JPH039882B2

JPH039882B2 -

Info

Publication number: JPH039882B2
Application number: JP57133073A
Authority: JP
Inventors: Kazufuchi Inoe; Hiroshi Korenaga; Yasuhiko Kojima; Nobuyuki Shibukawa; Shizuo Kadoya
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-07-30
Filing date: 1982-07-30
Publication date: 1991-02-12
Also published as: JPS5925329A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、硫酸化多糖体DF−4639を有効成分
とするインターフエロン誘起剤に関するものであ
る。この有効成分は、ゲル濾過法による分子量の
主ピークが約23000である硫酸化多糖体であり、
線溶誘導活性や大腸菌等による感染症の予防及び
治療に効果のあることが知られていた（特開昭56
−67301号及び特開昭57−42627号公報参照）。この硫酸化多糖体は微生物からの抽出物質とし
ては珍らしい成分であり、きわめて低い毒性であ
ることから、種々の有用性が期待される。そこで
実用的な用法を提供する目的で各種の試験を行な
い、その生物学的特性を調べた結果、本発明を完
成した。本活性物質の有効量をヒトまたはインターフエ
ロン（以下IFNと略す）誘起能を有する動物の体
内または細胞に投与することによりIFNを誘起す
ることができる。近年IFNは抗ウイルス活性と共
に抗腫瘍性が期待されているので、本活性物質を
ヒト、哺乳類（牛、馬、豚等）、鳥類、魚類等の
各種脊椎動物のウイルス感染症の予防および治療
に利用することが期待できるばかりでなく、抗腫
瘍剤としても期待できる。本活性物質は静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内
注射、腸管内、経口、経皮、スプレー等の方法で
投与することができる。適当な投与量は静脈内投
与では、動物では0.01〜20mg／Kgであるが、宿主
の種類、年令、体重等の諸条件、投与目的等によ
つて適当に選ばれる。実用的には動物では静脈内
投与0.01〜10mg／Kg、腹腔内0.1〜20mg／Kg、ヒ
トでは静脈内0.01〜10mg／Kgでよく、経口投与の
場合は約100倍多く用いる。IFNを投与した後に
本活性物質を投与する方法（プライミング法）に
よると、単独投与の場合よりも生物学的活性を３
〜10倍高めることができると同時に、宿主の応答
性を高め、有効期間を延長することができる。ま
た本活性物質の投与量を減ずることができる。本活性物質は散剤、カプセル剤、顆粒剤、錠
剤、カプセル剤、シロツプ、乳剤、懸濁液、ドロ
ツプまたは水剤等に製剤等に製剤したものが用い
られ、投与方法により適宜選ばれる。本活性物質は単一種の継代培養細胞上ではIFN
を産生しない。動物個体か生体から採取したての
リンパ球やマクロフアージに作用してIFNを産生
する。本活性物質をウサギに注射して産生された
血中インターフエロンは56℃の加熱やPH２の酸性
条件下ではやゝ不安定である。次に試験例および実験例により本発明を説明す
る。試験例１ IFN誘起法およびIFN活性の測定法 (a) in vitro法によるIFNの誘起方法ウサギ（日本白色種、体重約１Kg）を全採血
して殺し、脾臓、骨髄およびリンパ節細胞を採
取し、10％子牛血清を含むイーグルMEM培地
（GIBCO社製）を用いて、混合細胞約10⁷個／
mlを含む細胞浮遊液をつくり、各浮遊区分（１
ml）に、本発明の薬剤を100，10，１，0.1およ
び0.01μｇ／mlをそれぞれ加え、25℃で24時間
培養後、各培養液を遠心処理してその上清液を
とり、IFN活性測定用試料とした。マウス
（ddY系、６週令、体重25ｇ±１ｇ）は脾臓を
用い培養を37℃で行う以外は同様に処理した。 (b) in vivo法によるIFNの誘起方法本発明の薬剤の水溶液（10mg／ml）をウサギ
（体重約２〜2.5Kg）の耳静脈に注射し、注射前
（対照）、注射後２時間、４時間および６時間に
採血（２ml）し、その血清をIFN活性測定用試
料とした。マウスは尾静脈から注射する以外は
同様に行なつた。 (c) IFN活性の測定産生されたIFNの活性の測定は、常法になら
いウサギの実験系ではウサギ株化細胞RK−
13、マウスにおいてはマウス株化細胞Ｌを用い
て行なつた。まず予めシヤーレに準備しておい
た上記細胞の単層培養上に、適当に希釈した
IFN試料溶液を加え、37℃で一夜培養後、水疱
性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis
virus）（VSV）を攻撃用ウイルスとし、その
ブラツクの減少率を指標としてIFN活性をを測
定した。なおIFN活性の単位は常法にならい、
IFN無処置細胞におけるブラツク数の50％を示
す希釈の逆数として表現する。試験例２ IFN誘起剤であることの証明本活性物質で産生されたIFN試料は、ウサギを
用いた実験系では、同じ動物種の細胞株RK−13
細胞上でVSVの増殖を抑制する他、血清学的に
異るワクシニアウイルス（Vaccinia virus）の増
殖を抑制するが、動物種の異るマウスの細胞株細
胞上ではVSVの増殖を抑制しない。またマウス
を用いた実験例では同種のマウスのＬ細胞上では
VSVの増殖を抑制するが、異種のウサギのRK−
13細胞ではVSVの増殖を抑制しない。これらの産生されたIFN試料は、10万ｇで遠心
しても活性成分は沈降しないし、この活性成分は
透析もされない。また、この試料を0.08％トリプ
シン濃度で37℃２時間処理するとIFN活性は失活
する。ウサギのin vivoで産生（２時間目の血清）さ
れたIFN試料は56℃30分間の加熱、あるいはPH２
で一晩透析を行なうとその活性の約70％は失活す
る。本活性物質そのものはin vitroで継代培養細胞
に作用して抗ウイルス効果を発揮しないし、IFN
も産生しない。また、in vitroにてVSVそのもの
を直接不活化もしない。実験例１ (1) in vitroにおけるIFNの誘起試験動物として、試験例１で用いたと同種の
ウサギおよびマウスを用いた。各細胞浮遊液
（10⁷個／ml）を調製し、その各区分（１ml）に
種々希釈した試料を加える。希釈液は子牛血清
10％を含むイーグルMEM培地を用いた。培養
はウサギ細胞では25℃、マウス細胞では37℃で
24時間行ない、培養後の液を遠心処理して得た
上清液を試験例１に準じてIFN活性を測定し
た。

【表】 (2) in vivoにおけるIFN誘起試料を10mg／mlになるように燐酸緩衝液
（PBS）で溶解し、ウサギ（体重２Kg）の耳静
脈より注射し、注射前、注射後２，４，６時間
に採血（２ml）し、その血清についてIFN活性
を測定した。マウスについては尾静脈より注射
し、１群５匹で行なつた。本活性物質の各濃度
を含むよう、ウサギでは１ml、マウスでは0.2
ml容量で注射した。マウスの経口投与では250
mg／Kg／0.2mlで行なつた。

【表】

【表】本活性物質は、ウサギあるいはマウスに静脈
より注射した場合２時間をピークにIFNが血中
に出現する。マウスに経口的に与えると６〜15
時間にわたつて血中にIFNが検出された。これ
らのIFNはいずれも試験例２に合致する。実験例２ (1) ウサギ皮膚局所におけるワクシニアウイルス
発痘の抑制生理食塩水で希釈した各濃度の試料を１群３
匹のウサギ背部の皮内局所に0.2mlづつ注射し、
24時間後に同じ局所にワクシニアウイルスの最
小発痘量の十倍（0.1ml）を接種し、７日目に
局所の発痘を調べた。発痘の大きさは直径６mm
以上を(十)とし、10mm以上を（）とした。

【表】

【表】第５表に見られるように2μｇ濃度以上にて
発痘の抑制がみられる。 (2) マウスにおけるヘルペスウイルスの感染致死
の抑制 PBSで希釈した各濃度の試料を１群10匹の
マウスに腹腔内注射し（0.5ml）、６時間後およ
び24時間後にヘルペスウイルス（Ｉ型ミヤマ
株、７×10³PFU／0.5ml）を腹腔内投与し、ヘ
ルペスウイルスによる感染死に対する本活性物
質の効果を調べた（期間30日）。

【表】本活性物質はウイルス攻撃24時間前に与えて
も有効であるが、６時間前に与えた方がより良
い感染防禦を示す。 (3) マウス尾部におけるワクシニアウイルス発痘
の抑制 PBSで希釈した各濃度の試料を１群10匹の
マウスの腹腔内に注射し（0.5ml）、６時間後に
ワクシニアウイルスを静脈内注射し（0.1ml）
も、８日後に尾部の発痘数をしらべた。

【表】この表より12.5mg以上で発痘の抑制に有効であ
ることが認められる。本活性物質をヒトまたは動物に投与するため
に、本活性物質を有効成分とし、薬学的に許容し
得る担体または賦形剤を含有する薬学的組成物が
提供される。この組成物は経口、直腸内、経皮ま
たは粘膜内投与に適した形態であり得る。たとえ
ば経口投与用は固体でも液体でもよく、剤剤、カ
プセル剤、顆粒、錠剤、コートされた錠剤、シロ
ツプ、乳剤、懸濁液またはドロツプの形でもよ
い。この種の組成物は製薬に常用される担体また
は賦形剤を含んでいる。適当な錠剤用賦形剤の例
はラクトース、バレイシヨ澱粉または可溶性澱粉
およびステアリン酸マグネシウムで、腸管外投与
用担体の例は、滅菌された水、生理的食塩水また
はアーモンド油であつてアンプルに入れてもよい
し、または使用直前に活性物質を加えてもよい。これらの組成物は所望により、製薬に常用され
る結合剤、安定化剤、潤滑剤、防腐剤、増量剤等
を含んでもよい。実用的な剤形の他の例は、粘膜用としては、バ
ツカール、トローチ、点眼剤、坐剤等、注射用と
しては、水溶液、油溶剤、懸濁剤等、吸入用とし
ては、吸入剤、噴霧剤等、外用としては、軟膏、
硬膏、塗布剤、浴剤、噴霧剤等である。これらの組成物を活性物質の一定量を供給でき
るように成形された用量単位として調製すると有
利である。用量単位に含有される活性物質の実用
的な量は、静脈注射剤の単位含有量を１とした場
合、たとえば経口投与剤では約５〜100倍、皮下
注射剤では約２〜３倍、筋内注射剤では約1.5〜
３倍、バツカル、トローチでは約２〜４倍、坐剤
では約５〜20倍がよい。

Claims

【特許請求の範囲】

１硫酸化多糖体DF−4639を有効成分とするイ
ンターフエロン誘起剤。