JPH0398584A - ペシロミセス属菌によるα―ガラクトシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペシロ旦セス属菌によるα−ガラクトシダー
ゼの製造法およびそれに用いる微生物に関する。

α−ガラクトシダーゼはメリビオース，ラフイノース等
のガラクトオリゴ糖に存在するガラクトシル基とグルコ
シル基の結合様式であるα−１．６結合を特異的に切る
作用を有する酵素である。この酵素は甜菜糖工業におけ
るショ楯結晶阻害物であるラフィノースの分解に使用さ
れている。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕α−ガ
ラクトシダーゼを生産する微生物は自然界に広く分布し
ており、例えばエア口バクター属に属する細菌，ストレ
ブトマイセス属に属する放線菌，アスベルギルス属に属
する糸状菌等が知られている。

ところで、α−ガラクトシダーゼを前述のラフィノース
の分解に使用するためには、一般の微生物酵素に要求さ
れる高活性，長寿命，耐熱性のほかに、インベルターゼ
を有しないか、または存在しても微弱であることが要求
される。

しかし、このような条件を満足する微生物酵素ば少なく
、これまでにモルチェレラ属に属する糸状菌（特公昭４
７−１３０９号公報），アブシジア属に属する糸状菌（
特公昭５３−２３３９８号公報）が実用化されているに
すぎない。

日産８００トンの砂糖を作る製糖工場における上記酵素
の使用量は、菌体そのものを固定化酵素とし、連続通液
による処理方法を採用しているにもかかわらず、年間７
０〜１００トンにも達し、その費用は決して少ないもの
ではない。

このように多量の酵素を必要とする第１の理由は、反応
液に多量に存在するシヨ糖とラフィノースの分解のため
に生じる微量のガラクトースが酵素反応を阻害するため
である。例えば、モルチェレラ属糸状菌由来の酵素にお
いては、純粋のラフィノースを分解するときに要する酵
素使用量に比し実工程のジュースに対しては１１倍もの
酵素量が必要である。また、アブシジア属糸状菌由来の
酵素の場合は、その比が４倍と低いけれども、アブシジ
ア属糸状菌由来の酵素のベレットは使用時に崩壊が起こ
り、通液阻害が避けられない。そのため、菌体をプレス
後、凍結し菌体を変性させて崩壊の起こらない形にして
用いている（特公昭５２４６２８９号公報）。、しかし
、その結果ラフィノース分解率が犠牲になっており、ペ
レント状のものと比較して同一分解率を得るためには２
倍の酵素が必要である。これが第２の理由である。つま
り、どちらの酵素の場合も実工程では純粋のラフィノー
スの分解に要する使用量の８〜１１倍の酵素が必要にな
るのである。

そこで本発明者等は、上記両酵素の長所を併せ持つ、す
なわち阻害物質に強く、かつ培養菌体を変性させること
なく酵素として使用可能な微生物を探索し、より少ない
酵素量でラフィノースを分解できる技術の確立を試みた
のである。

〔課題を解決するための手段〕

その結果、北海道上川郡清水町の土壌から上記目的に適
う微生物を分離することに或功し、本発明を完或するに
至ったのである。

すなわち本発明は、ベシロミセス属に属し、α−ガラク
トシダーゼ生産能を有する微生物を培養してα−ガラク
トシダーゼを蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するα−ガラクトシダーゼの製造法並びにベシロ壽セス
属に属し、菌体内にα−ガラクトシダーゼを蓄積する能
力を有する微生物を提供するものである。

本発明では、α−ガラクトシダーゼ生産菌としてペシロ
ミセス属に属する微生物を使用する。本発明の特色は、
ペシロミセス属糸状菌由来のαーガラクトシダーゼがラ
フィノースをガラクトースとシュークロースに分解する
活性（以後、力価と称する。）が前記モルチェレラ属糸
状菌由来のものと同等であり、シｇ糖，ガラクトース等
の阻害物質に強く、かつモルチェレラ属糸状菌と同様に
菌体を変性させることなく菌体酵素として使用できるこ
とにある。本発明によれば、ラフィノースの分解に要す
る酵素量は従来の１／２〜１／３で充分である。

本発明のα−ガラクトシダーゼ生産菌は、本発明者らに
よって北海道上川郡清水町の土壌より単離せられたもの
であり、本菌の菌学的性質を以下に示す。

（１）　　ツアベック液体寒天培地および麦芽エキス寒
天培地上ではコロニーは大きく広がり、２０″Ｃ，１４
日間で直径８Ｃ！１に達する。色は黄褐色ないしオリー
ブ色で、培養期間が長くなるにしたがい暗色となるが、
緑色にはならない。コロニー表面は周囲に尾を引くよう
に広がり、胞子着生能を持つ菌糸の外観は戒熟すると粉
状となる。コロニー裏面は青緑となる。

（２）胞子を着生している菌糸は隔壁を有し、培地表面
を這うように生育し、隔壁間は短い。分生子柄は菌糸の
末端に、あるいは培地表面の菌糸から分岐または一部直
立した菌糸から発生し、梗子様の枝は隔壁のある梗子細
胞または輪生体から戒り、梗子は胞子着生菌糸に沿って
不規則に分布している。

（３）梗子は長さ１５〜２０ａｍ．巾２．　５　〜３．
　０μｍで長い先の尖った管状をしており、通常細胞の
軸からそれていて、先端で広く分岐し、分生子の長い鎖
をつける。分生子はだ円または紡錐状で、長さ３．５〜
７．０μｍ，中２．５〜３．２μｍで黄色から褐色を帯
び、表面は滑らかで発芽時にＩＯμｍに膨らむ。

（４）厚膜胞子は通常１４日以上培養後の培地に観察さ
れ、１個あるいは短い鎖状に菌糸の中間や末端に生じ、
色は褐色から暗褐色で、４〜８μｍの直径である。

（５）子のう殻あるいは菌核は試験したいずれの培地に
も形威されなかった。

上記した菌学的性質を有することにより、木菌はベシロ
ミセス・ヴアリオソティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍ　ｃｅｓν
ａｒｉｏｔｉ　ｉ）と同定された。しかしながら、既知
の菌株にはα−ガラクトシダーゼを生産するものは知ら
れていない。そこで、本菌はベシロミセス・ヴアリオッ
ティＨＳ−１００１と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ　Ｐ−１０９９６として寄託され
ている。本発明においては、本菌を自然もしくは人工的
手段によって変異させて得られるものであっても、α−
ガラクトシダーゼ生産能を有する菌株はすべて用いるこ
とができる。次に、本菌の培養法について説明する。

本発明において用いられる培地は、糸状菌の培養に際し
通常使用されている炭素源，窒素源および必要な無機塩
を用いて調製することができる。

炭素源の例としてはブドウ糖，ガラクトース，ラクトー
スなどが挙げられ、窒素源の例としては酵母エキス，肉
エキス，ペプトン１　コーンスチープリカーなどを挙げ
ることができる。無機塩としては、リン酸カリ，食塩，
硫酸アンモニウムなどが用いられる。このほか、必要に
応じてクエン酸，アスコルビン酸ナトリウムなどを加え
ることができる。

培養は、上記栄養素を組み合わせて液体培地を作威し、
当該菌体を接種し、３０〜４０’Ｃにて４８〜９６時間
フラスコでの振とう培養あるいはジャーファーメンター
による通気培養を行なう。

このようにして得られた菌体は、ろ過して充分水洗し、
そのまま酵素剤として使用可能である。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明
はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１ グルコース２％．コーンスチーブリカ−１％，硫酸アン
モニウム０．６％，リン酸カリウム０．４％，塩化ナト
リウム０．２％，クエン酸０．６％，アスコルビン酸ナ
トリウム０．３％を液体培地組戒とし、ｐＨ６．０に設
定し、前培養を３０゜Ｃにて２４時間行なった。その後
、６０ｆｉジャーファ−メンターに４０ｆｆｉの培地（
培地組或：グルコース１％，ラクトース　１．５％．コ
ーンスチープリ力−１％，硫酸アンモニウム０．６％，
リン酸カリウム０．４％．塩化ナトリウム０．２％，ク
エン酸０．６％，アスコルビン酸ナトリウム０．３％）
を作戒し、ｐＨ６．０に設定後、上記種菌２ｌを接種し
た。培養は温度３０″Ｃ，攪ばん回転数３　５　Ｏ　ｒ
ｐｍ，通気量３０ｉ／分の条件にて９０時間行った。

得られた菌体を、以下の項目についてモルチェレラ属菌
由来の酵素およびアブシジア属菌由来の酵素との比較を
行った。

（１）菌体量 培養液１００ｄあたりに生成する菌体量を比較した．な
お、モルチェレラ属菌およびアブシジア属菌の菌体量は
、特公昭５６−１０７２号公報記載のデータを用いた。

この結果を第１表に示す。

第１表 第１表より明らかなように、ペシロミセス・ヴアリオッ
ティ｝Ｉｓ−１００１の生成菌体量は既知菌の半分以下
となり、冷凍保存する場合、その保存スペースを半分以
下にできることがわかった。　なお、以下に述べる既知
菌との比較においては、実際に甜菜糖製造工程において
使用されているものを購入して使用したが、培地１成あ
たりに生じる酵素活性並びに菌体量は以上の値を基本に
おいて比較したものである。

（２）力価 各酵素の力価を以下の方法により測定した。従来この種
の酵素活性は鈴木，田辺氏法（鈴木英雄、田辺修：農化
，　３７，　６２３（１９６７））により測定されてき
たが、この方法では基質としてラフィノースと同様の結
合様式を有するメリビオース（０．０６Ｍ）を使用し、
単位酵素量（例えば培養液１ｄに生産される酵素量）当
たり、４０゜Ｃにおいて２時間の反応後、ｐＨ５．２の
条件下で遊離されるグルコース量（μｇ）を１単位とし
ている。しかし、実際の反応基質はラフィノースであり
、かつ反応条件は雑菌汚染を防ぐ意味からも５０″Ｃが
とられている。従って、より実用に即した力価測定法と
して、ラフィノースを同モル（０．０６Ｍ）用い、反応
温度を５０’Ｃとした際に遊離されるガラクトース量（
μｇ）を１単位（Ｕ）とする方法を採用した。

この方法で測定した結果と従来法で測定した結果を第２
表にあわせて比較した。

第２表 この酵素活性の測定法では、菌体を磨砕して得た磨砕菌
体を対照として測定しているので、アブシジア属由来酵
素の力価が高い。しかしながら、前述したように、使用
上の制約からプレス後、凍結により菌体を変性させるの
で第２表から直接力価の比較をすることはできない。後
記（６）で述べるように、ラフィノース基質１％溶液に
おいて５０゜Ｃで２時間反応させ、５０％の分解率を得
るのに必要なアブシジア属由来酵素の菌体量は、モルチ
ェレラ属由来酵素およびペシロミセス・ヴアリオシティ
ＨＳ−１００１由来酵素の場合よりも多くなる。

従って、ベシロミセス属菌体内に生産されるα一ガラク
トシダーゼ活性は、既知菌のそれと遜色のないことがわ
かる。また、インベルターゼ活性（基質をシュークロー
スとして、他条件を鈴木、田辺氏法で測定）も２　０　
０　Ｕ／ｄとなり、これらの値も既知菌と同等であった
。

（３）酵素活性の耐久性 各酵素を温度５０’Ｃの三番媚蜜３０Ｂｘ希釈液（ｐＨ
　５．　０に調整）に浸漬したのち、その酵素活性変化
をラフィノースを基質として反応温度５０゜Ｃにて測定
した。この結果を第３表に示す。

第３表 （単位／成） 第３表より明らかなように、ペシロミセス・ヴァリオッ
ティＩｓ−１００１由来酵素のα−ガラクトシダーゼは
既知菌のα−ガラクトシダーゼよりも溶出あるいは失活
し難い（４８時間後で８０％も残存している）ことがわ
かる。ただし、アブシジ”ア属由来酵素をｐＨ６．０の
条件下で使用すると、この溶出はペシロ５セス・ヴアリ
オッティＨＳ−１００１由来酵素に近いものとなる。従
って、実用上はアブシジア属由来酵素に関してはｐＨ６
．０を採用している。しかし、この場合、α−ガラクト
シダーゼ活性は、ｐＨ　５．　０に比べさらに３０％減
となる。

（４）シｇ糖濃度の影響 実工程中の反応液中には２０％強のシュークロースがラ
フィノース１％とともに存在していて、この高濃度のシ
ュークロースがα−ガラクトシダーゼ活性を阻害してい
る。その程度をラフィノース１％としてシュークロース
０％または２０％としたときの各酵素のラフィノース分
解率を比較した。なお、各酵素は同量（培養液２５０ｄ
において産する菌体量）用い、モルチェレラ属由来酵素
およびペシロ多セス・ヴアリオッティＨＳ−１００１由
来酵素はｐＨ５．０で、アプシジア属由来酵素Ｇよブレ
ス凍結処理をしたものを用い、ｐＨ６．０にて５０゛Ｃ
で２時間反応を行なった。結果を第４表に示す。

第４表 （表中単位は％） 第４表より明らかなように、シ！Ｉ　ｔｊ！濃度の分解
率に及ぼす阻害程度において、ペシロミセス・ヴアリオ
ッテイ｝Ｉｓ−１００１由来のα−ガラクトシタ゛一ゼ
は良い結果を示した。

（５）ガラクトースのラフイノース分解率に及３よす影
響 １％のラフイノースが完全に分解すると、０．３％程度
のガラクトースが生じる。一般に、酵素の反応系は平衡
関係にあり、このガラクトース濃度が高くなるとラフイ
ノースの分解も阻害される。

その阻害程度を、各酵素のラフイノース分解率として比
較した。なお、各酵素は反応液ＩＩｌ当たり培養液２５
０ｄに産する菌体量を用い、アブシジア属由来酵素はプ
レス凍結処理したものをｐＨ６．０で、他の酵素はｐＨ
５．０にて、５０゜Ｃで２時間の反応を行なった。また
、ガラクトース濃度はこの阻害度合を強調するために、
０％と０．５％で比較した。結果を第５表に示す。

第５表 （表中単位は％） 第５表より明らかなように、シヨ糖濃度の分解率に及ぼ
す阻害の場合と同様、ベシロミセス・ヴアリオッティＨ
Ｓ−１００１由来のα−ガラクトシダーゼは分解率の絶
対値および阻害程度の点からも既知菌より良い結果を示
している。

（６）酵素使用量 ペシロごセス・ヴアリオッティＨＳ−１００１由来のα
−ガラクトシダーゼは、既知菌由来のものよりシー！糖
およびガラクトースの存在下でも能力を発揮できること
がわかったが、実工程中のジュース中には他に色素，無
機塩類等もあり、実工程中で使用する場合はかような物
質に対しても耐性を示さねばならない。その程度を既知
菌由来の酵素と比較するため、三番Ｉ！蜜の３０Ｂχ希
釈液を反応液として（約１％のラフィノース含有）、５
０℃にて２時間反応させて５０％の分解率を得るのに必
要な菌体量として比較した．結果を第６表に示す．ただ
し、この時もアブシジア属由来酵素に関してはｐＨ６．
０、その他の酵素に関してはｐＨ５．０を採用した． （表中単位は乾物■であり、（　）内の値は必要菌体量
を得るのに要する培養液量（成）である）以上の結果か
ら、ベシロミセス・ヴアリオツティＨＳ−１００１由来
のα−ガラクトシダーゼは、力価は従来程度であるにも
かかわらず、反応液中の阻害物質に耐性があり、酵素が
菌体から溶出し難し）上に失活し難い性質を有するため
、結果的に既知菌由来の酵素と同一分解率を得るために
必要とされる菌体量は、絶対量からは１／４〜１／６、
経済性を考慮した必要培養液量での比較では、１／２〜
１／３でよいということがわかった。

〔発明の効果］ 本発明のペシロミセス・ヴアリオ・ノテイＨＳ−１００
１は、菌体内にα−ガラクトシダーゼを効率よく蓄積す
ることができる。本発明により得られるα一ガラクトシ
ダーゼは、甜菜糖製造工程中の反応液に含まれる各種阻
害物質に耐性があり、菌体から溶出し難い上に失活し難
いので甜菜糖製造工業の分野で有用である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペシロミセス属に属し、α−ガラクトシダーゼ生
   産能を有する微生物を培養してα−ガラクトシダーゼを
   蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするα−ガラ
   クトシダーゼの製造法。
2. （２）ペシロミセス属に属し、菌体内にα−ガラクトシ
   ダーゼを蓄積する能力を有する微生物。
3. （３）微生物が、ペシロミセス・ヴァリオッティ（￥Ｐ
   ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｖａｒｉｏｔｉｉ￥）である請
   求項２に記載の微生物。