JPH0395463A - 異種結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 異種結合アッセイには、標識結合試薬を非標識結合試薬
から分離する手段が提供されることが必要である。しば
しば特異的結合性リガンドまたは受容体が結合される表
顔が提供ざれている。例えば、ろ過可能なラテックスビ
ーズ；通常プラスチック製であり、またアッセイ混合物
の容器にも６ なる試験管またはウエル；磁場勾配内で分離可能な磁性
粒子；遠心分離により分離可能であり、あるいはクロマ
トグラフの固定相として使用される不溶性ポリマー；試
薬をろ過し、あるいはギヤピラリー作用により移送可能
なセルロースまたはガラスろ紙等の吸収性祠料等、種々
の表面が使用されてぎた。

米国￥ｆ許第４．６５９．６７８号には、１種以上のモ
ノクローナル抗体を用い、固体支持体に結合さばるに先
立ち、液体培地中に複合体が形威される免疫アッセイを
行なう方法が記述されている。

結合された試料の検出は、放剣性ヨウ素による標識、な
らびに蛍光測定および酵素標識等の標識方法を使川して
測定される。

米国特許第４．７８０，４２３号には、調節孔ガラス粒
子を使用した異種アッセイが記述されている。該調節孔
ガラス粒子は、蛍光免疫アツセイにおいてリガンドに結
合する特異的結合相手の為の支持体として使用される。

本発明において使用されるように、該ガラス粒子は、関
心のある複合体を結合し、その検出は蛍光プローブを用
いて達成される。蛍光測定は、ガラス粒子の存在下で行
なわれる。

米国特許第４．２９８．６８５号には、試験試料中生物
学的物質の定量測定に対するビオチン標識抗体の使川が
記述されている。存在する生物学的試料の量の定量的測
定は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等のＭ素標識を
使用することにより行なわれ、これは、試料に結合ずる
場合に該試利中の生物学的物質の存在を検出する手段と
して使用され得る。

磁性粒子またはガラスビーズ等の固体粒子の免疫学的ア
ッセイのための支持体としての使用は公知である。この
種のアッセイの例は、米国特許第４，７７７，１４５号
に記戟されているように蛍光測定免疫アッセイにおける
同体支持体としての磁性粒子の使用を含む。免疫アノイ
ニアイクロマトグラフィにおけるアビジンー被覆ガラス
ビーズの使用、およびこのようなアビジンー被覆ビーズ
のｍ製方法は、ＢａｂａＳｈａｋ　Ｊ．　Ｖ．および　
Ｔ，ＨＰｈｉ　ｌ　ｌ　ｉｔ）Ｓの　Ｊ．　　ｏｆ　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈＶ　　　４　４　４　：　２
１　（１９８８）に記載されている。

本発明は、遠心分離または慣用のろ過を用いることなく
高い容量、迅速な結合および異種アツセイの定常相の便
利な洗浄を達成するための本発明の改良方法を使用する
種々の異種結合アツセイを実施する手段を提供するもの
である。一般に、慣用のろ過系は、不便であり、かつ再
使用がしばしば不可能な高価なメンブレンを必要とする
。遠心分離は、自動化には不都合であり、また試ｌＩＩ
管よたｔよウエル←よ高い結合容量および迅速な結合を
与えるために適当な表面積または幾何学的条件を促供し
ない。

発明の要約 結合アッセイにおいて表面結含戒分を液体媒体中に溶解
または懸濁された戒分から分離する方法が提供され、こ
こでビーズ担体が結合のための表面を与え、かつ液体媒
体は、担体中に挿入され、ビーズの吸引および諸まりを
妨止り−るために充分に小ざい内部断面を有する管体を
通しての吸引に９ よりビーズから分離される。通常、ビーズは、それらの
表面に固定された多くの特異的結合対（ｓｂｐ）要素を
有し、これらは、分析対象、分析対象の類似体または分
析対象に結合司能な試薬である相補的ｓｂｐ要素の結合
が可能である。分離は、通常は液体媒体中に存ね．する
ｓｂｐｉ素の接合体を、ビーズ担体に結合した同様な接
合体から除去することに関するであろう。

本発明の一実施態様は、ｓｂｐ要素と試料とが、該試料
中に分析対象が存在する場合に分析対象がｓｂｐ要素と
複合体を形成する条件下で液体媒体中に合せられるリガ
ンド結合アッセイにおｌする分離の実施方法である。該
媒体｛ま、ビーズがｓｂｐ要素複合体に結合つる条件下
でビーズと合せられる。次いで、水性媒体は、ビーズ徂
体中に挿入された管休によりビーズから吸引され、ここ
でビーズの大きざは、液体媒体の除去を許容するために
充分に大ぎく、しかしながら該ビーズの吸引を妨げるた
めに介分に小さい。

本発明の別の実施態様において、第１のｓｂｐ１０ 要素を水性媒体から分１３１ｔタる方法が記述され、そ
の改良点は、第１のｓｂｐ要素が結合呵能なｓｂｐ要素
が結合される直径０．２〜２．５ｍの大きざのビーズ担
体の使用、およびｓｂｐ要素が結合されたビーズを媒体
から分離するための吸弓用管体の使用にある。

本発明の更に他の実施態様は、分析対象を含有するもの
ど考えられる試利中の分析対象の測定のためのアッセイ
方法であり、ここにおいて分析対象はｓｂｐ要素であり
、標識ｓｂｐ要素は、混合物中に存在する分析対象のｌ
ＩＩ度に関連をもってアッセイ混合物から分離ざれる。

該方法は、試利、標識ｓｂｐ要素およびビーズをアッセ
イ媒体中に合し、該標識ｓｂｐ要素は該ビーズに結合可
能であり；アッセイ媒体の体積を該ビーズをおおうに満
たない体積とし、標識ｓｂｐ要素を含むアッセイ媒体の
十分な量を用いてビーズをインキュベートし；各々の直
径が最小ビーズの最小直径より小さい１＠以上の孔を有
する吸引用管体を用いてアッセイ媒体をビーズから吸引
し、ビーズに結合１１ する標識ｓｂｐ要索を非結合物から分離し；該標識Ｓｂ
ｐ９索の存在をビーズについて試験することを含／υで
なる。

本発明の更に他の実施態様は、分析対象がリガンドおよ
びその相補的受容体からなるｓｂｐ要素である、該分析
対象を含有するものと考えられる試料中の分析対象のア
ッセイであって、該分析幻象は、ビーズの存在十で相補
的ｓｂｐ要素に結合し、ここで該ｓｂｐ要素一分析対象
複合体は、該ビーズ担体の表面に結合する。改良点は、
該溶液をビーズに結合ずる相補的ｓｂｐ要素分析対象複
合体から、各々の直径が最小ビーズの最小白径より小さ
い１個以上の孔をイ１する吸引用管体をビーズ担体中に
挿入することにより分ｍ−ａることを含んでなる。

本発明の更に他の実施態様において、ａ）分析対象の結
合およびｌｉｔ種を水性媒体中に形成し；ｂ）該媒体を
、前記結合または遊離種のいずれがと結合し得るビーズ
の担体と共にインキコベートし、ここで前記媒体は前記
担体をおおうに要する体柏１２ より小さく；Ｃ）インキュベート期間に続いて、鮪記媒
体を前記ビーズから吸引し、ここで前記ビーズの大きさ
は、前記水性媒体のビーズを含まない分離を可能とし；
およびｄ）前記結合または遊離種のいずれかの存在につ
いて前記ビーズを試験することを含んでなるアッセイ誘
導方法が記述される，３本発明の更に他の実施態様にお
いて、ｓｂｐ要素および試料を分析対象が該試料ψに存
在する場合に該ｓｂｐ要素と複合体を形成する条件下で
液体媒体中に合し；該媒体を０．２〜２．　５ｆｆｉ＃
Ｉの直径の大きさを有する非多孔悌ビーズの５０〜５０
，ＯＯＯ個の担体と、該ビーズが該ｓｂｐ要素と結合す
る条件下で合し；該媒体を、各々の大きさが最小ビーズ
の最小直径より小さい１個以上の孔を有する吸引用管体
を用いた吸引によりビーズから分離し、該ビーズの直径
が、該ビーズを吸引することなく液体媒体の除去を可能
とするに充分大きいことを含んでなるアツセイにおける
分離方法が記述されている。

本発明の他の実施態様において、抗原一抗休対１３ の要素を含む水性媒体を、非多孔性ビーズの担体と共に
試料と、該ビーズが抗原−抗体対の要素と結合する条件
下で合し、ならびに、該液体媒体を、吸引用管体により
ビーズから分離し、ここでビーズの最小直径は該吸引用
管体の孔より大きく、従ってビーズの吸引を阻止しつつ
水性媒体の除去を可能とすることを含んでなる巽種免疫
アッセイにおける分離方法が記述されている。

本発明の更に別の実施態様において、結合アッしイにお
ける分離方法が記述される。該方法は、第１のｓｂｐ要
素を含む水性媒体を、該第１のｓｂｐ要素と同一または
異なる第２のｓｂｐ要素が結合するビーズからなる担体
を、該第１の要素が該第２の要素に直接または間接に結
合する条件下で合し；ならびに、該ビーズの大きさが、
該ビーズを吸引することなく水性媒体の除去を許容する
に充分に大きいビーズ担体中に、管体を挿入することに
より水性媒体を吸引することを含んでなる。

本発明の詳細な記述 １４ 本発明は、メンブレン、ろ紙、磁気的分離または遠心分
離を必要どしない、試験管または、マイクロタイタープ
レートのウエルと同様に容易に洗浄可能な結合アッセイ
のための大きい表而積を捉供するものである。該方法は
、好ましくは非多孔性であって、管休に吸引されず、ま
たこれを詰らせないであろう充分な大きさのビーズから
なる担体を使用し、該管体は、ビーズ周囲の液体を吸弓
するために、担体の底部に没せられる。

核酸結合アッセイを含むリガンド結合アッセイ等の結合
アッセイは、一・般に種々の異なる型の固相を使用する
。使川される固相の型の例は、ラテックス粒子、二酸化
クロム常磁性粒子、磁性ヒルロース粒子、ガラスビーズ
、ポリスチレンボール、グラスファイバーろ紙、セルロ
ースろ紙、ニトロセルロースメンブレン、およびポリス
チレンミクロフィルター板、プラスチック被覆試験管等
を含む。

本発明は、遠心分離やろ過を使用する標準的な結合アッ
セイに比べ、より便利かつ迅速な結合１５ アッセイ方法を提供するものである１，本発明は、分離
工程が必要な試料中の分析対象のアッセイに対して特に
応用がある。

本発明の特定的な実施態様を記述するのに先立つで、種
々の用語を定義する。

′゛分析対象″は、興味ある試料または材利の測定され
るべき化合物または組成物を意味する。該分析対象は、
特異的結合対（ｓｂｐ）の要素であり、また核酸もしく
はオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいは単一も
しくは多価の、通常抗原性らしくはハプテン性である少
なくとも１個の共通エピトープ性もしくは決定部位を有
する単一化合物ｂｔ，＜は複数の化合物であるリガンド
であってもよい。核分析対象は、粒子の部分またはアッ
セイにおいて粒子に結合するものであり得る。

粒子の部分である分析対象の例は、血液群抗原（Ａ，Ｂ
，Δ１３、○、Ｄ等）または口ＬＡ抗原等の細胞表面上
の抗原である。分析対象が粒子に結合される際に関与す
る結合は、特異的もしくは非狛異的、免疫的もしくは非
免疫的であり得る。

１６ 多価リガンド分析対象は、通常ボリ（アミノ酸類）、す
なわちポリベプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸類およ
びこれらの組合せである。このような組合せは、細菌類
、ウイルス類、染色体類、遺伝子類、ミトコンドリア、
核、細胞膜等を含む。

多くの場合、本発明において使川される多エピトープ性
リガンド分析対象は、少なくとも約５，０００、通常少
なくとも約ｉｏ．ｏｏｏの分子星を有するであろう。ポ
リ（ア旦ノ酸）の類において、興味あるポリ（アミノ酸
）は、通常約５，０００〜５，０００，０００の分子量
、より普通には約２０，０００〜１，０００，０００の
分子量であり、興味あるホルモン類においては、分子量
は通常約５，０００〜６０．０００の範囲であろう。

蛋白質類の広範囲のものは、類似する＠造的特徴を有す
る蛍白質、特定の生物学的機能を有する蛋白質、特定の
微生物、特に疾患原因となる微生物に関連する蛋白質の
群と考えられる。

単エピトープ性リガンド分析対象は、一般に約１７ １００〜２．０００の分子量、通常は１２５〜１，ＯＯ
Ｏの分子量である。興味ある該分析対象は、薬剤、代謝
物、殺虫剤、汚染物質等を含む。薬剤に含まれる興味あ
るものは、アルカロイド類である。アルカロイド類のう
ちに含まれるものとして、モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デクストロメトロファン、それらの誘導体類および
代謝物を含むモルヒネアルカロイド：コカインおよびペ
ンゾイルエクゴニン、それらの誘導体および代謝物を含
むコカインアノレノＪロイド；リピルジン酸のジエチノ
レアミドを含むエノレゴトアノレカロイド；ステロイド
アルカロイド；イよナゾイルアルカロイド；キナゾリン
アルカロイド；イソキノリンアルカロイド；キニンおよ
びキニジンを含むキノリンアルカロイド；ジテルペンア
ルｊｙ　ｏイド、それらの誘導体および代謝物がある。

薬剤の群として続くものに、エストロゲン、アンドロゲ
ン、アンドロコルチコルステロイド、パイル酸、強心性
グリコシド類を含むステＬ１イド類、およびジゴキシン
、ジゴキシゲニン、サボニン、１８ サボゲニンを含むアグルコン類、それらの誘導体および
代謝物が含まれる。ジエヂルスチルベスト１」一ル等の
ステロイド類似物質ちまた含まれる。

薬剤にお１プる次の群は、フェノバルビタールおよびセ
コバルビタール等のバルビツエート、ジフ−［ニルヒダ
ン１−イン、ピリミドン、エトスクシイミド、およびそ
れらの代謝物を含む、５〜６員環を有するラクタム類で
ある。

薬剤にａ３　＆ｊる次の群は、アンフ１タミン、■フエ
ドリンを含むカテコールアミン、Ｌ−ドーパ、エビネフ
リン、ナルセイン、パバベリンを含む、２〜３個の炭素
原子のアルキルを有するアミノアルキルベンピン類、お
よびそれらの代謝物である。

薬剤における次の群は、オキサビパム、クロルブロマジ
ン、テグレトール、イミブラミンを含むベンズ複素環化
合物類およびそれらの誘導体および代謝物であり、該複
素環ｔよ、アゼピン、ジアゼピンお上びフ］−ノチアジ
ンである。

薬剤における次の群は、テオフィリン、カフェインを含
むプリン類、それらの代謝物および誘導１つ 体である。

薬剤におりる次の群ｔま、カンナビノールおよびテトラ
ヒド１］カンナビノ〜ルを含むマリワナから誘導される
ものを含む。

薬剤における次の群は、Δ、例えば８１２等の１３、Ｃ
，ＤＸＥおよびＫ１葉酸、チアミン等のビタミン類を含
む。

薬剤における次の群は、ヒドロキシル化および不飽和の
程度および部位において異なるプロスタグランジン類で
ある。

薬剤にお（する次の群（よ、ペニシリン、クロマイセチ
ン、テ１ヘラサイクリンを含む抗生物質、その代謝物お
よび誘導体を含む。

薬剤におりる次の群は、ＡＴＰ，ＮＡＤ、ＦＭＮ，アデ
ノシン、グアノシン、チくジンおｊ：びシヂジンを、適
当な糖およびボスフエート防換基を右して含むメクレオ
シド類およびヌクレオヂド類である。

薬剤にお（する次の群は、メタドン、メプロバメート、
セロトニン、メペリジン、アミトリプチ２０ ン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロ力インアミド
、アセチルブロ力インアミド、プロプラノロール、グリ
セオフルビン、バルプ口イン酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ　ａ
ｃｉｄ　）　、プチロフエノン、抗ヒスタミン類、アト
［１ピン等の抗コリン作動薬を含む他の個々の薬剤、そ
れらの代謝物および誘導体である。

疾病状態に関連する代謝物は、スペルミン、ガノクトー
ス、フエニルピルビン酸、およびボルフィリンタイプ１
を含む。

薬剤におＤる次の群は、ゲンタマイシン、カナマイシン
、トブラマイシン、およびアミ力シン等のアミノグリ」
シド類である。

興味ある殺虫剤のうちには、ポリハロゲン化ビフエニル
、リン酸エステル、ヂオホスフエート、カルバメート、
ポリハロゲン化スルフエンアミド、それらの代謝物およ
び誘導体がある。

受容体分析対象については、分子量は、一般には１０．
０００〜２×１０８の範囲、通常は１０．ＯＯＯ〜１０
６である。免疫グロブリン類、２１ ＩＯＡ，ＩｇＧ，ＩｇＥ，およびＩＱＭについて転よ、
分子斑は一般に約１６０，０００〜１０６の範囲で変化
する。酵素類は、通常は約１０．０００〜１，０００，
０００の分子量の範囲である。

天然の受容体は、広範囲で変化し、一般に少なくとも約
２５．０００の分子量を有し、アビジン、ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ、ヂロ４ｖン結合グロプリン、チロキザン結合ブレア
ルプミン、１ヘランスコルチン等を含めて、１０６また
はそれ以上の分子社であってもｊ、い。

特異的結合対（　”　ｓ　ｂ　ｐ要素″）は、表面上ま
たは空孔内に特異的に結合する領域を有し、これによっ
て他の分子の特定の空間的および極性機構に相補的と定
義される２種類の異なった分子の一方を意味する。特異
的結合対の要素は、リガンドおよび受容体（抗リガンド
）と称される。これらは、通常は、抗原一抗休等の免疫
学的対の要素であり、ビオチンーアビジン、ホルモンー
ホルモン受容体、核酸二重鎖、ＴｑＧ一蛋白質Ａ，ＤＮ
Ａ１）　Ｎ　Ａ　，　ｌ）　Ｎ　Ａ−Ｒ　Ｎ　Ａ等は免
疫学的対ではな２２ いが、本発明に包含される。

゛リガンド″は、これに対する受容体が天然に存在する
か、あるいは調製可能な何れかの有機化合物を意味する
。

゛受容体″は、例えばエピトープ性または決定部位等の
分子の特定の空間的および極性機構を認識し得る何れか
の化合物または組或物を意味する。

例示的な受容体は、チロキサン結合グロプリン、抗体類
、酵素類、Ｆ’　ａ　ｂ断片、レクチン類、核懐類、蛋
白質へ、補体成分Ｃ１Ｑ等の天然に産生ずる受容体類で
ある。

′゛ビーズ″は、非多孔性および多孔性粒子を意味づ゛
るが、非多孔性粒子が奸適である。該ビーズは、ｓｂｐ
要素が非拡散的に結合し、リガンド媒体に溶解せず、ま
た４よ逆に反応しない何れかの都合のよい材料であって
よい。通常ビーズは、ボリスチレン、ポリアクリレート
、ポリアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリウレタンテフ
ロン等のプラスチックであり、あるい（よ！ｌＦましく
はセラミック、例えばて１英、ガラス等に包囲された鋼
、ニッケル、２３ 銅等の金属であってよい。第一義的な要求は、それらが
液体アッセイ媒休Φに没せられた際に沈降して、該液体
を容れた容器の底部にビーズの床または担体を形成する
ために充分な比重を有することである。ビーズは、通常
、ほぼ均一な、好ましくはＯ。２〜２．５＃の大きさで
、粗または平滑な表面、好ましくは平滑であるものと定
義される。

女ｆましくは、該ビーズは、円形または長円形、通常は
およそ球形であり、非特異的結合を最小化する表面物性
を有している。本発明の結合アツセイにおいて使用され
ているように、該ビーズは、通常多官能性であり、抗体
、アビジン、ビオチン、レクチン、蛋白質Ａ等のｓｂｐ
要素に結合しているか、あるいは特異的非共有性結合し
得るであろう。

゛標識″は、ｓｂｐ要素に接合されるイｉ号発生系の要
素を意味する。該標識レま、｝１」１位体性または非同
位体性であることができ、酵素等の触媒、蛍光剤、染料
または化学発光剤等の色原体、放射性物質、粒子等を含
み、通常は非同位体性である。

２４ ゛信号発生系″は、１個以一Ｌの戊分からなり、少なく
とも１つの成分が標識である信号発生系を意味する。該
信号発生系は、ＫＩｌ中の分析対象の存在または量に関
連する信号を生或する。該信号発生系は、測定可能な信
３を発生させる為に必要なづ−べての試薬を含んでいる
。該標識は、通常、分析対象の類似物まＩこは分析対象
の結合代用物であり得るｓｂｐ要素に直接または間接に
接合されるか、あるいは、分析対象または分析対象類似
物に直接または間接的に結合し得るｓｂｐ要素に接合さ
れるであろう。信Ｅ発生系の戒分は、放剣活性物質、補
酵素、酵素性生戒物と反応する物質、酵素、および触媒
、囚休粒子、蛍光剤、着色剤、ノテックス粒子等であっ
てよい。該信号発生系は、外的手段、好ましくは、粒子
の凝集度合の測定、または電磁輻銅の使用、望ましくは
可視試験により検出可能な信月を提供する。多くの場合
、該信号発生系は、着色性基質が酵素的に変換されて紫
外または可視領域の光を吸収する染料を生じる着色性基
質および酵素、リン光物買、蛍光剤、化学２５ 発光剤、放銅活性原子、電気的活性基等に関連する。

該情弓発生系は、通常酵素である少なくとも１種の触媒
、および少なくとも１種の基質を含むことができ、また
２種以上の触媒と複数種の基質とを含んでもよく、１つ
の酵素の埜質が他の酵素の生或物であるような酵素の組
合せを含んでもよい。

該信号発生系の操作は、試料中の分析対象の量に関連す
る検出可能な信８を与える生或物を生或することである
。

特に興味あるものは、過酸化水素の産生に関与する酵素
、および染料前駆体を染料に酸化するための過酸化水素
の使用である。特定の組合せは、グルコースおよびガラ
クトースオキシダーピ等の粘類オキシダーゼ、またはウ
リカーゼおよびキサンチンオ↓シダーゼ等の複素環オキ
シダーピを、過酸化水素を染利前駆体の酸化のために使
用する酵素、すなわちセイヨウワサビペルオキシダーピ
、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダ
ーゼと組合せて含む。本発明において特にｙｔ！２６ 味あるものは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素系
の使用である。

゛非特異的結合′″しよ、特定の表面構造とは相対的に
独立した、標識または分子の表面に対する非共有的結合
を意味する。このような非特異的結合は、異なって葡電
した粒子間、または異なる電荷を有する多価イオン性試
薬を使用した場合には同様に荷電した粒子間の電荷また
は静電相互作用の結果として通常生じる。非特異的結合
は、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力
等によっても生じ得る。

゛補助林料″は、本発明によるアッじイにおいて使用さ
れる種々の付加的な材料を意味する。例えば、アッセイ
媒体の安定剤およびアッセイ成分に加え、アッセイ媒体
中には普通、緩衝剤が存在する。これらの添加物に加え
、しばしばアルブミン等の付加的な蛋白質、界面活性剤
、特に非イオン性界面活性剤、ポリアルキレングリコー
ル等の結合増強剤等が含められてもよい。

上述したように、本発明の一面としては、液休２７ 媒体からのｓｂｐ−標識接合体の分離方法に関与する。

該方法は、接合体を含有する液体媒体を、接合体に直接
または間接結合し得るｓｂｐ要素が結合したビーズと、
該接合体が該ビーズに結合する条件下で合するこどを含
んでなる。完全な分離を達成するために、好ましくは、
接合体を含む液体媒体は、ビーズ担体を完全におおうた
めに必姿な量より有意に過剰ではなく、またビーズをｄ
３おうに不充分な体積でよく、ビーズに結合するｓｂｐ
要素の量（よ、少なくとも全接合体を結合つるために充
分なしのである。しかしながら、液体の体積が、ビーズ
をおおうに必装な体積を実質的に越える分ＩＩＩＬｈ法
も本発明に包含される。いずれの場合にも、分離誘導方
法も同様である。インキュベート後、該液体媒体は、第
１に担体と共にインキュベートされ、これは別途ろ過装
置を備えておらず、従って液体に対して不浸透性である
容器内で通常は行なわれる。次いで、媒体は吸引によっ
てビーズから分離される。該吸引は、吸引用管体を用い
て行なわれ、該管休は、それが円形の２８ 断面を有する場合には接触する最小のビーズの直径より
小さい直径を有する１個以上の孔、好ましくは１個の孔
を有する。該管体断面が円形ではない場合には、孔の少
なくとも最短または最長の断面直径が、対応するビーズ
直径より小さくなければならない。結果的に、液体は、
ビーズの損失なしに効率的に担体から分離される。

本発明の実施において、通常水性の液体媒体が使用ざれ
る。その他の極性溶媒、アルコール類、エーテル類を含
め、１〜６個、通常１〜４個の炭素原子を有する含Ｍ素
有機溶媒も使用される。通常これらの共溶媒は、約４０
重量パーセント未満、より普通には約２０重量バーセン
ト未満で存在する。一般的には、Ｆｉｌ範囲５〜１０，
より普通には６〜９が使用される。アツセイにおけるｐ
Ｈについて他に考慮されることは、信号発生を最適化す
る一方、ｓｂｐ要素の結合を有意な水準に保つことであ
る。ある場合において、これらの考慮点の間で妥協点を
得ることになるであろう。種々の緩衝剤が、所望のｐＨ
を達戒し、また測定の間、ｐｌ−１を帷２９ 持するために使用される。例示的に緩衝剤は、ボレー１
ヘ、ホスフエート、カノレボネート、トリス、バルビタ
ール等を含む。使用される特定の緩衝剤は、本発明にお
いては臨界的ではないが、個々の分離またはアッセイに
おいてある緩衝剤が他のものより好ましいことはあり得
る。

分魅およびアッセイを実施するため（こ、中程度の温度
が通常採川され、普通には該方法を行なう間において一
定温度が使用される。アツセイ、特に免疫アツセイに関
し“Ｃ温度は、一般的に約Ｏ゜〜５０℃、より普通には
約１５°〜／ｉｏ’ｃの範囲である。

種々の試薬の濃度は、一般的には液体媒体中のｓｂｐ要
素またはアツセイにお（ノる分析対象の濃度範囲により
決定されるが、各試薬の最終濃度は、通常、興味ある範
囲にわたっての分離またはアツセイの感度および特異性
を最適化するように経験的に定められるであろう。

結合アッセイにおいて、水性媒体は、信号発生系の１種
以上の要素を含むことができる。該信号３０ 発生系の種々の要素の濃度は、分析対象の興味ある１度
範囲および関白する測定またはアッセイの型に依存して
変化するであろう。一般的な点としては、信号発生系の
種々の要素の濃度は、分析対象の興味ある１度範囲に関
連をもって発生する信号を最適化寸るように選択される
であろう。

本発明は、分析対象を含むと考えられる試料中の分析対
象のアッセイについて応用される。分析対象は、ｓｂｐ
要素である。該アッセイの一例において、該試料は、媒
体中に分散されるか、あるいは５０〜５０，０００、好
ましくは２００〜２０００個のビーズからなる担体のビ
ーズ表面に結合されていてもよい分析対象に対して、相
補的な第１のｓｂｐ要素を含んでなる通常水性の液体媒
体中に合せられる。該ビーズは、同時に、または引続い
てｅｊ！識を結合した第２のｓｂｐ要素に接触させられ
る。該標識は、試料中の分析対象の量に関連をもって検
出可能な信号を発生するための信号発生系の少なくとも
一部である。該第２のｓ　ｂ　ｐ要素が該ビーズに結合
することを許容する３１ インキュベーション後、非結合第２ｓｂｐ要素は、媒体
の吸引により除去され、次いで該ビーズは、信号発生系
の残る要素と合せられ、分析対象の量または存在が、信
号との関連において測定ざれる。

本発明の好適な実施において、Ｓｂｐ要素である分析対
象を含むと考えられる試料は、相補的ｓｂｐ要素および
該相補的ｓｂｐ要素に標識が結合ざれない場合には標１
’！　Ｓ　ｂ　Ｄ要索と共に液体媒体中に合せられる。

該媒体は、同時に、あるいは後に該媒体中に存在ずるす
べての相補的ｓｂｐ要素が直接的または間接的に完全に
結合するために充分な量のｓｂｐ要素が結合されたビー
ズ担体に接触され、ここで媒体の体積は、該担体表面を
ちょうどおおうか、あるいはおおうに不充分であり、こ
れによりビーズと標識ｓｂｐ要素との結合のための接触
が確実なものどなる。該媒体のビーズとのインキュベー
シ日ンに続き、該媒体が吸弓により除去される。該信号
発生系のいずれかの残る要素を添加後、結合標識を含む
ビーズは、分析対象の存在または量の指標としての検出
可能な信３２ 号の存在について試験される。

本発明の特に好ましい実施態様において、ｓｂｐ要素、
通常抗原である分析対象を含むと考えられる試料は、ビ
ーズ表面に結合されるが、あるいは結合可能である相補
的ｓｂｐ要素、通常抗体と、水性媒体中に合せられる。

分析対象の存在の働きとして相補的ｓｂｐ要素に結合可
能であり、かつ標識に結合されるか、あるいは結合可能
である第２のｓｂｐ要素もまた、水性媒体中に合せられ
る。次いで、該媒体は、標識およびビーズ担体に、これ
らが未だ存在していない場合には合せられ、該混合物は
標識がビーズに結合することを許容すべくインキコベ−
１へされる。次いで、ビーズの吸引を阻止寸るように設
計された吸引用管体を担体中に挿入し、吸引により水性
媒体がビーズから分離される。選択的に、次いで洗浄溶
液を添加し、吸引除去するこどもできる。該ビーズの密
度および大きさの故に、該ビーズは洗浄溶液の水流によ
り容易に懸濁され、次いで該ビーズからの洗浄溶液の効
率的吸引を可能とすべく急速に沈降す３３ る。

次いで、ビーズ担体上の標識の存在または量が、分析対
象または分析対象の特定量を含むことが知られている試
料を用いた場合に、担体上に捕捉された標識の量に関連
して測定ざれる。

便利の為に、アッセイを行なうための試薬類は、分析対
象のアッセイで使用するあらかじめ定められた量をもっ
て容器の組合せにおｔするキットとして提供され得る。

該キットは、■分析対象に相補的なｓｂｐ要素、０分析
対象または分析対象に対する受容体に特異的に結合し得
るビーズ担体で、該ビーズは平均直径０．２〜２．５ｍ
ｍを有するもの、および０分析対象または分析対象に対
する受容体に結合するか、または結合し得る標識を含ん
でなる。該キットは、試料中の分析対象の亀に関連して
信号を発生ずるための他の試薬を含んでもよい。付加的
に、該キットは、更に粒子間の結合を戻寸ための解放試
薬を含むことができる。補助的試薬を、必要に応じて含
めることができる。

ここに記述する本発明において、該ビーズは、３４１ 通常非多孔性、通常ガラスまたはラテックスであり、ま
た普通には０．２と２．５咽との間の平均直径である。

最も好ましくは、該ビーズは、平均直径０．５〜２Ｍで
ある。該ビーズは、通常、ほぼ球形であり、粗または平
滑表面を有してもよい。

結合アツセイにおいて有用であるためには、該ビーズは
、特定の表面物性を有していなＵればならない。該表面
４よ、Ｍ＋Ａ識およびｓｂｐ要素に対して低い非特異的
結合を有さねばならず、その一方、分析対象またはその
相補的ｓｂｐ要素に結合した標識を、結合していない標
識から分離する効率的手段を提供する。ビーズの大きさ
および形は、液体媒体の体積に対するビーズ表向の比を
最大とするように選択され、その一方、ビーズ担体への
吸引用管体の容易な挿入、および担体からの液体媒体の
効率的な分離を許容する。高い表面対体積比は、標識の
ビーズへのより迅速な結合を可能とするが、効率的分離
を妨害するより小さいビーズの使用を必要とする。通常
、０．５〜１．５ａのように０．２〜２．５＃の大きさ
の範囲にあるご−３５ ズが、最も有用であることが見出された。史には、結合
容量を最大にするために、ビーズ上のｓｂｐ要素の表面
密度を最大にすることがしばしば必姪となる。一般に、
表面密度は、少なくとも１０，０　０　０　ｎｍ２あた
りに１個のｓｂｐ要素分子、好ましくは、１　０　０　
０　ｎｍ２あたりに１個、最も好ましくは１　０　０　
ｎｍ２あたりに１個であるべきであり、ビーズに接触す
るアッセイ媒体中に存在するすべての相補的ｓｂｐ要素
が結合するために充分に高密度であることが好ましい。

ビーズの高度の表面積のために、背景非特異的結合が低
く保たれるように表面の物性に注意しなければならない
。ビーズに結合されるｓｂｐ要素としてアビジンを用い
た場合には、ビーズへのアビジンの結合後にシュクロー
スの存在下でガラス粒子を乾燥させることにより、非特
異的結合が低減され得る。糖類に加えて有用であること
が見出されＩζ被覆の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）　、ポリ（ビニルアルコール）、カゼインおよび脱
脂乳を含む。

３６ ビーズから液体を吸引除去するために使用される吸引用
管体は、１個以上、通常は１個の孔を有する。円形、長
円形、四角形または他の都合のよい形を有するであろう
孔は、吸引の際にビーズにより管が詰まることを防止す
る形とされる。好ましくは、該管体は０．５−３ｓの外
径を有して１０休中への容易な挿入を可能とし、円筒形
の場合には、０．１〜１ｍｌ、より菖通には０．２〜０
．５問の口径を有するど都合がよい。管休の孔の大きさ
は、その形状にかかわらず、常にビーズが管体内に吸引
され得ない程度である。ビーズの吸引防１［は、好まし
くは管休の孔をビーズｊ、り小さくすることで得られる
。別法として、孔はビーズ直径より大きく、しかしなが
ら、ビーズの管内への吸引を妨げる多孔性フリット、メ
ンブレンドまたは綱によりおおうことができる。該管体
は例えば鋼、ポリプロピレン、ノイロン、チタン等の担
体への侵入を８′１容するために充分な剛性を為する都
合のよい材料で作製されてよく、通常蛋白質を容易に洗
浄除去できる表向、特にビーズによりすりへら３７ されない滑かな表面を有するであろう。

該ビーズは、それらの表向にｓｂｐ要素が結合されるよ
うに処理され、この要素は直接的または間接的に分析対
象または分析対象に相補的なｓｂｐ要素に特異的に結合
するであろう。本発明の好ましい実施において、該ビー
ズは、種々の異なるアツセイに使用されることが可能と
なるであろうリガンドまたは受容体が結合される。例え
ば、アビジンは、０．５〜１．５ｍｍの球形ガラスピー
ズに共有結合ざれ得る。これらのビーズ担体は、水性媒
体中において分析対象に対するビオチン標識抗体類、分
析対象を含有する試利、および、溶液中の分析対象の量
の関数としてビオチン標識抗体に結合するであろう標識
抗体またはリガンドと共に混合される。ビオチンはビー
ズに結合され、またビオチンは何れの抗体にも結合され
得るため、同様なビーズがほとんどの抗休一抗原対に刻
して使用され得る。標識抗体またはリガンドのビオチン
化抗体への結合、および後省のビーズへの結合を許容す
るために充分なインキュベーション後、３８ 該溶液は、上記管体を用いた吸引によりビーズから除去
される。次いで洗浄用溶液が、同じまたは異なった管体
にＪ：り加えられ、液体が再度吸引される。洗浄リイク
ルの反復後、標識が検出され、該樵識の黴が試料中の分
析対象の最と関連付けられる。

本発明の方法の利用（よ、先に定義した分析対象に対す
るいずれの異種結合アッセイにも適川され得る。特定的
なアッセイは、例えばジゴキシン、トリイドチロニン（
’ｌ−３）、甲状腺刺激ホルモン（　Ｔ　Ｓ　ｌ−１　
）　、甲状腺結合グロプリン（　−Ｔ−　Ｂ　Ｇ　）、
ビタミンＢ１２、肝炎抗原（例えば、口１３，Ａｑ）、
および肝炎抗体、ヒト免疫不全ウィルス（口ＩＶ）関連
抗原および抗体に対するアッセイを含む。各系において
、分析対象に相補的なビオヂン化抗体または抗原が使用
される。アビジン以外のｓｂｐ要素、ハプテン、抗体、
抗原、核酸結合蛍白質、オリゴヌクレオブド、蛋白質Ａ
等の受容体等はビーズに結合ざれてもよく、ここで、分
析対象に相補的な抗体もしくは抗原に対して接合する相
補的３９ ｓｂｐ要素が使用される。

これらのアッセイにおいて、何れかの都合のよい標識が
使用され、これはしばしば酵素であり、好ましくはアル
カリ性ボスノアターピまたはセイヨウワ゜ナビペノレオ
キシタ゛−ゼ（口ＲＰ）等のペノレオキシダーゼである
。小分子についてのアツセイにおいて、標識は分析対象
の類似体に直接的に接合され得る。しかして、ジゴキシ
ンおよび「３のアッセイにおいて、これらの化合物は口
ＲＰに共有的に結合されて標識一ｓｂｐ要素接合体を与
える。

ＴＳ目のアッセイにおいて、Ｈ　Ｒ　Ｐに接合寸る抗休
を、−’ｌ−　Ｓ日に結合でき、ビーズに結合される第
２の非競合ビオチン化抗体と共に使用することができる
。両抗体および試利と共にビーズを３０〜６０分間イン
キュベート後、該溶液は除去され、該ビーズが４回洗浄
され、次いでテ１へラメチルベンジジンおよび過酸化水
素溶液と共にインキュベートざれる。１５分以内で溶液
中に発色し、これは該溶液をビーズから吸引後、または
溶液ビー４　０ ズ混合物の希釈によりビーズを沈ませてビーズをおおう
溶液の吸光度を直接測定可能として分光学的に測定され
得る。

上述の異種リガンドアッセイの一変法にｄ３いて、フル
オレセイン等のハプテンはｓｂｐ要素に結合する口Ｆ＜
　Ｐを置換し得る。このような系において、抗−ＴＳ口
−フノレオレセイン、ジゴキシンーフノレオレセインお
よびＴ３−フルオレセイン接合体が、酵素接合体に代え
て使用され得る。次いで、口ＲＰ−標識抗フルオレセイ
ン接合体が、アッセイ媒体に含められ、あるいはビーズ
とアツセイ媒体とのインキュベーション後にビーズに添
加される。このような系の利点は、単一の酵素試薬がす
べてのアッセイに対して使用され得ることである。

このことは、工程がしばしば不安定であり、また異なる
酵素接合体の起こり得る非特異的結合のために問題を有
タる各アッセイについての異なる抗体を用いた酵素接合
体の調製の必要性を削除する。

対照的に、異なる抗体に対するノルオレセインの結合は
、比較的に単純であり、かつ再現性ある工４１ 程である。

本発明の他の好適な実施態様において、すべてのアッセ
イは、同じ２種類の一般的試薬、アビジン等の一般的受
容体が結合する非多孔性ビーズ、おＪ；び抗一ノルオレ
セイン等の第２の一般的試薬が結合する酵素を使用する
。これらのアッセイの各々において、２種の付加的なｓ
ｂｐ要素が使用され、一つはビ詞チンに接合し、また一
つはフルオレセインに接合する。このようなアツセイに
４３いて、ビオチンおよびフルオレセイン結合ｓｂｐ要
素は、相互に、あるい１ま分析対象と、溶液相中にてビ
ーズ担体との結合に先立って結合され、ここでは、結合
反応が、分析対象の結合が酵素結合免疫吸着アッセイ（
ＥＬＩＳＡ）において普通起こるような表面における場
合よりも更に急速に進行する。

ＴＳ口特異性ＴＳ口等の多価エビトープ性の分析対象の
アッセイにおいて、本発明のアビジン被覆ガラスビーズ
による後段での捕捉のために、抗体類がビオヂンと接合
される。第２のＴ　Ｓ　Ｈ特異４２ 性抗体は、フルオレセインと接合される。酵素接合体は
、抗−フルオレセイン抗体に連結された１−Ｉ　Ｒ　Ｐ
を少なくとも１種有している。すべての戒分の混合物を
短時間インキュベ−１〜した後、アビジンで被覆された
ガラスビーズが添加されて複合体（ビオチンー抗体：Ｔ
Ｓ口：抗休一フルオレセイン：抗一フルＡレセインー口
１｛Ｐ）を表向に結合する。

充分な量のビーズを含む担体を、全抗体一試料インキュ
ベーション体積が、ビーズ間の空間に完全に捕捉される
ように添加される。このことは、表面対体積比を最大と
し、また比較的に短かい拡散距離を与え、これによって
振とうすることなくビオヂン化抗体の定抛的結合を許容
する。

次いで、該ビーズの表面は、ビーズ担体の底部に吸引用
管体を挿入し、次いで洗浄溶液を加え、また吸引するこ
とにより洗浄される。該ビーズの密度および大きざのた
めに、該ビーズは、洗浄溶液の水流により容易に懸濁さ
れ、次いで急速に沈降する。該ビーズは、充分に大きく
、洗浄プ［１−４３ ブによって吸引されない。次いで基質を、該ビーズが完
全におおわれるに充分な体積において添加し、および、
適当な時間インキコベートした後に酵素生或物の量を光
測定的に測定し、分析ス４象の既知量の試料を用いて得
られた生或物量と比較する。

いくつかの好適な実施態様における本発明の化学および
方法論は、標準的ＥＬＩＳＡ化学に対して以下の重要な
利点を為している：１）アビジン被覆ガラスビーズは、
づべてのアツセイにおける一般的試薬である；２）溶液
相における分析対象の抗体との結合は、抗体固定化固体
表面上で達或されるものと較べて、極めて迅速な動力学
を生ずる；３）高い抗体結合容量を伴う広いＩｉ１体表
面積が、捕捉の迅速な動力学を生ずる；および捕捉表面
を定檄的に加える必要がない。

更には、抗一フルオレセイン−１−Ｉ　Ｒ　Ｐ接合体は
、すべでのアッセイに対して一般的であり、また、最適
化および安定化すべき唯一の酵素試薬である。

このことは、各アッセイのために別個のＮ−素試桑４４ が必要な標準的ＥＩＩＳＡ様式とは対照的である。

ビオチンまたはフルオレッセインを抗体またはハブデン
に結合するための化学は単純かつ効率的である（例えば
、Ｄ．　Ｈ．　ＢＯＯｒＳｍａ　，Ｉｍｍｕ’ｎＯｃｙ
ｔｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ　，　２　＋　１　５　５　（
　１　９　８　３　））。

ビオチンまた（まフルＡレセイン接合体の安定性は、接
合体に使用された抗体と同程度である。

例 以下の例は、例示的なものであって、本発明を限定する
ものではない。別途示さない限り、試薬類は商業的な供
給者から得、利用できる場合には！ｌＩ造者の指示に従
って使用した。

これらの例において、アッセイプロトコールに記載され
たインキュベーション後のビーズからの液体媒体の吸引
、および引続く洗浄溶液の吸引は、真空系に連結され、
ビーズを通して反応ガラス試験管の底部に挿入された細
い鋼管（ビーズが管内に入らないような）を用いて行な
った。

例を通じて下記の略月が使用されている：ＡｂＤｉｇ　
　　　抗ジゴ：［シン抗体ＡｂＦ　　　　抗一フルオレ
セイン抗体Ａｂ１３　　　　抗一トリイオドチロニン抗
体八ＮＳ　　　　　８−アニリノナフタレン−１スルホ
ン酸 ビオヂン−Ｌ（＞ＮＨＳ　　スクシンイミジル６−　（
ビオチンアミド）へキサ ノエート Ｂ　ｉ　Ｓ−Ｎ口　　２．２′−オキシビス（エヂ２ ルアミン） ＢＳＡ　　　　　ウシ血清アルプミン ＤＣＣ　　　　　Ｎ，Ｎ’　−ジシクロへキシルノノル
ボジイくド Ｄｉｐ　　　　　ジゴキシン Ｄ＋ａ−ＣＭＯ　　ジゴキシン力ルポキシメブ−ルオキ
シム Ｄ　ｉ　ｑ一ＬＣ−ド　ジゴキシン力ルボキシメチルオ
キシム−ＬＣ−Ｎ口ーカル ボキシフルオレセイン Ｆ　　　　　　フルＡレヒイン ＥＤＡＣ　　　　１−エヂル３（３−ジメヂルア４６ ４５ ミノプロビル）カルボイミド Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　エヂレンジアミン四酢酸四ナ１
ヘリウム塩 ［＝　　　　　　フルオレセイン Ｆ　−　Ｃ　＜）　Ｏ　ｌ−１　　６−カルボキシノル
オレセインｒ’　−　Ｌ　Ｃ　−　Ｎ　ｌ−１　．２　
　カルボ１シフルオレセインＬＣ−Ｎ　　ト１２ ＧＢ　　　　　　ガラスビーズ １−Ｉ　Ｒ　Ｐ　　　　　セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ ＬＣ　　　　　　３．３’　−ジアミノーＮ−メチルジ
プロピルアミン ＮａＰ　ｉ　　　　リン酸ナトリウム緩衝液Ｎ　Ｈ　Ｓ
　　　　　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドｏ／ｎ　　　
　　一夜 Ｐ　Ｂ　Ｓ　　　　　リン酸塩緩衝食塩水Ｓｕｌｆｏ−
Ｎ　ｔ−ｌ　Ｓ　　スルフ−ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド Ｔ３　　　　　　３．３’　．５−１−リイオド−［チ
ロニン ４７ ＴＭＢ　　　　　３．３’　．５．５’　−テ１〜ラメ
チノレベンジジン−２口Ｃｌ ＴＮＢＳＡ　　　２．４．，６−トリニトロベンズスル
ホン酸 例１：ジゴキシン検　のための　　　　基アッセイ 材料の調製 翳 該試薬を、２つの連続する工程において調製した；１）
天然の目ＲＰの２個の反応性アミノ基を、スクシニル化
によりカルボキシル基に変換してｌ　Ｒ　Ｐ−Ｃ　Ｏ　
Ｏ　Ｈとした；２）次いで、ＨＲＰＣＯＯ目を過剰崩の
オキシビス（エチルアミン）およびＥｌ）ＡＣと反応さ
せて口Ｒ　Ｐ−スクシニルービス＝Ｎ口，を生戊させた
。

Ｈ　Ｒ　Ｐのスクシニル化 ０．１Ｍボノックス（ＢＯｒａＸ　’）中の２０ｍｇ／
ｍｌ−４　８ の口ＲＰ溶液２ｍＬに、室温にてＤＭＦ中の２．５Ｍ無
水こはく酸４０μＬを加えた。２０’　間撹拌した後に
、更に４０μＬの無水こはく酸溶液を加え、該混合物を
室温にて更に１時間インキュベートした。低分子祠料を
、０．００５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）／
ｐＨ＝７．０にて平衡化したヒファデックスＧ−２５カ
ラムにて反応混合物を生成することにより除去した。Ｈ
ＲＰ−ＣＯＯ口は、Ａｍｉｃｏｎ　　ＹＭ　−　１　０
メンブレンを用いて２０ｍｇ／ｍＬ　　ｌ−ＩＲＰ−Ｃ
ｏｏｌ−ｌまで濃縮した。

該反応は、ゲル電気泳動および反応性アミノ基のＴ　Ｎ
　１３　Ｓ　Ａ　Ｗ４定に引継がれた。

スクシニル化口Ｒ　Ｐへの反応性アミン基０．Ｏ０５Ｍ
　　ＮａＰｉ／ｐｔｌ＝７．０中の２０Ｒｇ／ＩＩ＋Ｌ
　　（Ｄ目ＲＰ−Ｃｏｏｌ−１　　１ｍＬに、固体２，
２′−オキシビス（エチルアミン）ジヒドロクロライド
８．８６Ｉｎ９を加えた。該反応混合物のｐＨを、０．
２Ｍ　　Ｎａ　　ＨＰＯ４を用いＴ７．Ｏに再調２ 整した。この混合物に、１４ＲｇのＥＤＡＣを加え、該
反応混合物をゆるやかに撹拌しつつ４℃にて２４９ 時間インキコベートした。未反応の低分子ｆｌ利を、０
．０５Ｍ　　ＮａＰｉ，０．０５ＭＮａ（，１／ｐＨ＝
７．８により平衡化したセフノ７デックスＧ−２５カラ
ムで口ＲＰ−スクシニノレービスーＮ口，から除去した
。反応性アくノ基の類をＴＮＢＳＡにより測定し、ｌ−
Ｉ　Ｒ　Ｐ−スクシニルビスーＮ１１２あたり１．５１
を得た１，該１−Ｉ　Ｒ　Ｐスクシニノレー．ビスーＮ
口２をＣＭ−セファデックスｌ−５０）にて精製し、２
種の主生戊物、（１）１個のアミノ具をイ１するｌ−Ｉ
　Ｆ＜　Ｐ−スクシニルビスーＮ　＋−１　２および（
２）口ＲＰあたり２個のアミノ基を有する口ＲＰ−スク
シニルービスＮト１２に分離した。

２．　ジゴキシンーＮｌ−１８の調製 ２０ｆｆｌ！ｊの［）ｉｇ−ＣＨＯ、５　ＩＱのＮ　Ｈ
　Ｓおよび９　ｍ９のＥＤＡＣを０．２ｍＬのＤＭＦ中
に含む溶液を、室温にて撹拌しつつ一夜（０／ｎ）イン
キュベートした。不溶性材別をろ過にて除去後、溶媒（
ＤＭＦ＞を回転エバボレータにより除去した。

生或物を４℃にて乾燥保存した。

５０ ３，　口ＲＰ−スクシニノレーオキシビス（エチ０．０
５Ｍ　　　ＮａＰｉ．０．０５　　　ＮａＣｊ！／ｐＨ
＝７．８中の１．　３１１１！？／ｍＬ　　ｌ−ｔＲＰ
−スクシニルービス−Ｎ目，（口Ｒ　Ｐあたり２個の反
応性アミノ呈を有する）の４ｍＬに、４℃にてＤＭＦ中
の１　ｕモル／ｍＬ　　ｌ）　ｉ　ｇ−ＮＩＩＳのｉ，
３ｍｌ−を添加した（４ｘ３２５μｌ−　：　３２５μ
Ｌ−のＤｉａＮ　ｌ−Ｉ　Ｓ溶液を１ｂ分おきに加えた
）。次いで該反応混合物を４゜Ｃにて撹拌しつつ３時間
インキュベートした。１５０μＬの２Ｍグリシン／ｐｌ
ｌ一８．Ｏを添加することにより反応を停止させ、室温
にて更に１時間インキュベートした。最終的に、該反応
混合物を遠心分離にかけて不溶性物質を除去し、０．０
５Ｍボラックス中でセフ７ｙ！ックスＧ−２５により精
製した。ＴＮＢＳＡを用いて残留する反応性アミノ基を
滴定することにより、ハプテン数が約２と評価された。

該接合体を４℃にて保存した。

５１ 抗一ジゴキシン抗体を、固定化蛋白質Ａにより精製して
、ＡｂｌＯＧ分画を得た。次いで、ＡｂＤｉｇ−ビオチ
ンを、Ａｂ（０．０５ＭＮａＰ　ｉ　，０．０５Ｍ　　
ＮａＣｊ！／ｐｌｌ７．８中に約２　−　２　．　５　
ｍ９／　ｍｌ−）およびビオチンーしＣＮＨＳ（第１に
ＤＭＦに溶解し、分別量を反沁に使用した）を混合し、
４゜Ｃにて３時間インキュベートした。該反ｌ６況合物
において、反応試薬のモル比は、Ａｂ：ビオチンーＬ　
Ｃ−Ｎ　Ｈ　Ｓ　一１：２５であった。非結合ビオチン
を、セファデックスＧ−２５カラムにより除去した。最
終接合体は、０．０５Ｍ　　ＮａＰ＋、０．００１％チ
メロザル＜Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ＞　／ｐＨ＝　７　．
　４中で４℃または凍結して保存した。

Ｃ．　　Ｄｉｑ−ＬＣ−１−の調製 この試薬は、（１）Ｆ−Ｎ｝−１８、（２）Ｆ−ＬＣＮ
口，および（３）　Ｄ　ｉ　ｇ−１−Ｃ−Ｆ＠調製する
連続する３工程で調製した。

１．　　　Ｆ−Ｎ＋−１８の調製 １〕Ｍ１−中の１００■７ｍＬ　６−カルポキシフノレ
５２ オレセインおよび３０．　６ｍｇ／ｍＬ　　Ｎｌ−１８
　　２ｍＬに、２　７　５Ｒｇ／ｍＬのＤＣＣ　　０．
４ｍＬを加えた。

該況合物を、室温にて暗室中でＯ／ｎ撹拌した。

形成されたジシクロへ１シル尿素を、ろ過により除去し
た。Ｆ　−　Ｎ　Ｈ　Ｓの形成は、ＣＩ−１２Ｃ口，：
メタノール：酢酸−８５：１５：１の溶媒系を用いたシ
リカプレート上の薄囮クロマトグラフィＴＬＣにて検査
した。ＤＭドを回転エバボレータにより除去し、生或物
（　Ｆ’　−　Ｎ　１１　Ｓ　）を史に高真空Ｆで乾燥
させ、４℃にて乾燥保存した。

１．５ｎ＋ＬのＬＣに、ＤＭ｝−中の１２５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ−ＮＨ３　　１、２’ｍＬを加え、室温にで撹拌しつ
つ、暗室中でｏ／ｎインキュベートした。モル比は、Ｆ
−ＮＨＳ　：　ＬＣ＝１　：　４０であった。該反応混
合物を、０．５Ｍ　　ＮａＰ　ｉ／ＤＩ１５．０にＴ：
１／２０に希釈し、該混合物のｐｌ＋をリン酸により５
．０に調整した。全混合物を、０．５ＭＮａＰ　ｉ／ｐ
ｌｌ＝５．０により平衡化したＢ　ｉ　ｏＲｅｘ７０カ
ラム＜２．５Ｘ１０ｃｍ＞に負葡した。負荷ｂ３ ？、該カラムを出発緩衝液により３，３′−ジアミノー
Ｎ−メチルジプロピルアミンがすべて除去されるまで洗
浄した（ＴＮＢＳＡ反応により監視）。該カラムを、６
−カルボキシフルオレセイン不純物を除去するために０
．００１ＭＮａＰ　ｉ　／ＤＨ＝６．　０にて洗浄した
。低イオン強度のＭｖｒＪ液による洗浄は、６−カノレ
ボキシフノレオレセインのみならずフルオレセイン含有
不純物も除去する。該ノＪラムを、脱イオン水（Ｄ一ト
１２０）にて洗浄して塩類を除去した。最終的に、該カ
ラムを０．８ＭＮ口。Ｏ口にて絞り出した。水酸化アン
モニウムは、凍結乾燥により除去しＩこ。純度の検査後
、生或物を−２０’Ｃにて乾燥保存した。

該反応は、ろ紙電気泳動（０．０５Ｍ　　ＮａＰ／ｐｔ
ｌ＝５．８、２０分間）およびＦＬＣ（Ｃ１８プレート
、Ｄ−１１２０中の５０％メタノールを溶媒として使用
）に続けられたくまた、生或物の純度を検査した）。

３・　　　ＤｉＱ−ＬＣ−　Ｆの二 ２３．Ｑ５ｑ（０，Ｑ５ｍｍｏｌｅ）の■ｉｇ５４ ＣＭＯ、５０．　３５１１１！？　（０．　１ｍ　ｍｏ
ｌ　）　ノ７）Ｌｔオレセイン−ＬＣ−Ｎｉ１２および
１９．２１１ｔ９（０．　Ｉ　Ｉｌｌ　ｍｏｌｅ）のＥ
ＤＡＣを、１．５ｍＬノＤＭＦ／ＤＭＳＯ　（５　：　
１）溶媒中に含む溶液を、室温にて賠空中で一夜撹拌し
た．，１〕ｔｏ−ＬｃＦ：およびＤ　ｉ　ｑ−ＣＭＯを
、３ｍＬのＤ−１−｛２０の添加により沈殿させ、ろ過
し、溶媒を廃棄した。

ろ別しｌこ＋Ａ利を、ＣＩ−Ｉ　　ＣＩ−１２＋メタノ
ール：？Ｉ１２ Ｍ−６０：４０＋５からなる溶媒系にＴｉ１溶解し、同
じ溶媒系をもってシリカゲル力ラム（１．５Ｘ２　０　
ｃｔｎ　）に負荷した。これらの条件下で、Ｄ１０ＣＭ
○は、ＤｉＱ−ＬＣ−１＝接合体に先行して移動し、Ｆ
一ＬＣ−Ｎ目，は、カラム頂部に残留した。拐料の純度
は、上述の溶媒系を用いたＴ　Ｌ　Ｃシリカゲルフ゛レ
ートおよびＤＨ＝５．８におりるろ紙上での電気泳動に
より検査した。該粘製材料から溶媒を減圧トで圓転エバ
ボレータにより除去し、生或物を最小体積のメタノール
／ＤＭＦ（７０　：　３０）に再溶解させ、遠心分離に
より不溶物質（シリカゲル）を除去した。最終工程は、
５５ 精製において可溶化し、生或物と共に溶出し１こであろ
うシリカゲルのはとｌυどを除去するために行なった。

該生或物を、メタノール／ＤＭＦ（７０：３０）溶媒系
中で−１０℃〜−２０’Ｃにて保存した。生或物の劃い
ま、既知量の６−カルボキシフルオレセインを用いて作
戒した標単曲線によりＡ４９ｏにて測定した。

Ｄ．　抗−フルオレセイン−１−Ｉ　Ｒ　｝）　　”　
　の“使用した抗一フルオレセイン抗体は、標準的モノ
クローナル抗体技術（　Ｈｉ　ｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．お
よびＫｏｈｌｅｒ，Ｇ．のＮａｔｕｒｅ　　　２　５　
６　　：　　４　　９　５　　（　　１　　９　　７５
））を用いて調製したモノクローナル抗一フルオレセイ
ン抗体であった。Ｈ　Ｒ　Ｐとの接合に先立って、これ
らの抗体を固定化蛋白質Ａにより、またはへｂｘ担体（
セフアクリルＳ−２００のサイジングとの組合せ）によ
りＴｇＧ分画にＩＩした。

後者の操作ｐＨ範囲は、５．８−７．０であった。

１，　口Ｒ　Ｐ−Ｎ　ｔ−Ｉ　Ｓの・１スクシニノレ化
口ＲＰＣ＋−ＩＲＰ−ＣＯＯ口〉を、接合体の調製に使
川した。０．００３Ｍ５６ ＮａＰ　ｉ／Ｉ）Ｈ＝６．９中の２０＊／ｍＬ　　ＨＲ
Ｐ−ＣＯＯＩ−｛　　１．２５１１１１に、１３１９の
スルホＮ　ｌ−Ｉ　Ｓを添加した。０．２Ｍ　　Ｎａ２
Ｐ○４により況合物のｐｌ１を６．９に再調整した後、
２０■のＥＤＡＣを添加した。該反応混合物を、室温に
て２０分間インキュベ−１へし、次いで、ＰＩ３Ｓ／ｐ
１＝７．１中にてセファデツクスＧ−２５カラムで精製
した。該精製トＩ　Ｒ　Ｐ　−　Ｎ　Ｈ　Ｓを、直ちに
フノレオレヒイン抗体＜Ａｂ，）との接合のために使用
した。

接合に先立って、フルオレセイン抗体を０．０２Ｍ　　
ＮａＰｉ，０．１４Ｍ　　ＮａＣｊ！／ｐｌ＋＝７．２
に対して透析し、次いで結合部位Ｉ１度と同じ最終濃度
となるように”　５２０は、を添加した（Ｆ５２ｏは、
抗一フルオレセイン抗体の結合部位をブ口ツクするため
に使用した）。

Ｑ，９ｍＬの２０４／ｍＬ　　ＩＩＲＰ−ＮＨＳに、Ｐ
［３Ｓ／ＤＩ＋　　７．２中の２■／ＩＩＩＬＡｂ，５
２ｏ３ＲＩＬを添加し、該混合物を４℃にて４．５時間
インキ１ベートした（混合物が最初に１１ｉ！縮されて
いる場合には、接合化学の効率が改善されるであろうが
、凝集体形成を最小とするように注意しなｔＪればなら
ない）。ヒドロキシルアミンを最終Ｓ度が反応混合物（
ａｌｌ＝７．０＞中で０．１Ｍとなるように添加するこ
とによって反応を停止させ、４℃にて一夜インキ１ベー
トした。該反応混合物を、ＹＭ−１０メンブレンを装着
したアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　濃縮装置を用いて約Ｉ
Ｉ一までｍ縮し、次いでセフアクリルＳ−３００カラム
（１．５Ｘ１’１４ｃｍ）にて精製した。ＭＷ＝２００
Ｋ−２５０Ｋに対応するピークの物質をアッセイに使用
した。

［．　アビジンーガラスビーズ（ＧＢ）の調直径約０．
７５ｍのガラスピーズ（Ｇｌｅｎ　Ｈｉｌｌｓ，Ｉｎｃ
．、Ｈａｙｗｏｏｄ　，　Ｎ　Ｊ　）を、最初に５％硝
酸中で／時間煮沸して清浄化し、次いで脱イオン水によ
り洗浄液が中性のｆｕｌｌとなるまで洗浄した。該ビー
ズを室渇にて減圧下に乾燥させた。

５８ ５７ １　Ｋ９の酸洗浄ビーズに、３００ｍＬの酢蒙エチル中
で１ｍＬのアくノプロピルトリエ１〜キシシランを加え
た。該混合物を次に回転吸引装置に置き、溶媒の除去に
従ってビーズをアミノシラン試薬の薄膜で被覆した。次
いで、該ビーズをステンレスの反応容器に移し、オーブ
ン中で１３０℃、窒素／アルゴン雰囲気で、一・夜加熱
した。冷却後、該ビーズを直接に次の工程に使用した。

傾斜組織培養フラスコ中の５００＃のアミン化ビーズに
、１　７０ｍＬ（７）Ｏ．ＩＭナトリウムボレートａｌ
ｌ９．０を１０分間で加えた。無水こはく酸の溶液（２
ＣＭＬ　　ｌ）ＭＦ中の２　．：　０　！Ｊ　）をピペ
ットで加えた。閉じたフラスコを手で振とうした。無水
こはく酸溶の最後の添加においてずべての液体を除去し
、該ビーズを脱イオン水２００ｍＬｘ４にて洗浄した。

１５０ｍＬの０．１Ｍ　　ＭＥＳ　　（１−　［Ｎ−モ
ルフォリノ］エタンスルフオン酸）、ｐｌｌ５．２で一
旦洗浄後、ビーズをちょうどおおう体積のＭＥＳ中に再
懸濁した。２ｍＬのＭＥＳ中の１００■の５９ ＥＤＡＣ　（１−エチル−３−１３−ジメチルアミノプ
Ｌ１ビル］カルボジイミド）を一度に加え、手−Ｃ撹拌
しつつ５分間混合した。吸７３１装置を用いた液体の除
去に際し、アビジン（２０■）およびＢＳＡ　（４０■
）の２０ｍＬＭヒＳ溶液を一度に加えた。ビーズを手で
混合し、更にＹＥＳ緩衝液をビーズがちょうどおおわれ
るように力『えｌこ。最後に、培養フラスコを内容物と
共に４℃にて一夜ヤノ［通撹拌器にか１プた。

ビーズの更なる調製は、該ビーズのＩＮＮａＣｊ２　（
２００ｍＬｘ／Ｉ．）　、続いて脱イオン水（２００ｍ
ｔ−ｘ４）による洗浄を含む。各洗浄の拍後、液体は完
全に除去した。次いでビーズを、０．１％ＢＳＡおよび
２．５％シュクロースを含むリン酸塩緩衝液（２０１１
１１４ホスフエート、１４０ｍＨ　　ＮａＣ．ｆ！、０
．０２％ＮａＮ３　、ｐＨ’７．４＞（１５０ｍｌ−ｘ
３）により処理した。過剰の液体を除去し、湿ったビー
ズを真空デシケー夕内の容器に移した。

最終的に、米国標準試験ふるい１６または２０６０ 番を通した後、該ビーズを保存に際して凝集することを
防止するためにカゼイン粉をまぶした。

３口−ビオチンによる結合研究は、このように調製した
ビーズが２−１１μ９の活性アビジンをビーズ１ｇあた
りに取込むことを示した。

Ｆ．　　ＴＭＢ／１１。０２目ＲＰ基質ＴＭＢおよび泳
素過酸化水素の濃縮保存溶液を別個に調製し、凍結して
保存した。新鮮な作動基質溶液は、各使用時に２種の試
薬を混合、希釈して調製した。濃縮保存溶液は次のよう
に調製した：Ｔ　Ｍ　Ｂ保存溶液（溶液１） ６．８２ｇ　クエン酸（ＭＷ−　　１９２．１）０．６
５２ｙ−１−Ｍｌ３ｘ２１−ＩＣＡ　（ＭＷ＝　３１３
．３）１００１１１ＬのＤ一口２０に溶解 ０．７５２ｙ　　尿素１−１２０２（ＭＷ＝９４．０７
）１００ｍＬのＤ−１１２０に溶解 基質作動溶液のＷＡ！ｌ！ ８ｍｌの　０．　　　１　　２５Ｍ　　　　Ｎａ　　ト
１２　　　ｐｏ　　４１ｍＬの溶液１ ｌｍｌの溶液２ 混合後、直ちに使用した アツセイプロトコール ジ］キシンアッセイのプロトコールは、３つの部分から
なる＝１）アツセイ成分（ビオチンＡｂ　　　＋Ｄ　ｉ
　ｑ−ＬＣ−Ｆ＋Ａｂ，　−１−ＩＲＰ）Ｄｉｇ 間の溶液相における結合で複合体くビオチンＡｂ　　　
−Ｄ　ｉ　ｇｌ−Ｃ　　Ｆ−Ａｂｒ−Ｈｌ’＜Ｐ　）Ｄ
１ｇ を形成；２）結合、および非結合アツセイ成分からのＧ
Ｂ−アビジンによる複合体の分離；および、３）Ｎ素基
質の添加および色発生。

ジゴキシンアッセイは、１０Ｘ７５ｓの処分可能ノＪラ
ス試ｊ＠管中で、５０μ℃の正常ヒト保存血清中の標準
もしくは未知試料、５０μでのアツセイ緩衝液（０．２
Ｍ　　ＮａＰｉ、０．１４ＭＮａＣｊ２および０．１％
ＢＳＡ，　ｌ）１１７．　４　＞中の１．７４ｎｏ／ｍ
Ｌ　　Ｄ　ｉ　ｇ−ＬＣ−Ｆならびに８０６２ ６１ ｎｏ／ｄビオチンーＡｂ，，ｇおよび１μｙ／ｄＡｂ，
一口ＲＰ接合体の混合物１００μＡを順次加えることに
より行なった。該アッセイ混合物を、渦混合器中で撹拌
し、３７℃にて１０分間インキュベートした。インキュ
ベート後、結合信号発生物（Ａｂ１−ＨＲＩ−’）の非
結合物からの分離を、各試験管に０．６５ｇのＧＢ−ア
ビジンを加えて行ない、次いで３７゜Ｃにて１０分間イ
ンキュベートし、最終的に４×１−の洗浄緩衝液（０．
０１Ｍ　　ＮａＰ　ｉ　、ｐｌｌ７．　２＞を用いて洗
浄した。洗浄後、試験管あたり０．３−の口ＲＰｍ質（
ＴＭＢ／尿索１−１２０２＞を加え、３７℃にて５分間
インキュベートした。既述の方法により作成された椋準
曲線を用い、３９人の患者の試料をジゴキシン濃度につ
いて定蚤した。得られた結果は、既知の放則免疫アッセ
イ（ＲＩＡ）により得た値と良好に比較ざれるものであ
った。

ヒイ 試薬は、＋１３　Ｆ　−　Ｎ　ｌ−Ｉ　Ｓ　，　（２）
　Ｆ　−　Ｌ　Ｃ　−　Ｎ　＋−１　２お６３ よびｆ３１Ｔ３−ＬＣ−Ｆを調製する３つの続く工程に
おいて調製した。Ｆ　−　Ｎ　Ｈ　ＳおよびＦ−ＬＣＮ
｝−１２は、例１に記載したように調製した。

１１１１ＬのＤＭＦ／ＤＭＳＯ　（４　：　１　）溶媒
中に、３０．４■（Ｑ．０　５ｍ　ｍｏｌｅ＞のトリイ
オ１ζチロフォルム酸、５０．　３５ｍｇ（０．　１ｍ
　ｍｏｌｅ）　０）Ｆ−ＬＣ−Ｎ口，および１９．２１
ｉ９（０．１ｍ　ｍｏｌｅ）のＥＤＡＣを含む溶液を、
室温にて昭全中で一夜撹拌した。Ｔ３−ＬＣ−Ｆおよび
トリイオドチロフォルム濱（未反１−６で残留する場合
）を、５ｍＬのＤ一口，Ｏの添加により沈殿させ、ろ過
し、溶媒を廃棄した。ろ別した制料を、Ｃ口，Ｃｊ！２
：メタノール：酢酸（５０　：　５０　：　５）からな
る溶媒系に再溶解し、同じ溶媒系にて１．５Ｘ２０ｃｍ
のシリカゲル力ラムに負荷した。これらの条件下で、ト
リイオドフォルム酸はＴ３−ＬＣ−Ｆ接合体に先行して
移動し、またＦ−ＬＣ−Ｎ目，は力フム偵部に残った。

材料の純度は、上述の溶媒系を用いてＴＬＣシリカゲル
プレートにより検査し１こ。該溶媒をｍ製材料から目転
エバポレータによ６４ ？除去し、生成物をメタノール／ＤＭＦ　（７０　：３
０）の最小体積中に角溶解させた。最後の工程は、精製
中に『耳溶化し、生戒物ど共に溶出したであろうシリカ
ゲルのほとんどを除去すべく行なった。生成物は、メタ
ノール／ＤＭＦ　（７０　：　３０）溶媒系にて−２０
℃で保存した。保存溶液中のｒ３−ＬＣ−Ｆｏｉ度は、
既知量の６一カノレポキシーフルオレヒインを用いて作
成した標準曲線から、Ａ４９ｏにより測定した。

Ｂ．Ａｂ■３−ビオチンのＩ製 抗−Ｔ３抗体を、固定化蛋白質Ａを用いて、ＩＯＧ分胸
に精製した。該抗体ＩＱＧを、ビオチンーＬ　Ｃ　−　
Ｎ　Ｎ　Ｓを用いてビオチン化した（反応混合物中で、
Ａｂ：ビオチンーＬ　Ｃ−Ｎ　ｌ−Ｉ　Ｓ　一１：２５
のモル比）。非結合ビオチンｔよ、セファデックス−０
２５カラムにより除去し、またＡｂ■３−ビオチンを０
．０５Ｍ　　ＮａＰ　ｉ／ｐｔｌ＝７．４中に４℃また
は凍結して保存した。

Ｃ．　ガラスビーズ（ＱＢ）へのアビジンの結合該試薬
を、０．　５ｍｍ　−　１　．　０ｍ＋の非多孔質ガラ
６５ スビーズを３−アミノプロピルトリエトキシシランによ
りｖｉ飾してガラスビーズ表面に反応性アミノ基を生或
させることにより調製した。次いで、該ＧＢ−ＮＨ２を
、ＥＤＡＣを用いてＣＭ−デキストランにて被覆し、最
終的にすべてのアよノ基をカルボキシル基に変換すべく
サクシニル化した。

アビジンをＣＭ−デキス１一ラン被ＩＧＢに、Ｅ　Ｄ　
Ａ　Ｃ化学により結合した。最後に、アビジン標識ガラ
スビーズを、２．５％シュクロース、０．１％ＢＳＡを
含む溶液で被覆した。該ビーズを減圧下で乾燥させた後
、これらをアッセイに使１目　し　１こ　。

例１は、アビジン被覆ガラスビーズ調製の別法を提供す
る。

０．０７５Ｍナトリウムバルビタール、０．　２Ｍ　　
ＮａＣｊ２、０．００２％チメロサル、０．　１％　１
３ｓＡＳｐｌｌ＝８．６。

２．　放出試薬（　Ｒ　Ｒ　） ６６ １ｇ／ｍＬ　　ＡＮＳ，５ｍＨ　　ＥＤＴＡ，０．　　
５ｑ／ｗ＋Ｌ　　ＢＧＧ，０．５Ｒｇ／ｍＬ　　ヒツジ
ＩＯＧ、４％　正常マウス血清を含有するアッセイ緩衝
を、結合Ｔ３を血清蛋白から放出させるために使用した
。

３．１−ＭＢ／口，０２１−ＩＲＰ基質濃縮保存溶液を
、例１に記載されると同様に調製した。

アッセイブ［ｌト］一ル アッセイは、１０Ｘ７５ｍの処分可能ガラス試験管中で
、５０μｌの商業的に入手可能な標準もしくは未知試料
、５０μ｛の放出試薬中の１．５ｎｏ／ｄ　　Ｔ３ｌ−
Ｃ−Ｆ、ならびに８　０　ｎｏ／　ｄビオチンーＡｂ１
３および１μｇ／ｉＩ！Ｉ２　　Δｂ，一口ＲＰ接合体
の混合物１　００！ｌｇを順次加えることにより行なっ
た。該アツセイ混合物を、渦混合器中で撹拌し、３７゜
Ｃにて１５分間インキコベートした。

インキュベート後、結合信号発生物（ＡｂＦ口ＲＰ）の
非結合物からの分離を、各試験管に０．６５ＳＪのＧＢ
−アビジンを加えて行ない、次６７ いで３７℃にて１０分間インキュベートし、最終的に４
×１一の洗浄緩衝液（０．０１Ｍ日ａＰ　ｉ　，　ｐｌ
ｌ７．　２＞を用いて洗浄した。洗浄後、試験管あたり
０．３−の目Ｒ　Ｐ基質（ＴＭＢ／尿素目，０２）を加
え、３７℃にて５分間インキュベートした。１−の１Ｎ
　　Ｈ　　ＰＯ４を添加づ゛る３ ことにより反応を停止させ、生じた色素量をＡ４５。に
て測定した。既述の方法により作戊された標卑曲線を用
い、４１人の患者の血清試料を千３ｍ度について定量し
た。得られた結果は、既知の放躬免疫アッセイ（ＲＩＡ
）により得た値と良好に比較ざれるものであった。

例３：ＴＨＳ検出のための！ｉ！ｉ！種酵素−基底　疫
アツセイ 材料の調製 八．Ａｂ　　　　＃１−ビオブーンの調製ＩＳ１１ 抗−ＴＳ口抗体は、固定化張白質Ａにより精製してＡｂ
ＩＣＩＧ分画を得るか、あるいは商業的供給者（Ｂｉｏ
ｓ　Ｐａｃｉｆｉｃ，　Ｈｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，　ＣＡ
　：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ　，　Ｍ八〉から純６８ 粋なものを購入した。Ａｂ−ビオチンを、Ａｂ（０．Ｉ
Ｍ　　ＮａＰ　ｉ　、０．２Ｍ　　ＮａＣ．ｅ／ｐｉ｛
７．５中に１−３■／−）およびスルホーＮ　Ｈ　ＳＬ
　Ｃ−ヒオチンを混合することにより調製した。

該スルホーＮ　Ｎ　Ｓ−Ｌ　Ｃ−ビオチンを、３−５分
別量において１５分間で加え、反応を室温にて１．５時
間進行させた。非結合ビオチニル化試薬を、セファデツ
クスＧ−２５カラムにより除去した。Ａｂ：スノレホー
Ｎ　Ｈ　Ｓ　−　Ｌ　Ｃ−ビオチンのモル比は、１；１
０、１：２０および１：４０であった。該接合体を、ｏ
．ｏｏｉ％のチメリソールを含む反応緩衝液中で保存し
た。

３７７．１２１１１ｇの６一カノレボキシフノレオレセ
インおＪ：び１１５■のＮ　Ｈ　Ｓを含むｏｖｔ＝３．
４＃ｌｉ！に、２０６．３％のＤＤＣを含むＤＭＦ０．
６ｄを加えた。該混合物を室温にて一夜撹拌した。ジシ
クロヘキシル尿素をろ過により除去した。該Ｆ　−　Ｎ
　Ｉ」Ｓを、ジクロロメタン：メタノール：酢６９ 酸−９０：１０１を用いてシリカプレート」二でのＴＬ
Ｃにより検査した。Ｆ−Ｎ　Ｈ　ＳをＤＭＦ中にて−２
０℃で保存した。

抗一丁Ｓ口を蛋白質Ａク口マトグラフィにより精製し、
Ｏ．ＩＭ　　ＮａＰｉ、０．２ＭＮａＣｊ！、５ｍＨ　
　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．３に刻して透析した。Ａｂ−Ｆを
、Ａｂ　（１．５−２．Ｏ幣／一）とＦ　−　Ｎ　Ｈ　
ＳとをＤＭＦ中で混合し、反応を室温にて１．５時間進
行ざ往ることにより調製した。使用したＦ−Ｎ｝−１ｓ
　：Ａｂ比は、１２．５：１および２５：１であった。

Ｃ．抗一フルオレセインーＨ　Ｒ　Ｐ接合体の調製試薬
を、例１に記載したのと同様にしてｉｉｌＨＪＬた。

Ｄ，　アッセイブロトコール ＴＳ口アッセイのブＬ１トコールは、３つの部分からな
る＝１）溶液相におけるアツセイ成分（ビオチンＡｂ，
Ｔ目Ｓ，Ａ．，８Ｈ−ＦおよびＴＳＩＩ１ Ａｂ１ｉ｛ＲＰ）間の結合：　　２）ＧＢ−アビジン７
０ ？よる鉗結合アツセイ成分からの複合体の分離；および
、酵素基質の添加および発色。

ｒ　Ｓ　ｌ−１アッレイを、１０Ｘ７５ｍガラス試験管
内で行なった。種々の量のＴＳ口を含むヒトまたはウシ
血清１　ｂＯμＡに、２　０　０　ｎｏのＡｂＦ口Ｒ　
Ｐを含む２０μ℃の緩衝液（０．ＯＩＭＮａＰ　ｉ　、
０．　１５０Ｍ　　ＮａＣＪ２、１．０％ＢＳＡ，０．
　１％トウイーン−２０）および１８Ｏｒ＋ｏのＡｔ）
　　　一ビオチンと八ｂＴＳＨ２　　Ｆを含むＴＳＨ１ ２０μｌのＭ衝液を加えた。渦混合器上で試験管を撹拌
し、３７℃で１２．ｂ分間インキュベートした。インキ
ュベート後、０．６５ｇのＧＢ−アビジンを添加し、更
に１２．５分間イン↓コ．べ−トを続けさせた。次いで
、ビーズを洗浄緩衝液（０．ＯＩＭ　　ＮａＰｉ，Ｏ．
’１５Ｍ　　ＮａＣｊ２，０．１％トウイーン、ｐｔｌ
７．４）１．０−にて４回洗浄した。洗浄後、０．２−
の日Ｒ　Ｐ基質（丁Ｍ　Ｂ　／　｝−１■０２）を加え
、５分間発色させた。

０．４−の口　ＰＯ４を加えることにより反応を３ 停止させた。試料を全量１．０−に希釈し、光学７１ 密度をＯ　Ｄ　４５ｏにて測定した。

上記の記載および例は、好ましい実施態様を含む混合物
を開示するものである。当業者に自明な修飾は、特許請
求の範囲に包含されるべきものである。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）リガンド結合アッセイにおける分離に際し、（ａ
   ）特異的結合対（ｓｂｐ）の要素、（ｂ）試料中に分析
   対象が存在する場合に該分析対象が前記ｓｂｐ要素と共
   に複合体を形成する条件下にある試料、および（ｃ）前
   記ｓｂｐ要素がビーズに結合する条件下のビーズからな
   る担体を、水性媒体中に合し； 前記水性媒体を、前記担体内に挿入された管体よつて前
   記ビーズから吸引し、ここで前記ビーズの大きさは、該
   ビーズを吸引することなく前記水性媒体の除去を許容す
   るために充分に大きいものである、 を含んでなることを特徴とする方法。
2. （２）前記ｓｂｐ要素が抗体である請求項１に記載の方
   法。
3. （３）前記ｓｂｐ要素がこれに接合する酵素を有してな
   る請求項１または２に記載の方法。
4. （４）前記ｓｂｐ要素がハブテンである請求項３に記載
   の方法。
5. （５）前記担体が５０〜５０，０００のビーズからなる
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. （６）前記ビーズが非多孔性であり、かつ大きさの範囲
   が０．２〜２．５ｍｍである請求項５に記載の方法。
7. （７）前記水性媒体の体積が、該水性媒体を前記担体と
   合した場合に、合した水性媒体の体積が前記担体のみの
   体積を越えないように選択される請求項１〜６のいずれ
   か１項に記載の方法。
8. （８）前記吸引を、１個以上の孔を有し各孔が最小のビ
   ーズの最小径より小さい径を有する管体を用いて行なう
   、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. （９）分析対象を含有すると考えられる試料中の該分析
   対象測定のための請求項１に記載のアツセイ方法であり
   、該分析対象はｓｂｐ要素であり、および標識ｓｂｐ要
   素がアツセイ混合物中に存在する分析物の濃度に関連す
   る量をもって該混合物から分離される方法において、 試料、標識ｓｂｐ要素およびビーズからなる担体をアッ
   セイ媒体中に合し、ここで前記標識ｓｂｐ要素は前記ビ
   ーズに結合可能であり；前記担体を前記標識ｓｂｐ要素
   を含む前記アッセイ媒体と共にインキュベートし、ここ
   で前記アツセイ媒体の体積は前記担体をおおうに満たな
   い量であり； 各々の径が最小ビーズの最小径より小さい１個以上の孔
   を有する吸引用管体を用いて前記アツセイ媒体を前記ビ
   ーズから吸引し、ここで前記ビーズに結合する標識ｓｂ
   ｐ要素を、結合されていない標識ｓｂｐ要素から分離し
   、および； 該ビーズを、前記標識ｓｂｐ要素の存在について試験す
   ること、 を含んでなるアツセイ方法。
10. （１０）前記ビーズを試験に先立ち水性の洗浄媒体に合
    することを更に含んでなる請求項９に記載の方法。
11. （１１）前記ビーズの試験を、前記洗浄媒体の存在下に
    行なう請求項１０に記載の方法。
12. （１２）リガンドおよびその相補的受容体からなる特異
    的結合対（ｓｂｐ）の要素である分析対象を含むと考え
    られる試料中の該分析対象のアッセイであつて、該分析
    対象が溶液中で相補的ｓｂｐ要素に結合し、前記ｓｂｐ
    要素−分析対象複合体がビーズ担体の表面に結合するア
    ッセイにおいて、前記溶液を前記ビーズに結合する前記
    相補的ｓｂｐ要素−分析対象複合体から、各々の径が最
    小ビーズの最小径より小さい１個以上の孔を有する吸引
    用管体を前記担体に挿入することにより分離することを
    特徴とするアツセイ。
13. （１３）ａ）分析対象の結合および遊離種を水性媒体中
    に形成し； ｂ）該媒体を、前記結合または遊離種のいずれかと結合
    し得るビーズの担体と共にインキュベートし、ここで前
    記媒体は前記担体をおおうに要する体積より小さく； ｃ）前記媒体を前記ビーズから吸引し、ここで前記ビー
    ズの大きさは、前記水性媒体の前記ビーズを含まない分
    離を可能とし；および、ｄ）前記結合または前記遊離種
    のいずれかの存在について前記ビーズを試験する、 を含んでなるアッセイ誘導方法。
14. （１４）特異的結合対（ｓｂｐ）要素および、分析対象
    が試料中に存在する場合に該ｓｂｐ要素と複合体を形成
    する条件下で試料を液体媒体中に合し；該媒体を、直径
    ０．２〜２．５ｍｍの大きさを有する非多孔性の５０〜
    ５０，０００個のビーズ担体と、前記ビーズが前記ｓｂ
    ｐ要素を結合する条件下で合し； 前記媒体を、各々の直径が最小ビーズの最小径より小さ
    い１個以上の孔を有する吸引用管体を用いた吸引により
    、前記ビーズの直径が前記ビーズを吸引することなく前
    記水性媒体の除去を許容するに充分な大きさをもたせて
    前記ビーズから分離すること を含んでなるアツセイにおける分離を行なうための請求
    項１に記載の方法。
15. （１５）第１の特異的結合対（ｓｂｐ）要素を含む水性
    媒体と、前記第１の要素と同一または異なる第２のｓｂ
    ｐ要素が結合されるビーズからなる担体とを、前記第１
    の要素が第２の要素に直接または間接に結合する条件下
    で合し；および、 前記水性媒体を、前記担体内に挿入された管体によつて
    吸引し、ここで前記担体を含むビーズの大きさは、前記
    ビーズを吸引することなく前記水性媒体の除去を許容す
    るに充分な大きさであること、 を含んでなる結合アツセイにおける分離を行なうための
    請求項１に記載の方法。