JPH0387200A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH0387200A JPH0387200A JP1225276A JP22527689A JPH0387200A JP H0387200 A JPH0387200 A JP H0387200A JP 1225276 A JP1225276 A JP 1225276A JP 22527689 A JP22527689 A JP 22527689A JP H0387200 A JPH0387200 A JP H0387200A
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- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cells
- propeptide
- human prorenin
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はヒト・プロレニンまたはそのプロフラグメント
の定量およびこれらの′４ｎ製等に有用な新規のモノク
ローナル抗体に関するものである。
の定量およびこれらの′４ｎ製等に有用な新規のモノク
ローナル抗体に関するものである。
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】プ
ロレニンは、血圧調節や電解質バランスに関与している
酵素レニンの前駆体である。血中のプロレニン含量は、
他の組織に比べて非常に多く、その生化学的および生理
学的機能について大きな関心が持たれてきた。 従来の技術では、プロレニンのみを特異的に認識する抗
体の作成は非常に困難であり、これまでプロレニンまた
はそのプロペプチドのみを定量したり、これらの生体組
織中における存在を観察したりすることは不可能であっ
た。またプロレニンの精製についても、複雑な生化学的
操作が必要であることから、簡便かつ迅速な方法の開発
が望まれていた。
ロレニンは、血圧調節や電解質バランスに関与している
酵素レニンの前駆体である。血中のプロレニン含量は、
他の組織に比べて非常に多く、その生化学的および生理
学的機能について大きな関心が持たれてきた。 従来の技術では、プロレニンのみを特異的に認識する抗
体の作成は非常に困難であり、これまでプロレニンまた
はそのプロペプチドのみを定量したり、これらの生体組
織中における存在を観察したりすることは不可能であっ
た。またプロレニンの精製についても、複雑な生化学的
操作が必要であることから、簡便かつ迅速な方法の開発
が望まれていた。
本発明によれば、ヒト・プロレニンに特異的な反応性を
有するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明
抗体の利用によれば、ヒト・プロレニンの免疫学的精製
手段ならびに免疫学的測定手段が提供される。 本発明抗体は、ヒト・プロレニンに特異的な反応性を有
する、すなわち特異的な結合性を有することをその最大
の特徴としており、かかる抗体にはヒト・プロレニンの
プロペプチドを構成する４３＋ｌＩＩのアミノ酸の異な
る部分に特異的に結合する数種のモノクローナル抗体が
含まれる。 以下、本発明抗体の製造方法について詳述する。 本発明抗体は、４３個のアミノ酸からなる台底ヒト・プ
ロレニン・プロペプチドを免疫抗原として免疫した哺乳
動物の形質細胞（免疫細胞）を、哺乳動物の形質細胞肺
細胞と融合させてハイブリドーマ（ｈｙｈｒｉｄｏｍａ
）を作威し、これより前記ヒト・プロレニンのみを特異
的に認識する抗体を産生ずるクローンを選択し、このク
ローンより得る。 なお本発明抗体の製造においては、必ずしもヒト・プロ
レニン・プロペプチドの精製標品を用いる必要はなく、
これを含む粗製品を使用することも可能である。 前記方法において免疫抗原、すなわちヒトプロレニン・
プロペプチドで免疫される噴孔動物としては、特に限定
されないが、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適
合性を考慮して選択することが好ましく、一般にはマウ
ス、ラット等が有利に使用される。 免疫は一般的方法により、たとえば前記ヒト・プロレニ
ン・プロペプチドを噴孔動物の腹腔内または静脈内に投
与することにより行われる。より具体的には、ヒト・プ
ロレニン・プロペプチドを生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）または生理的食塩水等で適当な濃度に希釈し、これを
必要に応じて通常のアジュバントを併用して、動物に数
回投与する。免疫細胞としては、前記ヒト・プロレニン
・プロペプチドの最終投与の約３日後に摘出した牌細胞
を使用するのが好まい。免疫細胞と融合される他方の親
細胞としての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、すで
に公知の種々の細胞株、たとえばマウスにおけるＰ３
（Ｐ３／Ｘ６３−八ｇＢ）（Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９
５−４９７（１９７５））、Ｐ３−Ｕｌ（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１＋１−７（１９８７））
、ＮＳ ］ （Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕ獅盾■ ６．５１１−５１９（１９７６）） 、Ｓ Ｐ ２／
Ｏ（Ｎａｔｕｒｅ ２７６．２６９−２７０（１９７８
）） 、ＦＯ（Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌｌ、 Ｍｅｔｈ、 ３５．１−２１（１
９８０）） 、Ｘ６３−６． ５． ３ （Ｊ、 Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、 １２３１５４Ｂ−１５５０（１９７９
）） 、Ｓ １９４ ＣＪ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １
４８．３１３−３２３（１９７８）］等、またラットに
おけるＲ ２１０ （Ｎａｔｕｒｅ ２７７．１３１−
１３３（１９７９））等の骨髄腫細胞が使用される。 前記免疫細胞と形質細胞との融合反応は、基本的には公
知の力ｌ去、たとえばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ＋、 ７３．３−４６（１９
８１））等に準じて行い得る。具体的には前記融合反応
は、たどえば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で
行われる。融合促進剤としては通常用いられるもの、た
とえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびセンダ
イウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに融合効率を
高めるためにジメチルスルフオキシド（ＤＭＳ○）等の
補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞と形質細
胞腫細胞との混合比は、通常の方法と変わりがなく、た
とえば形′ｆ７ａ１１１胞ｌＩ！ｌ１１１Ｉ胞に対し、
免疫細胞を約 １〜１０倍程度用いればよい。前記融合
時の培地としては、たとえば前記形質細胞腫細胞株の増
殖に使用されるＲＰＭＩ−１，６４０培地あるいはＭＥ
Ｍ培地など、この種の細胞の培養に使用される通常の各
種培地を利用でき、通常は牛胎児血清（ＦＯ３）等の血
清補液を除いておくのがよい。融合は、前記免疫細胞と
形質細胞腫細胞との所定量を前記培地中でよく混合し、
あらかじめ３７℃程度に加温したＰＥＧ７８液、たとえ
ば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常培
地に約３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で加えて混ぜ合わ
セることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添加
して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより
所望のハイブリドーマが形成される。 ハイブリドーマの分離は、通箆の選別用培地、たとえば
ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む
培地（ＨＡＴ培地）で培養することにより行われる。Ｍ
ＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の
細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常
数日〜数週間行えばよい。 かくして得られるハイブリドーマについて、通常の限界
希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索および単
一クローン化が行われる。 該産生株の検索は、たとえばＥＬＩＳＡ法、プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オフタロニー法およびラジ
オイムノアッセイ法等の一般に抗体の検出に用いられて
いる種々の方法に従って行われる。なお、前記抗体の検
索に使用する抗原としては、ヒト・プロレニン・プロペ
プチド標品を好ましく使用できる。 かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液
体窒素中で長期間保存可能である。 該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採
取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、あるいはハイブリドーマをこれと適合性
のある噴孔動物に投与して増殖させ、その腹水として得
る方広等が採用される。さらに、前記により得られる抗
体は、塩析法、ゲルろ適法、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の通常の精製手段により精製することもでき
る。 かくして得られる本発明抗体を免疫沈降法またはアフィ
ニティークロマトグラフィー等の通常の免疫学的精製手
段に利用することにより、ヒト・プロレニンを簡易かつ
特異的に精製可能である。 さらに、本発明抗体の利用によれば、放射免疫測定法（
ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および凝集法
等の通常の免疫学的手段により、高感度、高精度かつ高
い特異性をもってヒト・プロレニンを簡易に測定するこ
とができる。
有するモノクローナル抗体が提供される。また、本発明
抗体の利用によれば、ヒト・プロレニンの免疫学的精製
手段ならびに免疫学的測定手段が提供される。 本発明抗体は、ヒト・プロレニンに特異的な反応性を有
する、すなわち特異的な結合性を有することをその最大
の特徴としており、かかる抗体にはヒト・プロレニンの
プロペプチドを構成する４３＋ｌＩＩのアミノ酸の異な
る部分に特異的に結合する数種のモノクローナル抗体が
含まれる。 以下、本発明抗体の製造方法について詳述する。 本発明抗体は、４３個のアミノ酸からなる台底ヒト・プ
ロレニン・プロペプチドを免疫抗原として免疫した哺乳
動物の形質細胞（免疫細胞）を、哺乳動物の形質細胞肺
細胞と融合させてハイブリドーマ（ｈｙｈｒｉｄｏｍａ
）を作威し、これより前記ヒト・プロレニンのみを特異
的に認識する抗体を産生ずるクローンを選択し、このク
ローンより得る。 なお本発明抗体の製造においては、必ずしもヒト・プロ
レニン・プロペプチドの精製標品を用いる必要はなく、
これを含む粗製品を使用することも可能である。 前記方法において免疫抗原、すなわちヒトプロレニン・
プロペプチドで免疫される噴孔動物としては、特に限定
されないが、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適
合性を考慮して選択することが好ましく、一般にはマウ
ス、ラット等が有利に使用される。 免疫は一般的方法により、たとえば前記ヒト・プロレニ
ン・プロペプチドを噴孔動物の腹腔内または静脈内に投
与することにより行われる。より具体的には、ヒト・プ
ロレニン・プロペプチドを生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）または生理的食塩水等で適当な濃度に希釈し、これを
必要に応じて通常のアジュバントを併用して、動物に数
回投与する。免疫細胞としては、前記ヒト・プロレニン
・プロペプチドの最終投与の約３日後に摘出した牌細胞
を使用するのが好まい。免疫細胞と融合される他方の親
細胞としての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、すで
に公知の種々の細胞株、たとえばマウスにおけるＰ３
（Ｐ３／Ｘ６３−八ｇＢ）（Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９
５−４９７（１９７５））、Ｐ３−Ｕｌ（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１＋１−７（１９８７））
、ＮＳ ］ （Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕ獅盾■ ６．５１１−５１９（１９７６）） 、Ｓ Ｐ ２／
Ｏ（Ｎａｔｕｒｅ ２７６．２６９−２７０（１９７８
）） 、ＦＯ（Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌｌ、 Ｍｅｔｈ、 ３５．１−２１（１
９８０）） 、Ｘ６３−６． ５． ３ （Ｊ、 Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、 １２３１５４Ｂ−１５５０（１９７９
）） 、Ｓ １９４ ＣＪ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １
４８．３１３−３２３（１９７８）］等、またラットに
おけるＲ ２１０ （Ｎａｔｕｒｅ ２７７．１３１−
１３３（１９７９））等の骨髄腫細胞が使用される。 前記免疫細胞と形質細胞との融合反応は、基本的には公
知の力ｌ去、たとえばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ＋、 ７３．３−４６（１９
８１））等に準じて行い得る。具体的には前記融合反応
は、たどえば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で
行われる。融合促進剤としては通常用いられるもの、た
とえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびセンダ
イウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに融合効率を
高めるためにジメチルスルフオキシド（ＤＭＳ○）等の
補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞と形質細
胞腫細胞との混合比は、通常の方法と変わりがなく、た
とえば形′ｆ７ａ１１１胞ｌＩ！ｌ１１１Ｉ胞に対し、
免疫細胞を約 １〜１０倍程度用いればよい。前記融合
時の培地としては、たとえば前記形質細胞腫細胞株の増
殖に使用されるＲＰＭＩ−１，６４０培地あるいはＭＥ
Ｍ培地など、この種の細胞の培養に使用される通常の各
種培地を利用でき、通常は牛胎児血清（ＦＯ３）等の血
清補液を除いておくのがよい。融合は、前記免疫細胞と
形質細胞腫細胞との所定量を前記培地中でよく混合し、
あらかじめ３７℃程度に加温したＰＥＧ７８液、たとえ
ば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常培
地に約３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で加えて混ぜ合わ
セることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添加
して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより
所望のハイブリドーマが形成される。 ハイブリドーマの分離は、通箆の選別用培地、たとえば
ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む
培地（ＨＡＴ培地）で培養することにより行われる。Ｍ
ＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の
細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常
数日〜数週間行えばよい。 かくして得られるハイブリドーマについて、通常の限界
希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索および単
一クローン化が行われる。 該産生株の検索は、たとえばＥＬＩＳＡ法、プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オフタロニー法およびラジ
オイムノアッセイ法等の一般に抗体の検出に用いられて
いる種々の方法に従って行われる。なお、前記抗体の検
索に使用する抗原としては、ヒト・プロレニン・プロペ
プチド標品を好ましく使用できる。 かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液
体窒素中で長期間保存可能である。 該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採
取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、あるいはハイブリドーマをこれと適合性
のある噴孔動物に投与して増殖させ、その腹水として得
る方広等が採用される。さらに、前記により得られる抗
体は、塩析法、ゲルろ適法、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の通常の精製手段により精製することもでき
る。 かくして得られる本発明抗体を免疫沈降法またはアフィ
ニティークロマトグラフィー等の通常の免疫学的精製手
段に利用することにより、ヒト・プロレニンを簡易かつ
特異的に精製可能である。 さらに、本発明抗体の利用によれば、放射免疫測定法（
ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および凝集法
等の通常の免疫学的手段により、高感度、高精度かつ高
い特異性をもってヒト・プロレニンを簡易に測定するこ
とができる。
本発明によれば、ヒト・プロレニンの特異抗体が提供さ
れる。該抗体の利用によれば、ヒト・プロレニンの免疫
学的精製手段による精製が可能であり、その製造に際し
て極めて有用である。また本発明抗体の利用によれば、
ヒト・プロレニンの免疫学的測定手段が提供され、これ
によってヒト・プロレニンと各種の疾患の関連が明らか
となり、臨床上有用な知見が得られる。
れる。該抗体の利用によれば、ヒト・プロレニンの免疫
学的精製手段による精製が可能であり、その製造に際し
て極めて有用である。また本発明抗体の利用によれば、
ヒト・プロレニンの免疫学的測定手段が提供され、これ
によってヒト・プロレニンと各種の疾患の関連が明らか
となり、臨床上有用な知見が得られる。
本発明をさらに詳しく説明するため実施例を次に述べる
。 １）ヒトプロレニン・プロペプチドの合成Ｓｔｅｗａｅ
ｔら（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４）、 Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏ、 Ｐｕｂｌ、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、
ＩＬ（１９８４） ）およびＹｅｌ ｔｏｎら（Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８Ｌ １−７（
１９７８） ）の方法に従い、八ｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ
−５ｙｓ ｔｅｍｓ社製４３０Ａ型自動ペプチド合威機
を用いて、フェニル・アセトアミド・メチル（ＰＡＭ）
樹脂上で固相法により台底した。粗製プロペプチドは、
Ｖｙｄａｃ ＲＰ−Ｃ４カラムを装着した高速液体クロ
マトグラフにより精製した。プロペプチドのアミノ酸配
列は、エドマン分解により確認した。 ２）ハイブリドーマの製造 前記の方法により得た、ヒト・プロレニン・プロペプチ
ドを生理食塩水に溶解し０．１ｍｇ／ｍｌとし、等量の
フロイント完全アジュバントと混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液の前記ヒト・プロレニン・プロペプチド０
．００５〜０．０工■含有分を、６〜８週令のＢＡＬＢ
／ｃ系マウスに腹腔内投与した。 約６週間後、免疫化動物に前記と同し濃度のヒト・プロ
レニン・プロペブチド生理的食塩溶液０．００５〜０．
０１■含有分を腹腔内に投与し、投与３日後、免疫動物
より無菌的に肺臓を摘出した。次に、メソシュを用いて
牌蔵を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。 ８−アザグアニン存在下で数日間培養して復帰突然変異
体を完全に除いた、対数増殖期のマウス骨ＩＦ！腫細胞
株Ｘ６３ Ａｇ８ ６． ５． ３ （Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ。 １２３．１５４８−１５５０（１９７９））を前記と同
様に洗浄後、その１×１０７個と前記肺細胞ｌＸ１０’
個とを５０ｒｄ遠心管に入れ混合した。２００Ｘｇ、５
分遠心後、上滑を除去し、３７℃に保温したＰＥ０１５
４０ （和光純薬）４０％を含む、ＲＰＭＩ−１６４０
培地１ｍＢを加えて細胞融合させた。 融合した細胞は、遠心によってＰＥＧを除いた後、９６
ウエルプレートを用いて、ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジン（以下ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭ
Ｌ−１６４０培地中で１〜２週間培養して、ハイブリド
ーマのみを増殖させた。その後ＨＡＴを含まない培地中
で成育させ、約２週間後目的の抗体を産生ずるクローン
を、試験例１．に示すＥＬＩＳＡ法により検索し、所望
の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを得た。 ウサギ抗マウスＩｇ各イックイブ抗体（Ｍｉｌｅｓ社）
を用いた二重免疫拡散法により、これらのハイブリドー
マの産生ずるモノクローナル抗体のイソタモノクローナ
ル抗体２−Ｘ−Ｃｌの結果を示す。 試験例１．ＥＬＩＳＡ法による抗体の反応性の検定免疫
抗原として用いたヒト・プロレニン・プロペプチドを、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナト
リウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＪ（７，５（
ＴＢＳ）に溶解し、濃度０． Ｏ］〜０． ０５ｍｇ
／ｄとしたものを９６ウエルプレートの各ウェルに加え
、室温で１時間吸着さセた。反応後、ＴＢＳで３回洗浄
し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳを１
ウエルにつき０．２ｍＲずつ加え、室温で１時間処理し
た。次に、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ （ＴＴ
ＢＳ）で希釈した粗製または精製モノクローナル抗体を
各々０．０５ｍｆずつウェルに加え、室温で１時間反応
さセた。反応後、ＴＴＢＳで３回洗浄し、さらにＴＴＢ
Ｓで１０００〜５０００倍に希釈したアルカリフオスフ
オターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｋｓｏｎ社）を
１ウエルにつき０．０５ｍ１加え、室温で１時間反応さ
せた。ついで未反応の抗体をＴＴＢＳで充分洗い除き、
ｐ−ニトロフェニルフォスフエイト溶液（バイオランド
社）０．０５ｍｊ！を加え反昆、さセ、波ｒ：ｚ ４０
５ ｔｌｍにおける吸光度を測定し、モノクローナル抗
体の反応を判定した。 試験例２．ウェスタン・ブロッキング法による抗体の反
応特異性の証明 このｔ式験は、Ｔｏｗｂ ｉ ｎら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ［ＩＳＡ ７６．４３５
０−４３５４（１９７９） ）の方法に準して行った。 ずなわち、精製ヒト・レニンまたはヒト・プロレニンを
含む培養上清を、ドデシル硫酸ナトリウムを用いる電気
泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）により電気泳動後、ゲル
をニトロセルロース膜と密着し、ゲル側を陰極、二］ロ
セルロース側を陽極として電流を流し、ゲル上で泳動さ
れた蛋白質をニトロセルロース膜に転写した。転写され
たニトロセルロス膜を、１％ＢＳＡを含むＴＢＳに室温
で１夜浸してブロッキングを行い洗浄後、１次抗体とし
て前記２）により得られたハイブリドーマから調製され
たモノクローナル抗体をさらに１夜反応させた。反応後
膜をよく洗浄し、パーオキシダーゼで標識した抗マウス
ＩｇＧヤギ抗体を２次抗体として添加し、１％ＢＳＡを
含むＴＢＳ中で２時間反応さ七た。ついで、０．２Ｍ塩
化ナトリウム溶液でニトロセルロース膜を洗浄し、０．
１％４−クロロ−１−ナフトール溶液および０．０２％
過酸化水素水溶液により発色させた。なお対照として、
ヒト・レニンに対するポリクローナル抗体（ウサギ）を
用い、この場合は、抗マウスＩｇＧヤギ抗体に代えて、
抗つサギＩｇＧヤギ抗体を用いた。 ３）モノクローナル抗体の大量ｇＮ 前記２）で得られたハイブリドーマからモノクローナル
抗体を大量調製するには次の方法によった。 （１，） 細胞培養による方法 前記２）で得られたクローンを、ＲＰＭＴ−１６４０培
地にて５％炭酸ガスンキュベーター中で、３７°Ｃ１４
８時間培養した。ついで、培養液を１５００×ｇ、１０
分速心′Ｉ）ｆ％ｌ［することにより、目的のモノクロ
ーナル抗体を含む培養上清を得た。 （２）マウス腹水による方法 前記２）で得られたクローンから、細胞１×１０６個を
、あらかじめブリスクン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）を接種しておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウス
に腹腔的投与した。１０〜１４日後、蓄積した腹水を採
取し、本発明抗体を含む腹水を得た。 一
。 １）ヒトプロレニン・プロペプチドの合成Ｓｔｅｗａｅ
ｔら（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４）、 Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏ、 Ｐｕｂｌ、 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、
ＩＬ（１９８４） ）およびＹｅｌ ｔｏｎら（Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８Ｌ １−７（
１９７８） ）の方法に従い、八ｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ
−５ｙｓ ｔｅｍｓ社製４３０Ａ型自動ペプチド合威機
を用いて、フェニル・アセトアミド・メチル（ＰＡＭ）
樹脂上で固相法により台底した。粗製プロペプチドは、
Ｖｙｄａｃ ＲＰ−Ｃ４カラムを装着した高速液体クロ
マトグラフにより精製した。プロペプチドのアミノ酸配
列は、エドマン分解により確認した。 ２）ハイブリドーマの製造 前記の方法により得た、ヒト・プロレニン・プロペプチ
ドを生理食塩水に溶解し０．１ｍｇ／ｍｌとし、等量の
フロイント完全アジュバントと混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液の前記ヒト・プロレニン・プロペプチド０
．００５〜０．０工■含有分を、６〜８週令のＢＡＬＢ
／ｃ系マウスに腹腔内投与した。 約６週間後、免疫化動物に前記と同し濃度のヒト・プロ
レニン・プロペブチド生理的食塩溶液０．００５〜０．
０１■含有分を腹腔内に投与し、投与３日後、免疫動物
より無菌的に肺臓を摘出した。次に、メソシュを用いて
牌蔵を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。 ８−アザグアニン存在下で数日間培養して復帰突然変異
体を完全に除いた、対数増殖期のマウス骨ＩＦ！腫細胞
株Ｘ６３ Ａｇ８ ６． ５． ３ （Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ。 １２３．１５４８−１５５０（１９７９））を前記と同
様に洗浄後、その１×１０７個と前記肺細胞ｌＸ１０’
個とを５０ｒｄ遠心管に入れ混合した。２００Ｘｇ、５
分遠心後、上滑を除去し、３７℃に保温したＰＥ０１５
４０ （和光純薬）４０％を含む、ＲＰＭＩ−１６４０
培地１ｍＢを加えて細胞融合させた。 融合した細胞は、遠心によってＰＥＧを除いた後、９６
ウエルプレートを用いて、ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジン（以下ＨＡＴと略す）を含むＲＰＭ
Ｌ−１６４０培地中で１〜２週間培養して、ハイブリド
ーマのみを増殖させた。その後ＨＡＴを含まない培地中
で成育させ、約２週間後目的の抗体を産生ずるクローン
を、試験例１．に示すＥＬＩＳＡ法により検索し、所望
の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを得た。 ウサギ抗マウスＩｇ各イックイブ抗体（Ｍｉｌｅｓ社）
を用いた二重免疫拡散法により、これらのハイブリドー
マの産生ずるモノクローナル抗体のイソタモノクローナ
ル抗体２−Ｘ−Ｃｌの結果を示す。 試験例１．ＥＬＩＳＡ法による抗体の反応性の検定免疫
抗原として用いたヒト・プロレニン・プロペプチドを、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナト
リウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＪ（７，５（
ＴＢＳ）に溶解し、濃度０． Ｏ］〜０． ０５ｍｇ
／ｄとしたものを９６ウエルプレートの各ウェルに加え
、室温で１時間吸着さセた。反応後、ＴＢＳで３回洗浄
し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳを１
ウエルにつき０．２ｍＲずつ加え、室温で１時間処理し
た。次に、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ （ＴＴ
ＢＳ）で希釈した粗製または精製モノクローナル抗体を
各々０．０５ｍｆずつウェルに加え、室温で１時間反応
さセた。反応後、ＴＴＢＳで３回洗浄し、さらにＴＴＢ
Ｓで１０００〜５０００倍に希釈したアルカリフオスフ
オターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｋｓｏｎ社）を
１ウエルにつき０．０５ｍ１加え、室温で１時間反応さ
せた。ついで未反応の抗体をＴＴＢＳで充分洗い除き、
ｐ−ニトロフェニルフォスフエイト溶液（バイオランド
社）０．０５ｍｊ！を加え反昆、さセ、波ｒ：ｚ ４０
５ ｔｌｍにおける吸光度を測定し、モノクローナル抗
体の反応を判定した。 試験例２．ウェスタン・ブロッキング法による抗体の反
応特異性の証明 このｔ式験は、Ｔｏｗｂ ｉ ｎら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ［ＩＳＡ ７６．４３５
０−４３５４（１９７９） ）の方法に準して行った。 ずなわち、精製ヒト・レニンまたはヒト・プロレニンを
含む培養上清を、ドデシル硫酸ナトリウムを用いる電気
泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）により電気泳動後、ゲル
をニトロセルロース膜と密着し、ゲル側を陰極、二］ロ
セルロース側を陽極として電流を流し、ゲル上で泳動さ
れた蛋白質をニトロセルロース膜に転写した。転写され
たニトロセルロス膜を、１％ＢＳＡを含むＴＢＳに室温
で１夜浸してブロッキングを行い洗浄後、１次抗体とし
て前記２）により得られたハイブリドーマから調製され
たモノクローナル抗体をさらに１夜反応させた。反応後
膜をよく洗浄し、パーオキシダーゼで標識した抗マウス
ＩｇＧヤギ抗体を２次抗体として添加し、１％ＢＳＡを
含むＴＢＳ中で２時間反応さ七た。ついで、０．２Ｍ塩
化ナトリウム溶液でニトロセルロース膜を洗浄し、０．
１％４−クロロ−１−ナフトール溶液および０．０２％
過酸化水素水溶液により発色させた。なお対照として、
ヒト・レニンに対するポリクローナル抗体（ウサギ）を
用い、この場合は、抗マウスＩｇＧヤギ抗体に代えて、
抗つサギＩｇＧヤギ抗体を用いた。 ３）モノクローナル抗体の大量ｇＮ 前記２）で得られたハイブリドーマからモノクローナル
抗体を大量調製するには次の方法によった。 （１，） 細胞培養による方法 前記２）で得られたクローンを、ＲＰＭＴ−１６４０培
地にて５％炭酸ガスンキュベーター中で、３７°Ｃ１４
８時間培養した。ついで、培養液を１５００×ｇ、１０
分速心′Ｉ）ｆ％ｌ［することにより、目的のモノクロ
ーナル抗体を含む培養上清を得た。 （２）マウス腹水による方法 前記２）で得られたクローンから、細胞１×１０６個を
、あらかじめブリスクン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製）を接種しておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウス
に腹腔的投与した。１０〜１４日後、蓄積した腹水を採
取し、本発明抗体を含む腹水を得た。 一
第１図はヒ１〜・プロレニン・プロペプチド（プロフラ
グメント）のアミノ酸配列並びに本発明のモノクローナ
ル抗体の認識部位を示す説明図、第２図はウェスタン・
プロッティング法による本発明の特異性を示す説明図で
ある。
グメント）のアミノ酸配列並びに本発明のモノクローナ
ル抗体の認識部位を示す説明図、第２図はウェスタン・
プロッティング法による本発明の特異性を示す説明図で
ある。
Claims (1)
- ヒト・プロレニンのプロペプチド（プロフラグメント）
を特異的に認識するモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1225276A JPH0387200A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1225276A JPH0387200A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0387200A true JPH0387200A (ja) | 1991-04-11 |
Family
ID=16826792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1225276A Pending JPH0387200A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0387200A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0873999A1 (en) * | 1997-04-07 | 1998-10-28 | Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd. | Antibody to the prorenin profragment, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
-
1989
- 1989-08-31 JP JP1225276A patent/JPH0387200A/ja active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN=1985 * |
| BIOMEDICAL RESEARCH=1987 * |
| HISTOCHEMISTRY=1987 * |
| PROC NATL ACAD SCI USA=1986 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1985 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0873999A1 (en) * | 1997-04-07 | 1998-10-28 | Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd. | Antibody to the prorenin profragment, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| US5945512A (en) * | 1997-04-07 | 1999-08-31 | Tokiwa Chemical Industries Co., Ltd. | Prorenin antibody and renin-active substance containing the same |
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