、通常は、結
合体のミツプに対して補完的なミツプ表面に結合
させる場合に、ミツプ−酵素−結合体を試料より
も前に固体表面に加えることは避ける。分析対象
物が多価であり且つ表面上のミツプとミツプ−酵
素−結合対のミツプが同一である場合には、その
限りではない。これは分析対象物上の異なるサイ
トに指向する単一分枝系抗体を使用する場合にも
当てはまる。分析対象物の本性及び速度または平
衡測定の何れを行なうかにかかわりなく、全成分
を同時に加えることもできる。 洗浄段階は避けることが通常は望ましいけれど
も、場合によつては試料を固体表面に加え、温置
し且つ洗浄して、信号発生系を妨害するおそれの
ある内因性の物質を除くことが好ましい。 分析には１以上の温置工程を包含させることが
できる。たとえば、抗原分析物を表面と共に、あ
るいは、ミツプ−酵素−結合体と共に、他の成分
を加える前に、温置することが望ましいことがあ
る。温置期間を置くかどうかということ及びその
温置時間の長さは、測定の方式（速度または平
衡）及び相補ミツプの結合の速度に大きく依存す
る。通常は、温置工程は約0.5分乃至24時間、さ
らに普通には約５分乃至１時間の範囲である。温
置温度は一般に約４〜50℃、さらに普通には約15
〜37℃の範囲である。 試薬を混合したのち、信号を測定する。１回以
上の読みが行なわれるが、所定の時間間隔にわた
る信号水準の差を用いることが多い。測定の方法
は、吸光または発光の何れかの電磁放射線、特に
紫外及び可視光、比色、電気化学的、比濁的など
の観測とすることができる。信号は紫外または可
視領域、特に約250〜750nm、通常は約350〜
650nmの電磁放射線として読むことが望ましい。 信号を観測する温度は一般に約10〜50℃、さら
に普通には約15〜40℃である。 既知量の分析対象物を含有する標準分析媒体を
調製する。次いで標準分析媒体に対する観測信号
を、信号と濃度を関係させるようにプロツトす
る。標準曲線を確立すれば、信号を分析対象物の
濃度と直接に関係づけることができる。 信号を測定するための時間は、速度または平衡
方式の何れを用いるか、必要とする感度、信号発
生系の本質などによつて異なる。速度方式に対し
ては、読みの間の時間は一般に約５秒乃至６時
間、通常は約10秒乃至１時間の間で異なる。平衡
方式に対しては、定常状態に達したのち、単独の
読みで十分であるか、または適宜の間隔における
２回の読みで十分である。 配位子は、モノ−またはポリエピトピツクのも
のとすることができる。エピトピツクとは、他の
分子が特異的に結合する分子上の特異的サイトを
意味する。多くの場合に、配位子がモノ−または
ポリエピトピツクの何れであるかは、分析をどの
ように遂行するかには影響しない。分析対象物が
配位子である場合には、表面に結合したミツプは
配位子または受容体、通常は受容体とすることが
できる。ミツプ−酵素−結合体は配位子または受
容体の何れかを有することができる。しかしなが
ら、表面に結合したミツプ及びミツプ−酵素−結
合体が共に受容体である場合には、配位子はポリ
エピトピツクであるかまたは追加の試薬としてポ
リ（配位子類似体）を使用することによつてポリ
エピトピツクにしなければならない。すなわち、
配位子が表面に結合したミツプに結合して表面へ
のミツプ−酵素−結合体の結合のための配位子エ
ピトピツクサイトを提供するというサンドイツチ
方法を用いる。 受容体が分析対象物である場合には、表面に結
合したミツプとミツプ−酵素−結合体は同一また
は異なるミツプを有することができ、但しここで
配位子が両結合体中に含まれる場合には受容体は
多価であることを条件とする。 分析対象物、表面に結合したミツプ及びミツプ
−酵素−結合体がすべて同一タイプのミツプであ
るかまたは同一タイプのミツプを含有している場
合には、単分枝系抗体が含まれるのでない限り
は、同族メンバーを添加しなければならず且つ、
それが受容体である場合には、抗体またはその他
の多価受容体の何れかとして、あるいはそれが配
位子の場合には、ポリハプテン（ポリ（配位子類
似体））として、ポリエピトピツク形態で提供し
なければならない。 ミツプ−酵素−結合体は分析対象物に対して相
補的である必要はない。多くの場合に、配位子に
対して相補的である受容体に複数の酵素が結合す
るために、ミツプ−酵素−結合体が受容体を認識
することが望ましい。 材 料 分析において使用する成分は、分析対象物を含
有する試料、ミツプと信号発生系を結合させるべ
き固体表面、信号発生系の残りのメンバー、及び
適切なものとして、ミツプである。作用物の調製
において使用するものは固体表面とミツプであ
る。 分析対象物 本発明の配位子分析対象物は、モノエピトピツ
クまたはポリエピトピツクである。ポリエピトピ
ツク配位子分析対象物は通常はポリ（アミノ酸）、
たとえばポリペプチド及び蛋白質、多糖類、核
酸、並びにそれらの混合物である。このような混
合物または集合物は、細菌、ビールス、染色体、
遺伝子、ミトコンドリア、細胞核、細胞膜などを
包含する。 多くの場合に、本発明において使用するポリエ
ピトピツク配位子分析対象物は、少なくとも約
5000、さらに普通には少なくとも10000の分子量
を有している。ポリ（アミノ酸）領域において
は、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜
5000000の分子量、さらに普通には約20000〜
1000000の分子量であり；興味あるホルモンにお
いては、分子量は通常は約5000〜60000にわたつ
ている。 広い種類の配位子が米国特許第4193983号に記
されており、その説明は参考のためにここに編入
する。また、配位子類似体の説明もまた、この文
献中に認めることができ、その記述もまた参考の
ためにここに編入する。 信号発生系 信号発生系は少なくとも次の３成分を有してい
る：第一及び第二の酵素（これらの酵素は第一の
酵素の生成物が第二の酵素の基質であることによ
つて関連している）及び両酵素の基質。酵素触媒
反応の一方または両方のために、あるいは第二の
酵素の生成物と作用または反応させて検出可能な
信号を与えるために、追加の成分を必要とするこ
ともある。 信号発生系は、多くの場合に、光を吸収する発
色団のような、電磁放射線の測定をもたらす生成
物、あるいは、たとえば螢光体または化学ルミネ
センス体のような、発光をもたらす生成物を提供
する。 酵素の選択においては、酵素の入れ代わりの速
度に対する粒子の影響のほか、他の考慮すべき条
件もまた酵素の選択に影響する。これらの条件
は、酵素の安定性、高い入れ代わり速度の必要
度、物理的環境の変化に対する速度の感度、基質
または生成物、好ましくは生成物、の本性、酵素
の入手し易さ、酵素の性質に対する酵素の結合の
影響、試料溶液中で遭偶する可能性のある物質の
酵素活性に対する影響、酵素の分子量などを包含
する。 前記の特許文献中には酵素についての広範な説
明があり、その説明もまた参考のために本明細書
中に編入する。 種々の酵素の組合わせを使用することができ
る。１連の組合わせにおいては、NADまたは
NADPあるいはそれらの還元生成物を測定すべ
き能力を用いる。これらの組合わせにおいては、
NADに依存する酸化還元酵素を、酸化還元酵素
に対する基質を提供する酵素と共に使用する。測
定する生成物を生じさせるために、広い種類の酵
素及び反応を用いることができるが、酵素の多く
は炭水化物代謝の一部である。相当な数のこれら
の酵素がリン酸エステルの生成と変換に関係す
る。関係する可能性のあるその他の反応としては
リアーゼによる炭素−炭素結合の開裂、ケト−ア
ルデヒド変換を伴なう異性化及び脱カルボキシル
化である。 特に興味のあるものは糖を包含する組合わせで
あつて、その場合に第一段階において転移酵素、
加水分解酵素、リアーゼまたはイソメラーゼは、
特にリン酸エステルを伴なつて、酸化還元酵素に
依存するNAD（Ｐ）の基質を与える。特に有用な
ものは酸化還元酵素反応における酵素基質として
３〜６炭素原子を有する単糖類モノリン酸であ
る。 下表は、酸化還元酵素に対する前駆物質が生成
し且つNAP依存酵素の反応の経過ののちにNAD
またはNADPのその還元形態へあるいは還元形
態からの変換が続く場合の多数の実例を示す。各
例において両酵素は信号発生系の部分である。

【表】 デヒドロゲナーゼ

【表】 ドロゲナーゼ
その他の酵素の組合わせは過酸化水素の生成を
包含するが、その場合に化学ルミネセンス材料、
たとえばルミノール、を伴なう過酸化水素のペル
オキシダーゼによる触媒反応が光を生じさせる。
ルミノールのほかに、その他の２，３−ジヒドロ
−１，４−フタルアジンジオン類を用いることも
できる。これらは５−アミノ−６，７，８−トリ
メトキシ−及びジメチルアミノ〔ca〕ベンズ類
似体を包含する。その他の化合物は、親化合物に
対する一般名としてロフインを有する。２，４，
５−トリフエニルイミダゾール類であり、且つパ
ラ−ジメチルアミノ及び−メトキシ置換した化合
物もまた有用である。化学ルミネセンス化合物を
光の直接源とすることができ、または、たとえば
９，10−ジブロモアントラセンのような受容体と
反応させて、それを発光させることもできる。あ
りいはまた、過酸化水素と共に酵素的な触媒反応
を受けて検出可能な着色形態を与える、種々な染
料前駆物質を用いることもできる。 下表は両酵素を信号発生系の成分としている、
多くのこれらの反応を示す。

【表】 以下の系列の反応は、水を包含する２反応、通
常は加水分解酵素を包含する２反応に基づくもの
であるけれども、シンテターゼをも使用すること
ができる。

【表】 以下の系列の組合わせは、受容体または供与体
から電子を供与または受容することができ、その
結果として受容体または供与体の吸収スペクトル
に実質的な変化が存在する酵素に対する第一段階
における基質の調製を包含する。多くの場合に、
第二の酵素は酸化還元酵素、特にデヒドロゲナー
ゼ及びオキシダーゼである。この系列において両
酵素は信号発生系の成分である。

【表】

【表】 本発明においては、それ故、第一の酵素反応が
第二の酵素反応に対する基質を提供するように働
らく。第二の酵素反応は、直接に、または付加的
な反応によつて、特に300nm以上、好ましくは
350nm以上、さらに好ましくは400nm以上の光の
吸収；350nmを超え、好ましくは400nmを超え、
さらに好ましくは450nmを超える波長の光を発す
る螢光；あるいは化学ルミネセンスによつて、分
光光度的に測定することができる化合物の生成を
結果する。光の吸収の測定のためには、消光率は
上記の波長を超える吸収に対して10³mol^-1より
も大きく、好ましくは10⁴よりも大きくなければ
ならない。 前記のように、分析対象物の量に関係して表面
に結合するミツプの各相補対に対して表面に結合
する複数のミツプ−酵素−結合体を有することに
よつて、検出可能な信号を著るしく増大させるこ
とができる。かくして、１宿主からのたとえば抗
体のような受容体及び第二の宿主からの酵素に結
合する抗受容体を有することによつて、表面への
受容体の結合は、かかる受容体に結合する複数の
抗（受容体）−酵素−結合体をもたらす。これは、
抱合体の酵素が表面に結合た酵素により生じる生
成物の主要部分を捕捉することを可能として、全
媒体中で生じる検出可能な信号発生生成物の量を
最低にするという効果を有する。 バツクグラウンドを低下させる別の方法は、全
媒体中に捕捉剤を存在せしめることである。たと
えば、第一の酵素の生成物が過酸化水素であると
きは、全媒体中に過酸化水素を分解するカタラー
ゼまたはその他の反応物を使用することができ
る。全媒体中に捕捉剤を存在せしめることによつ
て、両酵素の全体的な入れ代わり速度の多少の低
下があるけれども、バツクグラウンド信号と比較
しての、分析対象物の量に関係する信号発生生成
物の生成の比率の実質的な増大が予想される。 各酵素系と共に、捕捉剤への異なるアプローチ
を用いることができる。表面へのミツプ−酵素−
結合体の結合の効果は、ミツプ−酵素−結合体が
溶液本体中にある場合よりも、少なくとも２倍、
さらに普通には10倍、より好ましくは100倍の速
度差を提供することが望ましい。 固体表面 天然または合成の、有機あるいは無機材料を包
含することができる、広く異なる固体表面を使用
することができる。特に興味あるものは、たとえ
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン
などのような、合成重合体、特に付加重合体、通
常は炭化水素重合体である。 固体表面は、共有結合または非共有結合のどち
らかで、ミツプと酵素を結合することができる
か、あるいは官能化または適当な材料による被覆
によつて、それが可能であることが必要である。
不活性な固体表面を、共有結合的に蛋白質を結合
することができるように変性するためには、広く
異なる官能基を用いることができる。官能基とし
ては活性ハロゲン化物、エポキシド、非オキソ−
カルボニル化合物、メルカプタンなどが含まれ
る。ミツプと酵素の表面への抱合の特定方式は、
それぞれが分析に対して必要な性質を維持する限
りは、本発明にとつて限定的ではない。 別法として、固体表面をポリ（アミノ酸）、た
とえばポリリシン、で被覆して、そのポリ（アミ
ノ酸）を、固体表面とポリヘプチド配位子または
受容体及び酵素の間の中間的結合剤として、働ら
かせることもできる。 拡散の速度は、所望の感度を取得するために必
要な時間を望ましくない程度に増大させるおそれ
があるから、そのような情況では、ミツプ−酵素
−結合体が表面に出合うまでの平均経路長を短か
くするために、固体表面の表面積を著るしく増大
させることが望ましい。固体表面積の全溶液容量
に対する比を決定するには、表面に結合させなけ
ればならない酵素の量に対する固体表面積の増大
の影響、及びこの酵素が生産する生成物の全媒体
中に逸出する量の両方を考慮しなければならな
い。増大した表面積を与えるために、固体表面と
して、通路として働らく大きな穴を有する翼、粒
子などを用いることができる。通常は容器の壁の
みを用いることが望ましい。 補助材料 本発明の分析においては、種々の補助的な材料
を用いることができる。特に、信号発生系の部分
として、酵素基質、補足因子及び抑制因子を使用
してもよい。加うるに、緩衝剤、安定剤、界面活
性剤、特に非イオン活性剤のような、その他の材
料を含有させることもできる。 キツト 便宜上の問題として、各試薬をキツトとして提
供することができるが、その場合に各試薬は興味
の範囲にある分析の感度を実質的に最適化するた
めの所定の比率で存在せしめる。通常は、試薬を
粉末、特に凍結乾燥した粉末として用意し、その
際、試薬の本性とプロトコールによつて必要とす
るような最低数の個々の配合物を使用することに
より、使用者による別々の測定と添加の数をでき
るだけ少なくする。その上に、容器、特にミクロ
タイター板を用意して、ミツプと酵素を器壁に結
合させる。結合体の酵素が系列中の第二の酵素で
ある場合にミツプ−酵素−結合体と共に、両酵素
に対して必要な基質と捕足因子を含有せしめるこ
とができる。前記のような各種の補助材料をも含
有せしめることができる。 実施例 以下の実施例は例証のために示すものであつ
て、限定のためのものではない。 百分率及び部数は、液体の混合物に対する容量
のほかは、特に他のことわりがない限りは、重量
による。温度は、他のことわりがない限りは、摂
氏である。 ミクロタイター板（リンブロー板、フロー研究
所）の凹所を、200μのポリリシン溶液（１
mg／ml）で１〜２時間被覆した。結合しないポリ
リシンを、0.1M酸性リン酸ナトリウム
0.2MNaCl，Ω7.0を用いる２回の洗浄によつて除
去した。次いで凹所を、グルコース オキシダー
ゼ（１mg／ml）と人のIgG（10μｇ／ml）の50μ
の混合物で、16時間被覆した。未結合の蛋白質を
0.2M NaCl，牛の血清アルブミン（１mg／ml）
及びツイーン20（0.02％）を含有する0.1M酸性リ
ン酸ナトリウムで２回洗浄した。板をこの洗浄緩
衝液（200μ／凹所）と共に温置した。２時間
後に、板の凹所を空にして暗所で振とうした。 チヤンネル形の反応に対しては、20μの洗浄
緩衝液を凹所に入れた。非チヤンネル形反応に対
しては20μの人のIgG（１mg／ml）を入れた。チ
ヤンネル形とは生成物がミクロタイター板に結合
した２酵素（GO及びHRP）から由来することを
意味するのに対して、非チヤンネル形とは１酵素
（GO）のみがミクロタイター板に結合し、他の
酵素（HRP）は溶液中に遊離していることを意
味する。チヤンネル形の免疫学的検定に対して
は、一連の希釈度における20μの人のIgGを加
えた。次いで30μ中で約30ngの活性HRPに希釈
した羊抗人IgG−ワサビ ペルオキシダーゼ−結
合体を各凹所に加えた。板を振とう下に３時間温
置した。次いで溶液に、ワサビペルオキシダーゼ
に対してモル的に約600倍過剰である100mgのカラ
ターゼを含有する0.15mlの基質（12.5nMの２，
2′−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸〔ABTS〕及び120mMのグル
コース）を加えた。最終容量は0.2mlであつた。
３時間後に、ミクロタイター板リーダー（フロー
研究所）上で、414nmにおける吸光度を読んだ。 下表はその結果を示すが、これらの値は２試料
の平均値である。HIgG（ng／凹所） 吸光度 0 0.457 0.1 0.351 1 0.374 10 0.168 100 0.08 1000 0.07 10000 0.02 非多孔性ビーズの使用を実証するために、以下
の実験を行なつた。約0.94μｍの大きさのポリス
チレン ビーズ（コンバスフエアズ，コバレント
テクノロジー社）を、ビーズの0.5％分散物10μ
中で３〜4ngの活性グルコース オキシダーゼ
と200〜400ngのhIgGがビーズに結合する条件下
に、グルコース オキシダーゼ及び人のIgGと混
合した。 チヤンネル形の反応に対しては、10μの緩衝
剤を加え、一方、非チヤンネル形の反応に対して
は、10μのHIgG（20μｇ）を加えた。次いでこ
の混合物に30μの結合体（１：100の希釈、約
15ngの活性HRPを含有）を加え且つ分析媒体を
約2.5時間温置した。チヤンネル形の反応におい
ては、ビーズが凝集して凹所の底に沈殿し、かく
して溶液は透明となつた。非チヤンネル形の反応
においては、溶液は濁つたままであつた。次いで
この混合物に、１凹所当り約35μｇの量で且つカ
タラーゼのHRPに対する400：１のモル比を与え
るために十分なカタラーゼと共に、前記の基質溶
液を加えた。 下表はその結果を示す。

【表】 上記の結果は、約100分において最良のチヤン
ネル形信号の非チヤンネル形信号に対する比が得
られることを示している。 上記のデータは本発明が固体表面上で分析を遂
行するための簡単且つ迅速な方法を提供すること
を実証する。驚くべきことに、２酵素が表面上に
あるチヤンネル形の反応と１酵素が表面上にあり
他の酵素が溶液中に分散している非チヤンネル形
反応の間には明確な相違を認めることができる。
表面上の酵素の生成物がミツプ−酵素−結合体の
酵素に対する基質として働らく場合に、表面上の
酵素の生成物を分解する捕捉剤を全溶液中に存在
させることによつて、感度が増大する。ミツプ−
酵素−結合体は、存在する分析対象物の量に関連
して、表面と全溶液の間に分配される。この分析
は、物理的な分離工程または試料の添加後の器壁
の洗浄の何れをも必要としない方法を提供すると
いう点で、特に有用である。この方法は分析媒体
中の試料の量の測定のために全溶液からのミツプ
−酵素−結合体の除去を必要とすることもない。 本発明を例証のために多少詳細に説明し且つ理
解を明瞭とするために実施例を示したが、特許請
求の範囲内において、いくつかの変更及び修飾を
行なうことができるということは明白であろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 配位子とその受容体から成る特異的結合対の
   １メンバーである分析対象物の試料中における存
   在を測定するための分析方法であつて、該方法
   は： (a) 連続的な水性媒体； (b) 該媒体と接触しており且つ特異的結合対のメ
   ンバーと第一の酵素が結合されている非多孔性
   固体表面； (c) 測定しうる信号を発生することができる信号
   発生系、但し該信号の強度は該媒体中の該分析
   対象物の濃度によつて影響を受け且つ該信号発
   生系は少なくとも第二の酵素と該第一及び第二
   の酵素の中の一つに対する基質を包含してい
   る； (d) 該第二の酵素は特異的結合対のメンバー−酵
   素−結合体を与えるように特異的結合対のメン
   バーに結合せしめられている、ここで固体表面
   に結合した特異的結合対のメンバー−酵素−結
   合体の量は該水性媒体中の分析対象物の量に関
   連している； ここで、上記２つの酵素は一方の生産物が他方
   の基質であるという関係を有している； を採用し、そして該方法は； 該特異的結合対のメンバーと該第一の酵素を結
   合せしめた該固体表面を、 (a)該試料；(b)該特異的結合対のメンバー−酵素
   −結合体；(c)該分析対象物、特異的結合対のメン
   バー−酵素−結合体及び表面に結合した特異的結
   合対のメンバーが同一である場合、該特異的結合
   対の相補的メンバー、および (e) 該両酵素の少なくとも一つに対する基質及び
   該信号発生系の残余のメンバー、 を含有してなる水性の分析媒体 と組合せ、 但し分析対象物が第一の受容体であるとき
   は、該固体表面に結合せしめた該特異的結合対
   の該メンバーは配位子または該第一の受容体の
   ための受容体とすることができ且つ該酵素結合
   体の該メンバーはそれぞれ該第一の受容体のた
   めの受容体または配位子とすることができ；且
   つ 該水性の分析媒体中の該信号の強度を、既知
   量の分析対象物を含有する分析媒体と比較して
   測定する、 ことから成る分析方法。 ２ 該固体表面は容器壁である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ 該固体表面は非多孔性粒子である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４ 媒体に対するΩは約５〜10の範囲にある特許
   請求の範囲第１，２または３項記載の方法。 ５ 該酵素の一つは加水分解酵素である特許請求
   の範囲第１，２または３項記載の方法。 ６ 該酵素の一つは酸化環元酵素である特許請求
   の範囲第１，２または３項記載の方法。 ７ 該酸化還元酵素はオキシダーゼである特許請
   求の範囲第６項記載の方法。 ８ 配位子及びその受容体から成る特異的結合対
   の１メンバーの試料中における存在を測定するた
   めの分析方法であつて、該方法は： (1) 約6.5〜9.5の範囲のΩにおける水性の緩衝連
   続相から成る媒体、及び該特異的結合対の中の
   一つと第一の酵素とを結合せしめて結合担体を
   与える担体としての固体非多孔性相、並びに (2) 測定しうる信号を発生することができ且つ特
   異性結合対のメンバー−酵素−結合体を与える
   ために特異的結合対のメンバーに結合せしめる
   第二の酵素とを有する信号発生系 を使用し、ここで該第一及び第二の酵素は該信号
   発生系を規定し且つ第一及び第二の酵素は一方の
   生産物が他方の基質であることによつて関連を有
   しており、ここで該測定しうる信号は該担体と該
   水性の媒体の間の該特異的結合対のメンバー−酵
   素−結合体の分配に関係して変化し、該分配は該
   媒体中の分析対象物の量に関係しており、 該方法は： 該特異的結合対のメンバー及び該第一の酵素を
   結合せしめた該担体を、 (a)該試料：(b)該特異的結合対のメンバー−酵素
   −結合体；(c)該分析対象物、担体及び特異的結合
   対のメンバー−酵素−結合体が特異的結合対の同
   一のメンバーを有する場合には、該特異的結合対
   の相補メンバー並びに(d)基質及び該信号発生系の
   付加的メンバーから成る水性媒体と組み合わせ、
   但し、その際、特異的結合対のメンバー−酵素−
   結合体は、該水性媒体と該担体の間で、該試料中
   の分析対象物の量に依存する量で分配され；且つ 該分析媒体中の該信号の強度を、既知量の分析
   対象物を含有する分析媒体と比較して測定する、
   ことから成る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９ いずれの酵素も酸化還元酵素である特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０ 該酵素の中の一つは過酸化水素を生産する
   ものである特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 該水性媒体中に、酵素過酸化水素捕捉剤を
   含有せしめる特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２ 該酵素の中の一つはグルコースオキシダー
   ゼであり且つ該酵素の他方はワサビペルオキシダ
   ーゼである特許請求の範囲第１０または１１項記
   載の方法。 １３ 複数の凹所を有するミクロライター板、但
   し該凹所の壁には第一の酵素と特異的結合対のメ
   ンバーが結合している；第二の酵素を有する特異
   的結合対のメンバー−酵素−結合体、但し該２つ
   の酵素は該酵素の一方の生産物が該酵素の他方の
   基質であることによつて関連している；及び該２
   の酵素に対する少なくとも１つの基質の組み合わ
   せ から成るキツト。 １４ ２つの酵素は酸化還元酵素である特許請求
   の範囲第１３項記載のキツト。 １５ 該酸化還元酵素の中の一方はグルコースオ
   キシダーゼであり且つ該酸化還元酵素の中の他方
   はワサビペルオキシダーゼである特許請求の範囲
   第１項記載のキツト。 １６ 該基質はワサビペルオキシダーゼを触媒と
   する反応によつて酸化せしめられた染料を包含す
   る特許請求の範囲第１５項記載のキツト。