JPH04103600A - 鶏卵抗体結合不溶性担体及びそれを用いた物質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフィニティクロマトグラフィーにおいて用い
られる不溶性担体に、リガンドとして鶏卵抗体を結合さ
せた鶏卵抗体結合不溶性担体及びそれを用いた物質の精
製方法に関する。

〔従来の技術〕

従来より、タンパク質の精製方法には、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、ゲル濾過等種々の方法が知ら
れており、それぞれ目的物質の特性に従って、これらの
方法の単独又は２以上の組合せにより精製がなされてい
る。

これらの精製方法の中でもアフィニティクロマトグラフ
ィーは、高純度に精製する手段として有効なものとして
利用されている。

アフィニティクロマトグラフィーは、相互に生物学的に
高い特異的親和性を有する２種類の物質の一方を固定相
として用い、その固定相に対する親和性の差を利用して
、目的物質と不純物とを分離するクロマトグラフィーで
ある。例えば、酵素と基質、抗原と抗体、ホルモンと受
容体、レクチンと多糖類なとの間に働く特異的相互作用
を利用して、相互作用を有する物質の一方を不溶性担体
に共有結合させたものをクロマトグラフィー用固定相と
し、他方の物質をカラムの通過中に捕捉して吸着させ、
次いで溶出処理により目的とする他方の物質を純化する
方法である。

アフィニティクロマトグラフィーのリガンドとしては、
種々のものか知られているが、例えばＰｒｏｔｅｉｎ　
Ａを不溶性担体に結合したものや、抗体を用いたイムノ
アフィニティクロマトグラフィーでは、リガンドとして
ウサギｒｇｃ　、ヤギｒｇＧ　、マウスのモノクローナ
ル抗体等が一般的に用いられている。

〔発明か解決しようとする課題〕

アフィニティクロマトグラフィーは前記の如く親和性の
差を利用するものであるので、固定相に結合させたりガ
ントと吸着される目的物質との間にある程度の結合力が
要求される。

しかし、この結合力か強すぎると、次いてなされる溶出
処理における条件かきびしくなるという問題がある。即
ち、溶出処理は通常りＨの変化を利用して抗体と抗原の
結合力を弱めることにより行なう。従って、溶出条件と
しては目的物質が変性しないｐＨ条件か望ましく、通常
タンパク質及びウィルス等は、アルカリ性下で変性を受
けやすい為、ｐＨを酸性に変化させる目的物質の溶出が
好まれている。しかしながら−船釣に抗原抗体反応は非
常に強固な結合である為ｐＨ２，Ｏ以下の溶出条件を用
いないと目的物質の溶出が不可能なことが多い。

例えばウサギＩｇＧ　、ヤギＩｇＧをリガンドとしたイ
ムノアフィニティクロマトグラフィーては、通常ｐＨ２
，０以下の溶出条件が用いられる。しかし、このような
溶出条件で溶出すると吸着された目的タンパク質までが
変性するという問題があるため、リガンドとしてはｐＨ
３〜５といった緩和な条件で溶出できるものを用いるの
が好ましい。また、溶出条件がｐＨ２以下というきびし
い条件では、リガンドが担体からはずれやすくなること
が知られており、従って、そのような条件下で使用した
場合、はずれた微量のりガントが溶出液中に混入する一
方、アフィニティー吸着体の寿命も短縮化するという問
題がある。

リガンドとして、特に前記のような哺乳類のＩｇＧは、
コスト面で高価な上に一般に溶出条件がきびしいことか
ら、これに代わる溶出条件の緩和なかつ安価に供給でき
る抗体をリガンドとして用いることが当業界で要請され
ている。

本発明の目的は、まさにこの点にあり、アフィニティク
ロマトグラフィーにおけるリガンドとして鶏卵抗体を用
いた鶏卵抗体結合不溶性担体及びそれを用いた物質の精
製方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の発明者らは前記課題を解決するため鋭意検討し
た結果、鶏卵抗体をリガンドとして結合させた鶏卵抗体
結合不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィ
ーにおいて、緩和な溶出条件で吸着物質を溶出できるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、 （１）鶏卵抗体をリガンドとして結合させていることを
特徴とする鶏卵抗体結合不溶性担体、（２）前記（１）
記載の鶏卵抗体結合不溶性担体を用いたアフィニティク
ロマトグラフィーにより、物質を精製する方法、並びに （３）前記（１）記載の鶏卵抗体結合不溶性担体を用い
たアフィニティクロマトグラフィーにより、不純物を吸
着除去する方法、 に関する。

本発明における鶏卵抗体は、予め抗原で免疫された鶏が
産出した卵から調製されるものを用いる。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量産
性などの点からは、白色レグホン系、ロードアイランド
レッド系、横送プリマスロック系、ニューハンプシャー
系等の卵用種を用いるのが特に好ましい。

免疫方法としては、皮下注射、筋肉注射、腹腔内投与等
、鶏を免疫することのてきる方法であれば特に制限はな
い。

抗原としては、分離精製の要請のある各種のタンパク質
あるいはウィルス等が挙げられ、特に限定されるもので
はない。例えばタンパク質としては、Ｃ反応性タンパク
質、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、各種の補体成分、Ｉ
ｇＧ、　ＴｇＡ、　ｒｇＭ、ＩｇＥ、　ＩｇＤ。

ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ　’）等の血液成分、尿カリクレイン、尿トリプシン
インヒビター等の尿成分、α−フェトプロティン、癌胎
児性抗原等の癌マーカー抗原及びインターロイキン、α
、β、γ−インターフェロン等のサイトカイン類、その
他プロティンＡ等種々のものか挙げられる。またウィル
スとしては、ロタウィルス、インフルエンザウィルス、
エイズウィルス、ポリオウィルス等が挙げられる。

抗原の投与量は所望の抗体価が得られ、かつ鶏に対して
悪影響を与えない程度の量を適宜選択すればよい。

通常、初回免疫後、毎週１回で３〜５回程度くり返し投
与すると、抗原に特異的に反応する抗体が鶏卵中に得ら
れる。

その後、抗体価の維持を目的として１〜４月毎に追加免
疫すると良い。

また、必要に応じてＦＣＡ（フロイント完全アジュバン
ト）、ＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）等のア
ジュバントを併用して免疫しても良い。

このようにして通常、初回免疫から１力月以上経過する
と、鶏卵中から十分な抗体価を有する抗体を調製するこ
とができる。

鶏卵中の特異的抗体価は、酵素免疫測定法（ＥＬｒｓＡ
　）　、ラジオイムノアッセイ、マイクロタイター法等
を用いて測定することかでき、免疫後に２週間程度の間
隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移を追跡す
ることができる。

本発明における鶏卵抗体は、前記のようにして免疫した
鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリンを抽出、分離するこ
とによって得ることができる。

この抽出、分離方法としては、例えば、デキストラン硫
酸やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、寒天、カラギ
ナン、ファーセレラン、ペクチン、キサンタンガム、ア
ルギン酸、アルギン酸塩、アルギン酸誘導体等を用いて
リポタンパク質を沈澱させ、その上清から分離、精製す
る方法（、Ｉｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　４６．６３−６８．１９８
１　／　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎ、　９（５）、　４７５−４９３．１９８
０／特開昭６３−２１５６９９号／特開昭６４−３８０
９８号）や、プロパツール、クロロホルム等を用いた抽
出法など通常、免疫グロブリンの抽出、分離に用いられ
る公知の種々の方法が用いられるが、カラギナン、キサ
ンタンガム、ペクチン等を用いるのが好ましい。

本発明における鶏卵抗体は、例えば前記のようにして免
疫した鶏の卵より、卵黄を分離し、次いで卵黄液からカ
ラギナン等を用いて卵黄リポタンパク質を除去した卵黄
水溶性タンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
イー、ゲル濾過、硫酸ナトリウム塩析、塩酸アンモニウ
ム塩析等の公知のタンパク質精製方法により精製された
精製鶏卵抗体が用いられる。

本発明において用いられる不溶性担体としては、アフィ
ニティクロマトグラフィーにおいて使用できるものであ
ればいずれでもよ（、特に限定されるものではない。通
常、セルロースゲル、デキストランゲル、アガロースゲ
ル、ポリアクリルアミドゲル、及び多孔性ガラス等が用
いられる。

鶏卵抗体と不溶性担体を結合させる方法は、ウサギＩｇ
ＧやヤギＩｇＧをリガンドとして結合させる場合と同様
に、常法により行なうことができる。

即ち、通常担体としてセルロース、デキストラン、アガ
ロースを用いる場合、臭化シアン等のハロゲン化シアン
を用いて担体を活性化し、抗体を結合させる方法、過ヨ
ウ素酸を用い担体を活性化し、抗体を結合させる方法、
１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）−ブタ
ン等のエボキシドを用い担体を活性化し、抗体を結合さ
せる方法、及びハロゲン化トリアジン等の架橋試薬を用
い担体に活性基を導入し、抗体を結合させる方法、また
、担体としてポリアクリルアミドを用いる場合は、まず
担体をアミノエチル誘導体、ヒドラジド誘導体あるいは
カルボキシル誘導体に変え、抗体を結合させる方法によ
り行なう。

本発明の物質の精製方法は、目的物質に対する鶏卵抗体
を前記の方法により調製し、該鶏卵抗体をリガンドとし
て不溶性担体に結合したものを用いて、常法によりアフ
ィニティクロマトグラフィーを行なう。リガンドに吸着
された目的物質の溶出処理は通常ｐＨ約３〜５という緩
和な条件で行なうことかできる。

例えば、抗原としてマウスＩｇＧを用いて鶏を免疫して
得られた抗マウスＩｇＧ鶏卵抗体をリガンドとして不溶
性担体に結合させたものを用い、アフィニティクロマト
グラフィーを行なう場合、試料としてのマウス血清をカ
ラムヘアブライすることにより、マウス血清中のマウス
ＩｇＧがリガンドである抗マウスＩｇＧ　ｍ非抗体に吸
着し、次いでｐＨ４の緩和な溶出条件で目的物質である
マウスＩｇＧを回収することができる。

あるいは、抗原としてロタウィルスを用いて鶏を免疫し
て得られた抗ロタウィルス鶏卵抗体をリガンドとして不
溶性担体に結合させたものを用い、アフィニティクロマ
トグラフィーを行なう場合、試料として、培養細胞で感
染増殖させた粗ロタウィルスをカラムヘアブライするこ
とにより、ロタウィルスのみがリガンドである抗ロタウ
ィルス鶏卵抗体に吸着し、次いでｐＨ４の緩和な溶出条
件により目的物質であるロタウィルスを回収することが
できる。

また、本発明の鶏卵抗体結合不溶性担体を用いれば、不
純物の除去にも利用することができる。

即ち、鶏卵抗体が不純物に対するものであれば、アフィ
ニティクロマトグラフィーを行なうことにより溶出画分
には不純物が回収され、素通り画分中に目的物質を回収
することができる。

例えば、動物細胞の組織培養においては仔牛脂仔血清を
用いて培養する場合が多いが、目的物質の精製において
は不純物としての仔牛脂仔血清を積極的に除去すること
が必要である。また、例えばモノクローナル抗体を精製
する場合には、ハイブリドーマを培養したマウスの腹水
由来の不純物を積極的に除去する必要がある。このよう
な場合に、これら不純物に対する鶏卵抗体を調製してア
フィニティクロマトグラフィーを行なうと、不純物を有
効に除去することができる。

また、本発明においては、前記のような目的物質の精製
方法を用いた精製工程と不純物の除去方法を用いた除去
工程を組み合わせることにより、より高純度に目的物質
を精製することができる。

〔作用・効果〕

本発明の鶏卵抗体結合不溶性担体を用いてアフィニティ
クロマトグラフィーを行なう場合、従来からリガンドと
して用いられているウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧを用いた
場合と比較して、溶出条件が従来法ではｐＨ２以下であ
るのに対し、Ｉ）Ｈ３〜５と緩和であるので、流出され
る目的物質が変性するおそれがないという優れた効果を
有する。また、溶出条件がきびしい従来法では、リガン
ドが不溶性担体からはずれる、いわゆるリガンドのもれ
が生じ溶出液中に微量のリガンドが混入するという問題
や、またそのためアフィニティー吸着体の寿命が短縮化
するという問題があることが知られている。しかし、本
発明では溶出条件が緩和であるのでリガンドのもれのお
それもなく、アフィニティー吸着体の寿命も長いという
効果を有する。

さらに、後述の実施例で示すように、産卵鶏１羽当たり
の抗体生産量はウサギＩ四当たりと比較して、１３．７
倍であること等から、抗体の供給面においても安価にか
つ安定供給できるという利点をも有している。

〔実施例〕

以下、実施例及び試験例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

実施例１ 〈産卵鶏及びウサギへの免疫〉 免疫動物としては、白色レグホン系の産卵鶏及びウサギ
（ＳＴＤ　Ｊｗ）を用いた。抗原は精製マウスＩｇＧ　
　（カッベル社）を用いた。免疫は抗原溶液（１ｍｇ／
ｍｌ　）を等量のフロイント完全アジュバントと乳化し
、産卵鶏１羽及びウサギ１匹あたり１回、抗原１ｍｇを
筋肉注射することにより行った。

免疫は隔週間隔て初回免疫を含めて４回繰り返した。

産卵鶏については、その後、４ケ月に１度免疫を行い、
１年間にわたり、その鶏卵を採取した。

これにより、年間１羽あたり平均２１０個の抗マウス［
ｇＧ鶏卵抗体の精製に使える鶏卵が得られた。

ウサギについては、最終免疫（免疫４日目）の１週間後
に常法に従い、全採血をしその血清を分離した。ウサギ
１匹あたり平均５２ｍ１の抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧ
の精製に使える抗血清が得られた。

尚、コントロールとして、免疫していない産卵鶏は、年
間１羽あたり平均２１４個のコントロール鶏卵か得られ
た。又、ウサギからは全採血により１匹あたり平均５０
ｎ＋　１のコント０−ル血清が得られた。

試験例１ 〈卵黄中及びウサギ血清中の特異的抗体価の測定〉マウ
スｒｇＧに対する特異的抗体価はＥＬＩＳＡで行った。

ヌンク社製のＥＬＩＳＡ　９６穴プレートへ抗原として
用いたマウスＩｇＧを常法に従いコーティングした。ブ
ロッキングにはオボアルブミンを用いた。

マウス１宮ＧコーテイングプレートへＰＢｓ−Ｔｗｅｅ
ｎ（０゜５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理的リン酸バッフ
ァー、　ｐＨ７゜２）で１０００倍希釈した卵黄及びウ
サギ血清を添加（１００μｍ／ウェル）し、室温て２時
間放置した。

次いで各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、２
次抗体としてアルカリフォスファターゼを結合させた抗
鶏卵抗体（ＩｇＹ）ウサギＩｇＧ及び抗つサギＩｇＧヤ
ギＩｇＧ　　（ザイメット社）を用い、それぞれ対応す
るウェルへ添加（１００μβ／ウエル）した。室温２時
間放置後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎて洗浄し、基
質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ社）
を用い、酵素反応（室温１５分間）を行わせ、プレート
リーダーにより波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し
た。初回免疫後の卵黄及びウサギ血清中のマウスＩｇＧ
特異的抗体価の推移を第１図に示す。

実施例２ 〈抗マウスＩｇＧ鶏卵抗体及びウサギＩｇＧの精製〉（
１）鶏卵抗体（ＩｇＹ）の精製 鶏卵より卵黄を分離し、卵黄と等重量の脱イオン水を加
え均質化した。この卵黄２倍希釈液に２倍量のλ−カラ
ギナン水溶液（１，５ｍｇ／ｍｌ　）を混合し、卵黄リ
ポタンパク質を凝集させた。３０分間室温に放置した後
、遠心分離（１０，０００ｘ　ｇ、　１０分間）でリポ
タンパク質を沈澱として除去した。その上清を濾紙（ア
トバンチツク東洋Ｎｏ、　２ペーパーフイルター）で吸
引濾過した。濾液に対し、リン酸２ナトリウムを２０ｍ
Ｍとなるよう溶解し、３Ｎ塩酸を加えて、ｐＨ８，０と
した。この液をあらかじめ２０ｍＭリン酸バッファーｐ
Ｈ８，０で平衡化したＤＥＡＥセファセルカラムヘアブ
ライし、同バッファーで非吸着物を充分洗浄した。カラ
ムから吸着タンパク質の溶出は、２００ｍＭリン酸バッ
ファーｐＨ８，０で行なった。溶出液へ１５％（Ｗ／Ｖ
）となるよう硫酸ナトリウムを溶解し、生した不溶物（
塩析物）を遠心分離（１０，Ｃ１００Ｘ　ｇ＋　１０分
間）で集めた。塩析物は２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ
８，０に溶解し、同様の硫酸ナトリウム塩析操作をさら
に２回繰り返した。

最終の塩析物は、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８，０
に溶解し、同バッファーに対し透析した。透析後の溶液
は、０．４５μｍのメンブレンフィルターを通した後、
凍結乾燥した。

以上の操作により、マウスＩｇＧに対する特異的抗体価
の上昇した鶏卵１個（卵黄１５ｇ）からタンパク質量と
して６５ｍｇのＩｇＹが得られた。

（２）ウサギ血清抗体（ＩｇＧ）の精製ウサギＩｇＧは
、常法により精製した。ウサギ血清に、等量のｌ０ｍＭ
リン酸バッフｙ　−ｐＨ７，Ｏ（０，１５ＭＮａＣ１含
む）を加え、さらに血清と等量の飽和硫酸ナトリウム液
を加え、３３％硫安塩析を行なった。

塩析物を遠心分離（１０，０００ｘ　ｇ、　１０分間）
で回収し、５０ｍＭリン酸バッフｙ　−ｐＨ８，０（０
，１５ＭＮａＣ１を含む）に溶解した。この液を５ｕｐ
ｅｒｏｓｅ　１２　ｐｒｅｐ、ｇｒａｄｅを用いたゲル
濾過て、＋ｇＧ画分を得た。ＩｇＧ画分を、２０ｍＭ　
トリス塩酸バッファーｐＨ８，３に対し透析した。

次いで、常法に従い、ＤＥＡＥイオン交換クロマ）−グ
ラフィー（ＭｏｎｏＱ、　　ファルマシア社）を行い、
ＩｇＧを吸着させ２０ｍＭ　）リス塩酸バッファーｐＨ
８，３，０〜０．２ＭＮａ、Ｃ１でグラジェント溶出を
行い、精製ＩｇＧ画分を得た。これを１０ｍＭリン酸バ
ッファーｐＨ８，０に対し透析した後、凍結乾燥した。

以上の操作によりマウスＩｇＧで免疫したウサギ血清１
ｍｌ当たり、タンパク質量として、１０．３ｍｇのウサ
ギＩｇＧか得られた。

試験例２ 〈抗体純度の検定〉 抗体の純度検定は、ファルマシアＦＰＬＣシステムによ
る、ゲル濾過分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２ＨＲ１０／
３０　）及びレムリーらによる５ＤＳ−電気泳動法によ
り行なった。

実施例２て得られたＩｇＹ及びウサギ１ｇＧは、共にゲ
ル濾過分析でシングルビークであり、かつ、５ＤＳ−電
気泳動分析で、抗体のＨ鎖及びＬ７鎖のみが確認され、
ＩｇＹ及びウサギＩｇＧは、純品にまで精製されたこと
が確認された。

試験例３ 〈マウスＩｇＧ特異的結合抗体量の測定〉実施例２で得
られたＩｇＹ及びウサギＩｇＧ中に含まれるマウスＩｇ
Ｇ特異的結合抗体の割合を、マウスＩｇＧをリガンドと
したアフィニティークロマトグラフィーで非吸着画分と
吸着画分に分け、それぞれのタンパク質量を測定するこ
とにより測定した。

リガンドに用いたマウスＩｇＧは、免疫抗原として用い
たカッペル社製の精製マウスＩｇＧである。

ゲルは、シアノジエンブロマイド（ＣＮ−Ｂｒ）活性化
セファロース４Ｂ　（ファルマシア社）を使用し、ファ
ルマシア社のマニュアルに従い、ゲル１ｍｌあたり１０
■のマウスＩｇＧを結合させた。

ＩｇＹ及びウサギＩｇＧを５０ｍＭリン酸バッファー（
０，１５ＭＮａＣ１含む）ｐＨ８，０に溶解した。それ
ぞれをマウスＩｇＧ−セファロース４Ｂ（１７ゲル）カ
ラムヘアブライし、５０ｍＭリン酸バッファー（０，５
ＭＮａＣｌ含む）　ｐＨ８，０で非吸着抗体を洗浄し、
次いで０．１Ｍ炭酸ナトリウム液（０，５ＭＮａＣ１含
む）　ｐｉ−ＩＮ、３て吸着抗体を溶出した。カラムへ
のアプライ抗体、非吸着抗体及び吸着抗体の量を波長２
８０ｎｍにおける吸光度をタンパク質量として算出し、
以下の結果（表−１）を得た。尚、コントロールとして
は、非免疫産卵鶏の卵黄及び非免疫ウサギの血液から、
ＩｇＹ及びウサギＩｇＧを精製し、上記と同様の操作を
行なった。

表−１マウスｒｇＧ特異的結合抗体量の測定面、波長２
８０ｎｏ＋の吸光度からの抗体量の算出は、ＩｇＹにつ
いては　Ｅ脣。、、＝１４．８、ウサギ＋ｇＧについて
は　Ｅ↓ｒ、、、　＝１３．５の吸光係数を用いた。

以上の結果より、マウスＩｇＧを抗原として免疫した産
卵鶏の鶏卵抗体（ＩｇＹ）では、抗体全量の２８％が、
またウサギ血清抗体（ＩｇＧ）では、抗体全量の５２％
かマウスＩｇＧ特異的結合抗体であることが示された。

ここでマウスＩｇＧ特異的結合抗体産生量を、産卵鶏１
羽及びウサギ１匹あたって比較すると、産卵鶏では年間
２１０個の鶏卵より３１５０−の卵黄が得られ、これよ
り抗マウスＩｇＧ鶏卵抗体が１３．６５０■精製される
。この中に含まれるマウスＩｇＧ特異的結合抗体は、３
．８２２■である。

一方、ウサギの場合、平均５２ｍ１の抗血清が得られ、
これより、抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧが５３６■精製
される。この中に含まれるマウスＩｇＧ特異的結合抗体
は、２７９■である。

従って、マウスＩｇＧで免疫した産卵鶏の１羽あたりの
マウスＩｇＧ特異的結合抗体生産量は、ウサギを用いる
従来法に比較し、１３３７倍であることが示された。

実施例３ （１）抗マウス（ｇＧ　ｍ非抗体・（ＩｇＹ）−セファ
ロース４Ｂの作製 ファルマシア社製シアノジエンブロマイド活性化セファ
０−ス４Ｂ　　１０．０ｇを１ｍＭＩ（Ｃ１中で膨潤さ
せ、ガラスフィルター（３Ｇ）上で充分洗浄した。次い
でカップリングバッフｙ　　　（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ
ｚ、　ｏ、　５ＭＮａＣ１バッファーｐＨ８，３）で充
分洗浄した。リガンドとして、実施例２で得られた抗マ
ウスＩｇＧ鶏卵抗体（ＩｇＹ）３３０■を、カップリン
グバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混合し、室温２時
間でカップリング反応を行なった。ゲル懸濁液とリガン
ド溶液の比率は１：２で行なった。ゲルをブロッキング
試薬（０，２Ｍ　　グリシン、　ｐＨ８，０）に移し、
室温２時間で未反応活性基をブロッキングした。次いて
、ゲルをガラスフィルター上でカップリングバッファー
、０．１Ｍ酢酸バッフｙ　−（０，５ＭＮａＣ１含む’
）　ｐ）！４゜０、カップリングバッファーの順で充分
洗浄した。

以上により、リガンド結合率９８％で、抗マウスＩｇＧ
鶏卵抗体（ＩｇＹ）−セファロース４Ｂゲル３３ｙｄが
得られた。

（２）抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧ−セファロース４Ｂ
の作製 リガンドとして、実施例２で得られた抗マウスＩｇＧウ
サギＩｇＧを用い、上記と同様の操作を行い、リガンド
結合率９７．５％で抗マウスＩｇＧウサギＩｇＧ−セフ
ァロース４Ｂゲル３３−が得られた。

試験例４ くイムノアフィニティーカラム溶出条件の比較〉実施例
３で調製した、それぞれのセファロース４Ｂゲル１０ｍ
１’をカラム（φ１．６　ａｎＸ　５ｃｍ　）にバッキ
ングし、５０ｍＭリン酸バッファ　−１）８８．０　（
０，５Ｍ　ＮａＣ１含む）で平衡化した。

試料は、精製マウスＩｇＧ（カッベル社）を平衡化バッ
ファーに溶解しく１０■／ｒＩＬｌ）、それぞれのカラ
ムへ５００μｌアプライした。

平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、溶出バッファ
ーとして、まず０．１Ｍ酢酸バッファーｐＨ４゜０　（
０，５Ｍ　ＮａＣ１含む）、次いでグリシン／塩酸バッ
フｙ−ｐＨ２，０（０，５Ｍ　ＮａＣ１含む）を用い、
ｐＨ４，０とｐＨ２，０の２段階ステップワイズ溶出を
行なった。

溶出は試料のアプライ方向とは逆方向で行なった。

溶出画分はフラクションコレクターで分取（１ｒｒＬｌ
／フラクシヨン）し、波長２８０ｎｍにおける吸光度を
測定した（第２図）。ｐＨ４及びｐＨ２溶出におけるマ
ウスＩｇＧの回収率を波長２８０ｎｍにおける吸光度よ
り求めた結果を、表−２に示す。

表−２溶出条件の比較結果 尚、酵素免疫測定法により、それぞれのカラムの溶出画
分について、リガンドとして用いた抗体（ウサギＩｇＧ
及びＩｇＹ）の検出を行なった結果、ｐＨ４，０の溶出
ではりガント抗体は検出されなかったが、ｐＨ２，０の
溶出ではいずれのリガンド抗体も検出された。

以上の結果より、従来、イムノアフィニティークロマト
グラフィーでリガンドとして用いられているウサギＩｇ
Ｇでは、吸着物質の溶出にｐＨ２，０以下の溶出条件が
必要であるが、ＩｇＹをリガンドとしたアフィニティー
クロマトグラフィーでは、ｐＨ４，０という比較的マイ
ルドな溶出条件で吸着物質が溶出回収できることが判明
した。

実施例４ くマウス血清ＴｇＧのイムノアフィニティークロマト精
製〉 マウス血清（５ｒＩＬｌ）を３３％飽和度で硫酸アンモ
ニウム塩析した。塩析物を５０ｍＭリン酸バッファー（
０，５Ｍ　　ＮａＣ１含む）　ｐＨ８，０ニ溶解し、同
バ’１７７７−に対して充分透析し、粗マウスＩｇＧ試
料とした。

実施例３で調製した抗マウスＩｇＧ鶏卵抗体（ＩｇＹ）
−セファロース４Ｂゲル２０ｙａｌをカラムにバッキン
グし、５０ｍＭリン酸バッフｙ−ｐＨ８，０（０，５Ｍ
　　ＮａＣ１含む）で平衡化した。このカラムへ粗マウ
スＩｇＧ　試料をアプライし、平衡化バッファーで充分
洗浄した。その後、０．１Ｍ酢酸バッフｙ　−ｐＨ４，
０（０，５Ｍ　ＮａＣ１含む）で吸着タンパク質を溶出
し、マウスＩｇＧ３４■を得た。

マウスＩｇＧの回収率は、酵素免疫測定法（サンドイン
チ法）で７２％であった。またその純度は、試験例２の
ゲル濾過分析でシングルビーク、かつレムリーの５ＤＳ
−電気泳動においても、ＩｇＧのＨ鎖及びＬ鎖のみが確
認されるものであった。

実施例５ くマウスハイブリドーマ培養上清からのＩｇＧ精製〉ヒ
トスーパーオキシドディスムターゼモノクローナル抗体
（マウスＩｇＧ＋クラス）を産生ずるマウスハイブリド
ーマを、１０％仔牛脂児血清を含むＲＰＭｌ培地で培養
した。その培養上清１０００Ｔｄ！を、分画分子量１０
，０００の限外濾過膜を用い、５０ｍＭ’Ｊン酸バッフ
ｙ　−ｐ）Ｉｓ、　０　（０，５Ｍ　ＮａＣ１含む）に
バッファー交換した。この液を実施例４で用いた抗マウ
スＩｇＧ鶏卵抗体−セファロース４Ｂカラムヘアブライ
し、非吸着タンパクを平衡化バッファーで充分洗浄した
。次いで０．１Ｍ酢酸バッファ　−ｐＨ４，０（０，５
Ｍ　ＮａＣ１含む）で吸着タンパクを溶出させ、ヒトス
ーパーオキシドディスムターゼモノクローナル抗体１０
■を回収した。マウスＩｇＧ、の回収率は、酵素免疫測
定法（サンドイツチ法）で、７６％であった。また、そ
の純度は、ゲル濾過分析でシングルビークかつ、レムリ
ーの５ＤＳ−電気泳動においてもＩｇＧ（７）Ｈ鎖及び
ｌのみが確認されるものであった。

実施例６ 〈マウスハイブリドーマ腹腔培養液からのＩｇＧ精製〉 ヒトスーパーオキシドディスムターゼモノクローナル抗
体（マウスＩｇＧ＋）を産生ずるマウスハイブリドーマ
を、ｌＯ％仔牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で
培養し、遠心で細胞を集めＭＥＭ培地で洗浄した後、Ｐ
ＢＳに懸濁した。これを、予めブリスタン投与しておい
たＢＡＬＢ／ｅマウス（雄、６ｗｅｅｋｓ）の腹腔内に
、マウスあたり１〜２　Ｘ　１０７ｃｅｌｌｓ注射した
。ハイブリドーマの注射後約ｌＯ８目に開腹し、マウス
あたり５−の腹水を得た。採取した腹水は遠心（３００
０ｒｐｍ、　２０ｍ１ｎ）後、硫安分画（０〜５０％飽
和）を行い、遠心して得られる沈澱物を５０ｍＭリン酸
バッファ　　（ｐＨ８，０，ｏ、５Ｎａｃｌ含む）に溶
解後、同バッファーに対して充分透析した。透析内液を
実施例４で用いた抗マウスＴｇＧ鶏卵抗体−セファロー
ス４Ｂカラムヘアブライし、非吸着タンパクを平衡化バ
ッファーで充分洗浄した。次いでＯ，ＩＭ酢酸バッフｙ
　　（ｐＨ４，０，０，５ＭＮａｃｌ含む）で吸着タン
パク質を溶出させ、ヒトスーパーオキシドディスムター
ゼモノクローナル抗体５０ｍｇを回収した。マウスＩｇ
Ｇの回収率はＥＬＩＳＡ　　（サンドイツチ法）で６８
％であった。また、その純度はゲル濾過分析でシングル
ビークかつ、レムリーの５ＤＳ−電気泳動においてもＩ
ｇＧのＨ鎖とＬ鎖のみが確認されるものであった。

実施例７ 〈抗ヒトロタウィルス鶏卵抗体−セファロース４Ｂの作
製〉 ヒトロタウィルスＭｏ株（血清型３型）で免疫した産卵
鶏の卵黄より、実施例２と同じ方法で鶏卵抗体（ＩｇＹ
）を精製した。このＩｇＹを実施例３と同様の方法でシ
アノジエンブロマイド活性化−セファロース４Ｂゲル１
ｒｎｌあたり１０ｍｇ結合させ、抗ヒトロタウィルス鶏
卵抗体−セファロース４Ｂを調製した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、卵黄及びウサギ血清中のマウスＩｇＧ特異的
抗体価の推移を示した図である。 第２図は、イムノアフィニティ力ラム溶出画分の波長２
８０ｎｍにおける吸光度を示した図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）鶏卵抗体をリガンドとして結合させていることを
   特徴とする鶏卵抗体結合不溶性担体。
2. （２）請求項（１）記載の鶏卵抗体が、予め抗原で免疫
   された鶏が産生した卵から調製されるものである鶏卵抗
   体結合不溶性担体。
3. （３）請求項（２）記載の抗原がタンパク質である鶏卵
   抗体結合不溶性担体。
4. （４）請求項（２）記載の抗原がウィルスである鶏卵抗
   体結合不溶性担体。
5. （５）請求項（１）、（２）、（３）又は（４）記載の
   鶏卵抗体結合不溶性担体を用いたアフィニティクロマト
   グラフィーにより、物質を精製する方法。
6. （６）請求項（１）、（２）、（３）又は（４）記載の
   鶏卵抗体結合不溶性担体を用いたアフィニティクロマト
   グラフィーにより、不純物を吸着除去する方法。
7. （７）請求項（５）又は（６）記載のアフィニティクロ
   マトグラフィーにおいて、ｐＨ３〜５の溶出条件下で吸
   着物質を溶出することを特徴とする請求項（５）又は（
   ６）記載の方法。