JPH04112799A - しゆう酸又はその塩類の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はしゆう酸又はその塩類の定量方法、特に被分析
液中に存在するしゆう酸又はその塩類の定量方法に関す
る。

〔従来の技術〕

しゆう酸又はその塩類の定量は化学実験上のみならず臨
床化学の分野においても重要であり、例えば血中又は尿
中のしゆう酸室量は尿路結石、高しゆう酸尿症等の疾病
の予防、治療或いは先天性代謝異常の判定等に、又糞便
中のしゆう酸の定量は消化器系の異常機能を診断するた
めの分析法として重要である。

又しゆう酸は有毒であるために食品衛生法においては最
終食品の完成前に除去しなければならないと定められて
おり、しゆう酸を含有する有害製品の検出のためにしゆ
う酸の定量は近年その重要性が更に認められている。

従来前記しゆう酸又はその塩類か含まれている又は含ま
れていることのある前述した如き被分析液中のしゆう酸
又はその塩類を選択的に定量するために酵素を用いたし
ゆう酸の定量法が幾つか開発されているが、何れも幾つ
かの欠点や問題点があって充分満足しうるものではない
。

例えばしゆう酸含有被分析液にしゆう酸膜炭酸酵素を作
用させて、炭酸ガスとぎ酸を生成させ、この炭酸ガスを
マノメーター等で測定するか、又はぎ酸を水蒸気無滴し
て定量する方法があるが、これらの方法は操作が複雑で
時間が長くかかる欠点を有する。

又しゆう酸含有被分析液にしゆう酸膜炭酸酵素を作用さ
せて炭酸ガスとぎ酸を生成させ、更に酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）とぎ酸膜水素酵
素を作用させて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）を生成させ、３４０ｎｍの吸光度
の増加により定量する方法もあるが、この方法は使用す
る２種類の酵素の至適ｐｌ（が大きく異なるため、２段
階の反応を必要とする欠点を有する。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述した如〈従来の酵素を用いたしゆう酸の定量法の操
作が複雑で時間が長くかかる欠点を改良するため、本発
明は簡単な操作でかつ短時間でしゆう酸含有被分析液中
のしゆう酸又はその塩類を選択的に定量する方法を提供
することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、　（１）＋７グニンベルオキシダーゼ、
又は（２）ポルフィリン金属錯塩及び／又はその誘導体
、又は（３）金属フタロシアニン及び／又はその誘導体
が触媒する過酸化水素存在下でのベラトリルアルコール
からベラトルムアルデヒドへの酸化反応が、しゆう酸又
はその塩類により特異的に阻害され、しゆう酸又はその
塩類の量と上記酸化反応阻害の度合との間に一定の関係
があることを見出し、これを利用することによって前記
目的を達成できることを認め、本発明を完成するに至っ
たものである。

即ち本発明は（１）リグニンベルオキシダーゼ、又は（
２）ポルフィリン金属錯塩及び／又はその誘導体、又は
（３）金属フタロシアニン及び／又はその誘導体による
過酸化水素の存在下でのベラトリルアルコールからベラ
トルムアルデヒドへの酸化反応におけるしゆう酸または
塩類の特異的な阻害を利用するしゆう酸含有被分析液中
のしゆう酸又は塩類の定量方法である。

本発明方法において使用するリグニンベルオキシダーゼ
（これは近年ベラトリルアルコールペルオキシダーゼと
も称されている）は過酸化水素存在下でベラトリルアル
コールからベラトルムブルデヒドへの酸化反応を触媒し
、かつしゆう酸およびその塩類によりその触媒活性が特
異的に阻害されるものであれば、任意の公知の酵素を使
用できその生産起源の生物種は伺であってもさしつかえ
ない。好適な生物種としては、例えば白色腐朽菌のファ
ネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａ
ｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　）力１挙げられ
る。また、本発明で使用するポルフィリン金属錯塩及び
金属フタロシアニン及びこれらの誘導体も過酸化水素存
在下でベラトリルアルコールからベラトルムアルデヒド
への酸化反応を触媒し、かつしゆう酸およびその塩類に
よりその触媒活性が特異的に阻害されるものであれば特
に制限はない。ポルフィリン金属錯塩の好適な化合物と
しては例えば、ヘミン（■型）が、また金属フタロシア
ニンの好適な化合物としては、例えばフタロシアニン鉄
錯塩が挙げられる。

本発明方法は例えば次の如くして実施できる。

緩衝液にしゆう酸含有被分析液、ベラトリルアルコール
及び（１）リグニンベルオキシダーゼ又は（２）ポルフ
ィリン金属錯塩及び／又はその誘導体、又は１３）金属
フタロシアニン及び／又はその誘導体を添加し、所定の
温度で１〜５分間加温後、更に過酸化水素を添加し、所
定の温度を保持しつつキュベツト内において反応を開始
し、分光光度計を用いて単位時間当りのベラトルムアル
デヒドの特異的な３１０ｎｍにおける吸光度の増加量を
測定してその逆数を求める。又別にあらかじめ濃度の明
らかなしゅう酸溶液を用いて同測定方法により作成した
標準曲線と比較対照してしゆう酸含有量を決定する。盲
検としては過酸化水素のかわりに蒸溜水を加えたものを
用いる。

本発明方法における測定時の反応温度は１５〜４５℃、
好ましくは３０〜４０℃が適当であり、また測定時の反
応液のｐＨは２〜９、好ましくは３．０〜４．５が適当
である。

本発明方法において使用する緩衝液は反応系のｐＨを２
〜９の範′囲に保持でき、本発明方法の反応を妨害しな
いものであれば特に制限はない。

好適な緩衝液としては例えば、２，２−ジメチルコハク
酸−ＮａＯＨ４ｌ衝液、クエン酸−ＮａＯＲｍ衝液、リ
ン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、トランスアコニット
酸緩衝液等が挙げられる。

本発明方法を実施するに当って、被分析液０，１１当り
、使用する触媒の量はリグニンベルオキシダーゼの場合
は５〜５０単位、ヘミン（■型）の場合は１〜１０μ１
１　フタロシアニン鉄錯塩の場合は１〜１０μｇがよい
。また、ベラトリルアルコールの濃度は測定時の最終濃
度として００１〜２０１Ｍ、過酸化水素の濃度は測定時
の最終濃度として０．０５〜０．５％％、緩衝液の濃度
は測定時の最終濃度として０．０１〜０．ＩＭがよい。

また被分析液１ゴ当りに存在する被分析しゆう酸量とし
てはＯ〜ｔｕｙ、好ましくは０〜２００μｇのものが良
好な結果を与える。なお、被分析物がペースト状あるい
は固形である場合はその一定量をミキサー等でホモジナ
イズし、水で抽出した後、屏過し、その炉液に蒸溜水を
加えて一定量として、被分析液とする。

〔作用〕

本発明方法によれば、触媒作用によりベラトリルアルコ
ールが酸化されてベラトルムアルデヒドを生成する量が
、しゆう酸又はその塩類の存在量によって比例的に阻害
されることを利用し、生成するベラトルムアルデヒドの
量を３１０ｎｍでの吸光度の増加量を測定することでし
ゆう酸又はその塩類の量を測定できる。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に示すが、こ
れらは本発明を例示するもので、本発明を限定するもの
ではない。

リグニンベルオキシダーゼ（ベラトリルアルコールペル
オキシダーゼ）の活性測定方法：リグニンベルオキシダ
ーゼの活性は、０．０２Ｎトランス−アコニット酸緩衝
液（ｐＨ３，０）２．７５ｗＬｔに１２０ｍＭベラトリ
ルアルコール水溶液０．０５ｄ及び適宜上記緩衝液で稀
釈した酵素液０．１１を添加し、３７℃にて３分間加温
した後、３Ｖｖ％過酸化水素水０．１１を添加し、３７
℃に保温しつつキュベツト内で反応させ、分光光度計を
用いて１分間当りの３１０ｎｍにおける吸光度の増加量
を測定し、生成するベラトルムアルデヒドの量をその分
子吸光係数ε、、、＝９３００Ｍ−’　（１ｍを用いて
算出し、１分間１　ｎ　ｒａｏｌのベラトルムアルデヒ
ドを生成する酵素量を１単位とする。

参考例　１ しゆう酸がリグニンベルオキシダーゼの触媒する過酸化
水素存在下でのベラトリルアルコールからベラトルムア
ルデヒドへの酸化反応へおよぼす阻害機構の調査 ファネロケーテ・クリソスポリウムＭＥ−４４６株由来
のリグニンベルオキシダーゼ３０単位及びベラトリルア
ルコール０．０２〜２ｍＭを含有する０、０２Ｍトラン
ス−７＝ニツト酸緩衝液（ｐＨ３，０）に、夫々しゆう
酸０　、０．１　、０．５及び１．０ｍＭを添加し、３
７℃にて３分間加温後、更に過酸化水素０．１％％を添
加し、３７℃に保温しつつキュベツト内で反応させ、分
光光度計を用いて１分間当りの３１０ｎｍにおける吸光
度の増加量を測定し、その逆数を求め、反応基質である
ベラトリル７Ａ／コールの濃度の逆数に対してブ０　’
７　）し、夫々のしゆう酸濃度におけるラインライ−バ
ー・バークのプロットを作成することによりＬゆう酸の
阻害機構を調査した。

盲検は過酸化水素の代りに蒸溜水を添加したものを用い
た。この結果を第１図に示す。本図よりしゆう酸は本酵
素に対して非競争阻害を呈し、その阻害定数（Ｋｉ　）
は０．３５ｍＭであった。

参考例　２ 触媒としてリグニンベルオキシダーゼを用いた場合のし
ゆう酸室量のための標準曲線の作成参考例１で用いたリ
グニンベルオキシダーゼ３０単位およびベラトリルアル
コ−ｙｖ　Ｏ，１ｍＭを含有スる０、０２Ｍトランス−
アコニット酸緩衝液（ｐＨ３，０）　２．８−に０〜２
００４／ｙｘｌのしゆう酸溶液を０．１−添加し、３７
℃にて３分間加温後、更に３〜％過酸化水素水０．１−
を添加して、３７℃に保温しつつ、キュベツト内で反応
させ、分光光度計を用いて１分間あたりの３１０ｍａｔ
における吸光度の増加量を測定し、その逆数をしゆう酸
濃度に対してプロットすることにより、しゆう酸室量の
ための標準曲線を作成しへこの結果を第２図に示す。

参考例　３ 触媒としてヘミン（■型）を用いた場合のしゆう酸室量
のための標準曲線の作成 参考例２においてリグニンベルオキシダーゼ３０単位の
かわりにヘミン（■型）１０μｌを用いる以外は参考例
２と同様にしてしゆう酸室量のための標準曲線を作成し
た。この結果を第３図に示す。

参考例　４ 触媒としてフタロシアニン鉄錯塩を用いた場合のしゆう
酸室量のための標準曲線の作成参考例２においてリグニ
ンベルオキシダーゼ３０単位のかわりにフタロシアニン
鉄錯塩１０μｇを用いる以外は参考例２と同様にしてし
ゆう酸室量のための標準曲線を作成した。この結果を第
４図に示す。

実施例　１ 被検者２名の尿（ア、イ）をそれぞれ８ｄずつ４区分に
分け、ア、イそれぞれの第１区分には何も加えず、第２
区分にほしゅう酸を０．５１１９、第３区分には同じ＜
：１．０１１ｇ、第４区分には１．５■を夫々加え、更
に夫々を１Ｍ塩酸でｐＨ３，０に調整後、沸騰水中で約
１５分間加熱後、室温まで冷却し、１０ｄに定容したも
のをしゆう酸含有被分析液として参考例２と同様の方法
で、参考例２において作成した標準曲線を用いて、しゆ
う酸の定量を行なった。これらの結果を第１表および第
２表に示す。

第　　１　　表　　（尿ア） 第　　２ 表 （尿イ） 以上の結果より、本発明方法によるしゆう酸の定量にお
いて、しゆう酸濃度と１分間当りの３１０ｎｍの吸光度
の増加量の逆数とは直線関係にあり、またしゆう酸の回
収率が９７．９〜１０１．８％と極めて高いことより、
本発明方法がしゆう酸の定量法として優れていることを
示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々の濃度のしゆう酸存在下でのリグニンベ
ルオキシダーゼ活性のラインライバー・バークのプロッ
トを示すグラフ、第２図はリグニンベルオキシダーゼを
用いた場合のしゅう酸室量の標準曲線を示すグラフ、第
３図はヘミンを用いた場合のしゆう酸室量の標準曲線を
示すグラフ、第４図はフタロシアニンを用いた場合のし
ゆう酸室量の標準曲線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リグニンベルオキシダーゼが触媒する過酸化水素存
   在下でのベラトリルアルコールからベラトルムアルデヒ
   ドへの酸化反応におけるしゆう酸又はその塩類の特異的
   な阻害を利用することを特徴とするしゆう酸含有被分析
   液中のしゆう酸又はその塩類の定量方法。 ２、ポルフィリン金属錯塩及び／又はその誘導体が触媒
   する過酸化水素存在下でのベラトリルアルコールからベ
   ラトルムアルデヒドへの酸化反応におけるしゆう酸又は
   その塩類の特異的な阻害を利用することを特徴とするし
   ゆう酸含有被分析液中のしゆう酸又はその塩類の定量方
   法。 ３、金属フタロシアニン及び／又はその誘導体が触媒す
   る過酸化水素存在下でのベラトリルアルコールからベラ
   トルムアルデヒドへの酸化反応におけるしゆう酸又はそ
   の塩類の特異的な阻害を利用することを特徴とするしゆ
   う酸含有被分析液中のしゆう酸又はその塩類の定量方法
   。