JPH04104798A - 抗アポ蛋白ｂ―１００モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は心筋梗塞等の心疾患や、糖尿病、脳卒中等の脳
血管障害等の各穐動脈硬化性疾患の発症因子としての脂
質代謝異常の臨床検査や診断及び治療に有用なアポ蛋白
Ｂ−１００に対するモノクローナル抗体に関する。

〔従来の技術〕

脂質代謝異常は、狭心症や心筋梗塞等の心疾患や糖尿病
、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化性疾患の重大
な危険因子とされ、血液中の総コレステロールとの関連
が数多く報告されている。

［Ｋａｎｎｅｌ、　Ｗ、　Ｂｌｅｔ　ａｔ、、　Ａｎｎ
、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ１９０、８５−９１（１９
７９）　；　Ｓｔａｍｅｌｅｒ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、
、　ＪＡＭＡ。

２５６、　２８２３−２８２８（１９８６）　　；　　
Ｌｉｐｉｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣ１ｉｎｉｃｓ　Ｐｒ
ｏｇｒａｍ、　ＪＡＭＡ、　２５１．３５１−３７４（
１９８４））。

脂質代謝異常とは、リポ蛋白の合成、分泌、異化の過程
でこれらのいずれかが異常をきたす状態と定義でき、こ
れは先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常
とに分類される。血液（血漿）リポ蛋白代謝と動脈硬化
についての研究としてはゴールドスタインとブラウン（
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　＆Ｂｒｏｗｎ）によって実証され
たＬＤＬ（低密度リポ蛋白）レセプター経路に関する一
連の研究があるＣＢｒｏｗｎ、　Ｍ、　Ｓ、　＆　Ｇｏ
ｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ＬｌＳｃｉｅｎｃｅ。

２３２、３４−４７　（１９８６）　］。

また、リボ蛋白の種類と性状について内藤のまとめた表
によれば〔内藤周幸、動脈硬化とりポ蛋白、血漿リポ蛋
白；原一部、植田伸夫、赤沼安夫編、　３１４−３４４
．講談社、東京、　１９８３］　、リポ蛋白の５口りが
各種リポ蛋白の中で最もコレステロールに富み、その組
成比率はおよそ５０％にもなっておりＬＤＬの代謝異常
による、血液中あるいは組織中の過剰のコレステロール
が動脈硬化の成因として最も重要な要因とされている。

従って上記動脈硬化の進展あるいは予防のたｔにリポ蛋
白のＬＤＬの代謝異常を検出することは、その臨床検査
・診断に極めて重要である。

しかしながら従来、上記脂質代謝異常の検出法としては
、血液中の総コレステロール及び血液中の）ＩＤＬ　（
高密度リポ蛋白）中のコレステロール値をパラメーター
とするものが最も一般に定着している。この方法は、血
液中の総コレステロール値を常法、例えば酵素法により
測定し、該値が臨床的及び経験的に設定された閾値（正
常域）を逸脱する場合を脂質代謝異常として検出するも
のである。

また近年、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との
結合物を比重により分画し、このうち特に高比重のリポ
蛋白（高密度リポ蛋白、ＨＤＬ）のコレステロール値を
ｓ定し、このＨＤＬ−コレステロール値そのものの又は
総コレステロール値から咳値を引いた値、即ち動脈硬化
指数を脂質代謝異常の検出パラメーターとする方法も行
われている。

しかしながら、現在までに蓄積された多くの疫学的調査
の結果及び臨床的知見によれば、これら従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映するものではなく、殊に臨床上その意義は低いこ
とがしばしば指摘されている。即ち、上記従来の方法は
いずれも総コレステロール値又はこれとＨＤＬ−コレス
テロール値を測定するものであって、これらの測定値は
いずれも脂質代謝異常とは必ずしも関連しない。特に総
コレステロール値の高値は虚血性心疾患のリスクファク
ターの一つとしての意義は有する〔例えばＭａｄ、　Ｃ
ｌ１ｎ、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、、　５８．３６３−３７
９（１９７４）参照〕が、疾患と直接結びつくものでは
なく、その検出方法による脂質代謝正常群における疾患
の発生や高度脂質代謝異常群にあける恒常的な健全性等
は、いずれも何ら稀なものではない。またＨＤＬ−コレ
ステロール値及びこれを基準とする動脈硬化指数をパラ
メーターとする場合も、上記と同様に実際の脂質代謝異
常を必ずしも的確に反映しない〔動脈硬化、　１４（４
）、　９３１−９３６（１９８６）等〕。

従って、動脈硬化と最も関連性が高いＬＤＬ中のコレス
テロールを直接血液中あるいは組織中で測定できること
が望ましい。リポ蛋白はカイロミクロン、ＶＬＤＬ　（
超低密度リポ蛋白）　、ｌ０Ｌ（中間型低密度リポ蛋白
）　、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白）　、ＩＩＤＬ（高密度
リポ蛋白）と呼ばれる５つに分けられ、それぞれ蛋白質
（アポ蛋白）、リン脂質、遊離コレステロール、コレス
テロールエステル、トリアジルグリセロール（中性脂肪
）からなりそれぞれその組成比率が異なり、上記のよう
にＬＤＬが最もコレステロールの含有比率が高く、主に
肝細胞及び末梢細胞のＬＤＬレセプターに取り込まれ代
謝される。

しかしながら、ＬＤＬ中のコレステロールの測定は難し
く、むしろＬＤＬの代謝に重要な機能を持つ蛋白質の測
定が一般に簡便であり、重要である。

ＬＤＬの代謝に係わる蛋白質はアポ蛋白Ｂと言われ、こ
れはリポ蛋白の合成・分泌、細胞のレセプターによる認
識機能をもつ。アポ蛋白ＢはＬＤＬ以外にはリポ蛋白の
カイロミクロン、ＶＬＤＬ中にも存在しており、腸管で
食事性（外因性）脂肪から合成されたカイロミクロン中
に含まれるアポ蛋白Ｂがアポ蛋白日−４８と呼ばれ、主
に体内で産生された（内因性）脂肪から肝で合成される
ＶＬＤＬ中に含まれるアポ蛋白Ｂがアポ蛋白Ｂ−１００
と呼ばれる。それぞれ腸管及び肝から分泌された後いず
れもＩＩＤＬからアポ蛋白Ｃとアポ蛋白Ｅを受は取って
成熟し、末梢血管でリポ蛋白リパーゼの働きによって水
解され、カイロミクロンはカイロミクロンレムナンド（
遣残型）へ変換され肝のレセプターを介して代謝される
。ＶＬＤＬはＩＤＬへと変換され、更に肝でアポ蛋白Ｅ
を認識するレセプターを介して代謝され、アポ蛋白Ｂ−
１００以外のすべてのアポ蛋白を失って遊離コレステロ
ールに富んだＬＤＬとなり流血中に再び現れる。即ち、
上記したように動脈硬化と脂質代謝異常の関係において
リポ蛋白ＬＤＬ中のアポ蛋白Ｂ−１００が最も重要であ
り、肝臓及び末梢組織においてＬＤＬ中のアポ蛋白Ｂ−
１００がＬＤＬレセプターと結合してＬＤＬが代謝され
てゆき、アポ蛋白Ｂ−１００とＬＤＬ中のコレステロー
ルは同時的変化を示すこととなる。即ち、細胞へのＬＤ
Ｌの取り込みはアポ蛋白Ｂ−１００を￥ＥＩＩｋするレ
セプターによって行われることから、ＬＤＬ中のコレス
テロールのみならず血液中のアポ蛋白Ｂ−１００の値が
動脈硬化の指標として重要な指標となり、近年多くの研
究がなされてきた［Ｂｒｏｗｎ、　Ｍ、　Ｓ、　＆　Ｇ
ｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｊ。

Ｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２．３４−４７（１９８
６）；　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｊ。

１１．　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎ、　　巳ｎｇｌ、　
　Ｊ、　　Ｍｅｄ、　　３０９．　２８８−２９６（１
９８３）　；　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　Ｌ、、　
ｅｔ　ａｌ、、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４６．　Ｅ１９７−９３Ｑ（１９
７７）　］。

アポ蛋白Ｂは上記のように２種のイソタイプがあり、ア
ポＢ−４８は肝臓のレセプターと結合し代謝され、アポ
ロ−１００は主に末梢組織でＬＤＬレセプターに結合し
代謝される。アポロ−１００の０ＩＲＮＡは１４、１２
１ｂｐであり、４５６３個のアミノ酸がコードされ、分
子量が約５１２．０００の蛋白質とされる（Ｂｌａｃｋ
ｈａｒｔ。

Ｂ、　　Ｄ、　　ａｔ　ｍｌ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅａ＋、、２６１．　１５３６４（１９８６））
。

アポ蛋白Ｂ−４８はアポ８−１００のアミノ基末端より
の半分であろうと考えられており、ヒトと家兎の小腸よ
り得られたｃＤＮ＾と肝由来のｃＤＮ＾の塩基配列と比
較して、すべてのｃＯＮ＾において２１５３番目の塩基
がＣからＴに変異してストップコドンになって２１５２
番でアミノ酸合成が終了し、アポ８−４８が出来てくる
ものと推定され、アポｅ−ｉｏｏにおけるＬＤＬレセプ
ターとの結合部位はカルボキシル末端寄りに存在すると
されている（Ｐｏｗｅｌｌ、　Ｌ、　Ｍ、　ｅｔａｌ。

Ｃｅ１ｌ、　５０．８３Ｈ１９８７）　　；　Ｈｏ５ｐ
ａｔｔａｎｋａｒ、＾、　Ｖ、ｅｔａｌｌＢｉｏｃｈｅ
ｒｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｎｍｕｎ、１
４８゜２７９（１９８７）　）。即ち、２１５３番目よ
りカルボキシ末端側を特異的に認識するモノクローナル
抗体によるアポＢ−１００の測定が出来れば、アポロー
４８と反応しないアポＢ−１００特異的モノクローナル
抗体となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来知られている抗アポ蛋白Ｂ−１００
抗体は、アポ蛋白Ｂ−１００のみならずアポ蛋白Ｂ−４
８とも反応するものであり、特異性が低かった。その結
果、この抗アポ蛋白Ｂ−１００抗体を利用した免疫測定
法による血液中のアポ蛋白Ｂ−１００値は、正確なもの
ではなかった。

従って、アポ蛋白Ｂ−４８等の他の蛋白と反応せず、高
い特異性を有し、血液中のアポ蛋白Ｂ−１００のみを正
確に検出することのできる抗アポ蛋白モノクローナル抗
体の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情において本発明者は、鋭意研究した結果、細
胞融合技術を利用することにより、アポ蛋白８−４８と
反応せず、アポ蛋白Ｂ−１００にのみ特異的に反応する
モノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明はアポ蛋白Ｂ−１００で免疫しだ哺乳
動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により
形成されたハイブリドーマにより産生され、アポ蛋白Ｂ
−１００に特異的に反応し、アポ蛋白Ｂ−４８とは反応
しないことを特徴とするモノクローナル抗体を提供する
ものである。

本発明モノクローナル抗体は、アポ蛋白Ｂ−１００で免
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との
融合により形成されたハイブリドーマにより産生される
。

細胞融合に用いられる親細胞としての免疫細胞は、アポ
蛋白Ｂ−１００を免疫抗原として用いて哺乳動物を免疫
し、当該哺乳動物から採取することにより調製される。

ここで免疫抗原としてのアポ蛋白Ｂ−１００は公知であ
り、常法に従い調製される［Ｈａｖｅｌ、　　Ｒ，Ｊ、
、　　ａｔ　　ａｔ、、　　Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉ
ｎｖｅｓｔ、、　　３４゜１３４５−１３５３　（１９
５５）等〕。

また、上記方法において免疫抗原、即ちアポ蛋白Ｂ−１
００で免疫される哺乳動物としては、特に制限はないが
、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して
選択するのが好ましく、一般にはマウス、ラット等が有
利に用いられる。免疫は一般的方法により、例えば上記
免疫抗原又は結合試薬により担体と結合させた抗原を哺
乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与
することにより実施できる。

上記に於てハプテンに結合される担体としては、通常抗
原の作成にあたり慣用される高分子の天然もしくは合成
の蛋白質を広く使用でき、例えば各種動物の血清アルブ
ミン類、血清グロブリン類、チログロブリン類、ヘモグ
ロブリン類、ヘモシアニン類や回虫より抽出された蛋白
質（アスカリース抽出物、特公昭６１−６１３５０号）
等のほか、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グ
ルタミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重
合体等を挙げることが出来る。また、結合試薬としては
、通常の抗原の作成にあたり慣用されるものを広く使用
でき、具体的にはアミノ基とアミノ基を架橋結合する、
例えばグリオキサール、マロンジアルデヒド、ゲルター
ルアルデヒド、スクシンアルデヒド、シボアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド類；チオール基とチオール基を架
橋結合する、例えばＮ、Ｎ／−０−フェニレンジマレイ
ミド、Ｎ。

Ｎ’　−ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド
化合物；アミノ基とチオール基を架橋結合させる、例え
ばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル化合物；アミノ基とカル
ボキシル基とをアミド結合する通常のペプチド結合形成
反応にもちいられる試薬、例えばＮ、Ｎ−ジシクロへキ
シルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチルアミ
ノカルボジイミド、ｌ−エチル−３−ジイソプロピルア
ミノカルポジイミド、ｌ−シクロへキシル−３−（２−
モルホニル−４−エチル）カルボジイミド等のカルボジ
イミド類等の脱水縮合剤を挙げることができるが、さら
にはｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムア
リールカルボン酸類と通常のペプチド形成反応試薬、例
えば上記脱水縮合剤とを組み合わせたものも、使用可能
である。

免疫は、例えばマウスの場合、免疫抗原を生理食塩水含
有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）や生理食塩水等で適当な濃度
に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、
供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投与量が１０
０〜５００ｐｇ／マウス程度になるようにして実施する
のが好ましい。アジュバントとしては百日咳ワクチン、
完全７０インドアジユバント、あるいはアラムを用いる
とよい。

更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の骨髄腫細胞としては、既に公知の種々のもの
、例えばＰ３／Ｘ６３−八ｇ８　（Ｘ６３）　（Ｎａｔ
ｕｒｅ。

２５６、４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３
−Ａｇ３．　ＵＨＰ３Ｌ１１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏ
ｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄｌ
ｎｍｕｎｏｌｏｇＬ　８１．１−７（１９７８））、Ｐ
３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＭＳＮＳｌ−１−Ａ、Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６１．５１１−５１９（１９
７６））、５ｐ２１０−Ａｇ１４（Ｓｐ２１０）（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２７６、２６９−２７０（１９７８））　
、ＦＤ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　Ｍｅｔｈ、、　３５．
１−２１（１９８０））等やラットにおける２１０．　
ＲＣＹ３．　Ａｇ１．２．３゜（Ｙ３）　（Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２７７、１３Ｈ１９７９）　）等を使用できる。

上記免疫細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、公知の方法
、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法［Ｍ６ｔｈｏｄｉｎ
Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７３．３（１９８１）　］等
に準じて行うことができる。より具体的には、通常の融
合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ！Ｇ）
　、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の
培地中で実施され、培地には更に融合効率を高するため
にジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加
することもできる。また、電気処理（電気融合）による
方法等を適宜採用することもできる。

免疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は、例えば骨髄腫細胞
に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通で
ある。融合反応時の培地としては、骨髄腫細胞の増殖に
通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０
培地、ＭＥ！Ｍ培地、その他のこの種の細胞培養に一般
に利用されるものを例示でき、通常これら培地は牛胎児
血清（Ｆｅ２）等の血清補液を除いておくのがよい。融
合は上記免疫細胞と骨髄腫細胞との所定量を、上記培地
内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰ８Ｇ溶液
、例えば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、
通常培地に約３０〜５Ｑｗ／ｖ％の濃度で加えて混ぜ合
わせることにより行われる。以後、適当な培地を逐次添
加して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことによ
り所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別培
地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプリン
及びチミジンを含む培地）で培養することにより行われ
る。該）ＩＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な
時間、通常数日〜数週聞行えばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とする
抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法［Ｂｎｇ
ｖａｌｌ、　Ｂ、、　Ｍａｔｈ、　Ｂｎｚｙｍｏｌ、、
　７０．４１９−４３９＜１９８０）　：］プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オフタロニー（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒ　１ｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法〔
「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社
Ｒ＆Ｄブラニング発行、第３０〜５３頁、昭和５７年３
月５日〕に従い実施することができ、この検索には前記
免疫抗原が利用できる。かくして得られるアポ蛋白Ｂ−
１００を認識する所望のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することがで
き、また液体窒素中で長期保存することもできる。なお
、免疫細胞としてマウス膵細胞を用い、骨髄腫細胞とし
てＰ３Ｌ１１を用いた場合、本発明モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマとしてＪＩ−＾、ＪＩ−Ｂ、
　ＪＩ−Ｃ，ＪＩ−ＤＳＪＩ−巳、ＪＩ−Ｆ、　ＪＩ−
Ｇ、　ＪＩ−Ｈ及びＪＩ−Ｉが得られ、このうちＪｒ−
Ｈは工業技術院微生物工業技術研究所にｒＪＩ−ＨＪな
る表示で微工研菌寄第１１２２５号（ＦＢＲＭ　Ｐ−Ｈ
２２５）として寄託されている。

上記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取法としては、該ハイブリドーマを、常法にしたがっ
て培養してその培養上清として得る方法やハイブリドー
マをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、
その腹水として得る方法が採用される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。また上記のごとくして得ら
れる抗体は、更に塩析、ゲル濾過法、Ｔフイニティクロ
マトグラフィー等の通常の手段により精製することがで
きる。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、Ｔポ
蛋白Ｂ−１００に特異的であるので、これを利用して、
例えば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー等
の通常の精製手段によりアポ蛋白Ｂ−１００を簡便且つ
特異的に精製することが可能である。また、本発明のモ
ノクローナル抗体の利用によれば、検体中のアポ蛋白Ｂ
−１００を免疫反応により、特異的に測定することがで
きる。該方法としては、通常の競合法、サンドイツチ法
によるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）　、酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ）　、凝集法等の通常の免疫学的手
法が挙げられ、これらの方法の操作、手順等は、常法に
従えばよい。より具体的には、例えば競合法を採用する
場合には、測定しようとする検体中のアポ蛋白Ｂ−１０
０と一定量の不活性化されたアポ蛋白Ｂ−１００とを、
標識剤で標識された本発明モノクローナル抗体の一定量
と競合反応させ、次いで、不溶化アポ蛋白Ｂ−１００と
標識抗体との結合体及び非結合標識抗体を分離し、その
何れか一方の標識活性を測定１することにより検体中の
アポ蛋白Ｂ−１００を定量することができる。又、サン
ドイツチ法を採用する場合には、被検体と不溶化された
本発明モノクローナル抗体とを反応させ、Ｔポ蛋白Ｂ−
１００不溶化抗体複合体を形成させ、この複合体に、標
識抗体の一定量を反応させ、次いで複合体と標識抗体と
の結合体及び非結合標識抗体を分離し、その何れか一方
の標識活性を測定することにより、検体中のアポ蛋白Ｂ
−１００を定量することができる。上記測定法において
検体として用いられる体液としては、例えば血液、細胞
組織液等を例示でき、これらのうちでは血液、特に血清
又は血漿が好ましく、これは更に常法に従い、各リポ蛋
白分画に分画したものを使用することもできる。

本発明モノクローナル抗体の標識物質としては、グルコ
アミラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、β−ガラクトオキシダーゼ等の各種の酵素、　＋
２５１、＋１１１、トリチウム等の放射性物質が挙げら
れる。該ｍ脆化法は、常法に従えばよイ［：Ｎａｔｕｒ
ｅ、　１９４．４９５（１９６２）　、Ａｃｔａ。

Ｅｎｄｏｃｒｌｉｎｏ、５ｕＰｐ１．１６８．２０６（
１９７２）等〕。

不溶化抗体は、アポ蛋白Ｂ−１００又は本発明モノクロ
ーナル抗体を、不溶性担体に化学的又は物理的に結合さ
せることにより製造される。不溶性担体としては、セル
ロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチ
レン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換
樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチ
ックチューブ、ナイロン、ガラスピーズ、絹、ポリアミ
ン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミ
ノ酸共重合物、エチレン−マレイン酸共重合物等が挙げ
られる。不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプ
チド法、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架
橋試薬としてグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソ
シアナート等を用いる）、Ｕｇ１反応による担体結合法
等の化学反応；あるいはイオン交換樹脂のような担体を
用いるイオン結合法；ガラスピーズ等の多孔性ガラスを
担体として用いる物理的吸着法によって行われる。

上記測定法において免疫反応は、通常４５℃以下、好ま
しくは４〜４０℃の温度で、数時間〜２４時間程度で行
われる。

かくして、本発明モノクローナル抗体を用いれば、簡便
に、高精度に、検体中のアポ蛋白Ｂ−１００を測定する
ことができる。

かかる本発明抗体を利用した精製系並びに測定系の設定
、その改変ないし応用は当業者にとり自明である。

〔発明の効果〕

本発明によれば抗アポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗
体が提供される。当該モノクローナル抗体を利用すれば
脂質代謝異常の臨床検査や診断及び治療が、より高精度
となる。

〔実施例〕

以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を説明するが本
発明はこれらに限定されるものではない。

参考例 正常ヒト血漿より遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ　５５　
Ｐ−７２、ロータスイング型２７−Ｚ　：日立製作新製
）により、ＬＤＬ　（ｄ　＝　１．００６〜１．０６３
）分画を約１００■分取し、これをＯ，ＯＯＩＭ　ＢＤ
ＴＡ含有０．１５Ｍ　ＮａＣ１水溶液で室温下、２４時
間透析した。エタノール：エーテル（３：　１）混合液
にこの２０■を加え、４℃下、３時間、ときどき攪拌し
ながら放置し、遠心（３０００ｒｐｍＸ１０分）して沈
澱物を得た。０．１ＭＫＣｌにて数回洗浄後、遠心（３
０００ｒｐｍＸ　１０分）して粉末状の沈澱物を採取し
、窒素乾燥した。これを８Ｍ尿素のＯ，ＯＩＭ　）リス
塩酸緩衝液（ｐｌ！＝８．６）に１０■／−濃度に溶解
し、その１ｒｎ１をゲル濾過（セファデックスＧ−２０
０：カラム２．５　Ｘ　９０ｃ＋＋＋　、ファルマシア
社製）に付し、同緩衝液にて流速５０−７時で溶出し、
分子量的５５０．０００の分画を採取した。

これを０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！水溶液にて透析後、濃縮
し、セファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）を用
いて同様にゲル濾過し、精製して、アポ蛋白Ｂ−１００
約５■を得た。

実施例１ 上記参考例で得られた精製アポ蛋白Ｂ−１００を１００
ｘ、同量のフロイント完全アジュバントと共に雄のＢａ
１ｂ／ｃマウス（６週齢）に皮下投与した。

その後同様に２回、３週問おきに追加投与して免疫した
。最終免疫の３日後に、［１を摘出した。

摘出膵臓より上記免疫したマウスの腫細胞を集め、３７
℃に加温したＲＰＭＩ培養液（ＲＰＭＩ−１６４０，日
水製薬製、以下ＲＰＭ［培地と略称する。）で３回洗浄
した。

同様にマウス骨髄腫細胞（Ｐ３［１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ
　ｔｏｐｉｃｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎ
ｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　７３．　ｐｐ３（１９８
１）参照）も洗浄する。これら、腫細胞と骨髄腫細胞を
細胞数比１０：１になるように５０ｍ１のチューブ内で
混和し、２００ｇ、　５分間遠心後上清をパスツールピ
ペットで完全に除去した。これらの損保は３７℃に保温
した水槽内にて行った。次にポリエチレングリコール４
０００　（ベーリンガーマインノ＼イム山之内社製、以
下ＰＥＧと略称する）を２−を加え、ゆっくりと１〜２
分間かき混ぜ１分間放置し、次いで３７℃に保温した牛
胎児血清（Ｆｅ２）をふくまないＲＰＭＩ培地１培地１
沙ｆくりと１分間位かけて加え、１分間放置し、更に固
液２−を加えて２分間放置し、更に固液４ｄを加え４分
間放置した。ついで３７℃に保温した１５％ＦＣ３，０
，０５力価／１の硫酸ストレプトマイシン、６００００
ロ／１のペニシリンＧカリウム、５４■／１−ゲンタマ
イシン及び１１１１１ピルベートを含有するＲＰＭＩ−
１６４０（以下これを完全ＲＰＭＩ−１６４０という）
８−を２〜３分間かけて加えた後、２００ｇで５分間遠
心分離した。上清を吸引除去し、３７℃に保温した完全
ＲＰＭＩ培地に、膵細胞ｌＸ１０１１個／ｍｌ！となる
ように懸濁させた。次に、この懸濁液を９６ウエルのプ
レート（コースタ−社製）にＯ，１ｒｎＩ！ずつ分注し
、３７℃、５％ＣＤ、　、１００％湿度のインキュベー
タ内で培養した。２４時間後、０．１−ずつ１０％（Ｆ
Ｃ’Ｓ）添加ヒポキサンチン１ｘ１０−’Ｍ、アミノプ
テリン４　Ｘ　１０−’Ｍ、チミジン１、６ｘ　１０−
５Ｍを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下、ＨＡＴ培地と略称
する）を各ウェルに添加した。以後上清を２日目、３日
目に０．１ｍｌ吸引し、０．１−の新しいＨＡＴ培地を
加えて液替えを行った。その後、液替えは２〜３日おき
に行った。６日目に同様に上滑を吸引しＩ　Ｘ　１０−
’Ｍヒポキサンチン、１．６×１０−’Ｍチミジンを含
む完全ＲＰＭＩ培地（以下、ＨＴ培地と称する）に代え
た。以後、完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。融合後、
１０〜１４日間でコロニーが肉眼で観察されるようにな
り、細胞が９６ウエルプレートの底面積の１／４を占め
た時より、上清を免疫抗原に用いたアポ蛋白Ｂ−１００
を抗原とする酵素免疫測定法（ＢＬＩＳＡ法）で試験し
、陽性となったウェルから直ちに限界希釈法によりクロ
ーニングを行った。即ち、Ｂｌａｂ／ｃ系マウス胸腺細
胞１×１０”個を含むように調製した１０％ＦＣ５加Ｒ
ＰＭＬ１６４０培地の２０−を用いて、ハイブリドーマ
を３個／ウェル、１個／ウェル及び０．３個／ウェルと
なる様に９６ウエルプレートに０．２−ずつプレートに
播きクローニングし、目的とするハイブリドーマを樹立
した。クローニングはアポ蛋白Ｂ−１００をコード口た
９６ウエルプレートを用い、パーオキシダーゼｉａａヤ
ギ抗マウス免疫グロブリン抗体（イー・ワイ・ラボ：　
Ｂ、　Ｙ、　Ｌａｂ、社）を使用したＥＬ＋ＳＡ法によ
り行った。かくして、所望の反応特異性を有する本発明
のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ９株を
得た。これらはそれぞれ（ＪＩ＾）〜（ＪＩ−１）と命
名した。

（１）上記で得られたクローンＮ（ＬＪＩ−＾〜ＪＩ−
１を、完全ＲＰＭＩ培地にて５％ＣＤ２条件下で、３７
℃にて、９６時間培養した。培養液を３００Ｏｒｐｍ　
、　１０分間遠心分離して、目的のモノクローナル抗体
を含む培養上清を得た。得られたクローンのうち一株（
本発明抗体産生ハイブリドーマＪＩ−Ｈ）を選定した。

該モノクローナル抗体産生細胞は、工業技術院微生物工
業技術研究所にｒ　ＪＩ−ＨＪなる表示で寄託されてお
り、その寄託番号は微工研菌寄第１１２２５号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１１２２５）である。

（２）　実施例１で得たクローンｋ　ＪＩ−Ｈの１×１
０６個を、予とブリスタン（アルドリッチ社製）を接種
しておいたＢａ１ｂ／ｃ系マウスに腹腔内投与した。

１０〜１４日後、蓄積した腹水を採取し、本発明モノク
ローナル抗体を含む腹水を得た。

該腹水は、抗体精製キラ）　（ＭＯＰＳ　Ｋｉｔ　；バ
イオ・ラッド社製）を用いて、精製抗体ＪＩ−Ｈを得た
。

上記クローンから得られた本発明モノクローナル抗体の
特性を以下に示す。

■　抗体のサブクラス マウスモノクローナル抗体サブクラス同定用キット　（
バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製）を用いて決定し
た上記抗体のサブクラスは、ＩｇＧ＋であった。

■　抗体産生レベル 実施例１−（１）で得られた培養上清を遠心分離し、上
清を１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ［培地にて３７℃、５％Ｃ
Ｄ。

の条件で１０日間インビ）口にて培養した。

ハイブリドーマが最大細胞密度になったときの培養上清
中のＪＩ−）１のＩｇＧ量は約１０μｇ／ｍｆであった
。

■　ウェスタンブロッティング 抗ヒトアポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗体の抗体特
異性の検討をウェスタンブロッティングにより以下の如
く行った。

ヒト血清よりリポ蛋白ＨＤＬ　、　ＬＤＬ　、　ＶＬＤ
Ｌ、カイロミクロン、精製アポＡ−１を日立５５Ｐ−７
５型超遠心機（日立製作新製）を用いて、以下の如く単
離・精製した。血清１００ｒｄに５％８ＤＴ＾１．６−
を加え、その３０−を比重１．００６液（１，１％塩化
す）　ＩＪウム液十０．０５％ＢＤＴＡ液）に重層し、
スイングロータ（ＲＰＳ−２７日立工機社製）を用いて
１５．ＯＯＯｒｐｍ　、　３０分間遠心分離した後、上
層のカイロミクロンを分取し、精製カイロミクロンとし
た。次に残りの下層に比重１．００６液を重層し、２６
．０００ｒｐｍ　、　２１時間遠心したのち、その上層
のＶＬＤＬを分取し、これを精製ＶＬＤＬとした。更に
残りの下層に比重１．１８２液（１，１％塩化ナトリウ
ム液＋３０．４％臭化ナトリウム液）を１／２溶加え、
比重１．０６３に合せて２６．０００ｒｐｍ　、　４０
時間遠心した後、その上層のＬＤＬを分取し、精製ＬＤ
Ｌとした。更に残りの下層に比重１．４８３液　（１，
１％塩化ナトリウム液＋７６．５％臭化す）　ＩＪウム
液）を１／２溶加え、比重１’、２１０に合せ、２６．
　ＯＯＯｒｐｍで６０時間遠心したのち、その上層のＨ
ＤＬを分取し、精製ＨＤＬとした。更にアポ蛋白Ａ−１
は上記の如く精製したＨＤＬ　１０■をエタノール：エ
ーテル（３：２）混液にて脱脂後セファデックスＧ−２
００（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００；　２．５Ｘ９０
ｃｍ）にてゲル濾過を行い、得られた分子量的２８にの
蛋白質を精製アポ蛋白＾−Ｉとした。これらの精製リポ
蛋白を用いて、ＳＯ３−ポリアクリルアミド電気泳動分
析を行った後、ウェスタンブロッティング法により、抗
体の特異性を検討した。

アポ蛋白＾−■モノクローナル抗体のウェスタンブロッ
ティングには７．５％ポリアクリルアミドゲルを用い、
アポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗体のウェスタンブ
ロッティングは５．５％ポリアクリルアミドゲルを用い
た。各単位リポ蛋白を溶解液Ｃ０，２Ｍ　）リス−グリ
シン緩衝液ｐＨ８，９＋３％５Ｏ３（硫酸ドデシルナト
リウム）＋３％メルカプトエタノール〕で溶解し、溶解
したリポ蛋白１■を、ブロムフェノールブルーを用いて
４０ｍＡ、室温で１時間泳動した（ＬＫＢ　２１１７　
ＭＯＵＴＩＰＨＯＲ泳動槽；　ＬＫＢ社製）。

泳動後、ニトロセルロース膜上にゲルをのせ、トランス
ファーユニット（常光社製）を用いてアポ蛋白へ−■抗
体用ゲル、アポ蛋白Ｂ−１００抗体用ゲルに対し、それ
ぞれ７０Ｖ　、　５０Ｖの電圧を１時間かけ、ニトロセ
ルロース膜に転写した。次にニトロセルロース膜を０．
５％ヘモグロビン＋０．５％ゼラチン液に入れ非特異反
応を室温にて１時間ブロッキングした。その後−次反応
として、Ｔポ蛋白Ａ−Ｉモノクローナル抗体（３〜５■
）１００倍希釈液とアポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル
抗体（３〜５■）２００倍希釈液（０，０５Ｍ　）リス
−塩酸緩衝液ｐ［Ｉ７．５にて希釈）を転写したニトロ
セルロース膜に４℃で、−昼夜反応させた。反応後、ニ
トロセルロース膜を０．０５Ｍ　）リス−塩酸緩衝液ｐ
）１７．５で洗浄シ、抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼ標識抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｃ１社製）を０．０５Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５，１，０００倍希釈とし、
６時間ニトロセルロース膜と反応後、ニトロセルロース
膜を０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５で洗浄し
、４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素水を加えて
発色させた。

その結果を第１図に示す。該図より、抗アポ蛋白＾−Ｉ
モノクローナル抗体は血清、ＨＤＬ　、アポ蛋白＾−■
及びカイロミクロンと反応し、抗アポ蛋白Ｂ−１００モ
ノクローナル抗体は、血清、ＬＤＬ及びＶＬＤＬと反応
するが、カイロミクロンとは反応しなかった。このこと
から抗Ｔポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗体はアポ蛋
白Ｂ−４８とは反応しないことがわかる。

更に、上記のＳＯ３−ポＩＪ　７クリルアミド電気泳動
法により、抗アポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗体に
より分画されたアポ蛋白Ｂ−１００の反応性を検討した
。

抗アポ蛋白Ｂ−１００イムノアフィニティゲル１Ｏｄ（
１，５Ｘ９ｃｍカラム；ファルマンＴ社製）にｌｄの血
清を添加し、吸着と未吸着に分画した。未吸着分画は、
１５−のＯ，ＯＩＭ　）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，４で
溶出した。吸着リポ蛋白は、２５−の３Ｍ　Ｎａ５ＣＮ
溶液（０，００１％ＢＳ八と０．３■／−ベンザミシニ
ン）　ｐＨ７，４で溶出した。吸着リポ蛋白はただちに
ＥＤＴＡ生理食塩水ｐＨ７，４で透析した。吸着と未吸
着リポ蛋白をミクロ・プロティン・ダイアリシス／コン
上レータ−；　Ｍｉｃｒｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｉａｌ
ｙｓｉｓ／Ｃｏｎｃｅｎｒａｔｏｒ　（バイオモレキュ
ラー・ダイナミックス社製；　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）Ｐ＾−１０透析膜を用いて
４℃にて試料を作製した。次に、濃縮した吸着、未吸着
リポ蛋白は前記したリポ蛋白単離法に基づいてＶＬＤＬ
を単離した。

次に３〜１５％グラージェント・ポリアクリルアミドゲ
ルを０．ＯＩＭ　）　！Ｊスス−酸緩衝液ｐＨ６，３で
泳動を行った。５Ｏ８−ＰＡＧＢにかける前に試料を２
％ＳＯ３、１０％グリセロール、１％メルカプトアセテ
ート、０．０５Ｍジチオスレイトール、０．００３％ブ
ロムフェノールブルー混液で調製した。泳動後、ゲルは
０．２５％クマシールブルー（メタノール酢酸溶液）で
−昼夜染色した。その結果を第２面に示す。

猿回のナンバーにおいてＮα１．２．３とＮ［Ｌ４．５
．６はそれぞれ同一検体から製作した分画で、Ｎα１と
Ｎα４はＴｏｔａｌ　ＶＬＤＬの泳動パターンであり、
アポ蛋白Ｂ−１００、アポ蛋白Ｂ−４８、アポ蛋白Ｅ１
アポ蛋白Ｃのいずれの存在も認められた。Ｎα２とＮα
５は未吸着ＶＬＤＬであり、アポ蛋白Ｂ−１００、アポ
蛋白日−４８、アポ蛋白Ｅ及びアポ蛋白Ｃが存在し、Ｎ
α１及びＮα４と同じ組成が認められた。しかしながら
、吸着ＶＬＤＬを示すｋ　３及びＮ１１Ｌ６はアポ蛋白
Ｂ−１００、Ｔポ蛋白Ｅ、アポ蛋白Ｃを認め、アポ蛋白
日−４８のバンドを検出しなかった。以上のことから、
抗ヒトアポ蛋白Ｂ−１００モノクローナル抗体（ＪＩ−
Ｈ）はアポ蛋白日−４８と反応しないことが明らかとな
った。

上記の二つの実験の結果より、本発明ヒトアポ蛋白Ｂ−
１００モノクローナル抗体（ＪＨ−１）はアポ蛋白Ｂ−
４８を認識しない抗体であることが分る。

■　ＢＬＩＳＡ法による標準曲線 本発明モノクローナル抗体を０．０１１ｕＪン酸緩衝液
（ｐＨ＝　７．２；以下、ＰＢＳと略称する）で１１０
０Ｉｔ／−に希釈して、これを９６穴マイクロプレート
の各式に１００μβづつ入れ、４℃で一晩固定後、０．
０１ＭＰＢＳで洗浄した。次いで各ウェルに２％ＢＳＡ
を含むＰＢＳを４００μβづつ入れ、４℃で一晩プロッ
キングを行った。ブロッキング後、０．ＯＬＭ　ＰＢＳ
で洗浄して、ここに１％ＢＳＡを含むＰＢＳで倍々濃度
に希釈した血清を１００μβづつ入れ、４℃で一晩放置
した。このプレートを０．ＯＬＭ　ＰＢＳで洗浄し、パ
ーオキシダーゼ標識抗アポ蛋白Ｂ抗体（パインディング
・サイト社製）を５０μβ添加して４℃で４時間反応さ
せた。プレートを洗浄後、結合したパーオキシダーゼの
酵素活性を○−フ二二レしジアミンを基質として反応さ
せて０Ｄ４９０ｎ＋ｎの吸光度を測定した。その結果を
第３図に示す。

猿回の縦軸は吸光度を、横軸は血清の希釈倍数を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明モノクローナル抗体及び抗アポ蛋白Ａ−
Ｉモノクローナル抗体の各種リポ蛋白含有検体に対する
ウェスタンブロッティングを示す図面であり、第２図は
ＶＬＤＬ分画の本発明モノクローナル抗体イムノアフィ
ニティゲル吸着部及び未吸着部の５ＯＳ−ＰＡＧＢパタ
ーンを示す図面である。第３図は本発明モノクローナル
抗体のＢＬＩＳＡ法における標準曲線を示す図面である
。 以　　上 第１図 抗アポＢ−１００ モノクローナル抗体 ＱΣコ 抗アポＡｉ モノクローナル抗体 第２図 検体Ａの未吸着 検体Ａの吸着 検体ＢのＴｏｔａｌ 検体Ｂの未吸着 検体Ｂの吸着 ＬＤＬ ＬＤＬ ＬＤＬ ＬＤＬ ＬＤＬ 第３図 Ｘｌ０−’ 血清希釈倍数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アポ蛋白Ｂ−１００で免疫した哺乳動物の免疫細胞
   と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により形成されたハイ
   ブリドーマにより産生され、アポ蛋白Ｂ−１００に特異
   的に反応し、アポ蛋白Ｂ−４８とは反応しないことを特
   徴とするモノクローナル抗体。 ２、ハイブリドーマがＪＩ−Ｈ（微工研菌寄第１１２２
   ５号）である請求項１記載のモノクローナル抗体。