JPH02211896A - ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒトミオシン軽鎖および一種以上の異種動物
のミオシン軽鎖と同等に反応し、かつヒト血清中のミオ
シン軽鎖とも反応するミオシン軽鎖に対するモノクロー
ナル抗体に関するものである。

Ｌａ　Ｄｕｅらにより急性心筋梗塞の患者血清において
グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯ
Ｔ）活性が上昇することが報告され（Ｊ。

Ｓ、　Ｌ、ａ　Ｄｕｅ　ａｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ
、　Ｖｏｌ、　１２０＋　Ｐ４９７　（１９５４））、
その後虚血による心筋障害によって心筋細胞から血中に
流出する酵素活性を測定することにより、心筋梗塞を生
化学的に診断する方法が次々と開発されるようになρた
６なかでも、ＧＯＴ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレ
アチニンフオスフォキナーゼ（ＣＰ　Ｋ）などは活性測
定が比較的容易であり、急性心筋梗塞患者の血清の９０
％以上で酵素活性が上昇することが示されている（Ｎ、
　Ｓ、　５ａｒｅｎｓｅｎ、　Ａｃｔａ、　Ｍａｄ。

５ｃａｎｄ、、Ｖｏｌ、１７４．ｐ７２５　（１９６３
））。

また、生化学的診断法は、心筋梗塞の診断ばかりでなく
、治療の評価や予後の判定の観点から梗塞心筋斌を算定
する方法としても注目されるようになった。

しかしながら、これらの生化学的診断法には、■標的酵
素には他の臓器から流出してくるアイソザイムが存在す
るために特異性に問題がある。■梗塞部心筋からの血中
への酵素の流出率と心筋梗塞の程度との相関が明らかで
ない、■最近、心筋梗塞の治療に用いられるようになっ
たウロキナーゼ、ティシュプラスミノーゲンアクティベ
ーターなどの血栓溶解剤がこれらの細胞質酵素を一度に
血流中に洗い出してしまうため（ウォッシュ・アウト効
果）、これらの薬剤使用時には梗塞心筋量との相関がな
くなるなどの問題がある。

このような従来の生化学的診断法に代りうる心筋梗塞の
診断において新しい指標となりうるマーカーの一つとし
て心筋ミオシンが注目されている。

心筋ミオシン分子は、心筋細胞構成蛋白質の中で最も多
量に存在しく約６０％）、筋肉の収縮機序の中心的役割
を担っている分子量約５０万の構造蛋白質であり、分子
［２０万の重鎖１分子量２万７０００の軽鎖１（Ｌｌ）
および分子量２万の軽鎖１１（Ｌｌｌ）のサブユニット
から構成されている。

心筋ミオシン軽鎖ないしそのフラグメントは、虚血によ
る心筋障害時の細胞膜の破壊に伴い、血中に放出される
ため、虚血による心筋細胞の崩壊過程を直接反映するも
のと考えられる。このことは。

心筋ミオシン軽鎖に対するウサギ抗血清を用いたラジオ
イムノアッセイにより証明され（Ｒ，Ｎａｇａｉｅｔ　
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ−！−Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｍｍｕｎ
、、　Ｖｏｌ。

８６、ｐ６８３　（１９７９））、臨床的にも心筋梗塞
の特異的な診断法として応用されうろことが報告されて
いる（永井良三ら、日本内科学雑誌。

第７０巻、第１６頁（１９８１）　Ｋａｔｕｓ　ｅｔ　
ａｌ。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　５４．
　ｐｐ９６４−９７０（１９８４））。

心筋ミオシン軽鎖は、虚血による心筋障害時に血中に流
出してくる指標物質として次のような特徴がある。

■　心筋ミオシンは心筋細胞内に構造蛋白質とし最も多
量に存在する。

■　心筋ミオシンは重鎖と軽鎖のサブユニットからなり
、ｐＨの変化などによりミオシン分子から容易に解離し
、分子量の小さい軽鎖は細胞外に遊離しやすい。

■　心筋ミオシン軽鎖はチオール基の含有量が少なく、
生化学的に安定な蛋白質であり１組織や血清に存在する
蛋白分解酵素の作用も受けにくい。

Φ　ウロキナーゼなどの血栓溶解剤を投薬した患者にお
いてもＣＰＫなどのようなラッシュ・アウト効果の影響
を受けることがなく、血中濃度の経時的変化と虚血によ
る心筋細胞の崩壊過程のパターンが一致する。

心筋ミオシン軽鎖の免疫学的測定法においてヒト心筋ミ
オシン軽鎖に対する抗血清を用いて行う方法としては、
上記のほか次のような報告がある。

・Ｔｒａｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｃａ
ｒｄｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　４１　。

）！Ｑ４．ｐｐ６４１−６４５　（１９７８）拳　Ｋ１
１ｚｖ　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｃ１ｒＣｕｌａｔｉｏｎ
、　　Ｖｏｌ、　　５　８　　、　　ｐｐ１３０ＩＩＫ
ｒ＋ｔｕｓ　Ｑｔ　ａｌｅ　（，１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ
、　Ｖｏｌ、　６０　（Ｓｕｐｐｌ。

ＩＴ）ｐ１３９　（１９７９） ：！らに、免疫学的測定法において抗体として心筋ミ；
ヤ？、、　＋、　１＋対するモノクローナル抗体を応用
した方法に関する報告もなされている。

・Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１
１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、、　Ｖｏｌ。

１４．５ｕｐｐ１．３．ｐｐ１３９−１４６　（１９８
２）ＩＩＫａｔｕｓ　ａｔ　ａ′ｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　７ｅ　Ｖｏｌ。

１９、Ｎ１１３．Ｐｐ４５１−４５５　（１９８２）心
筋ミオシン軽鎖の免疫学的測定法において。

抗体試薬として心筋ミオシン軽鎖に対するモノクローナ
ル抗体を用いる方法は、抗血清を用いる方法に比べて、
■抗体が心筋ミオシン軽鎖に対して特異性が高く、骨格
筋ミオシン軽鎖との交叉反応が少ない、■特異性の高い
抗体の大量かつ継続的供給が可能であるなどの利点を有
し、心筋ミオシン軽鎖の測定による心筋梗塞の診断の実
用化により適している。

一方、多発性筋炎やＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィ
ー症などの骨格筋疾患においても心筋梗塞と同様に骨格
筋ミオシン軽鎖が患者の血中に流出し、筋組織崩壊の指
標となることが骨格筋ミオシン軽鎖との交叉反応性の大
きい抗心筋ミオシン軽鎖抗体を用いたラジオイムノアッ
セイによって判明している（日本臨休、第４０巻、秋季
臨時増刊号、第１０７−１１１頁（１９８２））、Ｌか
しながら。

その免疫学的測定法は確立されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来のモノクローナル抗体を利用した心筋ミオシン軽鎖
の免疫学的測定法においては、■精製単離された心筋ミ
オシン軽鎖を用いて取得されるモノクローナル抗体は、
精製単離された心筋ミオシン軽鎖に対しては結合能を示
すが、その多くはヒト心筋梗塞患者の血中に存在する心
筋ミオシン軽鎖とは結合しないことが本発明者らの実験
により確かめられたが、このようなヒト血清中ミオシン
軽鎖における測定可能性の検討がなされていない、■標
準物質または標準物質およびＩ［心筋ミオシン軽鎖の心
筋ミオシン軽鎖として゛ヒト由来のものを用いているた
め、こられの免疫測定系を診断薬として実用化する場合
、心筋ミオシン軽鎖の調製が困難であるなどの問題点を
有していた。

本発明はこれらのミオシン軽鎖の免疫学的測定法を心筋
梗塞や骨格筋疾患の診断法として確立する上での問題点
を解決しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、筋疾患の診断法として実用化しうるミオ
シン軽鎖の免疫学的測定法を確立すべく種々研究を重ね
た結果、精製されたヒトミオシン軽鎖および一種以上の
異種動物のミオシン軽鎖と同等に反応し、かつヒト血清
中のミオシン軽鎖とも反応するモノクローナル抗体を取
得することに成功した。そして、該モノクローナル抗体
を使用すれば、従来のモノクローナル抗体を使用したミ
オシン軽鎖の免疫学的測定法の問題点を克服し、極めて
実用的かつ有意義なミオシン軽鎖の免疫学的測定システ
ムを組み立てることができることを知見し、本発明を完
成した。

すなわち１本発明は、精製単離されたヒトミオシン軽鎖
および一種以上の異種動物のミオシン軽鎖に同等に反応
し、かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応するミオシ
ン軽鎖に対するモノクローナル抗体に関するものである
。

以下、本発明のモノクローナル抗体について説明する。

本明細書において、「ミオシン軽鎖」とは、心筋（心室
筋または心房筋）ミオシンの軽鎖Ｉおよび／または軽鎖
■またはそれらのフラグメント、または骨格筋ミオシン
の軽鎖！、軽鎖■および／または軽鎖■またはそれらの
フラグメントを相称する。

「ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体」とは、心
筋ミオシンの軽鎖■および／または軽鎖■またはそれら
のフラグメントに結合能を有するモノクローナル抗体、
または骨格筋ミオシンの軽＄１．軽鎖■および／または
軽鎖■またはそれらのフラグメントに結合能を有するモ
ノクローナル抗体を相称する。

また、「異種動物」とは、ヒト以外のサル、イヌ、ネコ
、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、
ラット、モルモット、ハムスターリスなどの主として哺
乳動物を相称する。

本発明のモノクローナル抗体の調製は、公知の細胞融合
法、ＥＤウィルスなどによるトランスフォーメーション
法を応用して行うことができる。

細胞融合法は抗体の大量生産により適しており、以下細
胞融合法による本発明のモノクローナル抗体の製造工程
について説明するが、細胞融合法の一般的な技術手段に
ついては成帯、報文などの記載を参照することができる
（たとえば、岩崎辰夫ら著、「単クローン抗体−ハイブ
リドーマとＥＬＩＳＡ−Ｊ　　（株式会社講談社、昭和
５８年２月２０日発’（ｊ）　、　Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、　６、ＰＰ５１１−５１
９　（１９７６）　、　Ｍ、Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２７６、ｐｐ２６９
−２７０　（１９７８）など参照）、。

（ａ）抗体産生細胞の調製 ヒトの心筋から調製したミオシン軽鎖を異種動物に免疫
し、免疫を獲得した動物から肺細胞、リンパ節細胞また
は抹梢血細胞の抗体産生細胞を常法による取得する。

ミオシン軽鎖の調製は、０．２〜０．６Ｍの塩化カリウ
ムなどの塩類溶液を用いてｐＨ６，５〜７．０の条件下
で抽出したミオシンをＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２
５，ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０などのイオン交
換体を用いるイオン交換クロマトグラフィー、セファデ
ックスＧ−２００などのゲル充填剤を用いるゲル濾過ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーキ
レート剤による沈澱化法、尿素またはグアニジン塩酸塩
処理、分画電気泳動法、透析法、高濃度塩類溶液処理な
どの公知の方法を適宜に応用して処理することにより実
施することができる（「生化学実験講座１５　筋肉」　
（株式会社東京化学同人、昭和５０年１１月２５日発行
）ｐｐ３−１２、Ｒ，Ｎａｇａｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　ｐ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｖｏｌ、　８６．　ｐ６８３　（１
９７９）　、　Ａ。

Ｍ、　Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｉｒ、　Ｒｅｓ、、
　Ｖｏｌ、　１９　、　ｐｐ６１１−６２１　（１９６
５）　、　Ｗ、Ｔ、Ｐｅｒｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｔｍ、　Ｊ、、　Ｖｏｌ、　１１９．　ｐ
ｐ３１−３８　（１９７０）など参照）。

（ｂ）ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤
抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地では生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質
を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性
株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓ
ｅ）　を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また細胞の性質
として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型
の細胞株であることが好ましい。

ミエローマ細胞株の具体例としては、Ｐ３／Ｘ６３−Ａ
ｇ８　（ＡＴＣＣＴＩＢ−９）　　（Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２５６、ｐｐ４９５−４９７　（１９７５））
、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ、１　（Ｐ、Ｕ□）（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ　−１５９７）　　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ハ吐亜
ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、　　８１、ｐｐｌ−７（１９７８））、Ｐシ
／Ｘ６３−Ａｇ３，６５３　　（Ａ（ＴＣＣＣＲＬ−１
５８０）　　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、１２３、ｐｐ１５４８−１５５０　　（１９７
９））。

ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　　（ＮＳ−１）　　（
ＡＴＣＣＴ　Ｉ　Ｂ　−１８）　　（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　　６、ｐｐ５１１−５１９　　（１９７６）
）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　　（ＳＦ３）　　（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ−１５８１）　　（Ｎａｔｕｒｅ、　　Ｖｏｌ
、　　２７６、ｐｐ２６９−２７０　（１９７８））な
どのマウスミエローマ細胞株、２１０．ＲＣＹ、Ａｇ１
．２．３　（Ｙ３−Ａｇ１．２．３）（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１６３１）（Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２７７、ｐ
ｐ１３１−１３３（１９７９））などのラットミエロー
マ細胞株、Ｕ−２６６−ＡＲ，（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、、Ｖｏｌ、７７、ｐ５４２９　（１９８０））
。

Ｇ　Ｍ　１５００　（Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　２８
８、ｐ４４８（１９８０）、ＫＲ−４（肛匹、し■０組
姐。

Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ　、　Ａ、、　Ｖｏｌ、　７９、ｐ
６６５１　（１９８２））などのヒトミエローマ細胞株
を例示することができる。

（ｃ）細胞融合 細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合はイーグル最少基本培地
（ＭＥＭ）、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）
　、ＲＰＭＩ　１６４０などの動物細胞培養用培地中で
１０７〜１０”のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合
比１：４〜１０に混合して行う、、ｍ胞融合を促進させ
るために、融合促進剤として平均分子１１０００〜６０
ｏｏのポリエチレングリコール（、Ｐ　Ｅ　Ｇ　）をは
じめ、ポリビニールアルコール、ウィルスなどが使用さ
れる。

（ｄ）選択培地におけるハイブリドーマの選別細胞融合
処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する
手段としては、選択的培地における開胸の選択的増殖を
利用する方法が用いられる。たとえば、細胞液を１５％
ウシ胎児血清（Ｆｅ２）含有ＲＰＭ１１６４０培地など
で適当に希釈し、マイクロプレート上に１０５〜１０ｔ
″／ウエル程度まき、各ウェルに選択培地（たとえば、
ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換し
て培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン
抵抗性株１選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場合は、
未融合のミエローマ細胞は培養１０日日月らいまでに死
滅し、正常細胞である抗体産生細胞もｉｎ　ｖｉｔｒｏ
では長期間生育できないので、培養１０〜１４日目から
日月してくる細胞としてハイブリドーマを得ることがで
きる。

（ｅ）本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の検索 本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの検索
は、酵素橿識免疫定量法（ＥｎｚｙＩＩｅＬｊ、ｎｋｅ
ｄ　Ｉｍａ＋ｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ、　
Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）　。

放射性同位元素免疫定量法（ＲＩ　Ａ）などによって行
うことができる。たとえば、ヒトまたは異種動物のミオ
シン軽鎖を吸着させた９６ウエルＥＬＩＳＡ用マイクロ
プレートにハイブリドーマを含む培養上清を添加して特
異抗体を反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識
抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、ビチオン化抗免
疫グロブリン抗体を反応させた後、アビジンＤ−酵素標
識体を反応させ、各ウェルに酵素基質を加えて発色させ
る。発色の有無により１本発明のモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマを含む培養上清のウェルを判別
でき、ハイブリドーマの検索が行える。

（’ｆ）クローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソータ法などによ
り行うことができる。

（ｇ）抗体の産生 このようにして取得されたハイブリドーマから本発明の
モノクローナル抗体を産生ずる方法としては、通常の細
胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。

細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜１５％
ＦＣ５含有ＲＰＭ１１６４０培地、無血清培地などの動
物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗体
を取得することができる。

腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物に、ブリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔
内に投与した後、ハイブリドーマを約１０’個腹腔内投
与する。ハイブリドーマは１０〜１８日はどで腹水腫瘍
を形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体を生産する
。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、ＤＥ
ＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフィー、ミオシン軽鎖を結合させたセ
ファロース４ＢやプロティンＡ−セファロースなどを用
いるアフィニティクロマトグラフィー、分子ふるいクロ
マトグラフィーなどの方法を適宜選択し１組合せること
によって精製を行うことができる。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、■Ｎ
製単離されたヒトミオシン軽鎖と反応するだけでなく、
一種以上の異種動物の精製単離されたミオシン軽鎖とも
同等に反応し、かつ■ヒト血清中のミオシン軽鎖とも反
応するという２つの特徴により性格付けされる新規なミ
オシン軽鎖に対するモノクローナル抗体である。

このようなモノクローナル抗体をミオシン軽鎖の免疫学
的測定法に使用することにより、まず、上述の■の特徴
により実際の心筋梗塞などの筋疾患の診断が初めて可能
になるとともに、■の特徴により、ミオシン軽鎖を免疫
学的に測定するシステムにおけるＷ４準物質、標識ミオ
シン軽鎖などの従来ヒト由来のものを使用していた試薬
をヒト以外の異種動物から調製した試薬に代替すること
も初めて可能となったのである。このような代替は。

ヒトミオシン軽鎖および一種以上の異種動物のミオシン
軽鎖と単に反応する抗体を選択することによって達成で
きるものではなく、ヒトミオシン軽鎖と一種以上の異種
動物のミオシン軽鎖と同等に反応するものを選択するこ
とにより初めて完成できたものである。すなわち、たと
えば従来のヒト由来の標準抗原溶液に代えてブタなどの
異種動物由来の標準抗原溶液を用いて標準曲線を作成す
る場合、異種動物由来のものを使用して作成した標準曲
線は、ヒト由来のものを使用して作成した標準曲線とほ
ぼ同一であることが必要である。このような条件を満足
する標準曲線を作成するためには、ヒトミオシン軽鎖と
異種動物のミオシン軽鎖との両ミオシン軽鎖に単に反応
するだけでは不十分であり、両ミオシン軽鎖に同等に反
応するものを使用することにより初めて達成されるもの
である。

本発明のモノクローナル抗体を測定システム系に組み入
れる場合の使用態様は特に制限されず、たとえば固相化
抗体、標識化抗体などの通常の免疫学的測定法に常用さ
れている使用態様の中から測定システムに適合するもの
を常法に従って調製すればよい。

以下１本発明のモノクローナル抗体の有用性を実施例、
応用例を挙げて具体的に説明する。

実施例１（本発明のモノクローナル抗体の調製）公知の
方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　Ｖｏｌ、　１１３　
＋　ＰＰ３ｌ−３８（１９７０）’）により調製された
ヒト心室筋ミオシン軽＃’ｔ（１■／−）を生理食塩水
に溶解させ、完全フロインドアジュバントと１＝１で混
合してエマルジョンとしたものをＢＡＬＢ／Ｃマウス（
雌、６週令）に２週問おきに数回ミオシン軽鎖として５
０ｐｇ腹腔内投与し、最後に１０〜３０塊を静注した。

最終免疫から３日後にマウスの牌細胞を摘出し、ＭＥＭ
で洗浄した。マウスミエローマＰ、Ｕ□をＭＥＭで洗浄
し、牌細胞とＰ、Ｕ、を１０：１で混合して遠心分離し
、ベレットに５０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　１，０００ＭＥＭ溶液
１　ｍＱを徐々に加えて細胞融合を行った。

さらにＭＥＭ溶液を加えて１０−とじ、遠心分離し、ペ
レットを１０％ＦＣ８含有ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地
にＰ、Ｕ、として３　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ／　０　、１
−となるように懸濁させ、９６ウエルマイクロプレート
に各ウェル０．１−ずつ分注した。

１日後、ＨＡＴ培地を０．１ｍＱずつ添加し、その後３
〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換し
、ハイブリドーマの生育が認められたウェルの上清５０
鴻ずつをそれぞれ予めヒト心室筋ミオシン軽鎖でコート
した９６ウエルマイクロプレートに添加した。アビジン
Ｄ−酵素結合体としてアビジンＤ−ペルオキシダーゼ（
ベクター社製）、基質および発色剤として過酸化水素、
４−アミノアンチピリン−フェノールを用いた前記した
ＥＬＩＳＡ法によりヒト心室筋ミオシン軽鎖と反応する
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、限界希釈法に
よりクローニングを行った。

取得されたハイブリドーマが生産するモノクローナルに
ついて、抗体のサブクラスを決定し、ヒト、イヌ、ブタ
およびウシから調製したミオシン軽鎖および心筋梗塞患
者血清中の心筋ミオシン軽鎖との交叉反応性をハイブリ
ドーマの選択と同様のＥＬＩＳＡ法により試験した。そ
の結果を第１〜２表に示す。

サブクラスの決定は、心室筋ミオシン軽鎖をコートした
９６ウエルマイクロプレートに各モノクローナル抗体を
添加し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ
でブロッキングした後１Ｍ０ＮＯＡＢＩＤ−ＥＩＡｎｙ
　ト（ＺＹＭＥＤ社製）を用いて行った。

特異性の指標は、ＭＬＭ５２７抗体の一定量のビト心室
筋ミオシン軽鎖に対する結合量を１００とした場合の相
対的結合量を表わし、（−１１＋）は１００〜８０％、
（廿）は８０〜５０％、（＋）は５０〜１０％、（−）
は１０〜０％のランクを示す。

このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体の
うち、特に好適な抗体例としては、ＭＬＭ−５０８，Ｍ
ＬＭ−５２０、ＭＬＭ−５２７、ＭＬＭ−５３６，ＭＬ
Ｍ−５４４、ＭＬＭ−５８２などが挙げられる。

応用例　ｌ ■　ブタ心室筋ミオシン軽鎖の調製 ブタ心臓の心室筋を細断し、１０倍重量の１ｍＭＥＤＴ
Ａ含有５０ｍＭりん酸緩衝液（ＰＨ６，８５）で洗浄し
た。この組織片に０．６Ｍ塩化カリウム、１■ＭＥＤＴ
Ａおよび３ｍＭピロりん酸カリウム含有０．１５Ｍりん
酸緩衝液（ｐＨ６，８５）を加え、１５分間撹拌してミ
オシンを抽出後、１３倍重量のＩ纏ＭＥＤＴＡ溶液を加
え、濾過し、濾液に２４倍重量の１■ＭＥＤＴＡ溶液を
加えて４℃で１晩静置した。上清を吸引除去し、沈澱を
８，５００ｒ、ｐ、ｍ、２０分、４℃で遠心分離し、沈
澱を回収し、秤量した。１Ｍ塩化カリウム、２℃ｍ？４
ＥＤＴＡ、４０ｉｅＭアデノシン三りん酸および１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム含有２０＋ｍＭｈリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）を２倍量、蒸留水を等量加え、水冷下２回
ホモジナイズした。１００，０００ｇ、１時間超遠心分
離し、上清液に９倍量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え、メ
ルカプトエタノールを１滴加えて４℃で１晩静置した。

沈澱を８，５ＱＯｒ、ｐ４．２０分、４℃で遠心分離し
、得られた沈澱にグアニジン塩酸塩を最終濃度５Ｍにな
るように加え、メルカプトエタノールを加えて室温で３
時間撹拌し、等量の冷水、４倍量のエタノールを加え、
１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、　２０分、４℃で遠心分離し
た。上清を冷１ｍＭＥＤＴＡ溶液に対して数回透析し、
透析内液を回収してブタ心室筋ミオシン軽鎖１００■を
得た。

■　ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの精製 抗心筋ミオシン軽鎖■モノクローナル抗体ＭＬＭ５１５
をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーにて精
製後、１００■の抗体をアフィゲル１０　（Ｂｉｏ　Ｒ
ａｄ社ＪＩ！り５ＩＩＱに結合させ（結合率４２％）、
１Ｍエタノールアミンでブロック後、ゲルをカラムに充
填し、０．２Ｍグリシン塩酸緩ツ ミオシン軽鎖１１１１ｇをカラムに負荷し、ＰＢＳで溶
出し、ブタ心室筋ミオシン軽＃Ｉ　Ｉ　ａｉｍｓ品３．
７■を得た。

■　〔１″８１）標識モノクローナル抗体（（”’　Ｉ
　）−抗体）の作成 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
０８をマウス腹水より、硫安分画、ＤＥＡＥセルロース
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ＡｃＡ４４ゲル
濾過カラムクロマトグラフイーにより精製した。

この精製抗体をｌｌ１ｇ／−溶液とし、その４０ｍを２
００μＣｉのヨウ化ナトリウム（（”’　Ｉ　）　）で
クロラミンＴ法により１２Ｓ　ｔ　ｌｐｔｍ化した（）
ｌｕｎｔｅｒａｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、
　１９４、Ｐｐ４９５−４９６（１９６２））、これを
セファデックス０２５カラムクロマトグラフイーにより
遊離の放射性ヨウ化ナトリウムと分離し、（”’　Ｉ　
）−抗体とした。

■　抗体コートチューブの作製 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖■モノクローナル抗体ＭＬＭ５
４４を前記と同様に精製した。精製抗体をＰＢＳ　（ｐ
Ｈ７，４）に５０７ｊｇ／ｍＱとなるように溶解させ、
ポリスチレンチューブに０．５ＩＩＱｇずつ加え、４℃
で１晩放置してコートした。チューブから溶液を除去し
、１％ＢＳＡ、０．１％ナトリウムアジド含有ＰＢＳを
加え、室温で２時間放置してブロックした。ＢＳＡ溶液
を除去し、蒸留水で２回洗浄した後、凍結乾燥し、使用
時まで４℃で乾燥状態で保存した。

■　測定 抗体コートチューブに、精製ヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉ
および精製ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉをそれぞれ１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳで１．ＯＯＯｎｇ／ＩｎＱからｌｎｇ／
ｍＱまで段階希釈した標準液を２００越ずつ加え、次イ
テ〔１２ｓ■〕−抗体を５０，０００ｃ、ｐ。

ｍ、／２５０越となるように希釈して２５０鴻ずつ加え
た。

室温で１６時間反応させ、上清をアスピレータ−により
吸引除去し、蒸留水で２回洗浄後、各チューブの放射能
量をガンマ−カウンターで測定した。

その結果、第１図に示したように、ｌｎｇ／ａｎから１
１００ｎ／ｍΩまでヒト心室筋ミオシン軽鎖■の標準液
およびブタ心室筋ミオシン軽鎖！の′ＪＲ１１！液につ
いてほぼ同一の標準曲線が作成できた。

したがって、適当なファクターを乗じれば、ブタ心室筋
ミオシン軽鎖■の標準曲線からヒト心室筋ミオシン軽鎖
Ｉの量を換算できることが明らかとなった。

応用例　２ 健常人２１人、急性心筋梗塞患者９人から採取して調製
した血清試料各５０屑を前記と同様に抗体コートチュー
ブに加え、次に１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え（”ｓＩ　
）−抗体溶液２５０犀を加えた。室温で１６時間インキ
ュベーションした後、上清をアスピレータ−により吸引
除去し、蒸留水で２回洗浄後、オートガンマ−カウンタ
ーにて放射能を測定した。ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉを
標準物質として作成した標準曲線に基づいて、血清中の
ミオシン軽鎖を定量した。

その結果、健常人の血清試料中のミオシン軽鎖含量は０
．６２±０　、６７ｎｇ／ｎ＋Ｑであった。一方、急性
心筋梗塞患者では発作当日において１１．７±１４　、
３ｎｇ／＋＋Ｑと高く、発作後３〜６日目にピ一りとな
った。ピーク時の値は２３．３±１３．８ｎｇ／ａＱで
あり、その後減少して１週間から２週間後には正常値に
戻る例が多かった。

応用例　３ ■　ビオチン化抗体の作製 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
０８を応用例１と同様にＤＥＡＥセルロースイオン交換
クロマトグラフィー、Ａ　ｃ　Ａ　４４ゲル濾過カラム
クロマドグフイーで精製し、これをＯ，１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム水溶液に対して透析し、透析内液を同溶液で抗
体濃度が１■／　ａｍになるように調製した。０．７５
ｎｇのＮ−ハイドロキシサクシニルビオチンをジメチル
ホルムアミド１−に溶解させたもの０．１ｔＱを上記抗
体溶液１−に加えて混合し、室温で４時間放置した。混
合液を０．１％ナトリウムアジド含有ＰＢＳに対して透
析し、０．１％ＢＳＡ、０．１％ナトリウムアジド含有
ＰＢＳ溶液としてビオチン化抗体を調製した。

■　測定 応用例１と同様にして調製した抗体コートチューブにヒ
ト心筋ミオシン軽鎖Ｉまたはブタ心筋ミオシン軽鎖Ｉを
それぞれ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１　、　ＯＯＯｎｇ／
ｍＱからｌｎｇ／−まで段階希釈した標準液を１００ρ
ずつおよび１％ＢＳＡ、０．１％ナトリウムアジド含有
ＰＢＳを１５０／ｍずつ加え、室温で１．５時間反応さ
せた後、ＰＢＳで２回洗浄した。希釈したビオチン化抗
体を２５Ｑ７ｍずつ各チューブに加え、室温で１．５時
間放置後、ＰＢＳで２回洗浄した。アビジンローペルオ
キシダーゼ（ベクター社製）を１％ＢＳＡ、０．０１％
エチルマルキリチオサリチル酸ナトリウム含有ＰＢＳ溶
液で希釈して２５０ＩｉＱずつ各チューブに加え、室温
で１５分放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。０−フェ
ニレンジアミン２■をクエン酸緩衝液（ｐｌ（５，０）
１０ｍＱに溶解させて発色試薬を調製し、各チューブに
発色試薬１　ｍＱおよび３４０ｔｔｒＭ過酸化水索５０
ρをそれぞ九加えて室温で２０分反応させた後、ＩＮ硫
酸を１−ずつ加えて反応を停止し、各チューブ溶液の４
９０ｎ＋ｉの吸光度を測定した。

その結果、第２＠に示したように、ｌｎｇ／ｍｕから１
１００ｎ／−までヒト心室筋ミオシン軽鎖■の標準液お
よびブタ心室筋ミオシン軽鎖■の標準液についてほぼ同
一の標準曲線が作成できた。

応用例　４ 応用例１の■と同様にブタ、ウシ、イヌ、ラット心室筋
よりミオシンを抽出し、５Ｍグアニジン塩酸塩処理によ
りミオシン軽鎖を単離した。次にこれらをそれぞれ１％
ＢＳＡ含有ＰＢＳで段階希釈して標準液を作成し、応用
例１と同一の抗体コートチューブに２５ｔｌＱずつ加え
、次いでＰＢＳを７５４、実施例１と同一のＣ”５Ｉ）
−抗体を２５０４ずつ加えて室温で１晩放置した。上清
を除去し、洗浄した後、各チューブの放射能量をオート
ガンマ−カウンターで測定した。

その結果は、第３図に示したとおりであり、ブタ、ウシ
、イヌ、ラットの各心室筋ミオシン軽鎖の標準液による
標準曲線はヒト心室筋ミオシン軽鎖によるものとほぼ一
致し、これら異種動物の心筋ミオシン軽鎖をヒト心筋ミ
オシン軽鎖を測定する際の標準物質として使用できるこ
とが確かめられた。

応用例　５ 急性心筋梗塞患者の血清を発作直後より経時的にサンプ
リングし、応用例１のＲＩＡのサンドインチ法および応
用例３のＥＬＩＳＡ法により心筋ミオシン軽鎖の測定を
行った。

その結果は第４図に示したとおりであり、ＥＬＩＳＡ法
により得られた測定値がＲＩＡサンドインチ法により得
られたものよりもやや高めであるが、両者とも良い相関
を示した（相関係数０．９２）。

【図面の簡単な説明】

第１図は応用例１において、第２図は応用例３において
、第３図は応用例４において作成された標準曲線である
。第４図は応用例５における心筋梗塞患者血清中の経時
的な心筋ミオシン軽鎖含量の変化を示すものである。 特許出願人　（６７７）ヤマサ醤油株式会社茅１図 Ｖｚ図 ゴ廓ぽ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトミオシン軽鎖および一種以上の異種動物のミオ
   シン軽鎖と同等に反応し、かつヒト血清中のミオシン軽
   鎖とも反応するミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗
   体。 ２）ミオシン軽鎖が、心筋ミオシン軽鎖である請求項１
   記載のモノクローナル抗体。 ３）ミオシン軽鎖が、骨格筋ミオシン軽鎖である請求項
   １記載のモノクローナル抗体。