JPH0566547B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

発明の技術的背景 １ 発明の利用分野 本発明は、全血試料中のアナライト（被分析成
分）を分析する方法に関し、更に詳しくは、その
様な分析を行なうための、新規な方法並びに組成
物に関するものである。 血液試料中のアナライトの分析は、診断および
治療の両医学分野においてますます重要になつて
きた。通常、血清を用いて行なわれる分析を実施
するためには、予め試料中の赤血球を分離してお
かねばならない。このことは、特に、酵素標識イ
ムノアツセイの如き標識を用いた分析、中でも、
定量的な測定を行なう様な分析の場合には、まさ
しくそうである。これらの測定においては通常、
アナライトの濃度は様々であり、しかも、２種の
低濃度のアナライト相互の間の差異を検出するの
が普通である。この様な場合、赤血球細胞が特異
結合対（sbp）構成成分（メンバー）間で起きる
結合を阻害するかもしれないことから、該細胞を
全血試料から分離する作業は必須である。しか
も、この細胞は生成した信号を妨害し得る様な酵
素活性をも有している。定量分析には高い精度が
要求されるので、赤血球細胞の存在によつてひき
起こされる、分析に対してのバツクグラウンド妨
害を許容することはできない。 かくして、全血試料に関するエンザイムイムノ
アツセイには２段階が含まれることとなる。第１
段階においては、全血中の血清から赤血球を分離
する。この分離は一般に遠心分離法で行なわれ、
該細胞は底部に沈降するので、デカンテーシヨン
または他の方法で血清を分離することができる。
この、血清からの赤血球の分離は、通常、全血試
料を採集した場所で行なわれる。分離した後、該
血清を分析の場所まで運ぶ。分離工程が含まれて
いるために、患者から比較的大量の全血試料（一
般に約0.1〜5.0ml程度）を採取する必要がある。
全血試料の採取は侵襲的な操作なので、多くの医
師は、常套手段として、この分析を指示すること
に乗り気でない。更に問題を複雑にしているの
は、大多数の診療室には内部に血液分離装置が備
えられていないということである。その結果、血
漿からと赤血球の分離を行なうことができる場所
まで、血液試料を移送しなければならないことに
なる。 従つて、少量の全血試料に適用することのでき
る分析法が必要となる。その様な分析法は、赤血
球細胞の分離工程を含まず、かつ、ピンで刺して
滴下させた程度の少量の、患者から得た全血試料
に対しても適用することのできるものでなければ
ならない。この様な分析法であれば、医師等をし
て、アナライトの分析を、より日常的なものとし
て実施せしめるであろう。 ２ 先行技術 Anderson（Anal.Biochem.（1970）38：175〜
189）は、セルロース芯を用いた凝集反応の監視
について述べている。エンザイム・クロマトグラ
フイツク・イムノアツセイは、アメリカ特許第
398505号（1982年７月15日出願）により開示され
た。顆粒−含有媒質中のアナライトの測定は、ア
メリカ特許第519300号（1983年７月29日出願）に
よつて開示されている。 アメリカ特許第4168146号には、抗原を用いて
イムノクロマトグラフイーを行ない、次いで、こ
のイムノクロマトグラフイーを標識抗原と接触さ
せることからなるイムノアツセイが記載されてい
る。アメリカ特許第4233402号には、１つの酵素
の基質がもう１つの酵素の産物であるような１組
の酵素を用いたホモジーニアス・アツセイ（均質
分析）法が記載されている。この産物の生産の増
大は、分析媒質中のアナライトの量に関連してい
る。アメリカ特許第4275149号では、酵素を組み
合わせて用いる顆粒を使用する方法が記載されて
おり、この場合、顆粒の存在によつて２つの酵素
間の相互作用が高められるものであり、また、一
方の酵素の産物がもう一方の酵素の基質となつて
いる。特異的に結合する一対の構成要素の結合の
結果物である、顆粒に結合した２個の酵素の存在
に基づく最終産物の生産の増大は、媒質中のアナ
ライトの量と関連している。 様々なタイプの試験紙に様々の試薬を固定した
ものには関する特許にはアメリカ特許第3993451
号；第4038485号；第4046514号；第4129417号；
第4133639号および第4160008号がある。結合また
は非結合型の抗原の分離を含む様々な方法を開示
している特許には、アメリカ特許第29169号；第
3949064号；第3984533号；第3985867号；第
4020151号；第4039652号；第4067959号；第
4108972号；第4145408号および第4168148号があ
る。 発明の要約 本発明は、全血試料中に含まれる、特異的結合
対（sbpと称する）の構成要素（メンバー）の存
在を検出するための方法並びに組成物が提供する
ものである。これらのsbpメンバーはリガンドお
よびホモローガス（同族の）なリセプターとから
成る。本発明方法においては、赤血球細胞が分離
されていない全血試料を、該試料中の赤血球細胞
に対する結合剤に、水性の緩衝化された媒質中で
結合させる。分析のプロトコールに適するなら
ば、検出可能な信号を生産し得るような、１また
は１以上の信号生成系を含有させることもある。
少くとも１個のsbpメンバーが固体の吸収性要素
（固体吸収材）に実質的に均一に結合している。
固体吸収材のあらかじめ定めた領域に分析用の媒
質を接触させると、赤血球細胞は、気／液境界面
に隣接している、固体の吸収材上方領域に濃縮さ
れることになる。そして、上記の媒質が、固体の
吸収材を横切つて通過する。そして、残りの信号
生産系の構成要素が固体の吸収材に結合する。こ
のsbpメンバーの結合の結果として生産された信
号を検出し、試料中のsbpメンバーの量に関連づ
ける。 全血試料中のsbpメンバーの存在を測定するの
に用いる分析用キツトは、試料中の赤血球に対す
る結合剤、１つのsbpメンバーと結合する、少く
とも１個の標識を含む１つの信号生成系、固体の
吸収材、および本発明のイムノアツセイを実施す
るのに必要な補助物質のすべて、を配合した充填
物（パツケージ）からなる。 好ましい実施態様 上記の如く、本発明の方法によれば、アナライ
トを含んでいるかもしれない全血試料中のアナラ
イト（sbpメンバーの１つである）を測定するこ
とができる。本発明方法は、水性媒質中で、気／
液両相の境界面を規定している固体の吸収材の、
あらかじめ定められた領域に、全血試料と、赤血
球の結合剤とを接触させることからなる。該吸収
材は、その表面に均一に結合している１つのsbp
メンバーを有している。接触は、アナライトの量
に関連して境界線が明確に定まると共に、赤血球
細胞が気／液境界面で凝集する状態で上記吸収材
を横切る様にして行なう。この境界線の決定は、
標識sbpメンバーを含有する信号生成系に基づい
て行なう。 本発明方法では、試料を水性媒質中で結合剤と
混合する。もし適切ならば、この水性媒質中に１
またはそれ以上の信号生成系の構成要素を加える
こともある。 赤血球細胞は、全血試料中の主な妨害物質であ
る。その他の細胞性物質も妨害物質として分類す
ることができる。この細胞性物質は、全血中に少
量しか存在しないので、その存在が分析における
実質的なバツクグラウンド妨害に帰着することは
ない。さらに、これらの細胞性物質の内にあるも
のは、赤血球細胞と凝集し、本発明方法を適用す
る間に分析用媒質中から除去されてしまう。 結合剤を加えた後、１つのsbpメンバーが結合
している固体の吸収材のある部位、通常は一端、
に試料を接触させる。媒質をこの固体の吸収材に
沿つて拡散（展開）させると、赤血球細胞は気／
液境界面に保持される。拡散終了後、信号生成系
の残りのメンバーが固体吸収材に結合し、試料中
のアナライトの量に関連して定まる境界線（縁）
が定まる。 ここで、まず本明細書中で用いる多くの語句の
定義を述べる。 アナライト−測定しようとしている化合物また
は組成物であつて、リガンドであつてもよく、少
くとも１個の、共通の抗原決定基、あるいはリセ
プターを共有している、単一または複数の決定基
を有する、抗原性をまたはハプテン性の単数また
は複数の化合物群を指す。 特異的結合対−２個の異なる分子であつて、１
個の分子がもう１個の分子の特定の空間的な、あ
るいは極性的な組織体に特異的に結合することの
できる領域を、その表面または空洞（くぼみ）の
中に有している様な１対の分子を指す。 リガンド−そのものに対するリセプターが天然
に存在しているか、あるいは調製することができ
る、全ての有機化合物を指す。 リセプタ−（抗リガンド）−ある分子の特定の空
間（立体）的な、または極性の部位（即ち、抗原
決定基）を認識することのできる化合物または組
成物のすべてを指す。例示的なリセプターには、
例えば、チロキシン結合グロブリン、抗体類、酵
素類、Fabフラグメント類およびレクチン類等が
含まれる。 リガンド同族体−類似しているリガンドとリセ
プターを競合し合うことができる様な、修飾の施
されたリガンドであつて、該修飾によつて、リガ
ンド同族体がもう一つの分子に結合する手段を与
えられているものである。このリガンド同族体は
通常、１個の水素原子を該リガンド同族体をhub
または標識と結合させるような結合手で置換した
程度以上に、リガンドと異なつているものであ
る。 ポリ（リガンド−同族体）−普通はhub核に対
し、複数のリガンドまたはリガンド同族体が一緒
に共有結合したものを指す。このhub核は多機能
性物質、普通はポリマーであつて、通常、結合部
位として複数個の官能基（例えば、水酸基、アミ
ノ基、メルカプト基およびエチレン基等）を有す
るものである。このhub核は水溶性または水不溶
性であつてよいが、水溶性であることが好まし
く、また、分子量は少くとも約35000から
10000000あるいはそれ以上であるかもしれない
が、通常は600000以下であり、300000以下である
ことがより一般的である。hub核の例としては、
ポリサツカライド（多糖類）、タンパク質や核酸
を含むポリペプチド、並びにイオン交換樹脂等を
挙げることができる。 信号生成系−信号生成系は、１または１以上の
成分を有することができるが、その内の少くとも
１成分は特異的結合対メンバーの１つと結合して
いる。この信号生成系は外的な手段、通常、電磁
的放射線を用いた測定法、によつて検出すること
ができる。大部分の場合、この信号生成系は発色
団を含有しており、それらの発色団には紫外また
は可視領域の光を吸収する染料、りん光、けい光
および化学的ミネツセンスを発する染料が含まれ
ている。大部分の場合、信号としては一般に紫外
または可視領域の電磁波を吸収または発するもの
が好都合である。 標識（ラベル）−標識は、もう１つの分子と結
合（抱合）しているならば、如何なる分子でもよ
く、いずれの分子を標識にするかという選択では
任意である。本発明における標識は、信号生成系
の１つのメンバーと結合している、特異的結合対
の１メンバーであろう。 結合対標識−自身と類似したメンバーと結合す
るのに用いられる、特異的結合対の１つのメンバ
ーを指す。 信号標識−結合対メンバーに対して直接または
間接的に結合（特異的結合対間の結合を介して）
している信号生成系の１メンバーを指す。 標識されたリガンドー特異的結合対のリガンド
メンバーと、信号生成系の１メンバーとが、共有
結合的または非共有結合的に結合したものであ
り、共有結合の場合は、結合手、連結基、または
hub核を介して結合したものである。この標識さ
れたリガンドは、１または１以上のリガンド（リ
ガンド同族体を含む）あるいは１または１以上の
標識、もしくは両方を複数固有することができ、
後者の場合には、ポリ（リガンド同族体）−ポリ
標識と呼ばれる。 標識されたリセプター−リセプターと信号生成
系の１メンバーとが共有結合または非共有結合的
（通常は、連結基を有する共有結合により）に結
合したものであつて、それらの中には、該標識に
対して１または１以上のリセプターが結合してい
るものもあるかもしれないが、該リセプターに対
して１または１以上の標識が結合しているのが普
通である。 結合剤−赤血球細胞の結合剤であつて、全血中
の赤血球細胞を凝集させることのできる物質を指
す。この結合剤は、媒質が吸収材に接触した際
に、赤血球細胞を表面と液相との中間に分配させ
ることによつて該赤血球を媒質から分離する能力
を有していなければならない。例えば、この結合
剤は、赤血球細胞を相互に付着させる様な凝集剤
（例、赤血球細胞の特異抗体）であつてもよい。
その他の型の凝集剤としては、ポリリジン、ポリ
アルギニン、およびポリブレン等の重合アミノ酸
類、並びに、小麦胚芽凝集素（Triticam
vulgaris）等のレクチン類がある。 吸収材−気相と液相との境界面から液体を毛管
現象によつて移動させるような吸収性の固形材料
のすべてを指す。紙、セルロース粒子、シリカゲ
ルおよび吸収性セルロース・ビーズ等を含む種々
の材料がある。凝集した赤血球細胞を気／液境界
面上、またはその近くに、鋭いバンドまたは線と
して保持することができる様、その表面が比較的
滑らかであることが好ましい。吸収性物質のサイ
ズおよび形は、その材料の使用目的、即ち、凝集
した赤血球を保持すると共に、アナライトの分析
を行なうための支持体であること、を考慮して広
範囲に変化し得る。その表面は様々な異なつた物
理的性質を有するであろうし、種々の異なる化学
的組成物で成つてもよく、もしくは、組成物また
は積層物（ラミネート）、あるいはこれらの複合
物を混合したもの、の如く、１または１以上の組
成物から成るものであつてもよい。様々な材料を
使用できるが、第１義的に考慮すべきことは、
気／液境界面で赤血球細胞が凝集し得ること、並
びにこの材料の表面に対して結合し易いこと、で
ある。 吸収材−sbpメンバー結合（イムノクロマトグ
ラフ）−少くとも１個のsbpメンバーが共有結合
的、または非共有結合的に吸収材の表面に対して
非拡散的に結合していることである。この状態
は、文献記載の方法（例えば、アメリカ特許第第
4168146号および第4299916号参照）に従つて達成
することができる。 sbpメンバーの表面への結合は、液体が、その
領域を横切つて、アナライトおよび、もし適当な
らば信号生成系のメンバーを輸送すべく移動し得
る様な領域内で生じる。信号生成系の１または１
以上のメンバーは、共有結合的、または非共有結
合的な手段で吸収性支持体に対し、非拡散的に結
合するであろう。 方 法 本発明方法は、１つの分析法における２種の異
なつた機能、即ち、赤血球細胞の如き妨害細胞の
血漿からの分離とアナライトの測定、を一緒にし
て一工程で行なうようにするものである。分析す
べき全血試料を水性媒質（通常は緩衝化されてい
る）中で結合剤と、さらに、そうするのが適当な
らば、１または１以上の信号生成系のメンバーと
混合する。 結合剤は一般に、媒質を吸収材の一部に接触さ
せたとき、赤血球細胞を表面と液層との間に分配
させるのに充分なだけの量を用いる。赤血球細胞
に対して特異的な抗体の如き凝集剤については、
全血約50μに対し、抗体溶液約１〜20μ（特
異抗体0.5〜20μgを含有）を用いる。ポリ（アミ
ノ酸）の場合には、全血試料約50μに対し、約
10〜200μgを用いる。レクチンを結合剤として使
用する場合は、全血約50μに対し、約１〜50μg
を用いるとよい。 本発明方法には、試料を結合剤と結合させた
後、保持時間を要しないという利点がある。試料
を結合剤と結合した後、直ちに媒質と吸収材とを
接触させてもよい。その様な状態において、結合
剤と結合した赤血球細胞は、気／液境界面で凝集
する。別法として、媒質を約0.5〜10分間、好ま
しくは１〜２分間の間、保持しておいてもよい。
分析の遂行に対し、保持時間の有無が影響を及ぼ
すことはない。 上記の如く、本発明方法を実施するには、通常
水性媒質が用いられるであろう。また、極性有機
溶媒、通常炭素原子数が一般に１〜６、より一般
的には１〜４の酸化型の有機溶媒（例えばアルコ
ールやエーテル等を含む）もまた含有させること
ができる。これらのコソルベント類は、少くとも
約40重量％以下、より一般的には約20重量％以下
の割合で存在することになるであろう。 媒質のPHは、一般に約４〜11の間、より一般的
には約６〜10の間であることがわかつた。通常、
sbpメンバー間に有意なレベルの結合が達成され
るようなPHを選択する必要がある。所望のPH値に
調節し、かつ測定の間、このPH値を維持するため
に種々な緩衝液を用いてもよい。その様な緩衝液
の中には、例えばホウ酸塩、リン酸塩、トリス、
およびバルビタール等の緩衝液が含まれる。使用
された特定の緩衝液か、本発明方法にとつて臨界
的なものではなく、個々の分析に際して、ある緩
衝液が他のものより適切であるということが起こ
るであろう。 イオン強度は、一般に約0.01〜1.0の範囲内と
することができるが、約0.1〜0.4の範囲が好まし
い。特定の分析、並びに用いる試薬に応じて、上
記範囲内において最適なPHおよびイオン強度を選
ぶことができる。イオン強度は、赤血球細胞が
気／液境界面に保持され得るか否かに影響を及ぼ
す。 分析に際しての温度は、分析作業に影響を及ぼ
すことなく、約4°〜37℃の範囲範囲とし得るが、
約20°〜25℃の間がより一般的である。 媒質を、イムノクロマトグラフの一部分、通常
は一端、に接触させる。媒質が接触部分から前方
へ移動し、イムノクロマトグラフの該水性媒質に
接していない部分を横切るのに充分なだけの時間
をかける。上記の条件下で、細胞性物質は気／液
境界面に実質的に保持される。実質的に保持され
る、という語句は、赤血球細胞が、試料中のアナ
ライトを、バツクグラウンド妨害がほとんどまた
全く無い状態で検出することとの関係において、
信号生成性媒質中からの信号を検出することがで
きる程度に、気／液境界面に充分、保持されてい
る、ということを意味する。 イムノクロマトグラフに沿つての媒質の拡散に
伴つて、信号生成系の残りのメンバーはすべてイ
ムノクロマトグラフと結合する。信号生成系の各
成分と吸収材との結合順序は、従つたプロトコー
ルに依存する。 分析されるアナライトの濃度は一般に約10^-4〜
10^-15Ｍ、より一般的には約10^-6〜10^-13Ｍの範囲
で変化し得る。通常、その分析が定性的、準定性
的、もしくは定量的なもののいずれであるか、ま
た、特定の検出方法、および対象とするアナライ
トの濃度等を考慮して他の試薬の濃度を決定す
る。 種々の試薬を加える順序は、実施する分析の性
質、特定の標識、該標識が結合する化合物、アナ
ライトの性質、並びにアナライトと試薬類との相
対濃度ち依り、広範囲に変動し得る。 標識したsbpメンバーは、少くとも３種類の異
なつた方法で使用することができる。例えば、そ
の内の２方法は、標識sbpメンバーを、イムノク
ロマトグラフに接触させる前に、水性媒質中に存
在させておくことを含む方法であり、３番目の方
法は、水性媒質がイムノクロマトグラフに沿つて
拡散した後に用いられる試薬溶液中に、該標識
sbpメンバー（リガンドおよびリセプター）を存
在させておくことを含む方法である。最初の２方
法の場合には、sbpメンバー−標識は、アナライ
トと同時にイムノクロマトグラフを横切り、事実
上、結合可能な部位をアナライトと競合するか；
または、sbpメンバーは明らかな競合作用を有さ
ず、アナライトの結合帯域を越えた直後の帯域に
一次的に結合するか、のいずれかである。ある場
合には、試料含有溶媒のイムノクロマトグラフに
対する最初の接触ラインから、移動しつつある媒
質の境界線まで及ぶ結合帯を得ることがある。ま
た、他の状況下では、アナライトが結合している
帯域と、そうでない帯域が境界線で区別される。 上記の第３番目の方法（この場合のアナライト
は抗原性である）は、まず最初に試料を接触させ
ることを含む。試料がイムノクロマトグラフを横
切つた後、該イムノクロマトグラフを標識sbpメ
ンバーを含有する溶液に浸し、抗原と結合させ
る。この分析法は、従来からサンドイツチ法と呼
ばれている。勿論、ハプテンが含まれている場合
には、所定量のポリリガンドを提供することがで
きる。即ち、そのリガンドが重合またはhub核に
結合することによつて、ハンプテン性アナライト
とポリリガンドに共通の複数個の決定基を提供す
ることができるのである。実際には、その移動の
程度が試料中のアナライトの量に関連しているよ
うな合成抗原を製造する。 イムノクロマトグラフを、標識sbpメンバーを
含有する溶液に浸漬や噴霧等によつて実質的に均
一に接触させると、該標識sbpメンバーは抗原の
結合し得る決定基と結合し、その結果、試料中の
アナライトの量に関連した領域を指す検出可能な
信号を与えることになる。浸漬による接触は、吸
収材を水性媒質から出して標識sbpメンバーを含
有する溶液の中に置くことで行なわれる。別法と
して、標識sbpメンバーを含む溶液をイムノクロ
マトグラフを含む水性媒質に加えてもよい。 ２個の抗体間の橋渡しとして作用する抗原を用
いるよりも、むしろ、イムノクロマトグラフ上に
あるsbpメンバーと相互関係にあるsbpメンバー
を溶液に加えてもよい。アナライトをイムノクロ
マトグラフを横切つて通過させた後、このイムノ
クロマトグラフを、例えば浸漬や噴霧等により、
再び実質上均一に標識sbpメンバーの溶液と接触
させる。この標識sbpメンバーは、イムノクロマ
トグラフに結合しているsbpメンバーと相補的で
あるので、この標識sbpメンバーはイムノクロマ
トグラフ上の結合し得る部位に結合し、アナライ
トの存在しない領域を明確に示す。この方法で
は、アナライトの移動距離は、アナライト含有領
域内での認め得る信号の不存在によつて指示さ
れ、また、その境界線は、アナライトが存在しな
い領域における信号の存在によつて明確となる。 特定のプロトコールにより、洗浄は有用または
必要であつたり、回避されたりする。好ましいプ
ロトコールは、操作誤差を生ずる可能性が最少で
ある、最少数の工程を与えるものである。従つ
て、分析における誤差に係る洗浄および測定の両
工程がいずれも最少数であるプロトコールが考案
されねばならない。本発明方法によれば、最少数
の工程で全血試料を分析することができる。 条件の変動によつてアナライトの移動距離を変
化させることができる程、イムノクロマトグラフ
が標準化されていない場合には、既知量のアナラ
イトを含有する標準分析を提供することができ
る。アナライト試料と標準試料とに関して同時に
実施し、標準試料とアナライト試料との定量的な
比較を行なうことができる。必要ならば１以上の
標準試料を使用し、種々の濃度における移動距離
を図に表わし、特定の試料を定量するのに用いる
ことができる。 大部分の場合、イムノクロマトグラフに要する
時間は比較的短い。通常、試料が免疫性吸収域を
通過するのに、最少限度30秒を要するが１時間を
越えることはなく、より一般的には約１分から30
分間を要する。また信号の展開は、通常30秒から
30分間、より一般的には約30秒から５分間の間で
起こる。 エンザイムイムノアツセイの場合、信号生成系
は少くとも１個の酵素を有し、更に、１または１
以上の他の成分、あるいは１または１以上の基質
を有していてもよい。この信号生成系には、コエ
ンザイム類が含有されていてもよい。ある酵素ま
たはコエンザイムを標識として用いてもよく、こ
の場合、イムノクロマトグラフ上の標準の存在に
より、該標識の付近の信号が本質的に変化する。
通常、標識は酵素であるが、他の標識を用いても
よい。 標識は、基質の酵素的代謝回転をもたらすこと
により、その近傍の事象を多様化する。このよう
に、標識として用いられる信号生成系の構成要素
（メンバー）とは酵素的に信号を増幅するものを
意味し、上記で指摘したメンバーに限定される。 酵素標識の各々、または組合わせは、広範囲に
変動し得る。検出し得る信号を生成する生産物は
染料、けい光を発するもの、または化学発光を生
ずるもの、等である。信号は、吸収、けい光、ま
たは化学発光に基づく視覚観察によつて検出され
る。他方、吸収、反射、けい光または化学発光の
測定を利用した分光光度法的な測定を行なうこと
もできる。 最も興味深い酵素はオキシドリダクターゼ類お
よびヒドロラーゼ類である。多くの興味深い酵素
がアメリカ特許第4275149号に記載されている。
酵素を併用した場合には、一方の酵素はイムノク
ロマトグラフに非拡散的に結合しており、もう一
方の酵素はsbpメンバーに結合している。 標識−sbpメンバー結合体（抱合体）が試料と
結合していない場合には、試料がイムノクロマト
グラフを横切つた後、このイムノクロマトグラフ
を標識−sbpメンバー結合体を含有する溶液に、
実質上均一に接触させる。標識およびプロトコー
ルにより、１または１以上の信号生成系の他のメ
ンバーをも含有させることができる。 酵素−sbpメンバー結合体の場合には、イムノ
クロマトグラフを酵素−sbpメンバー結合体およ
び基質、さらには所望により捕捉剤を含有する溶
液に接触させる。この状態において、一方の酵素
はイムノクロマトグラフに結合しており、この酵
素とsbpメンバーに結合している酵素とは、一方
の酵素の基質がもう一方の酵素の生産物である、
という関係にある。この酵素−sbpメンバー結合
物は、通常水性緩衝液中に入つており、利用し得
る結合部位の数よりも実質上、過剰に存在してい
る。PH域および緩衝液に関しては、既に考察し
た。この酵素−sbpメンバー結合物が、リガンド
またはリセプターのいずれか一方と結合すると共
に、呈色するのに充分な時間の経過後、該溶液か
らイムノクロマトグラフを取除く。２種の酵素が
含まれていることから、酵素−sbpメンバー結合
物と基質とを同じ溶液内で結合させることがで
き、従つて、イムノクロマトグラフと接触させる
前に予め反応させておくことがないので、プロト
コール中の１工程を省略することができる。 酵素−sbpメンバー結合物とイムノクロマトグ
ラフとを接触させた後、このイムノクロマトグラ
フを基質溶液に浸漬することにより、展開する。
この場合、１つの酵素は、イムノクロマトグラフ
に結合してもよく、いなくともよい。 コエンザイム標識を用いた場合には、展開溶液
は、通常、(1)コエンザイムを再生するための１ま
たは１以上の酵素、および(2)基質を含有するであ
ろう。酵素反応にはコエンザイムが要求されるの
で、酵素と基質とは、免疫吸収帯と接触させる前
になんら反応させずに、単一の展開試薬として結
合させておくことができる。 基質は酵素に伴つて変化し、それは通常、速度
を制限することがない様、実質上過剰に存在させ
る。また、水溶液は通常、酵素系のために適当に
緩衝化されており、かつ、ある酵素の生産物であ
つて他の酵素の基質である物質に対する捕捉剤
（例えば、尿酸分解酵素の産物である過酸化水素
に対するカタラーゼ）を含有していてもよい。 このイムノクロマトグラフを、充分に検出可能
な信号生成性化合物が生産され、イムノクロマト
グラフのアナライト結合域が明確になるまで、充
分な時間、展開溶液に接触させておく。検出し得
る信号が生産されたならば、クロマトグラフの一
端からの距離を測定し、試料中のアナライトを定
量するための尺度とする。 境界線に幾分かの乱れが認められるかもしれな
いが、大多数の場合、境界線は、かなり明瞭なの
で、広範囲に及ぶアナライトに関し、２またはそ
れ以下の因子の濃度変化を、μg単位からpg単位
の範囲内で検出することができる。かくして、基
質に適当な染料前駆物質を用いることにより、ア
ナライトの量を、使用者による、妨害に対する感
受性が比較的少ないプロトコールで、単一の測定
（試料）を含む視覚的な観察により、定量的に測
定することができる。 材 料 本発明方法に用いる成分は次の通りである。吸
収性支持体、結合剤、sbpメンバー結合体（sbp
メンバーおよび標識を含む）、イムノクロマトグ
ラフ上の特定の帯域（免疫吸収性帯域）内の吸収
材に結合しているsbpメンバー、信号生成系の残
りのメンバー、アナライトを含有している試料、
並びに、適当ならば、ポリリガンドまたは多価リ
セプター。 アナライト 本発明のリガンドアナライトは、単一の抗原決
定基または多価抗原決定基を有することを特徴と
するのに対してリセプターアナライトは、単一ま
たは複数個の結合部位を有していてもよい。多抗
原決定基性のアナライトは、通常、ポリ（アミノ
酸）、即ち、ポリペプチドおよびタンパク質、多
糖類、核酸類、およびそれらの配合物であろう。
その様な配合物または集合物には、バクテリア、
ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、
核、および細胞膜等が含まれている。 本発明で用いられる多抗原決定基性リガンドの
大部分は、分子量が少くとも約5000、あるいは通
常、少くとも約10000であるポリ（アミノ酸）の
範ちゆうに属するものであつて、興味深いポリ
（アミノ酸）の分子量は、一般に約50000から
5000000の範囲が、より一般的には、約20000から
1000000であり、興味深いホルモンの場合の分子
量は、約5000から60000の範囲内である。 有用なリガンドに関する広範囲のリストは、ア
メリカ特許第4275159号に見られ、それらは、第
12欄から第17欄にかけて開示されている。 単一抗原決定基性リガンドの分子量は一般に、
約100から2000であり、より一般的には約125から
1000の範囲である。興味深いアナライトには、薬
剤、代謝産物、殺虫剤および汚染物質等が含まれ
る。 興味深い数多くのアナライトがアメリカ特許第
4275149号、第17欄および第18欄に掲載されてい
る。 リセプターアナライトの分子量は、通常、約
10⁴から２×10⁸の範囲内であり、より一般的に
は、約３×10⁴〜2X10⁶の範囲内であろう。免疫
グロブリンについては、IgA，IgD，IgE，IgGお
よびIgMの分子量は、約160000から約10⁶の範囲
内で変化するであろう。酵素類は並通、約10000
〜600000ダルトンの間で変化し得る。天然のリセ
プターは広範囲に変化するが、その分子量は一般
に、少くとも約25000、さらに、約10⁶およびそれ
以上であり、その様な物質には、アビジン、チロ
キシワ結合グロブリン、チロキシン結合プレアル
ブミン、トランスコルチンおよび膜表面タンパク
質等が含まれる。 リガンドが他の分子または支持体と結合する場
合、リガンドはしばしば、特定の部位に特定の官
能基を有するように修飾される。この修飾によつ
てリガンド同族体として表わされる産物が得られ
る。アメリカ特許第4275149号、第18および第19
欄にかけて、広範囲なリガンド同族体に関する記
述が認められる。 結合剤 本発明方法では、全血中の赤血球細胞を凝集さ
せることのできれ結合剤のすべてを用いることが
できる。ただし、それらの結合剤は、sbpメンバ
ーを凝集したり、sbpメンバー自身の結合を妨害
する、等の作用によつて本発明の分析を妨害する
ものでないことを条件とする。この結合剤は、赤
血球細胞を表面と液相との中間に分配させるもの
でなければならない。 結合剤の１つのグループは、赤血球細胞を相互
に付着させるような凝集剤である。その様な凝集
剤の例には、赤血球細胞に対する特異抗体があ
る。例えば、ヒト−赤血球細胞に関しては、その
様な細胞に対する抗体を、非−ヒト宿主中で常法
に従つて生じさせることができる。別法として、
当該技術分野で周知の方法により、ヒト赤血球細
胞に対するモノクローナル抗体を生産することが
できる。 また、全血試料中の赤血球細胞を凝集すること
のできる他の物質を結合剤として用いてもよい。
その様な物質の例として、ポリリジンおよびポリ
アルギニンの如きアミノ酸重合体、並びに小麦胚
芽凝集素やコンカナバリンＡの如きレクチン類が
ある。 イムノクロマトグラフ イムノクロマトグラフには、毛管現象で液体を
通過せしめると共に、sbpメンバーを非拡散的に
結合させる吸収を含むが、更に、信号生成系の１
または１以上のメンバーを含有することもある。 異なつた寸法（特に厚み）、異なつた材料およ
び異なつた形状の、広範囲に及ぶ様々な資材を用
いることができる。大多数の場合、その形状は伸
長された形状であり、矩形状の切片（ストリツ
プ）が便利である。この切片の少くとも一部に
は、該切片に均一に結合したsbpメンバーが保持
されている。この切片の大きさは、ある程度、取
扱い上の便宜に委ねられている。また、免疫吸収
帯は、アナライトが関心を引くような濃度範囲内
で存在していると思われるアナライト分子の全て
に適応することができるよう、充分な大きさでな
ければならない。そのプロトコールが、アナライ
トと標識sbpメンバーの両方を結合することを内
容とするものであれば、免疫吸収帯は、アナライ
トと標識sbpメンバーの両者のための容量を有す
る必要がある。 広範囲に及ぶ吸収材を用いることができ、それ
らは、天然または合成の重合物質、特に、紙や
クロマト用紙等の繊維を含む紙類の如きセルロー
ス性の物質、架橋させたデキストラン、アクリレ
ートの如き合成ポリマーまたは天然起源のポリマ
ーに改良を加えたもの、を含む、そのままで、あ
るいはシリカの如きセラミツク材料に抱合させて
用いられる。 イムノクロマトグラフの厚みは、通常約0.05mm
から約２mmの範囲で変動するが、約0.1mm〜約0.5
mmがより一般的であり、約0.2mm〜約0.4mmが好ま
しい。紙の構造は広範囲に変化し、細い中程度
に細い、中程度、中程度に粗い、粗いものが含ま
れる。その表面は、硬度および柔軟度をも組合わ
せて、滑らかな状態と、粗い状態の様々な組合わ
せで変動し得る。 このイムノクロマトグラフは種々の不活性な支
持体（Mylar^R（Dupont）、ポリスチレン、ポリエ
チレン等々）によつて支持することができる。支
持体は、イムノクロマトグラフと間隔をあけてそ
の裏打ちとして用いてもよく、縁どりまたはその
他、イムノクロマトグラフの機械的強度を増大す
るような構造で用いることができる。 このイムノクロマトグラフは、その性質を改良
するために広範な種類の物質で被覆してもよい。
被膜には、タンパク質膜、多糖類膜、砂糖あるい
は、特に、該支持体と抱合している物質の安定性
を増大させるのに用いられる物質が含まれる。こ
れらの化合物はまた、種々の物質、例えばsbpメ
ンバー、あるいはイムノクロマトグラフに結合し
た信号生成系のメンバーの結合を改良するのにも
用いることができる。 イムノクロマトグラフは、その表面に抱合され
るべき有機物質を共有結合させるように、反応性
の官能基化によつて活性化する。イムノクロマト
グラフの吸収材表面を活性化する方法には、アシ
ル基による官能基化（例えばカルボニルジイミダ
ゾール）臭化シアンまたはグルタルアルデヒドや
コハク酸の如き二官能基性化合物を用いる方法が
含まれる。種々の物質を吸収材表面に結合させる
方法は文献の中に見出すことができる。例えば、
アメリカ特許第4168146号参照。 表面に結合したsbpメンバーの量は、表面の大
きさおよび全アナライトが結合するのに要求され
る量、並びに、所望により、標識sbpメンバーの
数によつて変動し得る。一般に、sbpメンバーの
量は約10^-5〜10^-14モル／cm²、より一般的には約
10^-7〜10^-12モル／cm²の範囲内であろう。単位面
積当りのモル数は、アナライトによつて横切られ
た距離につき、関心のある濃度範囲を区別するこ
とを充分に保証するために、変化させる。 好ましい実施態様では、信号生成系の１メンバ
ーは、吸収材の表面に非拡散的に結合している。
特に、１つの酵素は表面に結合しており、これが
もう一つの酵素で標識されている標識sbpメンバ
ーと反応する。酵素類の関係は、信号生成系に関
する記述の中で議論する。 sbpメンバーと信号生成系と種々の表面に対し
て共有結合よりもむしろ吸着によつて結合してい
る。このことは、吸収材をsbpメンバーおよび／
または信号生成性メンバーを含有する溶液と接触
させることを含む。イムノクロマトグラフと溶液
とは、浸漬、噴霧、塗布、その他均一性を与える
ような方法で接触される。 通常、比較的大きいシートを使用し、これを適
当な大きさに切断して用いる。 信号生成系 信号生成系は、大抵の場合、電磁放射、特に紫
外部および可視部領域の光、より詳細に言うと約
400〜800nmの範囲の波長の放射、の吸収または
放射が関与する検出可能な信号の生成に係るもの
である。免疫クロマトグラフの性質上、検出可能
な信号を得るには、単位面積当り、十分な濃度の
ラベル（標識）が存在していることが必要であ
る。従つて、大抵の場合、個々のラベルは所望の
感度が得られる程十分ではないであろう。そのた
め、１個のラベルされたsbpメンバーについて複
数個の検出可能な分子を生成せしめる手段を設け
なければならない（その様な生成のための手段を
提供する信号−生成ラベルが、ラベルされたsbp
メンバーの免疫吸収帯通過を妨げない場合には）。
従つて、酵素または補酵素の様な、検出され得る
多数の分子を生成し得るラベルを使用する。それ
で、１個のラベルの存在によつて増幅が得られ
る。 光を吸収する生成物、例えば染料、あるいは発
光または化学反応によつて光を発する生成物、即
ち蛍光物質または化学発光体を生成することによ
つて所望の増幅を達成する酵素や補酵素が使用さ
れる。この様な生成物を与える多数の酵素また補
酵素が、米国特許第4275149号の19〜23欄、米国
特許第4318980号の10〜14欄に記載されている。 １個の酵素の生成物が、もう１つの酵素の基質
であるという関係にある酵素群の組み合せを使用
するのが特に重要である。この様にして、結合し
たアナライトを含んでいる領域と含んでいない領
域との境界を、より有効に決定する。 多数の酵素の組み合せが米国特許第4275149号
の23〜28欄に記載されており、それらの組み合せ
を本発明で使用することができる。 過酸化水素の生成に関与する酵素、およびその
過酸化水素を使つて染料前駆体を酸化して染料に
するものが特に重要である。具体的な組み合せ
は、糖類オキシダーゼ、例えばグルコースおよび
ガラクトースオキシダーゼ、またはヘテロ環式オ
キシダーゼ、例えばウリカーゼおよびキサンチン
オキシダーゼを、染料前駆体を酸化するのに過酸
化水素を使用する酵素、例えばペルオキシダー
ゼ、ミクロペルオキシダーゼおよびチトクローム
Ｃオキシダーゼと組み合せたものである。その他
の酵素の組み合せが、上記の文献に記載されてい
る。上記の酸化還元酵素の組み合せが好ましい
が、加水分解酵素、転移酵素、および上記のもの
以外の酸化還元酵素などのその他の酵素も使用す
ることができる。 使用し得る補酵素には、NAE［Ｈ］；NADP
［Ｈ］、ピリドキサル燐酸；FAD［Ｈ］；FMN［Ｈ］
など、通常、酸化還元酵素と結合する補酵素が含
まれる。サイクリング反応に関与する多数の補酵
素については特に米国特許第4318980号参照。 酵素反応の生成物は通常染料または蛍光物質で
ある。非常に多くの蛍光物質の例が米国特許第
4275149号の30〜31欄に記載されている。 ラベルsbpメンバー抱合体、リセプター、吸収
性担体およびアツセイを行なう条件を適当に選択
または操作することにより、本発明を２つの異な
つた手順（プロトコール）で実施することができ
る（アナライトおよび酵素−sbpメンバーを同じ
溶液で免疫クロマトグラフに適用する）。１つの
手順においては、アナライトが通過した免疫吸収
帯領域が、アナライトが存在している領域全体に
渡つて実質的に均一に検出可能な信号が生成され
ることによつて観察することができる。もう１つ
の手順では、主として、アナライトによつて占め
られる免疫吸収帯の中の領域に関係において検出
可能な信号を観察し得る。 アナライトと比較して、ラベル−sbpメンバー
抱合体の異なつた結合定数、移動率、吸着などに
よつて、異なつた結果が得られるかもしれない。
ラベルに結合した、sbpメンバー、特にハプテン
性アナライトの数を変えることにより、吸収材に
結合したリセプターの結合特異性を変えることに
より、例えばハプテンアナライトと抗原との間に
１個の結合基を持つている免疫源に対する抗体を
つくり、そして、ラベル−ハプテンアナライト抱
合体との異なつた結合基を使用することにより、
Rfフアクターを変えるために溶媒および／また
は担体を変化させることにより、あるいはその他
の方法でこのような変化を達成することができ
る。 ラベルとして１個の酵素を持つた信号生成系に
２個の酵素を使用する結果として、簡単な手順を
採用することができ、また、アナライトが進行し
た先端の正確な輪郭を提供する強い検出可能な信
号が得られる。吸収材に結合している酵素の生成
物を、sbpメンバーに抱合された酵素の基質とし
ているので、鋭く、迅速で均一な検出可能信号の
展開が免疫クロマトグラフ上で観察される。更
に、検出可能な信号を生成する化合物が、その表
面に素早く沈降するのを促進するために、免疫ク
ロマトグラフに結合した酵素のための基質濃度を
局所的に高くする。 本発明は、先行技術の方法より優れた多くの利
点を有する。本発明の主な利点は、アツセイを全
血試料に適用し得るという点にある。即ち、アツ
セイを行なう前に、まず、赤血球から血漿を分離
する必要がない。 本発明のアツセイは、全血試料から赤血球細胞
を分離するための複雑な装置を使用することな
く、特別の訓練を受けていない人によつて、診療
室で行なうことができる。もう１つの本発明の利
点は、極く少量の全血試料でアツセイを行なうこ
とができるという点にある。通常、アツセイを行
なうのに１、２滴の血液、即ち約50〜150μの
血液が必要なだけである。この様に、本発明は、
アツセイを行なうのにずつと多量の全血試料を採
血するという行き過ぎた操作を避けるものであ
る。指を刺して一滴の血液を採取するだけで十分
な試料を得ることができる。 キツト 簡便化のため、この免疫クロマトグラフは、ア
ナライトをアツセイするに際して試料を組み合せ
るための他の試薬類を組み合せて包装したキツト
として提供することができる。このキツトの成分
は、予め決められた比率にしておく。２種の酵素
を入れる場合は、他の試薬には酵素ラベル化ミツ
プ（mip）、吸収材に結合した酵素の基質、酵素
に必要な補酵素およびその他の基質、および検出
し得る発色団または発蛍光団を提供する染料前駆
体が含まれる。補酵素ラベルについては、補酵素
ラベル化メンバーおよび染料前駆体を含んでいる
適当な酵素（群）が含まれよう。更に、安定化
剤、緩衝剤などのその他の添加物を含ませてもよ
い。各種の試薬の相対量は、アツセイの感度を実
質的に最高にする溶液中の試薬濃度となる様に、
広範囲に変えることができる。特に、これらの試
薬は、賦形剤を含んでいる乾燥粉末、通常、凍結
乾燥品として提供することができる。この乾燥粉
末を溶解させると、試料と混合するための適当な
濃度の試薬溶液が得られる。 以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらの実
施例に制限されるものではない。 実施例において使用した略号は、以下の意味を
有する：HRP−ワサビペルオキシダーゼ、WGA
−コムギ胚凝集素、NHS−Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸イミド、EDAC−エチルジメチルアミノプロ
ピルカルボジイミド、DMF−ジメチルホルムア
ミド、BSA−牛血清アルブミン、BGG−牛ガン
マーグロブリン。温度は特に指摘しないが限り摂
氏で表わしている。液体の混合物は容量で示す
が、その他は重量部で表わしてある。 実施例１ HRP−オキシアミンの調製 5mMの酢酸ナトリウム（PH4.5の緩衝液）中に
10mg／mlのワサビペルオキシダーゼを入れた液５
mlに、0.2M過沃素酸ナトリウム50mlを加え、こ
の混合物を30分間攪拌した後、Ｇ−50セフアデツ
クス^Rカラムクロマトグラフイーにかけ、2mM酢
酸ナトリウム緩衝液（PH4.5）で溶出した。蛋白
質画分を集め（29ml）、この混合したものを４℃
に冷却し、0.5M炭酸緩衝液（PH9.5）中の0.2M2，
2′−オキシービス−エチルアミン2.9mlを４℃で
添加した。この混合物のPHを、1N水酸化ナトリ
ウムで9.5に調節して２時間攪拌し、４mg／mlの
水素化硼素ナトリウム／水溶液3.52mlを加え、こ
の混合物を３時間反応させた後、セフアデツクス
^ＲＧ−50カラムでクロマトグラフイーした。 HRP400mgを用いて上記の操作を繰り返し、
２，2′−オキシービス−エチルアミン3.5mlを得
た。もとのアミンと修飾したアミン（更に約４個
のアミノ基を有するもの）には、酵素活性におけ
る有意な変化は観察されなかつた。 実施例２ 免疫クロマトグラフの調製 １枚のワツトマン31ET紙（185×230mm）を
1.8のピリジン（0.2M、カルボニルジイミダゾ
ール中）に浸し、その混合物を室温で１時間、お
だやかに攪拌した。もう１枚の紙を同じ活性化
溶液中で活性化した。紙をそれぞれテトラヒド
ロフラン300mlで洗浄し、空気噴射器を使つて約
20秒間風乾した。 重炭酸緩衝液（PH9.5，70mM NaHCO₃と
30mM Na₂HCO₃）に入れた抗テオフイリン溶液
（２mg／ml）100mlを更に入れた。上で調製した一
枚の紙を皿に入れ、上記の抗体溶液でブロツト
した。１時間後にエタノールアミン500mlを皿に
加え、更に１時間後に皿から紙を取り出し、
100mM、NaH₂PO₄（PH7.0）および200mM NaCl
を含んでいる緩衝液500mlで２回洗浄した。次い
で紙を脱イオン水500mlで１回洗浄した。洗浄
後、紙を0.5％の水性ポリビニルアルコール250
mlに約20分間浸した。このポリビニルアルコール
溶液から紙を取り出してブロツトし、65℃で５
分間トンネル乾燥した。 実施例３ テオフイリンおよびHRPの抱合 反応フラスコに１−メチル−３−（3′−カルボ
キシプロピル）キサンチン8.1mg、NHS3.8mg、
EDAC6.7mgおよびDMF125μ入れ、この混合物
を室温で１夜放置した。 0.1M炭酸ナトリウム（PH9.0）にHRP−オキシ
アミン（１mg）を入れた1.3mlの試料を４つ用意
し、これに、上で調製した種々の量のエステルを
加え、HRPに対するテオフイリンのモル比が
400，200，100および100である標本を得た。１番
目の反応混合物（モル比：400）に、DMF0.217
mlおよび8.25μ増量の上記エステル66μを約２
時間で添加した。２番目の反応混合物（モル比：
200）に、DMF0.238mlを加え、8.25μ増量のエ
ステル33μを添加した。３番目の反応混合物
（モル比：100）に、DMF0.24mlを加え、8.2μ
増量のエステル16.5μを加えた。最後の反応混
合物（モル比：100）には、DMFを添加せず、
2.1μ増量のエステル8.25μを加えた。添加中、
温度4°に保持し、この混合物を4°で一夜放置し
た。 次いで反応混合物を、標準的な緩衝液を使用
し、Ｇ−25セフアデツクス^Rクロマトグラフイー
によつて後処理した。フオリン（Folin）および
UVスペクトル分析により、テオフイリン／HRP
比はそれぞれ6.9，4.0，1.6および2.1であること
がわかつた。 実施例４ 赤血球−特異結合剤を用いたアツセイ 全血試料（10μづつ）をテオフイリンと混合
し、実施例３の抱合体0.2μg／ml、グルコースオ
キシダーゼ100μg／ml、BSA1mg／ml、ヒトの赤
血球に対して特異な抗体5μを更に含有してい
る水性媒質中、それぞれの濃度が０，2.5，５，
10，20および40μg／mlのテオフイリンを含む２
％血液懸濁液となる様にした。 実施例２で調製した紙を予め6.5×90mmの切
片で切断した。一連の別々の切片の末端（約５
mm）を、上記の試料のそれぞれに浸した。 10分後、グルコース60mM、燐酸ナトリウム
0.1M NaCl0.2Mの溶液（PH7.0）であつて、
400μg／mlの４−クロロ−１−ナフトールを含ん
でいる展開液（８ml）を各試料に添加した。切片
の底辺から色の先端までの距離を、テオフイリン
の濃度を異にする各試料について求めた。 比較（対照）ため、テオフイリン溶液に全血試
料を加えないことを除いて上記と同じ操作を行な
つた。 結果を表１にまとめた。２回の測定の平均値を
示した。

【表】 上の結果は、本発明方法によれば妨害となる赤
血球細胞を除去することなく、全血試料につい
て、テオフイリンの正確なアツセイをすることが
できることを示している。 実施例５ 非特異的結合剤を用いたアツセイ 非特異的結合剤、例えばレクチン（植物凝集
素）を用いてアツセイを行なうために、全血試料
（各12.5μ）を、実施例３の抱合体（テオフイリ
ン／HRP）0.8μg／ml、グルコースオキシダーゼ
100μg／ml、BGG1mg／mlおよび小麦胚芽凝集素
（WGA）10μを更に含有している水性媒質中
の、実施例４と同じ濃度のテオフイリンと混合し
た。 免疫クロマトグラフイー切片の末端を上記の各
試料に浸した。10分後、各切片を展開し、切片の
底辺から色の先端までの距離を、実施例４と同様
にして、テオフイリンの濃度を異にする試料につ
いて測定した。 テオフイリン溶液に全血試料を添加しないこと
を除けば、上に記載したものと同じ試料を用い
て、実施例４と同様に対照試験を行なつた。 結果を以下の表２に示す。２回の測定値の平均
値を示した。

【表】 上の結果は、妨害する赤血球細胞を除去するた
めの別個の工程を設けなくても、植物凝集素の様
な非特異的結合剤を用いて、全血試料中のテオフ
イリンを正確に分析することができることを示し
ている。 上記の方法に従つて、もう１つの対照試験を行
なつた。この場合はテオフイリン溶液にWGAを
添加しないで行なつた。 その結果、赤血球細胞が色の先端と共に移動し
その先端を不明瞭にするのを防止し、従つて、色
の先端の移動距離の測定を困難にするのを防止す
るのに、赤血球細胞の非特異的結合剤、この場合
は植物凝集素、が重要であることがわかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リガンドと対応リセプターで構成される特異
   結合対の１員である、全血試料中の被分析物を測
   定するにあたり、水性媒質中で、表面に特異結合
   対の１員が実質的に均一に結合している吸収材Ａ
   を、その気／液境界面となることが予定されてい
   る領域において、全血試料Ｂおよび全血試料中に
   存在する赤血球細胞のための結合剤Ｃと接触さ
   せ、これによつて該媒質が該吸収材を横切つて形
   成する被分析物の量に関連した境界線を得ると共
   に、該赤血球細胞を前記気／液境界面において凝
   集させ、次いで標識した特異結合対の１員を含む
   信号生成系を用いて該境界線を測定することから
   なる方法。 ２ 結合剤が凝集剤である第１項に記載の方法。 ３ 結合剤が赤血球細胞に特異的である第１項に
   記載の方法。 ４ 結合剤が赤血球細胞の特異抗体である第１項
   に記載の方法。 ５ 結合剤がレクチンである第１項に記載の方
   法。 ６ 結合剤が重合したアミノ酸である第１項に記
   載の方法。 ７ 結合剤がポリリジンである第１項に記載の方
   法。 ８ PHが約６〜10である第１項に記載の方法。 ９ イオン強度が約0.1〜0.4の範囲内である第１
   項に記載の方法。 １０ 全血試料中におけるリガンドと対応リセプ
   ターで構成される特異結合対の１員の存在を検出
   する方法であつて、(1)該試料中の赤血球細胞のた
   めの結合剤、(2)少なくとも１個の特異結合対の１
   員が結合している固体吸収材および(3)検出可能な
   信号を生成することができる信号生成系であつ
   て、その構成員中に特異結合対の１員と結合して
   いる標識が少なくとも１個含まれている系を使用
   し、かつ(a)水性媒質中で、該試料、該結合剤およ
   び該信号生成系の全構成員よりは少ない構成員を
   混合し、(b)該吸収材の一部を該水性媒質に接触さ
   せて気／液境界面を形成させ、かつ該水性媒質を
   該吸収材に沿つて拡散させると共に、該赤血球細
   胞を気／液境界面に隣接する領域で濃縮させ、(c)
   該吸収材を該信号生成系の残りの構成員と接触さ
   せ、(d)該信号生成系の結果としての信号を検出す
   ることからなり、該信号が該試料中の該特異結合
   対の一員の量に相対的なものである方法。 １１ 結合剤が該赤血球細胞のための特異抗体で
   ある第１０項に記載の方法。 １２ リガンドと対応リセプターで構成される特
   異結合対の１員である、全血試料中の被分析物を
   測定するにあたり、水性媒質中で、表面に特異結
   合対の１員が実質的に均一に結合している吸収材
   Ａを、その気／液境界面となることが予定されて
   いる領域において、全血試料Ｂおよび全血試料中
   に存在する赤血球細胞のための結合剤Ｃと接触さ
   せ、これによつて当該媒質が当該吸収材を横切つ
   て形成する被分析物の量に関連した境界線を得る
   と共に、当該赤血球細胞を前記気／液境界面にお
   いて凝集させ、次いで標識した特異結合対の１員
   を含む信号生成系を用いて該境界線を測定するこ
   とからなる方法に用いるものであつて、該方法に
   従つて該試料を組合わせるために予め定めた比率
   において、必須材料としての(a)該赤血球細胞のた
   めの結合剤、(b)少なくとも特異結合対の一員が結
   合している吸収材および(c)該試料中に存在する被
   分析物の量に相対的に検出可能な信号を生成する
   ことができる信号生成系を含んでなるキツト。