JPH0386897A - 検出可能な１本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成に有用な化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、細胞系または細胞不含系に於いて、問題とし
ている相捕的な核酸配列の同定、位置づけ、および検出
に有用な一本鎖オリゴヌクレオチドであって、その塩基
に、ｌまたはそれ以上の検出可能なリポータ−グループ
として機能し得る置換基が結合しているか、または１ま
たはそれ以上の検出可能なリポータ−グループが結合し
ている、１またはそれ以上のヌクレオチド単位を含んで
いる、長さが２００塩基単位以下の定まった配列の１本
鎖オリゴヌクレオチド、を合成する上で有用である新規
なヌクレオチドモノマーに関する。

発明の背景 ニックトランスレーション法（Ｐ、　　Ｒｉｇｂｙう、
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１３：２３７　２５１　１９
７７年）またはギャップ充填反応（Ｇ　、　　Ｂ　ｏｕ
ｒｇｕｉｇｎｏｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２０：２９０−
３０６．１９７６年）による２本鎖ＤＮＡへの放射性同
位元素の押入を含む先行技術を用いて、標識した２本鎖
デオキシポリヌクレオチドを酵素を用いて製造する方法
は確立されている。具体的には、Ｄ　Ｎ　ａｓｅにより
切れ目をつくり、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鎖
に沿って翻訳させる。このニックトランスレーション過
程では、大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ　　
Ｉ）は、添加したデオキシヌクレオチド三燐酸の存在下
で、２本鎖ＤＮＡの１本鎖の切れ目領域の３°水酸基末
端方向へヌクレオチドを縮合していく。同時に、この酵
素は切れ目の５°末端からヌクレオチドを除去していく
。

もし添加するこの三燐酸体の１またはそれ以上を、例え
ば３！Ｐ燐酸で標識しておくと、Ｐｏｌ　　Ｉによる新
しい鎖にこの標識が導入される。ギャップ充填法によれ
ば、制限酵素で切断した後のくぼんだ末端を、Ｐｏｌ　
　Ｉからのクレノー断片またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて充填することができる。

ニックトランスレーションおよびギヤ１．フ充填広のい
ずれによっても、標識された２本鎖ＤＮＡが得られる。

この生成物の長さはＤＮａｓｅｌをどれくらい反応に加
えるかによる。通常、標識の３０％が導入され、鎖の長
さが４００〜８００ヌクレオチド単位になる様に行なう
。生成物の長さは、４００〜８００単位の範囲内では予
測できない程度に不均質である。標識したヌクレオチド
と同様に酵素を保存するために、通常各反応容器中、１
マイクログラムのＤＮＡだけを標Ｌｉｌする。

Ｃ−５位を炭素鎖で修飾したピリミジン塩基を持った２
本鎖ポリヌクレオチドが同様の方法で酵素的に製造され
ている。これは、Ｊ、Ｓａｇｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂ　１ｏｓｐｈｙｓ、　Ａ　ｃｔａ、　　６０６　：　
１９６　２０１．１９８０年）によって報告されている
ホモポリマーのプライマー鋳型の酵素的伸長法、または
Ｐ、　Ｌ　ａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７８：６６３３−６６３７．１９
８１年）によって報告されているビオチンに共有結合し
た２”−デオキシウリジン５°−三燐酸を使って、ＤＮ
Ａポリメラーゼによりニックトランスレーション／ギャ
ップ充填することによって行なわれた。このビオチンは
、アビジンのための認識部位として機能し得る。

Ｒｉｇｂｙら、Ｂ　ｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎらおよびＬ　
ａｎｇｅｒらによって記載されている酵素法によって、
同様の物理的特性を持った生成物が得られる。この酵素
法によって製造されたポリヌクレオチドは、長さが４０
０〜８００単位であり、出発物質として２本鎖ポリヌク
レオチドを必要とし、全ゆる場合に２本鎖ポリヌクレオ
チドを生産し、そして、予め選択された部位を標識化す
ることができない。

更に、全ての酵素法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖を
修飾し、生成した鎖を互いに分離することができない。

この方法によれば、酵素は全ての単位を、修飾した単位
で置き換えるか、あるいは修飾されたヌクレオチド三燐
酸および天然のヌクレオチド三燐酸の混合物を添加した
場合は、修飾された単位をランダムに挿入していく。更
に、Ｌａｎｇｅｒらの酵素法では、蛍光性、発光性また
は抗原性のレポーターグループを挿入したポリヌクレオ
チドを製造することはできない。この技術のいずれを用
いても、レポーターグループを持った、あるいは持たな
い、定まった長さの、定まった配列または一本鎖特性の
オリゴヌクレオチドを製造することはできない。更にま
た、この先行技術の方法では、レポーターグループが付
着した修飾された塩基を、ポリヌクレオチドの予め定め
られた位装置に挿入することもできない。

Ｃ−８位を修飾されたアデニン塩基を取り入れた２本鎖
ポリヌクレオチドも酵素法で製造されている。これは、
Ｃ，Ｖｉｎｃｅｎｔら（Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓ、ｌｏ：６７８７　６７９６．１９８２年）によって
報告されている様に、ＤＮＡフラグメントに８−アミ７
ヘキシルアミノーＡＴＰ（リボヌクレオチド）を押入す
ることにより行なわれた。しかしこの方法は範囲が限定
されており、アデニンリボヌクレオチドの三燐酸により
３゛−末端だけを標識することができる。修飾したピリ
ミジンヌクレオシドは挿入することができない。更に、
他の酵素法と同様、２本鎖ポリヌクレオチドの両路が標
識され、定まった配列の短い（＜　１００単位）オリゴ
ヌクレオチドを製造することができない。

上記の先行技術としての酵素法は、置換されたヌクレオ
シド５°−三燐酸の化学合成が必要であり、次いで酵素
的な認識およびこの非天然の基質の、切れ目をつけた２
本鎖ＤＮＡへの挿入が必要である。この様な方法は、予
め選択した長さまたは配列のポリヌクレオチドを製造す
ることができず、かつ、ここで使用するポリメラーゼや
ＤＮａｓｅは高価なものである。更に、これらの方法は
時間がかかり、非能率なものであり、高い酵素活性を必
要とし、２本鎖ＤＮＡに限定されている。はんの少量の
、即ち数マイクログラムのはっきりしないポリヌクレオ
チド、通常制限フラグメント、が生産されるだけである
ので、これらを天然起源のものから煩雑な方法で分離し
なくてはならない。

更に、ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光またはジニトロフェ
ニルの様な潜在的に有用なリポータ−グループを認識し
たり挿入したりできないので、このポリヌクレオチド生
成物においては、達成し得る修飾の範囲が著しく制限さ
れる。

限られた生物学的応用のために、長いポリリボヌクレオ
チド分子（ＲＮＡ）の３°末端に１つの蛍光分子を取り
つける方法がＪ、Ｇ、Ｊ、　Ｂａｕｍａｎらによって開
示されている（　Ｊ　、　　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　　
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　　２９　：　２３８．１９８１年
）。この方法も、酵素法を使って天然の起源から煩雑な
方法で分離した極く少量（マイクログラム量）のＲＮＡ
を使用しており、この方法には２°および３″の水酸基
が必要であるのでＤＮＡに応用することはできない。

また、ＤＮＡに比較してＲＮＡが化学的に遥かに不安定
であることが、この方法によって製造されたポリリボヌ
クレオチドの応用範囲を狭くしてい天然の核酸塩基を持
った、定まった配列のオリゴヌクレオチドの非酵素的合
成法は、Ｓ、　　Ａ、　Ｎａｒａｎｇら（Ｍｅｔｈ、　
　Ｅｎｚｙｍｏｌ　　６５　：６１０．　１　ｃ３８０
年）、Ｒ，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈ
ｅｍ、　　４５：２７１５．１９８０年）、Ｍ、　ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ。

Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　１０３　：３
１８５．１９８２年〉およびＧ、　　Ａｌｖａｒａｄｏ
−Ｕｒｂｉｎａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：２７０．１
９８Ｉ年）により報告され、またはまとめられている。

この様な合成法は、通常、活性化したヌクレオチドモノ
マーを、生長するヌクレオチド鎖の遊離水酸基−含有末
端単位とカップリングさせることにより鎖伸長を行なう
ものである。このカップリングは、Ｎａｒａｎｇらによ
ってまとめられているホスフェート・トリエステル法、
あるいはホスファイト・トリエステル法の１つと同様、
燐含有基を介して行なわれる。後者の内、Ｌｅｔｓｉｎ
ｇｅｒらおよびＡ　１ｖａｒａｄｏ　−Ｕ　ｒｂｉｎａ
らの方法はホスホアミダイトの化学を使用し、Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉらの方法はホスホアミダイトの化学を使用し
ている。

上記のオリゴヌクレオチドの化学合成では、修飾されて
いない、即ち天然の核酸塩基だけを挿入するのであるか
ら、その目的生成物は短いフラグメントにあり、修飾さ
れていない、即ち天然のＲＮＡまたはＤＮＡに似ている
。この様な合成の目的生成物は、標識もリポータ−グル
ープも挿入していないという点に注意すべきである。

ホモポリマーポリヌクレオチドの直接的な修飾は、ポリ
ウリジル酸系で報告されている（Ｂｉｇｇｅら、Ｊ　、
　　Ｃａｒｂ、　、　Ｎ　ｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、　Ｎ
　ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　８　：２５９．１９８１年）
。しかし報告された方法は範囲が限定されており、有用
な生成物を製造し得ない。その処置法は、著しいポリヌ
クレオチドの開裂と破壊を引き起し、除去できない金属
イオン類が混在した生成物が得られ、しかもこの方法は
、ＤＮＡポリヌクレオチドのシトシン残基だけを修飾で
きるに過ぎない。更にこの方法は、特定の長さの定まっ
た配列のオリゴヌクレオチドを製造することができず、
チミンまたはプリン塩基を修飾することができず、そし
て予め選択した部位を修飾することができない。

以上の記載から明らかな様に、従来、定まった配列のポ
リヌクレオチドは、既述した様な欠点、特に時間、費用
、生成物の長さ、配列および収率に関する欠点を持った
酵素法によってのみ生産されて来た。更に、この様な方
法は２本鎖生成物を生産し得るに過ぎない。２本鎖ポリ
ヌクレオチドは、溶液中でアルカリまたは熱により変性
し、短時間、鎖を自然に分離することができる。しかし
、個々の１本鎖を物理的に、互いに分離することはでき
ず、そしてまた、変性条件を取り除くと、急速に自然の
２本鎖の形に戻る。ハイブリダイゼーションを行なうた
めの条件は、自然復帰のための条件でもあるので、変性
したポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションの条件
下に置くと、このポリヌクレオチドはその元の２本鎖の
配置に戻る。

従って、どちらか一方の鎖と標的ポリヌクレオチドとの
ハイブリダイゼーションは、もう一方の鎖との競合によ
って制限を受ける。

ヌクレオシドの修飾は、例えば抗ウイルス性Ｃ−５置換
ピリミジンヌクレオシドの合成（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ　
ら、Ｊ、　　Ａｍｅｒ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　
　９８：１５８７−１５８９．１９７６年ＨＲｕｔｈら
、Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、４３：２８７０　２８７６．１９７８年；お
よびＢ　ｅｒｇｓｔｒｏｍら、米国特許第４，２４７，
５４４並びに４，２６７．１７１号参照）またはｃ−Ｂ
置換アデニン誘導体の合成（Ｚａｐｐｅｌｌｉら、米国
特許第４，３３６，１８８並びに４，１９９，４９８号
参照）において行なわれている。これらのヌクレオシド
およびＬ　ａｎｇｅｒら、およびり、　Ｗａｒｄによっ
て報告されているもの（ヨーロッパ特許出願第００６３
８７９号）は、本発明方法に於いては有用でない。この
様な報告されているヌクレオシドは、望ましくない部位
での反応性が高く、これを化学的方法によるオリゴヌク
レオチドの合成に使用すると、望ましくない副産物が得
られたり、コントロールできない合成が行なわれたり、
所望の生成物が得られなかったりする。更に、上記のヌ
クレオシドは、置換基中に適当な部位を持っておらず、
リポータ−グループを結合させて修飾することができず
、また、マスク（遮蔽）した反応性官能基も持っていな
い。この様なヌクレオシドは、いずれも本発明方法に於
いては有用でない。

リポータ−グループを持った、あるいは持っていない、
何らかの修飾された塩基が導入されている定められた配
列のオリゴヌクレオチドの化学合成について記載された
先行技術は全くない。

危険な、−そして不安定な放射性同位元素を含んでいな
い、高品質の標識された一定配列の１本鎖オリゴヌクレ
オチドの速やかな出現が待たれており、この要求を満た
すことが本発明の主たる目的である。この目的が、予測
可能な、優れた製品を高収率で与える化学的方法、即ち
非酵素的方法により達成された。更に詳しくは、本発明
は、定められた配列のオリゴヌクレオチド中への、多種
多様の選択された検出可能なリポータ−グループで修飾
されたヌクレオチド（またはヌクレオシド）の化学的導
入を可能ならしめるものであり、この様にして得られた
オリゴヌクレオチドは、例えば、問題としている相補配
列の同定、位置づけ、分離モして／または定量に有用で
ある。

このように、本発明は、標識した、定められた配列の１
本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成に有用である新規
化合物を提供するものである。

本発明化合物は、標識した、定められた配列のオリゴヌ
クレオチドの新規な化学合成法に有用であり、この方法
は種々の面で先行技術の酵素法に優るものである。更に
詳しくは、従来の酵素法による２本鎖性の、不均質な予
測不能な４００−１ｏ、ｏｏｏ塩基単位のものの生産と
は異なり、本発明に基づく方法は、好ましくは２００塩
基単位以下の、均質な、予測可能な様に定められた長さ
の、標識された、定められた配列の１本鎖オリゴヌクレ
オチドの合成を可能にするものである。

本発明に基づく方法によって製造された生成物の収量は
、先行技術の酵素法によって得られる２〜３マイクログ
ラムの収量と違って、数百〜数百マイクログラムのオー
ダーである。更に、本発明方法で得られるオリゴヌクレ
オチドは、酵素法で得られる２本鎖と違って、１本鎖で
ある。オリゴヌクレオチド生成物が１本鎖形態であるこ
とは、２本鎖ポリスクレオチドの再ハイブリダイゼーシ
ョンにつきものの相補鎖からの競合を回避できるもので
ある。

本発明の説明 本発明は、約２００塩基単位の長さより短い、定められ
た配列の１本鎖オリゴヌクレオチドであって、１種また
はそれ以上の検出可能なリポータ−グループとして機能
し得るか、あるいはまた、１種またはそれ以上の検出可
能なリポータ−グループと結合し得る置換基が、その塩
基の立体的に耐容性のある部位（例えばピリミジンのＣ
−５、プリンのＣ−８）に結合している様なヌクレオチ
ド単位を少なくとも１個含んでいる１本鎖オリゴヌクレ
オチド、を化学的に合成するために有用である新規化合
物を提供するものである。より具体的には、本発明は、
式： ［式中、Ｂはピリミジン塩基またはプリン塩基であり、 Ｒは、着色、蛍光、発光もしくは放射活性グループまた
はりガント認識グループとして機能する少なくとも１個
のリポータ−グループまたは固形担体と既に結合してい
るかまたはそれらと結合し得るリンカ−アームであり、 Ｒ８はＨまたはマクスされたヒドロキシ基であり、 Ｒ４およびＲ２は、いずれか一方がマスキング基であり
、Ｒ４がマスキング基である場合、Ｒ６は、反応性のリ
ン含有基であるか、または（伸長するオリゴヌクレオチ
ドの５°末端ヌクレオチドの５゛−ＯＨ基が反応性のリ
ン含有基を有するときには）Ｈであり、あるいは、 Ｒ６がマスキング基である場合、Ｒ４は、反応性のりン
含有基であるか、または（伸長するオリゴヌクレオチド
の３°末端ヌクレオチドの３°−ＯＨ基が反応性のリン
含有基を有するときには）Ｈであるコ で示される構造を有する、実質上純粋な一本鎖オリゴヌ
クレオチドの化学合成における中間体として有用な反応
性モノマーに関するものである。この本発明のモノマー
は、定められた配列の１本鎖オリゴヌクレオチドの化学
的合成法に有用であり、この方法は即ち、非酵素的合成
法であって、活性化されたヌクレオチドモノマーと、伸
長しつつあるヌクレオチド鎖の遊離の水酸基を持った端
末単位とをカップリングさせることからなり、該七ツマ
−および端末単位の少なくとも一方が、その塩基の立体
的に耐容性のある部位に、１種またはそれ以上の検出可
能なリポータ−グループとして機能し得る、あるいは１
種またはそれ以上の検出可能なリポータ−グループと結
合し得る置換基が結合することによって修飾されている
ことを特徴とする方法である。

本発明方法によって製造されるオリゴヌクレオチドは、
１種またはそれ以上のピリミジンを塩基とする、または
プリンを塩基とする単位を含んでいて、その単位はりボ
ヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであ
ってもよく、その合成前に、リポータ−グループが結合
する特定のヌクレオチド単位と同様、そのリポータ−グ
ループも、予め選択される。本発明の化合物によって合
成される１本鎖オリゴヌクレオチドは、具体的には、以
下の構造を有するものと定義される二式： ［式中、Ｒ”は水素またはヒドロキシ、Ｂはピリミジン
塩基またはプリン塩基、Ｒは、着色、蛍光、発光もしく
は放射活性グループまたはリガンド認識グループとじ−
て機能する少なくとも１個のリポータ−グループまたは
固形担体と既に結合しているかまたはそれらと結合し得
るりンカーアームであるコ で示されるヌクレオチド残基を少なくとも１つ予め選択
された位置に有する、基本的に２００ヌクレオチドを越
えない予め選択された配列からなる実質上純粋な一本鎖
オリゴヌクレオチド。

本発明を実施する上の最も好ましい態様本発明の定めら
れた配列の１本鎖オリゴヌクレオチドを合成するための
好ましい化学的方法は、活性化されたヌクレオチドモノ
マーと、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の、遊離の水酸
基を持った端末単位の少なくとも一方が、その塩基の立
体的に耐容性のある部位に、１種またはそれ以上の検出
可能なリポータ−グループとして機能し得る、あるいは
１種またはそれ以上の検出可能なリポータ−グループと
結合し得る置換基が結合することによって修飾されてい
るという特徴を有する該ヌクレオチドモノマーと該端末
単位をカップリングさせることからなる。

リポータ−グループと結合し得る本発明に於ける置換基
は、一般的に求核性の性質を示すものであると言うこと
ができる。この様な置換基の例としては、第１級アミン
、芳香族アミン、カルボン酸、水酸基などを含んでいる
ものが挙げられる。

ヌクレオチドモノマーおよび端末単位の塩基は、目的生
成物であるオリゴヌクレオチド中に希望する予め定めら
れたヌクレオチド単位の配列が得られる様に選択される
。この様な塩基はプリン類であるアデニン（Ａ）、グア
ニン（Ｇ）、またはヒボキサンチン（Ｈ）の形をとるか
、あるいはピリミジン類であるウラシル（Ｕ）、シトシ
ン（Ｃ）、またはチミン（Ｔ）の形をとることができる
。この様な塩基はまた、天然から単離し得るその池の塩
基の形をとっていてもよい。

ヌクレオチド単位上の立体的に耐容性のある部位とは、
その単位の核酸塩基上の位置であって、その位置に、置
換基が結合することによって該単位が修飾されるもので
あり、その際、生成物であるオリゴヌクレオチドと相補
的核酸成分トノハイブリダイゼーションが重大な妨害を
受けず、そして該置換基がｌ若しくはそれ以上のリポー
タ−グループとして機能したり、あるいは１若しくはそ
れ以上のリポータ−グループに結合するのが立体的に妨
げられない様な位置であると定義することができる。立
体的に耐容性のある部位はプリン類のＣ−８位、ピリミ
ジン類のｃ−５位である。本発明のオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーション用のプローブとして特に有
用であるので、置換基および／またはリポータ−グルー
プを取り付ける修飾は、特定のハイブリダイゼーション
に必要なピリミジンまたはプリン塩基上の部位で行なわ
れてはいけない。修飾されてはいけない部位には、アデ
ニン塩基のＮｌおよびＮ＠、グアニン塩基のＮ’、Ｎ”
およびＯｅ、シトシン塩基のＮ３およびＮ４などが含ま
れる。一般的に、ヘテロ原子（ＮまたはＯ）への置換は
避けるべきである。

リポータ−グループとは、芳香族および／または多環式
グループであってよく、適当な物理的または化学的検出
系あるいは検出法によって容易に測定または検出し得る
物理的あるいは化学的特性を持った化学的グループであ
ると定義することができる。本発明に於けるオリゴヌク
レオチドに有用なリポータ−グループは容易に検出でき
る。容易な検出能は、色の変化、発光、蛍光または放射
活性の様な特性によって与えられる。あるいはまた、リ
ポータ−グループがリガンド認識部位として機能し得る
ことによっても、検出能は得られる。

この様なグループは、機能的には着色、発光、蛍光、放
射活性またはリガンド認識グループと呼ばれる。この様
なグループの中には、通常の検出技術、例えば比色検出
、分光光度検出、蛍光検出または放射活性検出などによ
って検出するのに適したもの、あるいは、この様な通常
の検出法によって検出できるグループを含んでいる特定
のりガント−リガンド複合体の形成に関与し得るものな
どがある。

本明細書においては、リポータ−グループは、適当な測
定法または検出法を使って容易に測定または検出できる
物理的、化学的またはその他の特性を持った置換基であ
ると定義される。ここで定義されたリポータ−グループ
には、適当な測定法または検出法を使って容易に測定ま
たは検出できる物理的、化学的またはその他の特性を持
った反応生成物または複合体を最終的に与える１若しく
はそれ以上の相互作用、を開始させることができる置換
基も含まれる。

この様なグループ、反応生成物もしくは複合体が持って
いる、または引き起す、測定可能である、あるいは検出
可能である特性の例は、色の変化、発光、蛍光または放
射活性である。この様な特性は通、・Ｓの比色計、分光
光度計、蛍光分析計または放射活性検出計を使って測定
または検出することができる。

ここで定義したリポータ−グループによって開始され得
る相互作用には、例えば比色法、分光光度法、蛍光法ま
たは放射活性検出法などによって容易に検出し得るグル
ープまたは複合体を生成する適当に特異的で選択的なり
ガント−リガンド相互作用が含まれる。この様な相互作
用は、タンパク質−リガント、酵素−基質、抗原−抗体
、炭水化物−レクチン、タンパク質−補助因子、タンパ
ク質−作動因子、核酸−核酸または核酸−リガント相互
作用なくの形をとることがある。このリガンド−リガン
ド相互作用の例として、ジニトロフェニル−ジニトロフ
ェニル抗体、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチド
−相補性オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ−ＤＮＡ％ＲＮＡ
−ＤＮＡおよびＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼなどが挙げ
られる。

当業者であれば、その他の有用な相互作用についても思
い浮ぶことであろう。

本発明方法に於いては、選択されたリポータ−グループ
（群）は、ヌクレオチド鎖の端末単位にカップリングさ
せる前のヌクレオチドモノマーに取り付けてもよいが、
オリゴヌクレオチド生成物ができ上った後に取り付ける
こともできる。オリゴヌクレオチド生成物におけるヌク
レオチド単位の配列は、その最終的な用途のための正確
な特異性を持ったオリゴヌクレオチドが得られる様に、
予め連窓しておく。本発明のオリゴヌクレオチドは、組
換えＤＮＡおよび核酸の再ハイブリダイゼーション技術
が関与するその他の計画を行なうのに有用である。その
様な用途として、細胞系または細胞不含系において注目
している相補配列の同定、位置づけ、分離および／また
は定量などが挙げられる。更に詳しくは、その様な用途
には、核酸成分のハイブリダイゼーションが関与する全
ゆる基礎的な生物学的操作または診断的応用、あるいは
、立体的に耐容性のある部位の修飾によってオリゴヌク
レオチド生成物を固形担体に結合させた場合の、アフィ
ニティークロマトグラフィーによる相補配列の精製（そ
の後検出するか否かは不問）が含まれる。

オリゴヌクレオチド生成物中のヌクレオチド単位はプリ
ンまたはピリミジンを塩基とするものであり、修飾され
た塩基を持った単位とまざり合った天然の塩基を持った
単位を含んでいてもよい。

この様な単位はりボヌクレオチド、またはデオキシリボ
ヌクレオチドである。カップリング工程は、３°位が活
性化されたモノマー単位と、伸長しつつあるヌクレオチ
ド鎖の端末単位の遊離の５°ヒドロキシをカップリング
させるのが好ましい。あるいは、５°位を活性化したモ
ノマー単位を、ヌクレオチド鎖の端末単位の遊離の３°
ヒドロキシとカップリングさせることもできる。この端
末単位は、ヌクレオチドモノマーがカップリングする時
の、伸長するヌクレオチド鎖の最初の単位、即ち唯一の
単位であるか、あるいは複数個のヌクレオチド単位群の
端末の１つである。

本発明方法により、以下の一般式で示される定まった配
列のオリゴヌクレオチドが生産される。

式中、ｎは１〜約１９９、好ましくは約５〜約６０、最
も好ましくは約１０〜約４０ＳＲ’は水素またはヒドロ
キシ、Ｂは天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基
であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミ
ンまたはその他の天然に存在する塩基であり、天然に存
在する塩基を持ったヌクレオチド単位は、それぞれ修飾
された塩基（Ｂ１）を持った１またはそれ以上のヌクレ
オチド単位と混じり合っている。修飾されたピリミジン
塩基（Ｐｙ”″）は、Ｃ−５位が置換されたものであり
、その與型的な例は以下の一般式で示されるウラシルお
よびシトシン塩基である： 修飾されたウラシル塩基　修飾されたシトシン塩基修飾
されたプリン塩基（Ｐ　ｕ”）はＣ−８位が置換されて
おり、その代表例は、以下の一般式で示される修飾され
たアデニンおよびグアニン塩基である： 置換基Ｒは、ｌまたはそれ以上のリポータ−グループと
して機能し得る、あるいは１またはそれ以上のリポータ
−グループに結合し得るという特徴を持っている。修飾
されたピリミジン塩基では、置換基Ｒは２またはそれ以
上の炭素原子を含んでおり、一方、修飾されたプリン塩
基では、Ｒは１またはそれ以上の炭素原子を含んでいる
。これに関し、Ｒは以下の官能化された炭素鎖の１つの
形をとるのが好ましい： Ｒ＝−ＣＩｌ＝ＣＲ，Ｒｔ、−Ｃｌｌ　ｔ　ＣＩＩＲ＋
　Ｒｔ、−ＣＩＩＲ，Ｒ，、上記式中、Ｒ，は水素また
はアルキル、Ｒ２はアルキル、アルケニル、アリールま
たは官能化されたアルキル、アルケニル、アリール（こ
こで官能基には１またはそれ以上のアミン、アミド、ニ
トリル、カルボン酸、カルボン酸エステル、ヒドロキシ
、ジニトロフェニル、アミノベンゼンスルホネートなど
が含まれる）、Ｚは窒素、酸素または硫黄の如き多価へ
テロ原子である。更に、Ｒ２は固形担体あるいは、例え
ば着色、蛍光、発光、放射活性またはリガンド認識基と
して機能するｌまたはそれ以上のリポータ−グループに
結合していてよい。機能的な蛍光基には、フルオレセイ
ン、ローダミンなど、およびそれらの付加物が挙げられ
る。機能的な発光基には、ルミノール、アクリジン、ル
シフェリン、ジオキセタン、ジオキサミドなど、および
それらの付加物が挙げられる。リガンド認識基には、蛋
白質とのりがノド様相互作用によって認識し得る、ある
いはその様なリガンド様相互作用を誘導し得るビタミン
（例えばビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオ
チン）、抗原、例えばジニトロフェノール、炭水化物お
よびその他の官能基またはその様な基の付加物が含まれ
る。核酸と相互作用し得るもう１つのオリゴヌクレオチ
ドは、リガンド様相互作用を誘導し得る基の例である。

リガンド認識基はまた、認識によって着色が生じる場合
は、機能的な着色リポータ−グループとしても役立つ。

例えば、ジニトロフェニルをリポータ−グループとして
使用した場合、検出系として、色の変化を生じるパーオ
キシダーゼと結合した抗ジニトロフェニル抗体を用いた
既知の検出系を使用することができる。機能的な放射活
性基は、選ばれたリポータ−グループ中に放射活性要素
を含んでいる。

本明細書に於いて、プリンまたはビ°リミジン塩基とい
う表現を使用する場合は、その様な塩基の類似体をも含
んでいるものとする。この様な類似体には、デアザアデ
ノシン（ツベルシジン、ホルミシンなど）の様なプリン
塩基類似体、デアザウラシル、デアザシトシン、アザウ
ラシル、アザシトシンなどの様なピリミジン塩基の類似
体が挙げられる。

式Ｉのオリゴヌクレオチドは、以下の式で示されるモノ
マーヌクレオチド類似体単位から、化学合成により製造
するのが最もよい： ■・ ［ここでＲｅ”メチル、クロロフェニル；Ｘ＝クロロ、
ジアルキルアミノ、モルホリノ］上記式中、Ｒ８はトリ
チル（トリフェニルメチル）、ジメトキシトリチル、ま
たは５′−ヒドロキシの為のその他の適当なマスキング
基であり、ＢおよびＲｏは、適切ならばマスクされてお
り、■はオリゴヌクレオチド生成物の合成に於ける鎖伸
長に際し、ヌクレオチド間結合形成に適した燐含有基で
ある。ヌクレオチド間結合形成に適した燐含有基■の好
ましいものはアル牛ルホスホモノクロリダイトまたはア
ルキルホスホモノアミダイトである。あるいは、ホスフ
ェートトリエステルをこの目的に使用してもよい。この
モノマー単位はまた、３゛−ヒドロキシに結合したＲ８
および５°−ヒドロキシに結合した■を持っていてもよ
い。

一般に「マスキング基」または「ブロッキング基」とい
う用語は、完全な官能基の化学反応性を変化させ、望ま
しくない反応を起こさない様に、その官能基に第２の部
分を結合させて、その官能基を化学的に修飾することま
たは「ブロックコすることの機能的な表現である。この
様な修飾は可逆的であり、適当な処理によってもとの官
能基に変換することができる。多くの場合、この様なマ
スキングは、形の上では構造的な機能性の相互変換であ
る。例えば第１級アミンはアセチル化によってマスクさ
れて置換アミドとなり、これはその後適当な加水分解に
よって第１級アミンにもどすことができる。

式Ｉの化合物には、その許容し得る共役酸塩も含まれる
。この様な塩の製造に使用し得る共役酸は非反応性のカ
チオンを含むものであり、例えば窒素含有塩基、例えば
アンモニウム塩、モノ−ジー、トリーまたはテトラ−置
換アミン塩など、あるいは適当な金属塩、例えばナトリ
ウム、カリウムなどの塩である。

以下に本発明の製造工程を概説し、図式的に例示する。

その後、本発明をより具体的に例示し、詳細な説明を挙
げる。本発明はピリミジンを塩基とするヌクレオチド単
位およびプリンを塩基とするヌクレオチド単位の両者を
含んでいるオリゴヌクレオチドに関するものであるので
、合成過程でピリミジンおよびプリンを塩基とする同化
合物を使用するものを例示する。例示した個々のピリミ
ジンおよびプリンを塩基とする化合物は、それぞれピリ
ミジンおよびプリン群の一例に過ぎず、それらは、適当
であるかまたは所望の場合、その製造工程およびオリゴ
ヌクレオチド生成物において、それぞれの群の他のもの
で置き換え得るものと理解されるべきである。大部分に
於いて、デオキシリボヌクレオチドを示したが、本発明
はりボヌクレオチドをも意図するものであると理解され
るべきであり、オリゴヌクレオチド生成物中に於いてリ
ボヌクレオチド化合物が必要である場合は、デオキシリ
ボヌクレオチド化合物をリボヌクレオチド化合物で置き
換えることができる。

本発明のより重要な点は、新規なオリゴヌクレオチドの
合成法に於ける中間体として必須である新しいヌクレオ
シド群を提供することである。この様なヌクレオシドは
全て、官能化された炭素鎖と１またはそれ以上のアミド
からなる置換基によって修飾された塩基を持っており、
このアミドの窒素は、この塩基の立体的に耐容し得る部
位に、炭素鎖を介して結合している。ピリミジンを基礎
とするヌクレオシドの場合は、炭素鎖はｃ−５位に結合
しており、プリンを基礎とするヌクレオシドの場合は、
炭素鎖は多価へテロ原子、例えば窒素、酸素または硫黄
を介してＣ−８位で結合している。

更に、この様なヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの
化学合成に適した、例えばジメトキシトリチルの様な基
で、５°位（または３“位）が化学的にブロックされて
いる。

この新規なヌクレオシド群に於いて、置換基はＣＨ，Ｃ
ＨＲ＋ＣｎＨ，ｎＹ、−ＣＨ＝ＣＨ，ＣｎＨｔｎＹ。

−ＣＨ＝ＣＨ１−Ｃ−ＮＨＣｎＨ，ｎＹ、またはＣＨ＝
　ＣＲ＋　ＣＣｎＨｔｎＹから選ばれる。ここに１ 於いてＲ２は水素またはＣ，−Ｃ，低級アルキル、Ｙは
１またはそれ以上のアミド、置換アミド、置換アミノま
たは置換アミノアルキルフェニル基である。より詳しく
は、Ｙは１またはそれ以上の１ −ＮＨＣＣＸ３（Ｘは水素、弗素または塩素）を含んで
いてよい。これらのヌクレオシドおよびそのマスクされ
たものの合或は、実施例１１　■、■、■、■、■、Ｘ
１■およびＸ■に記載しである。

好ましいヌクレオシドは、ピリミジンヌクレオシドのｃ
−５に置換基−ＣＨ＝ＣＨＣ−ＮＨＣｎＨ−ｎＹ１ いる。最も好ましいのは、ピリミジン塩基がウラシルで
あるヌクレオシドである。

本発明方法は、選択したヌクレオシドの製造から開始す
ることができる。一般に、最も好ましいヌクレオシドは
以下の如くして製造するのが最もよい。Ｂ　ｅｒｇｓｔ
ｒｏｍおよびＲｕｔｈの方法［Ｊ、　　Ａｍｅｒ。

ＣｈｅＩＩｌ、Ｓｏｃ、９６：１５８７（１９７６）］
により、］２°−デオ牛シウリジから５−（メチル３−
アクリリル）−２°−デオキシウリジンを製造する。次
いでこのヌクレオシドをピリジン中、１．０５当量のジ
メトキシトリチルクロリドで処理して５′ヒドロキシを
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護する。２％のトリ
エチルアミンを含有するクロロホルム中の０〜１０％メ
タノールのグラジェントで溶出するシリカクロマトグラ
フィーにより、得られた生成物を精製する。精製した５
“−ＤＭＴ＝５−（メチル３−アクリリル）−２°−デ
オキシウリジンを、周囲温度にて、ＩＮＫＯＨで２４時
間処理し、メチルエステルを加水分解する。得られた５
′−ＤＭＴ−５−（３−アクリリル）−２゜−デオキシ
ウリジンをピリジン中の過剰のジシクロへキシルカルボ
ジイミドおよびヒドロキシベンズトリアゾールで処理す
る。４時間後、２〜５倍過剰量の１，７−ジアミノへブ
タンを加え、反応物を一夜撹拌する。１２〜２０時間後
、１０〜２０倍過剰量の無水トリフルオロ酢酸を加え、
反応物を室温で４時間撹拌する。２％のトリエチルアミ
ンを含有するクロロホルム中の０−１０％メタノールの
グラジエンで溶出するシリカクロマトグラフィー、次い
で１％のトリエチルアミンを含むメタノールで溶出する
セファデックスＬＨ−２０を用いた排斥クロマトグラフ
ィーにより、生成物を精製する。適切なフラクションを
集めると、５’ＤＭＴ−５−［Ｎ−（７−トリフルオロ
アセチルアミノヘプチル）−■−アクリルアミド］−２
°−デオキシウリジンが得られる。この生成物は、実施
例Ｘ■およびＸ■に記載したホスホクロリグイト法によ
るオリゴヌクレオチド合成に適切である。

別法として、この化合物は実施例■および■に記載した
方法を組み合せて製造することもできる。

この方法に於けるジアミノヘプタンを他のジアミノアル
カン（例えばジアミノプロパン、ジアミノヘキサン、ジ
アミノドデカン）で置き換えると、ｎが３．６または１
２であり、Ｒが である長さの置換基を持った他の化合物が得られる。こ
の様な２つのヌクレオシド、１つはピリミジン（ウラシ
ル）を塩基とし、他方はプリン（アデニン）を塩基とす
るものを、この方法を例示する後記の図式の最初に示し
た。次いで、反応ｌに示す様に、例えばアデニンを基礎
とするヌクレオシドの６位のアミンにベンゾイル基（Ｂ
ｚ）を結合させることによって、ヌクレオシドの塩基上
の反応部位をマスクする。この様なマスキングについて
は、ｒｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　
　ｉｎ　　ＮｕｃｌｅｉｃＡ　ａｉｄ　　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙｊ、第１巻、Ｗ、　　ＺｏｒｂａｃｈおよびＲ，
Ｔｉｐｓｏｎ編、ＷＮｅｙ　−ｒ　ｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ、　Ｎ。

Ｙ、、１９６８に一般的に記載されている。反応１に示
す様に、例えば、トリフルオロアセチル基（Ａｃ）を結
合させることによって置換基上の非保護アミンをマスク
する。

次いで、ヌクレオシドの選択した３”または５゛ヒドロ
キシを、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を結合させる
ことによってマスクする。後に示す反応２に於いては、
５°−ヒドロキシをマスクし、３′ヒドロキシを遊離、
即ち反応し得る様にしておく。あるいはまた、３°ヒド
ロキシをマスクし、５゛ヒドロキシを遊離にしておいて
もよい。

次いでこのヌクレオシドを、好ましくはその３′ヒドロ
キシに、活性化部分を含んでいる燐含有基を結合させる
ことによって、活性化されたヌクレオチドモノマーに変
換する。この修飾されたヌクレオシドを適当にブロック
する場合は、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉらによって記載された方法、またはＮ　ａｒａｎｇに
よってまとめられた方法の改良法をオリゴヌクレオチド
合成に使用することができる。Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
によって記載されている様なホスホアミダイト化学を用
いる方法は実施例ＸＶＩ−ＸＶＩ［Ｉに詳しく述べであ
る。ホスホアミダイト化学を使用するには、Ｄ　ｏｒｐ
ｅｒらの改良法［Ｎ　ｕｃＩｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、　　１１：２５７５（１９８３）］と同様、Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉらの方法の修正法を使用し、保護され
た、修飾されたヌクレオシドをメチルクロロ（Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピル）ホスホアミデートまたはメチルクロロ
−ホスホモルホリゾートでホスフィチル化する。あるい
は、保護され、修飾されたヌクレオシドを室温でトリメ
チルホスフェート中、１．２当１ｔのクロロフエニルジ
クロロホスフェートでホスホリル化し、次いで水に入れ
て、修飾されたヌクレオシドの３′−クロロフェニルホ
スフェート付加物を得ることができる。この様な付加物
は、Ｎ　ａｒａｎｇらによって例示的にまとめられてい
る様に、ホスホトリエステル・アプローチの修飾に有用
である。反応３の図式は、塩素が活性化部分として機能
するホスホモノクロリダイト基をヌクレオシドの３°ヒ
ドロキシに結合させることによる、式■の活性化モノマ
ーヌクレオチド単位の合成を示している。

選択された活性化ヌクレオチドモノマー、即ちウラシル
を塩基とするモノマーまたはアデニンを塩基とするモノ
マーの、伸長しつつあるヌクレオチド鎖の端末単位への
カップリング即ち縮合は、図式の反応４に示しである。

ヌクレオチド鎖は、その右側末端に、天然に存在する塩
基およびその３°ヒドロキシに結合したマスキング基Ｒ
４または固形の担体を持ったヌクレオシド単位を含む様
に描いである。例示した鎖はまた、天然に存在する塩基
を持ったｌまたはそれ以上（ｎｏ）のヌクレオチド単位
を含んでおり、この単位はヌクレオシド単位の５°ヒド
ロキシに結合しており、ヌクレオチド単位の末端のもの
は５′位に遊離のヒドロキシを持っている。このカップ
リング反応に於いて、モノマーの塩素が端末単位の遊離
ヒドロキシの水素と反応して除去され、かくして、図示
した様に端末単位の酸素がモノマーの燐にカップリング
し、このモノマーがヌクレオチド鎖の新しい端末単位と
なる。

次いでＤＭＴ５’ブロッキング基を除去し、さらに活性
化ヌクレオチドモノマー単位を次々とカップリングさせ
てヌクレオチド鎖を伸長させ得る様にする。鎖に付加す
るヌクレオチド単位は予め選択することができ、天然に
存在する塩基または修飾された塩基のいずれかである。

天然に存在する塩基を持ったｌまたはそれ以上（ｎ”）
のヌクレオチド単位を付加することによる更なる鎖の伸
長を図式の反応４ａに示す。

選択された長さおよび配列のオリゴヌクレオチドを合成
したら、その端末単位からＤＭＴ基を除去し、マスクし
た反応性基を脱マスクする。反応性基が脱マスクされた
修飾ウラシルおよびアデニン塩基の例を反応５に図式的
に示す。鎖の最初のヌクレオチド単位が固形担体Ｒ４に
結合している場合は、その固形担体から鎖を切り離す。

脱マスクの適切な順序は予め選択することができる。

修飾された塩基の置換基が、オリゴヌクレオチド生成物
の意図する用途に於いてリポータ−グループとして機能
し得ない場合は、反応６に例示した様に、適当なリポー
タ−グループＲ３をその様な置換基に結合させることが
できる。反応６は、塩基のそれぞれの置換基に結合した
リポータ−グループを持ったそれぞれの塩基を示してい
る。

合成工程の例示 ウラシル塩基のもの アデニン塩基のもの 式■のモノマーヌクレオチド単位 反応４ａ 更に鎖の伸長 上記式中、例えば、オリゴヌクレオチド生成物中のＢｍ
は以下の通りである： オリゴヌクレオチド生成物に、各種の有用ナリポーター
グループ（Ｒ６）を結合することができる。

例えば下記に示すようなレポーターグループを有するオ
リゴヌクレオチドを挙げることができる。

で示されるリポータ−グループ（Ｒ２＝ビオチンまたは
フルオレセイン）を持ったオリゴヌクレオチド生成物。

本発明の工程を一般的に説明し、図式化して示したが、
その説明した各反応について、以下により詳細に説明す
る。

反応１について、シトシンのＮ　４、アデニンのＮ＠、
グアニンのＮ！、および修飾された塩基のアルキルまた
はアリールアミンの様な化学的に反応性のあるアミンの
、適当なマスキング基によるマスキングは、アルコール
類、ピリジン類、ルチジン類、クロロホルムの様な適当
な溶媒中、ヌクレオシドを過剰量の適当な酸無水物と、
０℃〜１１０°Ｃの範囲の温度、通常２０°Ｃ〜８０℃
で、約１〜２４時間反応させることにより好適に実施す
ることができる。適当な酸無水物には無水酢酸、無水ト
リフルオロ酢酸、無水安息香酸、無水アニス酸などがあ
る。好ましいのは無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無
水安息香酸および無水イソ酪酸である。

反応２に於ける５°−ヒドロキシのマスキングは、ヌク
レオシドをやや過剰量の適当な酸に不安定なマスキング
剤、例えばトリチルクロライド、モノメトキシトリチル
クロライド、ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴＴ
ＣＱ）、トリメトキシトリチルクロライドなどと反応さ
せることにより好都合に行なうことができる。好ましい
のはジメトキシトリチルクロライドである。典型的な反
応は、例えばピリジン類、ルチジン類、トリアルキルア
ミン類などの適当な溶媒中、−２０℃〜１２０℃の範囲
の温度、通常２０°Ｃ−１００℃の温度で約１〜４８時
間反応させることである。好ましい反応では、ピリジン
中のＤＭＴＣＱｌ、１当ｉ１を使用し、室温で約２時間
反応させる。

上記の各反応のそれぞれの生成物は、それを次の反応の
出発物質として使用する前に、分離および／または単離
するのが一般的に好ましい。分離および単離は、例えば
蒸発、濾過、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層
クロマトグラフィーなどの適当な精製法によって行なう
ことができる。

典型的な分離および単離法の具体的な例については、後
記の適当な実施例を参照することができる。

しかし、勿論その他の同等の分離法を採用することもで
きる。また、典型的な反応条件（例えば温度、モル比、
反応時間）が与えられてはいるが、その様な範囲以上ま
たは以下の条件も、通常好適性には劣るものの、使用し
得るということも理解されねばならない。

反応３に示したホスファイト体への活性化は、ヌクレオ
シド化合物を、適当な溶媒中、−９０℃〜６０’Ｃの温
度で、１分〜２時間、適当なホスフィチル化剤で処理す
ることにより、最も好適に行なうことができる。好適な
ホスフィチル化剤には、メチルホスホジクロリダイト、
Ｏ−クロロフェニルホスホジクロリダイト、ｐ−クロロ
フェニルホスホジクロリダイト、メチルホスホ（ジアル
キルアミ／）モノクロリダイトなどが含まれる。適切な
溶媒としては、０〜２０％の適当な塩基（通常１〜５容
量％）、例えばルチジン類、コリジン類、トリアルキル
アミンなどを含有しているピリジン、ルチジン類、アセ
トニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロ
ホルムなどが挙げられる。

好ましいホスフィチル化剤はメチルホスホジクロリタイ
ト、０−クロロフェニルホスホジクロリダイト、および
メチルホスホ（ジ−イソプロピルアミノ）−モノクロリ
ダイトである。好ましいホスフィチル化条件は、５％の
２，６〜ルチジンを含有しているアセトニトリルまたは
ピリジン中の０゜ｇ当量のメチルホスホジクロリダイト
を用いて５〜１０分間、室温またはそれ以下で行なうこ
とである。

伸長しつつあるヌクレオチド鎖に、修飾されたヌクレオ
チドモノマ一体を化学的に挿入して、定のヌクレオチド
配列を作成する例は反応４および４ａに示しである。典
型的な条件は、適当な溶媒中、−２０℃〜５０℃、好ま
しくは周囲温度で、約１〜６０分間行なうことである。

好適な溶媒混合物は、０〜２０％の適当な塩基（通常１
〜５容量％）、例えばルチジン類、コリジン類、トリア
ルキルアミン類などを含有しているピリジン、ルチジン
類、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン
、クロロホルムなどである。伸長しつつある鎖は溶解性
であるか、非溶解性であるか、または当技術分野で知ら
れている適当な化学的方法によって適当な固形担体に結
合されているかである。固形担体に結合しているのが好
ましい。更に、伸長しつつある鎖は、既に１またはそれ
以上の修飾されたヌクレオシド体を含有している場合も
あれば、そうでない場合もある。

反応４で伸長しつつある鎖に活性化モノマーを縮合させ
た後、その最初の生成物を適当な試薬で処理して中間体
ホスファイトトリエステルの酸化を行ない、要すればオ
リゴヌクレオチドの未反応の５゛−ヒドロキシをブロッ
クするためにキャッピングを行ない、５’−ＤＭＴ基を
除去する。ホスファイトトリエステルの酸化は、適当な
溶媒、例えばテトラヒドロフラン／水／ルチジン混合物
中で、０．ｌ〜５重ｆｆｉ／容量％のヨウ素で処理する
ことにより行なうことができる。未反応の５゜−ヒドロ
キシの化学的キャッピングは、例えばテトラヒドロフラ
ン／ルチジン混合物中、無水酢酸および４−ジメチルア
ミノピリジンを使ってアセチル化またはアシル化するこ
とで達成し得る。５−プロツキング基、通常ＤＭＴ、の
除去は、非プロトン性溶媒中緩和な有機酸で、例えばク
ロロホルムまたはジクロロメタン中のｌ〜５容量％のジ
クロロ酢酸またはトリクロロ酢酸で処理することにより
、最も都合よく行なうことができる。ＤＭＴを除去され
た伸長しつつあるヌクレオチド鎖は、活性化されたモノ
マーによる次の反応で更に伸長するための受容体となり
、その結果、反応４ａに示す様に、所望の長さおよび配
列のオリゴヌクレオチドが得られる。

所望の配列のオリゴヌクレオチドが製造されたら、反応
５を行なってオリゴヌクレオチド生成物を得る。この目
的で、チオフェノール処理をしてホスフェートトリエス
テルからメチルマスキング基を除去し、適当な水性アル
カリまたはアンモニア処理をして保護されたアミンから
ベンゾイル、アセチル、イソブチル、トリフルオロアセ
チルまたはその他の基を除去し、モして／または固形担
体から生成物を脱離させる。オリゴヌクレオチド生成物
からのＤＭＴの除去は、周囲温度〜４０°Ｃに於いて、
水性酢酸の様な緩和な酸で１０〜６０分間適当に処理す
ることにより行なう。この様な反応は、最後の精製段階
で、あるいはその前に行なうことができる。最後の精製
は適当な方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動
、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＤＥＡＥ
−セルロース上の逆相またはアニオン交換、またはこれ
らの方法の組合せによって行なう。

ここに述べたオリゴヌクレオチドの合成法は、修飾され
たデオキシリボヌクレオシド（Ｒ’はＨ）または修飾さ
れたりボヌクレオシド（Ｒ’はヒドロキシ）にも利用で
きる。リボヌクレオシドを使用する場合は、適当なマス
キング基、例えばシリルエーテルで与えられるもの、に
よって２°−ヒドロキシをマスクする。アラビノースお
よび３°−デオキシリボースを含むその他のリボース体
も、所望のオリゴヌクレオチドを製造する方法に使用す
ることができる。

ヌクレオチド塩基を修飾する置換基は、それ自体が１ま
たはそれ以上のリポータ−グループとして機能してもよ
い。その例は、ジニトロフェニル基を含んでいる置換基
である。置換基がリポータ−グループとして機能し得な
い場合は、鎖伸長のカップリング反応の前または後で、
１またはそれ以上のリポータ−グループと結合すること
ができなければならない。選択されたオリゴヌクレオチ
ド生成物は、適当な試剤と反応してその様なリポータ−
グループと結合する。例えば、修飾された塩基をオリゴ
ヌクレオチドに挿入し、その置換基のＲ１が１またはそ
れ以上の１級アミンを含んでいる場合は、適当な緩和な
条件を用いてアミン−反応性基、例えばインシアネート
、インチオシアネート、活性カルボン酸共役体、エクス
ポキシドまたは活性芳香族化合物とカップリングさせて
アミド、ウレア、チオウレア、アミンまたは芳香族アミ
ン結合を生成させる。例えば、反応５の図式に示した様
に、１級アミンを持った置換基で修飾されたウラシルま
たはアデニン塩基を含んでいるオリゴヌクレオチドは、
フルオレセイン・イソチオシアネートの様な適当な試剤
と反応させて、反応６に示した様に、置換基に結合した
リポータ−グループＲ，（フルオレセイン）を得ること
ができる。同様にして結合することができるその他のリ
ポータ−グループには、多種多様の有機部分、例えばフ
ルオレセイン類、ローダミン類、アクリジニウム塩類、
ジニトロフェニル類、ベンゼンスルホニル類、ルミノー
ル類、ルシフェリン類、ピオチン類、ビタミン類、炭水
化物などが含まれる。

好適な活性リポータ−グループは市販のものを使用でき
るが１例えばｒ　Ｂ　ｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　
　ａｎｄＣｈｅｍｉ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＪに一
般的に記載されているタイプの方法［Ｍ、ＤｅＬｕｃａ
およびＷ、　ＭｃＥｌｒｏｙ編、Ａ　ｃａｄ、　　Ｐ　
ｒｅｓ８ｓ　ニューヨーク（１９８１）コ、Ｄ、Ｒｏｓ
ｗｅｌｌらまたはＨ、Ｓ　ｃｈｒｏｒｄｅｒらの方法［
Ｍｅｔｈ、　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　ＬＸ　１１．１９
７８］およびそこに引用されている文献の方法によって
合成することができる。

典型的には、リポータ−グループの付加は、望ましくは
水性溶媒中、Ｒ３がＣｎＨ、ｎＮ　Ｈ、である修飾され
た塩基の置換基を、過剰の選択されたリポータ−グルー
プと、約−２０℃〜５０℃（好ましくは２０’Ｃ〜４０
’Ｃ）の範囲の温度で１〜２４時間反応させることによ
って達成するのが好都合である。好適な溶媒は水性緩衝
液およびＯ〜５０％の有機溶媒、例えば低級アルコール
、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ピリジ
ンなどである。好ましいリポータ−グループ反応体には
、フルオレセイン・インチオシアネート類、ジニトロフ
ェニルインチオシアネート類、フルオロジニトロベンゼ
ン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピオチン、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルジニトロベンゾエート、イソ
チオシアネート類、例えばアミノブチルエチルイソルミ
ノールインチオシア不一トなど、カルボキシフルオレセ
インの活性エステル、ローダミン、ビオチン付加物、シ
オキセクン類、ジオキサミド類、カルボキシアクリジン
類、炭水化物などが含まれる。

更に、オリゴヌクレオチド生成物が、Ｒが１またはそれ
以上のカルボン酸を含んでいる修飾された塩基を含有し
ている場合は、例えば１級アルキルアミン類と緩和に縮
合させてアミド結合を生成させ得る。典型的には、これ
は、望ましくは水性溶媒中、オリゴヌクレオチドを、１
級アミンを含有している過剰のリポータ−グループと、
水溶性カルボジイミドの様な適当な縮合剤の存在下で、
約−２０°Ｃ〜５０°Ｃ（好ましくは２０℃〜４０°Ｃ
）の範囲の温度で、６〜７２時間反応させて行なうのが
好都合である。この種の好ましいリポータ−グループに
は、（アミノアルキル）−アミノ−ナフタレン−１，２
−ジカルボン酸ヒドラジド類、アミノ−フルオレセイン
類、アミノローダミン類、アミノアルキルルミノール類
、アミ／アルキルアミノベンゼンスルホニル付加物、ア
ミノ糖類などが含まれる。更に、最初のオリゴヌクレオ
チド生成物の化学合成を、置換基がその様なリポータ−
グループを含んでいる修飾されたヌクレオチドモノマー
を用いて行なってもよい。その様なグループをマスクす
る必要がある場合には、カップリング反応の間に適当に
マスクされる。一方、ある種のリポータ−グループはマ
スキングを必要としない。例えば、マスキングされてい
ないニトロフェニル付加物は、カップリング反応中、悪
影響を受けることなく修飾されたヌクレオチドモノマー
上に存在し得る。

本発明方法で使用されるリポータ−グループは、通常芳
香族系、多芳香族系、環系、および多環系の有機部分を
含んでおり、これは更に、窒素、酸素、硫黄の様なヘテ
ロ原子を含むことによって官能化されているものである
。

オリゴヌクレオチド生成物は１つのタイプ以上の修飾、
または１つ以上の修飾された塩基を含むことができる。

このタイプのオリゴヌクレオチドの例は、以下の構造式
で示されるものである：上記式中　Ｃｌ″′は５−（３
−アミ／プロピル）シトシン、 Ｕ″′は５−［Ｎ−（４−アミノブチル）−１−アクリ
ルアミド］ウラシル、そして Ａ′″は８−［６−２，４−ジニトロフェニル）−アミ
ノヘキシルコアミノアデニンである。この生成物を更に
フルオレセイン・インチオシアネートと反応させて修飾
し、Ｃ１およびＵ”上にフルオレセインリポータ−グル
ープを付与する。

この様なオリゴヌクレオチド生成物は、本発明方法によ
って可能となったオリゴヌクレオチド生成物中の修飾さ
れた、および修飾されていないヌクレオチド単位の選択
の多様性を示している。より詳細に述べると、この様な
オリゴヌクレオチドは、同じか、または異なったタイプ
のリポータ−グループ機能を提供する置換基によってそ
の塩基が修飾されている１種以上のヌクレオチド単位を
用いる例を示している。また、その塩基が、リポータ−
グループが結合している置換基によって修飾されている
単位、即ちＣ′″およびＵ′″が例示されており、一方
Ａ″″は、その塩基が、それ自体にジニトロフェニル基
を含んでいるがためにリポータ−グループとして機能し
得る置換基によって修飾されている単位の例である。更
にこの様なオリゴヌクレオチドは、それが同じタイプの
１以上のヌクレオチド単位を含有し得ること、および修
飾された塩基を持った単位と混合した、非修飾塩基を持
った単位を含有し得ることを示している。

反応６に示した様に、置換基の１級アミンにリポータ−
グループを結合させる代りに、２者択一的にこの様なア
ミンまたはその他の基を、適当に活性化された固形担体
に結合させることができる。

こうすることによって、修飾された塩基を介してその様
な担体に共有結合している一定のオリゴヌクレオチド配
列が得られる。この様な固形担体は、相捕的な核酸成分
の検出および単離に有用である。

あるいはまた、修飾されたヌクレオシドモノマーを、鎖
伸長カップリング反応４の前に固形担体とカップリング
させ、それによってカップリング反応中にその様なモノ
マーのための固形担体を提供してもよい。

当業者が本発明を実施し得る様に、以下に具体的な実施
例を挙げる。この実施例は本発明の範囲を制限するもの
と解釈してはならず、単に本発明の例示であり、代表例
であると解釈すべきである。

構造を明らかにする為に、前記の工程の図式を参照する
とよい。

実施例１ この実施例では修飾されたヌクレオシド前駆体、５−（
３−トリフルオロアセチルアミ／プロペニル）−２°−
デオキシウリジンの合成について説明する。

５−クロロマーキュリー−２°−デオキシウリジン（３
，６ｇ、７　、８　ｍｍｏｌ）をメタノール２００村に
懸濁する。Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミド（６、
８ｘＱ、　５５　ｍ＋ｍｏｌ）を加え、次いでメタノー
ル中の０．２Ｎリチウムテトラクロロパラジウム酸塩４
１村を加える。室温で１８時間撹拌した後、この反応物
を重力濾過して黒色固型のパラジウムを除去し、黄色の
メタノール性濾妓を２００ｏづつのホウ水素化ナトリウ
ムで５回処理し、次いで減圧濃縮して固型の残留物を得
る。残留物をシリカゲル上フラッシュ・カラムクロマト
グラフィーにかけ、１クロロホルム中のメタノール１５
容１１％混液で溶離して精製する。生成物が適当に精製
されている画分を合わせて減圧濃縮し、５−（３−トリ
フルオロアセチルアミ７ブロベニル）−２’−デオキシ
ウリジンの結晶２．４９を得る。ＵＶλｍａｘ２９１ｎ
ｍ（６７８００）、１ｍ１ｎ２６６ｎｍ（ｇ　４４００
）；ＴＬＣ（シリカ、クロロホルム中メタノール１５容
量％溶液で溶離）Ｒｆ＝０．４゜実施例■ この実施例で修飾されたヌクレオシド前駆体５−［Ｎ−
（トリフルオロアセチルアミノヘプチル）−ｌ−アクリ
ルアミド］−２′−デオキシウリジンの合成について説
明する。

５−クロロマーキュリー−２°−デオキシウリジン（３
，６９，７、８ｍｍｏ１）をメタノール２００１１２に
懸濁する。Ｎ−（７−トリフルオロアセチルアミノヘプ
チル）−アクリルアミド（５５ｍｍｏｌ）を加え、次い
でメタノール中の０．２Ｎリチウムテトラクロロパラジ
ウム酸塩４１！を加える。室温で１８時間撹拌した後、
この反応物を重力濾過して黒色固型のパラジウムを除く
。黄色のメタノール性濾液を２００Ｒｇづつのホウ水素
化ナトリウムで５回処理し、次いで減圧濃縮して固型の
残留物を得る。残留物をシリカゲル上フラッシュ・カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム中のメタノ
ール１０容量％混液で溶離して精製する。生成物が適当
に精製されている画分を合わせて減圧濃縮し、５−［Ｎ
−（７−１−リフルオロアセチルアミノへブチル）−１
−アクリルアミド］−２’−デオキシウリジンの結晶２
．８ｇを得る。ＵＶλｍａｘ３０２ｎｍ（ε１８０００
）、１ｍ１ｎ２３０　ｒｕｎ、　２８Ｏｎｌｌ：ＴＬＣ
（シリカ、クロロホルム中メタ／−ル１５容量％混液で
溶離する）Ｒｆ＝０．３゜実施例■ この実施例では、反応で示した如く、５°−ジメトキシ
トリチル−５−（３−１−リフルオロアセチルアミノプ
ロペニル）−２′−デオキシウリジンの製造のための、
５°−ヒドロキシのマスキングについて説明する。

５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペニル）−
２°−デオキシウリジン（２，４９）を２回、ヒｒＪジ
ンから完全に蒸発させ、次いでビワジン４０ＲＱ中で撹
拌する。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）クロライド（２
，３ｇ、６　、６　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室
温で４時間撹拌する。薄層クロマトグラフィー（シリカ
上、クロロホルム中のメタノールｌＯ容量％混液で溶離
する）によって反応の完了を確認した後、この反応物を
濃縮して残留固型物を得る。この残留物をシリカ上カラ
ムクロマトグラフィーにかけ、流速の速い不純物をクロ
ロホルムで全て溶離してしまってから、生成物をクロロ
ホルム中のメタノール５容量％混液で溶離する。

次いでこの残留物を濃縮し、５°−ジメトキシトリナル
−５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペン−１
−イル）−２’−デオキシウリジンを、白色のふわふわ
した（毛羽立った）固型物（４ｇ）として得る。この生
成物は熱時分解する；Ｕ■λＩＩｌａＸ２９１ｎｍ、１
ｍ１ｎ２６６　ｎｍ；Ｔ　Ｌ　Ｃ（シリカ、クロロホル
ム中メタノール１０容量％混液で溶離する）：Ｒ「値０
．６である。

実施例■ この実施例では５′〜ジメトキシトリチル−５−（３−
トリフルオロアセチルアミノプロピル）−２゛−デオキ
シウリジンを得るための、環外二重結合に対する水素添
加、並びに５”−ヒドロキシのマスキングについて説明
する。

実施例Ｉおよび■のヌクレオシド前駆体の合成、並びに
５°−ヒドロキシマスキングを繰返す［ただし、ＤＭＴ
クロライドの添加前に、精！ｌ！５−（３−トリフルオ
ロアセチルアミノブロペニル）−２゜デオキシウリジン
をメタノール中、１０％パラジウム−炭素触媒上、室温
で撹拌しながら２大気圧の水素で処理するコことにより
、５°−ジメトキシトリチル−５−（３−１−リフルオ
ロアセチルアミノプロピル）−２゛−デオキシウリジン
を製造する。

実施例■から■においては、その他の修飾されたウラシ
ルヌクレオシドの合成、次いで、反応２で示したヒドロ
キシのマスキングについて説明する。

実施例■ Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミドを下記の化合物群
（番号上〜ｆｌ）に置き換え、実施例■および■の操作
を繰返してヌクレオシド前駆体の合成、ならびに５°ヒ
ドロキシのマスキングを行ない、それぞれに対応する下
記の化合物群（番号、１’−８’）を得る：すなわち、
以下の化合物に置き換える： １　　Ｎ”−（３−ブテニル）トリクロロアセトアミド
２　　Ｎ−（５−へキセニル）トリフルオロアセトアミ
ド ３　　Ｎ−（２−メチル−２−プロペニル）トリフルオ
ロアセトアミド ４　　Ｎ−（４−エチニルフェニルメチル）トリフルオ
ロアセトアミド ５　　Ｎ−（１−メチル−３−ブテニル）トリフルオロ
アセトアミド ６　　Ｎ−（１２−１−リクロロアミノドデシル）アク
リルアミド ７　　Ｎ−（ペルトリフルオロアセチルポリリシル）ア
クリルアミド ８　　Ｎ−（３−トリフルオロアセチルアミドプロピル
）アクリルアミド、そして以下の化合物を得る： １’　　５°−ジメトキシトリチル−５−（４−）リク
ロロアセチルアミノブテン−１−イル）−２’−デオキ
シウリジン ２゛　５°−ジメトキシトリチル−５−（６−）リフル
オロアセチルアミノヘキセン−１−イル）−２°−デオ
キシウリジン 旦゛　５°−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフル
オロアセチルアミノ−２−メチルプロペン−１−イル）
−２°−デオキシウリジン ４゛　５°−ジメトキシトリチル−５−［２−（４−ト
リフルオロアセチルアミノメチルフェニル）エテノ−１
−イル］−２°−デオキシウリジン５°　５°−ジメト
キシトリチル−５−（４−トリフルオロアセチルアミノ
−４−メチルブテン−１−イル）−２°−デオキシウリ
ジン ６′　５′−ジメトキシトリチル−５−［Ｎ−（１２−
トリクロロアセチルアミノドデシル）−１−アクリルア
ミド］−２’−デオキシウリジン７°　５°−ジメトキ
シトリチル−５−［Ｎ−（ペルトリフルオロアセチルポ
リリシル）−１−アクリルアミド］−２°−デオキシウ
リジン ８°　５°−ジメトキシトリチル−５−［Ｎ−（３−ト
リクロロアセチルアミ／プロピル）−アクリルアミド］
−２°−デオキシウリジン 実施例■ ５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペニル）−
２゛−デオキシウリジンを下記の５−置換−２°−デオ
キシウリジン類（番号、旦〜上旦）に置換え、実施例■
の５゛ヒドロキシのマスキング操作を繰返すことにより
、下記の生成物群（９’〜１）を製造する。即ち、以下
の化合物に置き換える： ９５−（プロペン−１−イル）−２°−デオキシウリジ
ン １０　５−（カルブメトキシエチル）−２゛−デオキシ
ウリジン １１　５−（３−カルブメトキシプロパン）−１−イル
）−２°−デオキシウリジン １２　５−（４−カルブメトキシ−２−メチルブテン−
１−イル）−２°−デオキシウリジン１３　５−（３−
シアノプロペン−１−イル）−２゛−デオキシウリジン １４　５−（４−シアノ−２−メチルブテン−］−イル
）−２°−デオキシウリジン ｒｓ　　５−［２−（４−カルブメトキシフェニル）エ
テンーｌ−イルコー２°−デオキシウリジン１６　５−
（４−アセトキシブテン−１−イル）−２°−デオキシ
ウリジン １７　５−（４−アセトキシブタン−１−イル）−２°
−デオキシウリジン、そして以下の５′−ジメトキシト
リチル−５−アルキル−２°−デオキシウリジン類を得
る： ９°　５°−ジメトキシトリチル−５−（プロペン−ｌ
−イル）−２′−デオキシウリジンｌＯ″　５”−ジメ
トキシトリチル−５−（２−カルブメトキシエチル）−
２′−デオキシウリジン１１’　　５°−ジメトキシト
リチル−５−（３−カルブメトキシプロパン−１−イル
）−２°−デオキシウリジン １２°　５°−ジメトキシトリチル−５−（４−カルブ
メトキシ−２−メチルブテン−１−イル）−２゜−デオ
キシウリジン １３°　５゛−ジメトキシトリチル−５−（３−シアノ
プロペン−１−イル）−２°−デオキシウリジン１４’
　　５’−ジメトキシトリチル−５−（４−シアノ−２
−メチルブテン−１−イル）−２°−デオキシウリジン １５”　５°−ジメトキシトリチル−５−［２−（４−
カルブメトキシフェニル）エテノ−１−イル）−２−デ
オキシウリジン １６°　５°−ジメトキシトリチル−５−（４−アセト
キシブテン−１−イル）−２”−デオキシウリジン １７°　５”−ジメトキシトリチル−５−（４−アセト
キシブタン−１−イル）−２°−デオキシウリジン １８゛５°〜ジメトキシトリチル−５−［４−（２゜４
−ジニトロフェニル）ブチル］−２’−デオキシウリジ
ン 実施例■ ５−クロロマーキュリー−２゛−デオキシウリジンを５
−クロロマーキュリ−ウリジンで置き換えて実施例１−
Ｖｌのヌクレオシド前駆体の合成および５°−ヒドロキ
シのマスキング法を繰返して行なうことにより、対応す
る５′−ジメト牛シトリチルー５−置換ウリジン類を製
造する。

実施例■−℃は修飾されたシトシンヌクレオシドの合成
を例示するものである。シトシンヌクレオシド類は、ア
デノシンヌクレオシド類と同様に、ウラシルヌクレオシ
ド類と異なり、塩基部分の上に反応性基を持っているの
で、その様な反応性基を、望ましくない反応から防御す
るためにマスクする。これらの実施例では、反応２にお
ける５“−ヒドロキシのマスキングと同様、反応ｌで示
したシトシンの塩基部分にある反応性基のマスキングに
ついて説明する。

実施例■　５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロ
ペニル）−Ｎ’−ベンゾイル−２’−ｆ’ｔキシシチジ
ン ５−クロロマーキュリー−２°−デオキシウリジンを５
−クロロマーキュリー−２°−デオキシシチジンで置換
え、実施例Ｉのヌクレオシド前駆体の合成方法を繰返し
て行ない５−（３−トリフルオロアセチルアミノプロペ
ニル）−２°−デオキシシチジン（ＵＶλＩＩＩａに２
８７　ｒ＋ｍ）を製造する。精’１２５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノプロペニル）−２°−デオキシシ
チジン（１，３９，４，６開ｏｆ）を無水エタノール８
０ｊ１１２中で撹拌し、無水ベンゾイル（１，５９，７
ｍｍｏｌ）を加え、この反応物を還流させる。更に、１
．５ｇづつの無水ベンゾイルを１時間毎に５回加える。

薄層クロマトグラフィー［シリカプレート、ｎ−ブタノ
ール／メタ７−ル／；＃ＮＨ，ＯＨ／水（６’Ｏ：２０
　：　ｌ　：２０）で溶離するコにより反応の終了を判
定した後（６−１ｏ時間の間）、この反応混合物を冷却
し、減圧濃縮して半固型物を得る。この固型物をエーテ
ルと共に３回こね、デカントし、乾燥する。この粗生成
物を水から再結晶し、クロマトグラフ的に純粋なＮ４−
ベンゾイル−５−（３−トリフルオロアセチルアミノプ
ロペニル）−２°−デオキシシチジンを白色固型物とし
て得る。この生成物は１２０℃以上で分解する；Ｕ　Ｖ
　ｍａｘ＝　３１１　ｎｍｃ＋実施例ＩＸ５’−ジメト
キシトリチル−５−（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロペニル）−Ｎ’−ベンゾイルー２°−デオキシシチ
ジン５−（３−トリフルオロアセチルアミ／プロペニル
）−２′−デオキシウリジンを５−（３−１−リフルオ
ロアセチルアミノプロペニル）−Ｎ’−ベンゾイル−２
°−デオキシシチジンで置換え、実施例［Ｉ［の５゛−
ヒドロキシのマスキング操作を繰返すことにより、５°
−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフルオロアセチ
ルアミノブロペニル）−Ｎ’ベンゾイル−２゛−デオキ
シシチジンを製造する。

実施例Ｘ Ｎ−アリルトリフルオロアセトアミドを実施例■のＮ−
アルキルトリフルオロアセトアミド類に置き換え、実施
例■およびＩＸのヌクレオシド前駆体の合成および５゛
ヒドロキシのマスキング操作を繰返すことにより、対応
する５゛ジメトキシトリチル−５−いりフルオロアセチ
ル）アミノアルキル）−Ｎ’−ベンゾイル−２°−デオ
キシシチジン類を製造する。すなわち、以下の化合物群
である。

５°−ジメトキシトリチル−５”−（４−）リフルオロ
アセチルアミノブテン−１−イル）−Ｎ’−ベンゾイル
−２゛−デオキシシチジン ５°−ジメトキシトリチル−５−（６−トリフルオロア
セチルアミノヘキセンー１−イル）−Ｎ　’−ベンゾイ
ルー２°−デオキシシチジン ５°−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフルオロア
セチルアミノ−２−メチルプロペン−ｌイル）−Ｎ’−
ベンゾイル−２゛−デオキシシチジン ５゛−ジメトキシトリチル−５−［２−（４−トリフル
オロアセチルアミノメチルフェニル）エテンー■−イル
］−Ｎ４−ベンゾイル−２゛−デオキシシチジン ５°−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフルオロア
セチルアミノ−４−メチルブテン−１−イル）−Ｎ’−
ベンゾイル−２′−デオキシシチジン５°−ジメトキシ
トリチル−５−［Ｎ−（１２−トリフルオロアセチルア
ミノドデシル）−１−アクリルアミド］−Ｎ’−ベンゾ
イル−２゛−デオキシシチジン ５゛−ジメトキシトリチル−５−［Ｎ−（ペルトリフル
オロアセチルポリリシル）−１−アクリルアミド］−Ｎ
４−ベンゾイル−２°−デオキシシチジン 実施例ＸＩ　　５°−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベン
ゾイル−５−（２−カルブメトキシエチニル）−２°−
デオキシシチジンの合成 ５−（２−カルブメトキシエチニル）−２°−デオキシ
シチジン（０，８２９，２，６開ｏｆ）を無水エタノー
ル５０１Ｑ中で撹拌する。無水安息香酸（５００即、２
．２ｍ＋ｍｏｌ）を加え、この反応物を加熱還流させる
。更に、５００ｘＬｉづつの無水安息香酸を■時間毎に
５回加える。薄層クロマトグラフィーで反応の完了を判
定した後（通常、６−８時間）、この反応物を冷却し、
減圧蒸留して黄色の半固型物質を得る。シリカゲルを用
いたクロマトグラフィーにかけ、メタノール／クロロホ
ルムの１：１９からｌ：３に至る直線的な割合の混合物
で溶離し、適当な画分を合わせて蒸発させることにより
Ｎ４ベンゾイル−５−（２−カルブメトキシエチニル）
−２゛−デオキシシチジンの無晶形の白色固形物質とし
て得る。ＵＶλｍａｘ２９６　ｎｍ、λｍ１ｎ２７０ｎ
ｒｒ１０この固型物を完全に乾燥させ、ピリジン２０Ｒ
Ｑに溶かす。ジメトキシトリチルクロライド（１１当量
）を加え、この反応物を周囲温度で６時間撹拌する。濃
縮して固型物を得、次いでこれをシリカゲル上カラムク
ロマトグラフィーにかけ、クロロホルム中のメタノール
１０％混液で溶離して５′−ジメトキシトリチル−Ｎ４
−ベンゾイル−５−（２−カルブメトキシエチニル）−
２°−デオキシシチジンを、灰色がかった白色のふわふ
わした固型物として得る。

実施例Ｍ ５−（２−カルブメトキシエチニル）−２°−デオキシ
シチジンを下記の化合物群（番号上旦カら２１−まで〉
で置き換え、実施例Ｍのヌクレオシド前駆体の合成法を
繰返して行なうことにより、それぞれ対応する下記の化
合物群（番号ユ゛から２ヱ°まで）を得る。即ち、次の
化合物群で置き換える； １９　５−（２−カルブメトキシエチル）−２°−デオ
キシシチジン ２０　５−（３−カルブメトキシプロパン−１−イル）
−２°−デオキシシチジン ２１　５−（４−カルブメトキシ−２−メチルブテン−
１−イル）−２゛−デオキシシチジン２２　５−（３−
シアノプロペン−１−イル）−２′−デオキシシチジン ２３　５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−イル
）−２゛−デオキシシチジン ２４　５−［２−（４−カルブメトキシフェニル）エテ
ノ−１−イル）−２°−デオキシシチジン２５　５−（
４−アセトキシブテン−１−イル）−２゛−デオキシシ
チジン ２６　５−（４−アセトキシブタン−１−イル）−２デ
オキシシチジン ２７　５−［４−（２，４−ジニトロフェニル）ブチル
コ２“−デオキシシチジン そして次の５゛−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイ
ル−５−アルキル−２゛−デオキシシチジン類を得る： １９°　５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（２−
カルブメトキシ上テン−ｌ−イル）−２′−デオキシシ
チジン ２０°　５′−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−
カルブメトキシプロパン−１−イル）−２°−デオキシ
シチジン ２１’　　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（４
−カルブメトキシ−２−メチルブテン−１−イル）−２
°−デオキシシチジン ２２゛５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−シ
アノプロペン−１−イル）−２’−デオキシシチジン ２３°　５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（４−
シアノ−２−メチルブテン−１−イル）−２°−デオキ
シシチジン ２４°　５°−ＤＭＴ−Ｎ◆−ベンゾイル−５−［２−
（４−カルブメトキシフェニル）エテノ−ｌ−イル）−
２°−デオキシシチジン ２５°　５°−ＤＭＴ−Ｎ◆−ベンゾイル−５−（４−
アセトキシブテン−１−イル）−２°−デオキシシチジ
ン ２６゛５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブタン−１−イル）〜２°−デオキシシチジン ２７’　　５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−［４
−（２，４−ジニトロフェニル）ブチル］−２°−デオ
キシシチジン 同様に、その他の酸無水物、例えば無水酢酸、アニソイ
ル無水物またはトリル無水物を用いることにより、実施
例Ｘおよび℃において、ベンゾイルがアセチルまたはア
シルで置き換えられてた形のＮ４−アシルまたはＮ４−
アセチル−５−アルキル−２゛−デオキシシチジンが、
それぞれ、製造される。

実施例Ｘ■ ５−クロロマーキュリー−２°−デオキシシチジンを５
−クロロマーキーリーシチジンに置換え、実施例■から
Ｘのヌクレオシド前駆体の合成法および５°−ヒドロキ
シのマスキング法を繰返すことにより、対応する５°−
ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−５−置換シチ
ジン類を製造する。

実施例Ｘ［Ｖ この実施例は、アデニンヌクレオシドの反応性塩基部分
のマスキングおよび５°ヒドロキシのマスキングを例示
するものである。

Ｎ８−ベンゾイル−８−（６−アミノヘキシル）アミノ
−２′−デオキシアデノシン（４ｍｍｏｌ）を無水エタ
ノール６０ｘＱ中で撹拌する。トリフルオロ酢酸無水物
（６ｍｏ＋ｏｌ）を加え、この反応物を室温で撹拌する
。更に１時間毎にトリフルオロ酢酸無水物を、２部加え
る。４時間後、反応物を濃縮して固型残留物を得、これ
を−夜凍結乾燥する。このＮ６−ペンゾイルー８−（６
−１−リフルオロアセチルアミノヘキシル）アミノ−２
°−デオキシアデノシン粗生成物を完全に乾燥し、２回
、ピリジン中から固型残留物になるまで濃縮する。この
固型物質を撹拌下、ピリジン４０１ｔＱに入れ、ジメト
キシトリチルクロライド（６，５ｍｍｏｌ）を加える。

４時間後、反応物を濃縮して固型残留物を得る。これを
シリカゲル上、カラムクロマトグラフィーにかけ、クロ
ロホルム中のメタ７−ル含量がＯから１５％の間である
多段グラデイエンド溶離を行ない、５°−ジメトキシト
リチル−Ｎ８−ベンゾイル−８−（６−トリフルオロア
セチルアミノヘキシル）アミ／−２’−デオキシアデノ
シンを灰白色の固型物として得る。

実施例ｘ■からＸ■は、図表の反応３の如く、５゛位が
マスクされた５−置換−ヌクレオシドおよび天然起源の
ヌクレオシドを活性化して、各々対応するホスホモノク
ロリグイト類（ｐｈｏｓｐｈｏＩＩｉｏｎ。

ｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅｓ）とすることに関する。

実施例ＸＶ　　５°−ＤＭＴ−５−（３−１−リフルオ
ロアセチルアミノプロパン−ｌ−イル）−２’−デオキ
シウリジンの３′−ホスホモノクロリダイトの製造 乾燥５’−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチルア
ミノプロパン−１−イル）−２°−デオキシウリジン（
１，５４９，２、２ｍｍｏｌ）を、残留する水および溶
媒を除去するために、いずれも１２時間以上を要して３
回、ベンゼン２０籾中から凍結乾燥する。得られた非常
にふわふわした白色粉末を、減圧下のままで窒素雰囲気
中に移し、２，６−ルチジンを５容量％含有する無水ア
セトニトリル中に、最終濃度が３０１！１Ｍとなる様に
溶かす。窒素雰囲気下、激しく撹拌しながらメチルホス
ホジクロリダイＩ−（１，０当量）の巨大丸薬を迅速に
シリンジ（注射器）で加える。この反応物を窒素雰囲気
下、約１分間流巻き状に操作する。次いで、得られた粗
５°−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロパン−１−イル）−２°−デオキシウリジン３′−
メチルホスホモノクロリダイトの反応溶液を、更に精製
することなく、デオキシオリゴヌクレオチドの合成（実
施例Ｘ■〉にそのまま用いる。この物の”Ｐ−ＮＭＲ（
ＣＨ，ＣＮ／ＣＤＣ１３）は、通常、４０　７０ｍｏ１
％が所望の生産物であることを示している（１６７．５
ｐｐｍ）。残りは、ビス−３゛、３°−［５’ＤＭＴ−
５−（３−トリフルオロアセチルアミ／プロパン−１−
イル）−２’−デオキシウリジリルコメチルホスファイ
ト（１４０ｐｐｍ）と、５”−ＤＭＴ−５−（３−トリ
フルオロアセチルアミノプロパン−１−イル）−２’−
デオキシウリジン３°−メチルホスホネート（９、５ｐ
ｐｍ）で構成され、この後者の化合物は、反応系中の水
の存在を反映した量だけ生成される。

実施例ＸＶＩ　　天然起源の２゛−デオキシヌクレオシ
ドの３°−ホスホモノクロリグイト類の製造５°−ＤＭ
Ｔ−５〜（３−トリフルオロアセチルアミノプロパン−
１−イル）−２’−デオキシウリジンを、 ５’−ＤＭＴ−２’−デオキシチミジン５°−ＤＭＴ−
Ｎ’−ベンゾイル−２°−デオキシシチジン ５°−ＤＭＴ−Ｎ”−ベンゾイル−２°−デオキシアデ
ノシン ５’−ＤＭＴ−Ｎ”−イソブチリル−２°−デオキシグ
アノシン で置換え、実施例Ｘ■の操作を繰返すことにより、下記
の対応するホスホモノクロラダイト類を製造する。即ち
、 ５’−ＤＭＴ−２’−デオキシチミジン３°−メチルホ
スホモノクロリダイト ５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−２′−デオキシシチ
ジン３°−メチルホスホモノクロリダイト５’−ＤＭＴ
−Ｎ”−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン３“−
メチルホスホモノクロリダイト ５’−ＤＭＴ−Ｎ”−イソブチリル−２°−デオキシグ
アノシン３°−メチルホスホモノクロリダイト 実施例Ｘ■ メチルホスホジクロリダイトを、０−クロロフェニルホ
スホジクロリダイトで置き換え、実施例Ｘ■およびＸ■
のホスホモ／クロリグイトの合成法を繰返すことにより
、対応する５“−ＤＭＴ−ヌクレオシド３°−ホスホモ
ノクロラダイト類、即ち、 ５’−ＤＭＴ−５−（３−ｈリフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２’−デオキシウリジン３°−０クロロフ
エニルホスホモノクロリダイト５°−ＤＭＴ−２’−デ
オキシチミジン３°−ｏ−クロロフェニルホスホモノク
ロリダイト、５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−２°−
デオキシシチジンａｌ−〇−クロロフェニルホスホモノ
クロリダイト ５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−２゛−デオキシアデ
ノシン−３′−〇−クロロフェニルホスホモノクロリダ
イト ５°−ＤＭＴ−Ｎ”−イソブチリル−２゛−デオキシグ
アノシン３’−ｏ−クロロフェニルホスホモノクロリダ
イトを得る。

同様に、已−クロロフェニルホスホジクロリダイトを用
いることにより、類似物質の３′−ヒークロロフェニル
ホスホモノクロリダイト付加物が製造される。０−クロ
ロフェニルホスホモノクロリダイト生成物の［”Ｐ］Ｎ
ＭＲ（ＣＨ，ＣＮ　ＣＤＣｌ５）は、１６０．７．１６
０．５ｐｐｍ（ジアステレオマー）である。

実施例Ｘ■−ＸＸ■は、図表の反応４および５に示した
如く、修飾された塩基が組み込まれたオリゴヌクレオチ
ド類の化学合成を例示するものである。

実施例Ｘ■　５−（３−アミノプロピル）−ウラシルお
よび天然起源のヌクレオチド単位を含有するデオキシオ
リゴヌクレオチド類の合成デオキシオリゴヌクレオチド
合成の直前に、実施例Ｘ■およびＸＶＩのホスホモノク
ロリダイトの合成操作を行ない、その生成物をそのまま
無水アセトニトリル１５容量％２，６−ルチジン中に３
ＱｍＭの粗３°−メチルホスホモノクロリダイトを含ん
だものとして使用する。

固体の担体（５−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−２−デオ
キシアデノシン３゛−サクシンアミドブロピル・シリカ
２５０朽、２０μ当量）を適当な反応フロー容謂（ガラ
スまたはテフロン８製のカラムまたは漏斗）に入れる。

この固体担体は、予め、アセトニトリル１５容量％ルチ
ジン、テトラヒドロフラン／水／ルチジン中に沃素２ｗ
／ｖ％を含むもので２分間、アセトニトリル７５％ルチ
ジン、クロロホルム、クロロホルム中にジクロル酢酸を
４容量％含むもので２．５分間、モしてアセトニトリル
１５％ルチジンで順次処理して予めコンデイションを調
整しておく。この場合、各処理は所望に応じて総容ｆ１
５−１５１１１２を２または３回に分けて用いるかある
いは定常的に流すか、そのいずれでもよい。

デオキシオリゴヌクレオチドは反応４に従い、所望の活
性化された５°−ＤＭＴ−ヌクレオシド３°メチルホス
ホモノクロリダイトモノマーを連続的に添加し、伸長し
つつあるヌクレオチド鎖の端末単位（これは、最初、こ
の鎖の唯一の単位である。つまり、固体担体を含んでい
るデオキシアデノシンを塩基とする単位である。）の遊
離の５゜−水酸基にこれを結合させることで合成される
。

付加は、実施例Ｘ■およびＸ■の中から選択した３０ｍ
Ｍの粗モノクロリダイト１０村を、鏡上の脱保護された
ばかりの、５゛ヒドロキシと２〜３部づつに分けるか、
または定常的に流し、２〜６分間反応させることにより
行なう。１つの完全な試薬サイクルが後に続く所の最初
のホスホモ／クロリグイト付加は次の連続処理で構成さ
れるニー５°−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチ
ルアミノプロピル）−２°−デオキシウリジン３′メチ
ルホスホモノクロリダイト、 一アセトニトリル／ルチジン洗浄、 −無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフラン（ｌ：３　
：２）中０．３Ｍ４−ジメチルアミノピリジンにより５
分間キャッピングする、 アセトニトリル１５％ルチジン洗浄、 −テトラヒドロフラン／水／ルチジン（６：２：ｌ）中
２％沃素で２分間、酸化する、 −アセトニトリル１５％ルチジン洗浄、−クロロホルム
洗浄、 一りロロホルム中４容量％ジクロル酢酸で２゜５分間処
理してＤＭＴを除去する。

クロロホルム洗浄、 一アセトニトリル／ルチジン洗浄。

上記のサイクルを、各回毎に、５°−ＤＭＴ−５−（３
−トリフルオロアセチルアミノプロピル）２°−デオキ
シウリジン３゛−メチルホスホモノクロリダイトを下記
の３°−メチルホスホモノクロリグイト類の中の異なっ
たもので置換え、１３回繰返して行なう。ただし最終試
薬サイクルではジクロル酢酸処理は除外する： ５°−ＤＭＴ−２°−デオキシチミジン３゛−メチルホ
スホモノクロリダイト ５′−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２°−デオキシウリジン３゛メチルホスホ
モノクロリダイト ５°−ＤＭＴ−Ｎ”−ベンゾイル−２°−チオキシアデ
ノシン３°−メチルホスホモノクロリダイ５°−ＤＭＴ
−Ｎ’−ベンゾイル−２゛−デオキシシチジン３°−メ
チルホスホモノクロリダイト５°−ＤＭＴ−Ｎ”−イソ
ブチリル−２゛−デオキ／グアノシン３°−メチルホス
ホモノクロリダイト ５°−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２”−デオキシウリジン３°−メチルホス
ホモノクロリダイト ５’−ＤＭＴ−２°−デオキシチミジン３−メチルホス
ホモノクロリダイト ５°−ＤＭＴ−５＝（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２°−デオキシウリジン３°−メチルホス
ホモノクロリダイト、 ５’−ＤＭＴ−デオキシチミジン３′−メチルホスホモ
ノクロリダイト ５°−ＤＭＴ−５−（３−）リフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２゛−デオキシウリジン３′−メチルホス
ホモノクロリダイト ５　’　−Ｄ　Ｍ　Ｔ　　Ｎ　”−イソブチリル−２−
デオキシグアノシン３°−メチルホスホモノクロリダイ
ト ５°−ＤＭＴ−Ｎ＠−ベンゾイル−２°−デオキシアデ
ノシン３°−メチルホスホモノクロリダイト ５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−２゛−デオキシシチ
ジン３゛−メチルホスホモノクロリダイト担体を移し、
濃水酸化アンモニウム２ＭＱで、周囲温度において４時
間処理し、この担体から生成物を放出させる。上清を取
除き固型物を濃水酸化アンモニウム０．５３！１２で３
回洗浄し、これらの上清を合わせて密封し、−夜５０℃
で加熱する。透明な黄色の上清を完全に凍結乾燥する。

−吹精製は、ＲＰ−８（Ｃ−８）カラム上、ｐＨ６，８
の２５ｍ　Ｍ　酢酸アンモニウム中のアセトニトリルの
割合が０−３０容量％である様なグラデイエンド溶離（
６０分間）による、逆相高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）で行なう。約４０分後に鋭いピークを示して
溶離する５’−ＤＭＴ−末端化生成物を集める：もっと
短い鎖を持つものは、キャップされたものもされていな
いものも、共に２５分より以前に溶離してしまう。集め
た生成物を蒸留して固形残留物を得、これを８０％酢酸
で周囲温度において２０分間処理（ＤＭＴを除くため）
した後、凍結乾燥して固型物残渣を得、これを少量の水
性緩衝液に溶かす。生産物は一般に、ＨＰＬＣ後におい
て９０％以上の均質性がある。更に、これを通常の２０
％ポリアクリルアミドゲル（厚さｌ〜６　ｍｍ）上、電
気泳動にかけ、適当な生成物バンド（生成物は、通常、
同様の長さの修飾されていないデオキシオリゴヌクレオ
チド類よりもゆっくり泳動する）を切り取り、抽出する
ことにより、なお−層積製される。こうして製造された
精製（純化）５アミノプロピル−ウラシル−含有ペンタ
デカデオキシオリゴヌクレオチド生成物を以下に図式的
に示ス［図中Ｕ”＝５−（３アミノプロピル）ウラシル
］。

〇− 従来のアンモニアによるオリゴヌクレオチドの脱保護に
よれば、置換基上のマスキング基であるトリフルオロア
セチル基も除去されてしまったことに注目されたい。次
いで、このオリゴヌクレオチドの長さおよび配列の決定
を、適当なプロトコール（例えば、そのヌクレオチド単
位に含まれる塩基が修飾されていない様な、従来技術に
属するオリゴヌクレオチド類の長さおよび配列を決定す
るために既に用いられたプロトコール等）を利用して、
０Ｐ−キナーゼ法および配列決定により行なうことがで
きる。

同様に、本発明で採用したメチルホスホモノクロリダイ
ト付加物の順序および数を計画的に変化させることによ
り、選択された長さおよび塩基配列において異なる、他
の５−（修飾された）ウラシル−含有デオキシオリゴヌ
クレオチド類が製造される。また、実施例Ｘ■およびｘ
■のヌクレオシド３゛−メチルホスホモノクロリダイト
付加物を相当する実施例Ｘ■の３°−２−または２−ク
ロロフェニルホスホモノクロリダイト付加物に置換よる
と共に、クロロフェニル保護基を除くためにピリジニウ
ムオキシメート処理を行なう（デオキシオリゴヌクレオ
チド合成の終りであって、濃水酸化アンモニウム処理の
前）ことによっても、同じデオキシオリゴヌクレオチド
生成物が得られる。

実施例ＸｌＸ ５°−ＤＭＴ−５−（３−トリフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２゛−デオキシウリジンを下記の５°−ア
ルキル−２°−デオキシウリジン類（番号２旦−１旦）
で置換え、実施例ＸＶ−Ｘ■のホスホモノクロリダイト
およびデオキシオリゴヌクレオチドの合成法を繰返すこ
とにより、それぞれ対応する、ウラシル塩基Ｕｎを持つ
下記のオリゴヌクレオチド類（番号２８’−３６°）が
製造される。

即ち、下記の化合物に置き換えると： ２８°　５°−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノプロペン−１−イル）−デオキシ
ウリジン ２９５゛−ジメトキシトリチル−５−（４−１−リフル
オロアセチルアミノブタン−■−イル）−２’デオキシ
ウリジン ３０５°−ジメトキシトリチル−５−（４−トリフルオ
ロアセチルアミノブテン−１−イル）−２゜デオキシウ
リジン ３１　５°−ジメトキシトリチル−５−（６−１リフル
オロアセチルアミノへ牛サンー１−イル）−２”−デオ
キシウリジン ３２５゛−ジメトキシトリチル−５−（６−１リフルオ
ロアセチルアミノヘキセン〜ｌ−イル）−２゜−デオキ
シウリジン ３３５°−ジメトキシトリチル−５−（２−１−リフル
オロアセチルアミノプロパン−２−イル）−２’−デオ
キシウリジン ３４５°−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフルオ
ロアセチルアミノ−２−メチル−プロペン−１−イル）
−２′−デオキシウリジン ３５５゛−ジメトキシトリチル−５−（３−トリフルオ
ロアセチルアミノ−２−メチル−プロパン−１−イル）
−２′−デオキシウリジン ３６５°−ジメトキシトリチル−５−［２−（４トリク
ルオロアセチルアミノメチルフエニル）エテノ−１−イ
ル）−２°−デオキシウリジン３７５°−ジメトキシト
リチル−５−［Ｎ−（ペルトリフルオロアセチルポリリ
シル）−１−アクリルアミトコ−２°−デオキシウリジ
ン ３８５”−ＤＭＴ−５−［Ｎ−（７−１−リフルオロア
セチルアミノヘプチル）−１−アクリルアミド］−２°
−デオキシウリジン、 Ｕ′″が下記のものである実施例Ｘ■の生成物に相当す
るデオキシヌクレオチド類が製造される。

２ｇ’　　５−（３−アミノプロペン−１−イル）ウラ
シル ２９’　　５−（４−アミノブタン−１−イル）ウラシ
ル３０°　５−（４−アミノブテン−ｌ−イル）ウラシ
ル３１’　　５−（６−アミノヘキサン−ｌ−イル）ウ
ラシル ３２’　　５−（６−アミノヘキセン−１−イル）ウラ
シル ３３“　５−（３−アミノプロパン−２−イル）ウラシ
ル ３４’　　５−（３−アミノ−２−メチルプロペン−１
−イル）ウラシル ３５’　　５−（３−アミノ−２−メチルプロパン−■
−イル）ウラシル ３６°　５−［２−（４−アミノエチルフェニル）エテ
ンーｌ−イル］ウラシル ３７’　　５−［Ｎ−（ポリリシル）−１−アクリルア
ミトコウラシル ３８°　５−［Ｎ−（７−アミノブタン）−１−アクリ
ルアミトコウラシル。

同様に、他の５°−ＤＭＴ−５−（アシルアミノアルキ
ル）−２°−デオキシウリジン類を用いれば、類似のデ
オキシオリゴヌクレオチド類が製造される。

実施例ＸＸ ５’−ＤＭＴ−５〜（３−アセチルアミノプロピル）＝
２′−デオキシウリジンを下記の５−置換−２°−デオ
キシウリジン類（番号３７−４６）に置換えて実施例×
■〜Ｘ■のホスホモノクロリダイトおよびデオキシオリ
ゴヌクレオチドの合成法を繰返すことにより、それぞれ
、下記の対応する、Ｕ１ウラシル塩基を持ったオリゴヌ
クレオチド類（沿号１ヱ°−４旦°）を製造する。即ち
、次の化合物に置換える。

３７５°−ＤＭＴ−５−（プロペン−１−イル）−２′
−デオキシウリジン ３８５°−ＤＭＴ−５−（２−カルブメトキシエチル）
−２゛−デオキシウリジン ３９５°−ＤＭＴ−５−（３−カルブメトキシプロパン
−１−イル）−２°−デオキシウリジン４０５′−ＤＭ
Ｔ−５−（４−カルブメトキシ−２−メチルブテン−１
−イル）−２゛−デオキシウリジン ４１　５’−ＤＭＴ−５−（３−シアノプロペン−１−
イル）−２°−デオキシウリジン ４２５°−ＤＭＴ−５−（４−シアノ−２−メチルブテ
ン−１−イル）−２°−デオキシウリジン４３５°−Ｄ
ＭＴ−５−［２−（４−カルブメトキシフェニル）エテ
ノ−１−イル）−２“−デオキシウリジン ４４５°−ＤＭＴ−５−（４−アセトキシブテン−１−
イル）−２°−デオキシウリジン ４５　５’−ＤＭＴ−５−（４−アセトキシブタン−１
−イル）−２゛−デオキシリジン ４６５°−ＤＭＴ−５−［４−（２，４−ジニトロフェ
ニル）ブチル］−２’−デオキシウリジン。

モしてＵｌが以下のものである生成物を得る。

３７’５−（プロペン−１−イル）ウラシル３ｇ’　　
５−（２−カルボキシエチル）ウラシル３９°　５−（
３−カルボキシプロパン−１−イル）ウラシル ４０’　　５−（４−カルボキシ−２−メチルブテン１
−イル）ウラシル ４１’　　５−（３−シアノプロペン−１−イル）ウラ
シル ４２°　５−（４−シア／−２−メチルブテン−１−イ
ル）ウラシル ４３”　５−［２−（４−カルボキシフェニル）エテノ
−１−イル）ウラシル ４４°　５−（４−ヒドロキシブテン−１−イル）ウラ
シル ４５°　５−（４−ヒドロキシブタン−１−イル）ウラ
シル ４６°　５−［４−（２，４−ジニトロフェニル）ブチ
ル］ウラシル 注：４６′　は、直接リポータ−グループとして機能す
る、即ち、抗ジニトロフェニル抗体のリガンドとして用
い得る。同様に、他の適当な５°−ＤＭＴ−５−アルキ
ル−２゛−デオキシウリジン類を用いれば類似のデオキ
シオリゴヌクレオチド類が製造される。

実施例ＸＸｌ ５°−ＤＭＴ、−５−（３−トリフルオロアセチルアミ
ノプロピル）−２°−デオキシウリジンを５゜−ＤＭＴ
−Ｎ番−ペンゾイルー５−（３−トリクロロアセチルア
ミノプロピル）−２’−デオキシシチジンで置換え、実
施例ＸＶ−Ｘ■の操作を繰返すことにより、実施例ＸＸ
と同様（ただしＵ”［５（３−アミノプロピル）−ウラ
ジルコが５−（３−アミノプロピル）シトシン類で置換
えられた）、デオキシオリゴヌクレオチドが製造される
。例えば、式： （式中、Ｃ′″は５−（３−アミノプロピル）シトシン
を表わす） で示される化合物である。

実施例ｘｘｎ ５°−ＤＭＴ−Ｎ◆−ベンゾイル−５−（３−トリクロ
ロアセチルアミノプロピル）−２’−デオキシシチジン
を下記の化合物群（番号４７−５７）で置き換えて実施
例ＸＸ［のデオキシリボヌクレオチド合成法を繰返すこ
とにより、それぞれ、下記のＣ′″シトシン塩基類（番
号４７’−５７°）を持った、対応するオリゴヌクレオ
チド類が製造される。即ち、以下の化合物に置換える。

■　５−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−トリフ
ルオロアセチルアミノプロペン−１−イル）−２’−デ
オキシシチジン リ　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（４トリフ
ルオロアセチルアミノブタン−１−イル）−２°−デオ
キシシチジン ４９５°−ＤＭＴ−Ｎ◆−ベンゾイル−５−（４−トリ
フルオロアセチルアミノブテン−■−イル）−２°−デ
オキシシチジン 廷　５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（６−ドリ
フルオロアセチルアミノヘ牛サン−１−イル）＝２゛−
デオキシシチジン ５１　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（６−ト
リフルオロアセチルアミノヘキセンーｌ−イル）＝２°
−デオキシシチジン ５２　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−ト
リフルオロアセチルアミノプロパン−２−イル）＝２゛
−デオキシシチジン ５３５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−トリ
フルオロアセチルアミノ−２−メチルプロペン−１−イ
ル）−２°−デオキシシチジン５４　５’−ＤＭＴ−Ｎ
’−ベンゾイル−５−（３−トリフルオロアセチルアミ
ノ−２−メチルプロパン−１−イル）−２°−デオキシ
シチジン５５５°−ＤＭＴ’−Ｎ’−ベンゾイル−５−
［２−＜４−トリフルオロアセチルアミノメチルフェニ
ル）エテノ−１−イル］−２’−デオキシシチジン５６
５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−［Ｎ−（−ルト
リフルオロアセチルボリリシル）−１−アクリルアミド
］−２’−デオキシシチジン５７　５’−ＤＭＴ−Ｎ’
−ベンゾイル−５−［Ｎ−（１リフルオロアセチルアミ
ノへブチル）−アクリルアミトコ−２°−デオキシシチ
ジン。

モしてＣｍが次のものである生成物を得る。

４７°　５−（３−アミノプロペン−１−イル）シトシ
ン ４８’　　５−（４−アミツブクン−１−イル）シトシ
ン４９’　　５−（４−アミノブテン−１−イル）シト
シン５０’　　５−（６−アミノヘキサン−１−イル）
シトシン ５１’　　５−（６−アミ／ヘキセン−１−イル〉シト
シン ５２°　５−（３−アミノプロパン−２−イル）シトシ
ン ５３’　　５−（３−アミノ−２−メチルプロペン−１
イル）シトシン ５４°　５−（３−アミノ−２−メチルプロパン−１イ
ル）シトシン ５５°　５−［２−（４−アミノメチルフェニル）エテ
ノ−１−イル）シトシン ５６″　５−［Ｎ−（ポリリシル）−１−アクリルアミ
ド］シトシン ５７’　　５−［Ｎ−（７−アミｙヘプチル）−１−ア
クリルアミド］シトシン 同様に、他のＮ４−アシル−５−（アシルアミノアルキ
ル）−２゛−デオキシシチジン類を用いることにより、
類似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造される。

実施例ＸＸ■ ５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−）リフル
オロアセチルアミノプロピル）−２″−デオキシシチジ
ンを下記の化合物群（番号５８−６８）に置換えて実施
例ＸＸＩのデオキシオリゴヌクレオチド合成法を繰返す
ことにより、それぞれ下記のＣ″シトシン塩基類（番号
５８’−６８’）を持った、対応するオリゴヌクレオチ
ド類が製造される。即ち、次の化合物に置換える。

５８　５’−ＤＭＴ−Ｎ４−ベンゾイル−５−（プロペ
ン−１−イル）−２°−デオキシシチジン５９　５’−
ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（２−カルブメトキシ
エチル）−２゛−デオキシシチジン６０５°−ＤＭＴ−
Ｎ’−ベンゾイル−５−（２−カルブメトキシエテノ−
１−イル）−２°−デオキシシチジン ６１　５“−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３−カ
ルブメトキシプロパン−１−イル）−２“−デオキシシ
チジン ６２　５’−ＤＭＴ−Ｎ◆−ベンゾイル−５−（４−カ
ルブメトキシ−２−メチルブテン−１−イル）−２°−
デオキシシチジン ６３　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（３〜シ
ア／＼プロペン−１〜イル）−２°−デオキシシチジン ６４５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル〜５−（４−シア
ノ−２−メチルブテン−１−イル）−２°−デオキシシ
チジン ６５５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−［２−（４
−カルブメトキシフェニル）エテノ−１−イル］２゛−
デオキシシチジン ６６５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル〜５−（４−アセ
トキシブテン−１−イル）−２°−デオキシシチジン ６７　５’−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−（４−ア
セトキシブタン−１−イル）−２’−デオキシシチジン ６８５°−ＤＭＴ−Ｎ’−ベンゾイル−５−［４−（２
、４−ジニトロフェニル）ブチル］−２−デオキシシチ
ジン。

そして、Ｃ１が次のものである生成物を得る。

５８°　５−（プロペン−１−イル）シトシン５９°　
５−（２−カルボキシエチル）シトシン６０°　５−（
２−カルボキシエチル）−１−イル）シトシン ６１’　　５−（３−カルボキシプロパン−１−イル）
シトシン ６２’　　５−（４−カルボキシ−２−メチルブテンｌ
−イル〉シトシン ６３°　５−（３−シアノプロペン−１−イル）シトシ
ン ６４°　５−（４−シアノ−２−メチルブテン−１−イ
ル）シトシン ６５’　　５−［２−（４−カルボキシフェニル）エテ
ノ−１−イル）シトシン ６６’　　５−（４−ヒドロキシブテン−１−イル）シ
トシン ６７’　　５−（４−ヒドロキシブタン−１−イル）シ
トシン ６８“　５−［４−（２，４−ジニトロフェニル）ブチ
ル］シトシン 同様に、他の適当な５’−ＤＭＴ−Ｎ’−アシル−５−
アルキル−２゛−デオキシシチジン類を用いることによ
り、類似のデオキシオリゴヌクレオチド類が製造される
。

実施例ＸＸ■ ５’−ＤＭＴ−５−（３−）リフルオロアセチルアミノ
プロピル）−２°−デオキシウリジンを５゜−ＤＭＴ−
Ｎ’−ベンゾイル−８−（６−トリフルオロアセチルア
ミノヘキシル）アミノ−２゛−デオキシアデノシンで置
き換えて実施例ｘｖ−ｘｘｍのホスホモノクロリダイト
およびデオキシオリゴヌクレオチド合成法を繰返すこと
により、実施例Ｘ■と同様にデオキシオリゴヌクレオチ
ド類［ただし、ＵｌはＡ１で置換えられており、このＡ
１は８−（６−アミノ）キシル）アミノ−２°−デオキ
シアデノシンを表わす］を製造する。

実施例ｘｘｖ−ｘｘ■は、反応６で示される様に、適当
に修飾された塩基類を有するオリゴヌクレオチド類への
リポータ−基の結合を例示するものである。

実施例ＸＸｖ　フルオレセイン化デオキシオリゴヌクレ
オチド 式： ［式中、Ｕ′″は５−［Ｎ−（７−アミツヘブチル）１
−アクリルアミトコウラシルを表わす］で示される純化
ペンタデカ−ヌクレオチド（実施例Ｘ■から得たもの）
を、３０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ９，５の
３００ｍＭホウ酸ナトリウム水溶液または炭酸ナトリウ
ム緩衝液に、２５Ａ２６０単位／＊Ｑの割合で溶かす。

固型のフルオレツセインインチオシアネ−１−（０，５
＋９／ｘｃ）を加え、この混合物を密封し、４°Ｃ〜２
５°Ｃで一夜、ゆるやかに振盪する。この反応物を直接
Ｇ−５０Ｓ　ｅｐｈａｄｅに８カラムにかけて非結合−
フルオレッセイン添加物を分離する（このものは保持さ
れる）；フルオレツセイン化デオキシオリゴヌクレオチ
ド付加物は空容量付近で溶出する。顕著にＡ２６０単位
を含む初期の画分を合わせて凍結乾燥し、出発物質のペ
ンタデカデオキシオリゴヌクレオチドに類似した構造の
固型の生成物を得る。ただし、この場合、Ｕ’″は式： であるか、または未反応の５−［Ｎ−（７−アミツヘブ
チル）−１−アクリルアミド］ウラシルのいずれかであ
る。λｍａｘ（Ｈ，Ｏ）２６２ｎｍ、　４９８ｎｍ０実
施例ＸＩＸ、　ＸＸＩ、−ＸＸＩ［およびＸＸ■で述べ
た化合物群を用いてこの操作を行なえば、同様にして、
対応するフルオレセイン化されたまたはポリフルオレセ
イン化されたデオキシオリゴヌクレオチド類が製造され
る。

実施例ＸＸ■ フルオレセイン以外のレポーター基の結合は、フルオレ
セイン・イソチオシアネートを例えば下記の化合物に置
き換え、実施例ＸＸ■の操作を繰返し行なうことによっ
て達成し得る。それらの化合物群は、例えば ２．４−ジニトロフェニル・インチオシアネート １−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンアミノエチル
・イソルミノール・インチオシアネート アミノエチルアミノナフタレン−１，２−カルボキシリ
ック・ヒドラジッド・インチオシアネート Ｎ、Ｎ’−ビス（アルキルスルホニル）−Ｎ−アリール
−Ｎｏ−イソチオシアネートアリール−ジオキサミド ｍ−スルホニル・アニリン・インチオシアネート ９−（Ｎ−ヒドロ牛シサクシンイミジル）ビオチン ９−（Ｎ−ヒドロ牛シサクシンイミジル・カルボキシ）
−Ｎ−メチルアクリジン、または臭化シアン活性化Ｓ　
ｅｐｈａｒｏｓｅ”であり、これらによって、フルオレ
ラセン以外の基が結合した、対応する付加物を製造する
ことができる。

実施例ＸＸ■　イソルミノールおよび遊離の第１級アミ
ン−含有リポータ−グループの結合実施例Ｘ■から得た
式： ［式中　［Ｊ　Ｉ″は５−（２−カルボキシエチニル）
ウラシルを表わす］ で示される純化ペンタデカヌクレオチドを、水に３０Ａ
２６０単位／ｄの割合で溶かし、ｌ容量のピリジンで希
釈する。アミノブチルエチルイソルミノールを終濃度が
１　ｍｙ／　ｍ（ｌになる様に加え、次いで５倍モル過
剰量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カーポジイミドを加える。

この反応物を密封し、暗所で１２〜４８時間、ゆるやか
に振盪する。この反応混合物を減圧濃縮して固型残留物
を得、これをそのままＧ−５０Ｓ　ｅｐｈａｄｅに３カ
ラムでクロマトグラフする。イソルミノール−デオキシ
オリゴヌクレオチド連結物は、空容量付近で溶出する。

顕著にＡ２６０単位を含有している初期の画分を合わせ
て凍結乾燥し、出発物質のデオキシオリゴヌクレオチド
に類似した構造を有する固型生成物を得る。ただし、こ
の場合、Ｕ″は式： あるいは未反応の５−（２−カルボキシエチニル）ウラ
シルのいずれかである。

Ｒ９がカルボキシを含んでいる様な実施例Ｘ■およびＸ
Ｘ■の化合物群を用いてこの操作を行なえば、同様に、
対応するデオキシオリゴヌクレオチド−イソルミノール
が製造される。

また、アミノブチルイソルミノールをその他の遊離第一
級アミンを含むレポーター基で置換え、この操作を繰返
すことにより、同様にして相当するデオキシオリゴヌク
レオチド−レポーター付加物が製造される。

実施例ＸＸ■　ジニトロフェニルリポータ−クループの
結合 式： ［式中、Ａ″′は８−（６アミノヘキシル）アミノアデ
ニンを表わすコ で示される純化ノナヌクレオチドをｐＨ９の２５０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液に２０Ａ２６０単位／村の割合で
溶かし、■−フルオロー２．４−ジニトロベンゼンを加
える。この反応溶液を周囲温度で一夜振盪した後、直接
Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘｌＩＧ　−５０カラムにかけてクロ
マトグラフする。顕著にＡ２６０単位を含む初期の画分
を合わせて濃縮し、出発物質のデカヌクレオチドと類似
の構造を有するオリゴヌクレオチド生成物を得る。ただ
し、この場合、Ａ″″は式： で示されるか、あるいは未反応の８−（６−アミノヘキ
シル）アミ／アデニンである。

８−（６−アミ／ヘキシル）アミノアデニンをその他の
、遊離第一級アミンを含有する修飾された塩基で置換え
てこの操作を繰返し行なうことにより、同様に対応する
ジニトロフェニル化されたオリゴヌクレオチド付加物が
製造される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式； ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｂはピリミジン塩基またはプリン塩基であり、 Ｒは、着色、蛍光、発光もしくは放射活性グループまた
   はリガンド認識グループとして機能する少なくとも１個
   のリポーターグループまたは固形担体と既に結合してい
   るかまたはそれらと結合し得るリンカーアームであり、 Ｒ＿８はＨまたはマクスされたヒドロキシ基であり、 Ｒ＿４およびＲ＿５は、いずれか一方がマスキング基で
   あり、Ｒ＿４がマスキング基である場合、Ｒ＿５は、反
   応性のリン含有基であるかまたはＨであり、Ｒ＿５がマ
   スキング基である場合、Ｒ＿４は、反応性のリン含有基
   であるかまたはＨである］ で示される構造を有する、実質上純粋な一本鎖オリゴヌ
   クレオチドの化学合成における中間体として有用な反応
   性モノマー。 ２、式中、Ｒが、式： −ＣＨ＿２ＣＨＲ＿１ＣｎＨ＿２ｎＹ； −ＣＨ＝ＣＲ＿１ＣｎＨ＿２ｎＹ； −ＣＨＲ＿１ＣｎＨ＿２ｎＹ； ▲数式、化学式、表等があります▼；または ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１はＨまたはアルキルであり、ｎは０〜２
   ０であり、 Ｙは少なくとも１個のブロックされたアミノ基、ブロッ
   クされたカルボキシ基、ブロックされたヒドロキシ基も
   しくはブロックされたチオ基を含有するか、または少な
   くとも１個のリポーターグループまたは固形担体を含有
   するものである］で示される第１項に記載の活性モノマ
   ー。 ３、Ｒが立体的に耐容性のある部位に結合している第１
   項に記載の活性モノマー。 ４、Ｂがピリミジンである場合には、ＲはＣ５位に結合
   しており、Ｂがプリンである場合には、ＲはＣ８位に結
   合している、第１項に記載の活性モノマー。