JPH04122858A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高感度で非特異反応が少ない免疫測定法に関
し、特に、グリコシド誘導体含有重合体を反応系に存在
させた免疫測定法に関する。

〔従来の技術〕

各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。

このような抗原抗体反応による測定方法としては、高感
度定量法として放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測
定法（ＢＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（Ｆ
ＩＡ）等の各種の方法が知られている。また、赤血球や
細菌等の生物系の担体やラテックス等の人工担体に抗原
あるいは抗体を担持させ、検体中の抗体あるいは抗原を
検出する免疫測定法が広く行われてきた。

抗原抗体反応は本質的に対応する物質量の反応が厳密に
かつ選択的に行われるという点で特異性が高く、また検
出感度が極めて高いということにより、重要な医学的検
査法として位置付けされている。

これらの抗原抗体反応による測定方法において、抗原抗
体反応を促進させ、あるいは微量成分を効果的に測定す
ることを目的として種々の添加剤が用いられている。例
えば、反応系にポリエチレングリコール（特開昭５８−
４７２５６号、特開昭５９−５４９６８号、特開昭６３
−４５０６６号）やデキストラン等の親水性ポリマーを
添加する方法が採用されてきた。

［発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、検体となる体液（血液、尿等）は、組成
も性状も多様であり、そのため多くの免疫反応では抗原
抗体反応とは無関係な副反応とも言うべき非特異反応を
多々伴うことが知られている。上記のような添加物を使
用すると、目的とする物質とそれに対する抗原または抗
体との免疫反応を増強すると同時に、非特異反応までも
増強する場合が多い。その結果、バックグラウンド値（
目的とする抗原または抗体が含まれていない検体の測定
値）が高値となり、バンクグラウンド値を鰯える量の測
定値でないと検出することができなかった。つまり検出
感度が低くなり、かつ一定の量販上のシグナルを得るた
めに多量の試料を必要としていた。従って、この方法は
、短時間で反応を進行させることは可能であるが、非特
異反応をも増強するために、抗原抗体反応のみを促進し
、微量成分を効果的に測定するには充分な方法とは言え
なかった。

また、デキストランのような多Ｉｉ類の場合には、溶解
度が低いので十分な増感作用が得られる濃度の溶液を調
製することが困難であり、調製された溶液の粘度も高く
なり使用し難いという問題があった。

本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、非特異反応が抑制されかつ高感
度の免疫測定法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明の免疫測
定法は、被測定物質である抗原または抗体に、対応する
抗体または抗原を反応させる抗原抗体反応を利用した免
疫測定法において、該反応系に、下記の一般式（１）で
表される少なくとも１種のグリコシド誘導体を七ツマー
単位として含む水溶性重合体及び／または水溶性共重合
体を存在させることを特徴とする免疫測定法である。

一般式（Ｉ）； （式中、Ｇ−０−は保護基を有しない糖残基を示す、Ｒ
は水素原子、メチル基またはエチル基を示す０ｍは１〜
３の整数を示す、ｎは１〜４の整数を示す、）。

上記グリコシド誘導体において、糖残基とは、糖の還元
末端のグリコシド炭素原子に結合した水酸基から水素原
子が外れた基である。具体的には糖単位１〜３程度の単
糖またはオリゴ糖の残基を意味する。

単糖の具体例としては、例えば、グルコース、マンノー
ス、ガラクトース、グルコサミン、マンノサミン、ガラ
クトサミン等の六単糖類、アシビノース、キシロース、
リボース等の五単Ｉ！類を挙げることができる。

オリゴ糖の具体例としては、例えば、マルトース、ラク
トース、トレハロース、セロビオース、イソマルトース
、ゲンチオビオース、メリビオース、ラミンアリビオー
ス、キトビオース、マンノビオース、ソホロース糖の２
糖類、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マンノトリオー
ス、マルトトリオース等を挙げることができる。

上記の一般式（Ｉ）で表される少なくとも１種のグリコ
シド誘導体をモノマー単位として含む水溶性重合及び／
または水溶性共重合体は、下記の一般式（Ｉａ） （Ｉａ） （式中、Ｇ−０−は保護基を有しない糖残基を示す。Ｒ
は水素原子、メチル基またはエチル基を示す０ｍは１〜
３の整数を示す、ｎは１〜４の整数を示す、） で表されるグリコシド誘導体をモノマーとして、重合ま
たは共重合させることによって得られる。

グリコシド嫌　　　１ａ　　のＡ　　　そのグリコシド
誘導体（Ｉ　ａ）は、ヘテロポリ酸及び重合禁止剤の存
在下に、下記の一般式（ＩＩ）Ｇ−０−Ｒ’　　　　　
・・・（Ｉ［）（式中、Ｇ−０−は保護基を有しない糖
残基を、Ｒ’　は低級アルキル基を示す。）。

で表されるアルキルグリコシドと、下記の一般式（式中
、Ｒは水素原子、メチル基またはエチル基を示す０ｍは
１〜３の整数を示す、ｎは１〜４の整数を示す、）で表
される（アルキル）アクリル酸エステルとを反応させる
ことにより製造できる。

該反応は溶媒中または無溶媒下で行うことができる。

なお、前述した一般式（ｎ）中のＲ′としての低級アル
キル基とは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプ
ロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル
基等の炭素数１〜４程度の直鎖または分枝鎖状のアルキ
ル基を意味する。

原料化合物であるアルキルグリコシド（Ｉｌ）としては
特に制限されず、公知の方法で製造されたもの、または
市販のものを使用してもよい０例えば、メチルグルコシ
ド、メチル　β−Ｄ−ガラクトシド、メチル　Ｄ−マル
トシド、ブチルマンノシド等の、アルキル部分が炭素数
１〜４程度の直鎖または分校鎖状アルキル基であるアル
キルグリコシドを使用できる。アルキルグリコシド（Ｉ
ｌ）は単独で使用してもよくまたは２種以上を併用して
もよい。

もう一方の原料である（アルキル）アクリル酸エステル
（Ｉ［Ｉ）としても特に制限されず、公知のものを使用
でき、例えば、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アク
リル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ヒドロキ
シプロピル、エチルアクリル酸２−ヒドロキシエチル等
を挙げることができるが、この限りではない。

ヘテロポリ酸としてはその種類、使用量は特に制限され
ない。

重合禁止剤としては特に制限されず、公知のものが使用
できる。

グリコシド誘　　（Ｉａ）のム　法　その２）また、グ
リコシド誘導体ＣＴａ）は酸触媒及び重合禁止剤の存在
下、反応系に酸素を供給しながら、保護基を有しない糖
と（アルキル）アクリル酸エステルとを反応させること
によっても製造できる。

この方法によれば、合成あるいは入手が比較的困難なア
ルキルグリコシドを用いることなく、入手可能な保護基
を有しない糖を用いて、目的とするグリコシド誘導体（
Ｉａ）を高収率で得ることができる。

保護基を有しない糖としてはすでに例示した単糖または
オリゴ糖であって、保護基を有しないものであれば特に
制限なく利用できる。

（アルキル）アクリル酸エステルとしては上記一般式（
ＩＩＩ）で表されるものが使用できる。

酸触媒としては特に制限されず公知のものが使用できる
。

重合禁止剤としては、前述した合成法（その１）の場合
と同様、公知のものを使用できる。

反応系に酸素を供給する方法としては特に制限されず、
例えば、空気等の酸素を含む気体または酸素を反応混合
物中に吹き込めばよい。

圀！反登！製五 上記反応により得られるグリコシド誘導体（Ｉａ）は、
通常の精製手段、例えばシリカゲルクロマトグラフィー
、または抽出分離等によって精製できる。

グリコシド　　　　　　ｆ　　　八　のまた、上記一般
式（Ｉａ）で表される誘導体をモノマーとして用い、繰
り返し単位（１）からなるホモポリマー、２種以上の異
なる繰り返し単位（１）からなるコポリマー、並びに、
繰り返し単位（１）とそれに共重合可能な繰り返し単位
からなるコポリマーの重合については、通常の方法に従
って行うことができる。具体的には、例えば、塊状重合
法、溶Ｗ！Ｌ（もしくは均一）重合法、ｌ！？１１重合
法、乳化重合法、放射線（γ線、電子線）重合法等を挙
げることができる。

例えば、溶液重合では、溶媒、重合成分、重合開始剤及
び溶媒の使用割合も特に制限されない。

また、２種以上の異なるグリコシド誘導体（Ｉａ）を共
重合させる場合、及びグリコシド誘導体（Ｉａ）とそれ
に共重合可能な化合物を共重合させる場合も、その使用
割合は特に制限されず、得ようとする共重合体の用途等
に応じて適宜選択すればよい。

上記のグリコシド誘導体（Ｉａ）に共重合可能な化合物
としては、α、β不飽不飽和２舎結有する親水性化合物
が好ましく、例えば、アクリルアミド、アクリル酸、メ
タクリル酸、Ｎ−ビニルピロリドン等が挙げられる。

重合終了後、通常の手段により、重合反応物から目的と
する重合体を分離採取及び精製できる。

ついで得られた重合体を、例えば、再沈澱法でさらに精
製してもよい。

このようにして得られた重合体は、数百〜数十刃の分子
量を有している。

（免疫測定法への応用） 崖息羞来 上記のグリコシド誘導体含有重合体及び／またはグリコ
シド誘導体含有共重合体を、適当な濃度で免疫測定系に
添加した場合、抗原抗体反応を特異的に増強する作用を
示す。

使用方法としては、一般に用いられている増感剤と同様
の方法で反応系に添加すればよい。

可な 本発明により被測定物質を測定する場合の測定系として
は、従来から周知の方法を用いることができる。

すなわち、本発明の方法は、測定物と反応物のいずれも
が可溶性のものを用いる、いわゆる溶液系と、反応物を
反応媒体に実質的に不溶性の担体に感作（担持）する、
いわゆる担体系のいずれにも適用される。

具体的な方法としては、放射免疫測定法（ＲｌＡ）、酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、
または光散乱を利用した免疫測定法等が挙げられる。ま
た、凝集反応を利用した測定法として、例えば、ラテッ
クス凝集反応、ラテックス近赤外比濁法（ＬＰＩＡ）、
免疫比濁法、血球凝集法その他における抗原抗体反応を
利用した測定法が挙げられる。

特に、ラテックス凝集反応や、血球凝集法等の凝集法に
おいて顕著な効果が発揮される。

丑■方抜 上記グリコシド誘導体含有重合体及び／またはグリコシ
ド誘導体含有共重合体の利用方法としては、検体に添加
して用いる方法と、免疫測定試薬の構成品に予め添加し
ておく方法がある。

検体に添加する方法としては、抗原または抗体を含む免
疫測定試薬の構成品を検体に添加する前に、該グリコシ
ド誘導体含有重合体及び／または該グリコシド誘導体含
有共重合体を含む緩衝液等を検体に添加する方法が挙げ
られる。

また、免疫測定試薬構成品に添加する方法としては、検
出しようとする抗原または抗体に対する抗体または抗原
を含んだ反応用試薬、または、反応媒体である１ｌｌＩ
ｉ液成分のみを含んだ希釈液等に、予め該グリコシド誘
導体含有重合体及び／またはグリコシド誘導体含有共重
合体を添加しておく方法等が挙げられる。

例えば、ラテックス試薬を用いた抗原抗体反応により被
測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗原ま
たは抗体に対する抗体または抗原を含有するラテックス
試薬に予め該グリコシド誘導体含有（共）重合体を添加
しておく、このような試薬を用いて凝集反応を行い、生
じた凝集の程度を光学的にもしくは目視観察することに
より被測定物質が測定され得る。

あるいは、グリコシド誘導体含有（共）重合体を含まな
いラテックス試薬を使用することも可能であり、この場
合には抗原抗体反応時にグリコシド誘導体含有（共）重
合体が該反応系に存在するようにすればよい。例えば、
検体に予めグリコシド誘導体含有（共）重合体を添加し
ておく方法；使用する緩衝液にグリコシド誘導体含有重
合体を加えてお（方法等があり、特に限定されない。

また、固相を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により被
測定物質を測定する場合には、被測定物質である抗原ま
たは抗体に対する抗体または抗原を酵素で標識したコン
ジュゲート（酵素標識抗体もしくは酵素標識抗原）溶液
中に予めグリコシド誘導体含有（共）重合体を添加して
おく、このような試薬を用いて抗原抗体反応を行い、最
終的に酵素反応により得られた吸光度の変化量を光学的
にもしくは目視観察することにより被測定物質が測定さ
れ得る。あるいは、グリコシド誘導体含有（共）１合体
を含まないコンジュゲートを使用することも可能で、こ
の場合には抗原抗体反応時にグリコシド誘導体含有（共
）重合体が該反応系に存在するようにすればよい０例え
ば、検体に予めグリコシド誘導体含有（共）重合体を添
加しておく方法；使用する緩衝液にグリコシド誘導体含
有（共）重合体を加えておく方法等があり、特に限定さ
れない。

また、特許請求の範囲に挙げた一般式（１）で表される
グリコシド誘導体をモノマー単位として含む（共）重合
体について以下の（１）、（２）。

（３）を単独にあるいは２種類以上を組み合わせて使用
することも可能である。

（１）１種類の繰り返し単位（１）からなるホモポリマ
ー （２）２種類以上の繰り返し単位（りからなるコポリマ
ー （３）１種類以上の繰り返し単位（１）とそれに共重合
可能な繰り返し単位からなるコポリマー盪足ｌ亘 本発明によれば、−ｇに抗原抗体反応を利用して測定し
得る生理活性物質はいずれも測定が可能である。

被測定物質としては、タンパク質、ポリペプチド、ステ
ロイド、脂質、ホルモン等があり、例えば、各種抗原、
抗体、レセプター、酵素等が挙げられる。具体的には、
梅毒トレポネーマ菌に対する抗体、抗カルジオライビン
抗体、インスリン、Ｃ反応性タンパク質、アルファーフ
ェトプロティン、ＣＥＡ　（癌胎児性抗原）、ＨＢｓ抗
原、抗ＨＢｓ抗体、抗）（Ｂｃ抗体、ＨＢｅ抗原、抗Ｈ
Ｂｅ抗体、ヒトフィブリノーゲン、リウマチ因子、抗ス
トレプトリジン０抗体、ＨＴＬＶＩ、Ｉｔ、■に対する
抗体等が例示される。

（好ましい態様） （ａ　グ　コシド　　　　　ム　の 前述のグリコシド誘導体含有（共）重合体の中でも特に
本発明者らの研究により、グリコシド誘導体（１ａ）と
して以下の構造式で表されるグルコシルエチ！レメタク
リレート（Ｇｌｕｃｏｓｙｌｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃ
ｒｙｌａｔｅ　、以下ＧＥＭＡと略す）を使用して得ら
れた（共）重合体が重合が容易であり、分子量の調整を
行い易く、かつ優れた増感効果が観察されるという結果
が得られた。

−Ｕつ二氷王１ 本発明で用いるグリコシド誘導体含有（共）重合体の分
子量の範囲については、抗原抗体反応における反応媒体
に可溶のものであれば、特に限定はされないが、分子量
が小さすぎると、多量の該（共）重合体を必要とし、ま
たそのため反応媒体に溶解させるのに長時間要する等の
手間がかかる。

このため、少なくとも分子量は３，０００以上が好まし
い、しかし測定する項目によってはこれに限定されない
。

この場合の平均分子量の測定方法は、ゲルクロマトグラ
フィ（ｃｐｃ法）、末端基定量法、粘度法等より適宜選
ばれる。

」互１里災皇皮 この免疫測定法において、抗原抗体反応の反応系に存在
させるグリコシド誘導体含有（共）重合体の濃度は、用
いるグリコシド誘導体含有（共）重合体の分子量、共存
する塩、タンパク、糖類等の添加物の濃度によって適宜
選ばれる。一般には該反応系における反応時の終濃度が
０．０１〜１０．０％（Ｗ／ＶＬ好ましくは０．　１〜
５．０％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．５〜２．０％
（Ｗ／Ｖ）の割合で含有されるように調整を行う。

グリコシド誘導体含有（共）重合体濃度が０．０１％（
Ｗ／Ｖ）を下回ると、抗原抗体反応を促進する効果が小
さくなる。逆に１０．０％（Ｗ／■）を上回ると目的成
分以外の物質との非特異反応が増大する。

ユｌと免炎厘定床 本発明は、特にラテックス凝集反応法、血球凝集反応法
、免疫比濁法等の凝集法において顕著な効果が発揮され
る。

（１）ラテックス凝集反応法 試薬の調製は、まず、公知の方法により、ラテックス粒
子に抗原または抗体を物理的または化学的方法により担
持（感作）させる、用いる抗体は免疫グロブリンあるい
はその断片、例えばＦ（ａｂ′）２等でもよい。前述の
ような方法で、該反応系にグリコシド誘導体含有（共）
重合体を存在させ、上記のような試薬を用いて凝集反応
を行い、生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視
観察することにより被測定物質が測定され得る。

具体的には、ラテックス粒子の凝集の程度を光学的に検
出する方法においては、測定は散乱光強度、吸光度また
は透過光強度を測定する光学機器で行う、測定の波長は
３００〜２４００ｎｍが使用できる。

測定方法については公知の方法に従い、用いるラテック
ス粒子の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定に
より、散乱光強度の増加もしくは減少を測定することに
より行われる。また、これらの方法を併用することも可
能である。ラテックス粒子の凝集の程度を肉眼で判定す
る試薬においては、通常、試料と感作ラテツクス粒子を
含む溶液とを判定板上で混合し、１〜１０分間揺り動か
した後、凝集の有無を観察する。凝集判定には、単に肉
眼判定以外に、ビデオカメラで撮影し、画像処理を施す
ことによって判定することも可能である。

（２）血球凝集反応法 担体としての血球をまずホルマリンまたはグルタルアル
デヒド等で固定し、この固定血球に検査すべき抗原に対
応する抗体を感作（吸着）させ、得られた抗体感作血球
を生理食塩液またはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳと略す）
を基材とする反応液（検体の希釈にも用いられるため希
釈ともいう）に浮遊させて抗体感作担体含有反応液を調
製し、これにあらかじめ反応液で希釈した被検血清を加
えて反応させ、一定時間後に逆受身凝集反応によって生
じる感作血球凝集像を測定する。

なお、該反応系にグリコシド誘導体含有（共）重合体を
存在させる方法は、前述の■朋方迭の項で述べた通りで
ある。

（３）酵素免疫測定法 固相を用いた酵素免疫測定法により被測定物質を測定す
る場合には、被測定物質である抗原または抗体に対する
抗体または抗原を常法により固相に吸着させ、かかる固
相と検体を反応溶液中で抗原抗体反応を行わせ、さらに
上記の抗原または抗体と、被測定物質である抗原または
抗体に対する抗体または抗原を公知の方法により酵素で
標識したコンジュゲート（酵素標識抗体もしくは酵素標
識抗原）溶液とを反応させ、最終的に酵素反応により得
られた吸光度の変化量を光学的にもしくは目視観察する
ことにより被測定物質が測定され得る。

なお、該反応系にグリコシド誘導体含有（共）重合体を
存在させる方法は、前述の五里方抜の項で述べた通りで
ある。

（ｅ）反廠条註 （１）緩衝液； 上記抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反
応媒体としては、被測定物質の種類に応じた各種緩衝液
が用いられる。この緩衝液は、被測定物質を失活させる
ことなく、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオン
強度やｐＨを有するものであればよい０例えば、リン酸
緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液が使用される０
反応のＰＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。

（２）反応温度及び反応時間： 反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０°Ｃが好ましい
。反応時間は適宜法められる。

（３）併用する添加物； 反応時には、さらに測定系の感度を高めたり、非特異反
応を抑制するために、塩化コリン等の第４級アンモニウ
ム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン
（Ｃ１−、Ｉ−，５ＣＮ）、ゼラチン等を添加すること
も可能である。

また、微生物等の混入により、糖残基が分解することを
防ぐために、各種の防腐剤（ＮａＮｓ）やエステラーゼ
及びグリコシダーゼ阻害剤等を反応系に添加することも
可能である。

〔作用及び発明の効果〕

本発明によれば、上記した特定のグリコシド誘導体含有
重合体及び／または該グリコシド誘導体含有共重合体が
免疫反応系に添加されるため、抗原−抗体反応が特異的
に増強される。しかも、後述の実施例から明らかなよう
に、目的とする特異反応を増感させるだけでなく、非特
異反応は抑制される。従って、免疫測定法の検出感度を
効果的に高めることが可能となる。

〔実施例〕

以下、本発明の非限定的な実施例を挙げることにより、
本発明を一層明瞭なものとする。

グリコシド誘導体の八　法 （１）グルコシルエチルメタクリレートの合成方法（そ
の１） メチルグルコシド（ＳＴＡ−ＭＲＧ　１０６．　Ｈｏｒ
ｉｚｏｎ社ｇ）１９．４　ｇをメタクリル酸２−ヒドロ
キシエチル１４０威に懸濁させ、ハイドロキノンモノメ
チルエーテル２．６ｇとリンモリブデン酸１．　０ｇと
を加え、充分に混合撹拌した後に徐々に加熱した。８０
〜９０℃に達したところで、その温度を維持しながら約
２時間撹拌した後、２Ｎ水酸化ナトリウムで中和した。

得られた反応液を、減圧下にｆＡ縮し、ついでシリカゲ
ルクロマトグラフィーに供した。（溶離液は、クロロホ
ルム：メタノ−／Ｌｚ９：ｌの混合溶剤）、Ｒｆ＝０．
２（７）分画物を濃縮し、グルコシルエチルメタクリレ
ート２０゜１ｇをオイル状物質として得た（収率は６８
．８％であった。） （２）グルコシルエチルメタクリレートの合成方法（そ
の２） ブドウ糖９０ｇを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル
６５０ｄに懸濁させ、ハイドロキノンモノメチルエーテ
ル１．０ｇとパラトルエンスルホンｆｔ１Ｏ，５ｇとを
加え、空気を吹き込みながら加熱した。温度が約１１０
℃に達したところでその温度を維持しながら２時間撹拌
した後冷却し、炭酸水素ナトリウムで中和した。得られ
た反応物を減圧下に１ｌｉｉＬ、次いでシリカゲルクロ
マトグラフィーにて精製しく溶離液はクロロホルム：メ
タノール−１：Ｏ〜１：１、勾配溶離）、目的物である
グルコシルエチルメタクリレート１１０ｇを得た（収率
は７５％であった。） （３）ガラクトシルエチルメタクリレート（以下ＨＥＡ
−Ｇａｐと略す）の合成方法 下記に示す原料化合物及び触媒を用いたこと以外は、（
１）と同様にして目的化合物を得た。

原料化合物： メチル　β−Ｄ−ガラクトシド・・・１９．４ｇメタク
リル酸２−ヒドロキシエチル・・・１４０ｍ触媒：シリ
コンタングステン酸・・・１．Ｏｇ目的化合物ニガラク
トシルエチルメタクリレート収量：２２．Ｏｇ（収率７
２％） １金侠■貞製 （１）ＧＥＭＡのホモポリマーの重合法ＯＥＭＡＩＯｇ
を蒸留水７０ｄに溶解した。この溶液に過硫酸アンモニ
ウム（ＡＰＳ）１０１ｇを添加し、窒素ガス気流中撹拌
下において５０℃で１２時間反応させた０反応終了後、
反応液を１２のアセトンに投入し、析出した白色沈澱を
濾取し、アセトンで洗浄した後減圧乾燥した。得られた
白色沈澱を１００ｄの蒸留水に熔解し、これを１１のア
セトンに投入した。析出した沈澱を減数し、ポリ（グル
コシルエチルメタクリレート）（以下、ｐＧＥＭＡと略
す）９．５ｇを白色沈澱として得た。収率は９５％であ
った。

本重合法で得られたｐＧＥＭＡの平均分子量をＧＰＣ法
により測定した。溶媒系は０．１Ｍ臭化リチウムを含む
ＤＭＦを溶離液として用い、Ｉｎｋ物質はポリエチレン
オキサイドを用いた。その結果、得られた重量平均分子
量は４０万であった。

以下の実施例における（共）重合体の分子量の測定は、
全てこの方法で行った。

次に、ＡＰＳ量を４０ｇ使用し、反応温度を６０℃に変
えたこと以外は、上記と同様に反応させたところ、重量
平均分子量１５万のｐＧＥＭＡが得られた。

（２）ＨＥＡ−Ｇａｌ！のホモポリマーの重合法ＨＥＡ
−Ｇａ　４２１１０　ｇをジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）７０ｄに溶解した。この溶液に、アゾビスイソブ
チロニトリル（ＡＩＢＮ）２５ｇ＋ｇを添加し、窒素ガ
ス気流中撹拌下に７５°Ｃで１２時間反応させた０反応
終了後、（１）のｐＧＨＭＡを得た場合と同様にしてア
セトン沈澱で重合体を回収し、再沈澱精製を行い、真空
乾燥し、ポリ（ガラクトシルエチルメタクリレート）（
以下、ｐＨＥＡ−Ｇａｌと略す）８．９ｇを白色粉末と
して得た。収率は８９％であった。

二のものの重量平均分子量は３０万であった。

次に、反応温度を６５℃としたこと以外は上記と同様に
して反応させたところ、重量平均分子量４０万のｐＨＥ
Ａ−Ｇａｌｌが得られた。

法 ｃＥＭＡ１２ｇ及びアクリルアミド８ｇを蒸留水８０Ｍ
１に溶解した。この溶液に過硫酸アンモニウム４０■を
添加し、窒素ガス気流中撹拌下に５５°Ｃで１０時間反
応させた。反応終了後、反応液を２２のアセトンに投入
し、析出した白色沈澱を濾取し、さらにアセトンで洗浄
した後、減圧乾燥した。得られた白色沈澱を１０（ｌｄ
の蒸留水に溶解し、これを２ｊ２のアセトンに投入して
ポリマーを析出させた。析出した沈澱を濾取、アセトン
洗浄の後、減圧乾燥し、８．７ｇの白色粉末を得た。

このものは水、ＤＭＳＯ，ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）に可溶で重量平均分子量は３０万であった。

（２）ＧＥＭＡ／アクリル酸共重合体の調製法ＯＥＭＡ
１５ｇ及びアクリル酸５ｇを蒸留水８０Ｈ１に溶解し、
２Ｎ　　ＫＯＨでｐＨ６，０に調製した。以下、（１）
のアクリルアミドとの共重合体を得た場合と同様にして
反応を行い８．２ｇの白色粉末を得た。このものは水に
可溶で、重量平均分子量ば４０万であった。

（３）ＧＥＭＡ／ビニルピロリドン共重合体の調製法 ＯＥＭＡ１２ｇ及びビニルピロリドン８ｇを蒸留水８０
Ｍ１に溶解した。この溶液に過硫酸カリウム３０■を添
加し、重合反応を行った。以下、（１）の共重合体調製
法と同様にして反応を行い、８．０ｇの白色粉末を得た
。このものは水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯに可溶で重量平均分
子量は３５万であった。

（４）Ｃ；ＥＭＡ／メタクリル酸共重合体の調製法ＯＥ
ＭＡ１５ｇ及びメタクリル酸５ｇを蒸留水７０Ｍ１に溶
解した。この溶液にＡＰＳ４０ｇを添加し、重合反応を
行った。以下、（１）の共重合体調製法と同様にして反
応を行い、１５．２ｇの白色粉末を得た。このものは水
、ＤＭＦ、ＤＭＳＯに可溶で重量平均分子量は４２万で
あった。

固相としてビーズを用いたサンドインチ・ＥＩＡ法によ
るインスリンの測定系に本発明を適用した０本実施例に
おいては、次に挙げる試薬及び測定用検体を使用した。

（Ａ）試薬の調製 インスリン測定用ＥＩＡキット：　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　
Ｂ−Ｔｅｓｔ　Ｈａｋｏ　　（和光純薬社製）を用いた
。

インスリン高値血清：インスリン濃度が高値の血清で、
他のインスリン測定用キットｌＮ５ＬＩＬＩＮ［ＭＩＴ
ＳＬＩＩ　ＩＩ］　　（カイノス社製）により、インス
リンを含有することが確認されている血清。

インスリン除去血清：アフィニティー・クロマトグラフ
ィーにより、インスリンを除去した血清で他のインスリ
ン測定用キット　ｌＮ５ＵＬＩＮ　［ＭＩＴＳＬＩＩＩ
Ｉ］（カイノス社製）により、インスリンが含まれてい
ないことが確認されている血清。

ＧＥＭＡホモポリマー：前述したＧＥＭＡのホモポリマ
ーの重合法に準じて調製されたＧＥＭＡのホモポリマー
で、平均分子量４００，０００のもの（以下、ｐＧＥＭ
Ａ４０万と略す）、及び１５０．０００のもの（以下、
ｐＧＥＭＡ１５万と略す）を用いた。

ＧＥＭＡコポリマー：前述したＧＥＭＡの共重合体の調
製法に準じて調製されたＧＥＭＡのコポリマーで、ＧＥ
ＭＡとアクリルアミドのコポリマー（以下、ｐＧＥＭＡ
／ＡＡｍと略す、平均分子量約３０万）、及びＧＥＭＡ
とアクリル酸とのコポリマー（以下、ｐＧＥＭＡ／ＡＡ
と略す、平均分子量約４０万）を用いた。

ポリエチレングリコール：平均分子量６０００のものを
用いた。（牛丼化学社製；試薬１級）キット構成品であ
る酵素標識抗体溶液中に、ＰＧＥＭＡ４０万、ｐＧＥＭ
Ａ１５万、ｐＧＥＭＡ／　Ａ　Ａ　ｍまたはｐＣ，ＥＭ
Ａ／ＡＡを各々添加し、反応系における終濃度が各々１
．０．１．５．０゜８．１．０％（Ｗ／Ｖ）になるよう
に調製した。

この酵素標識抗体溶液を使用し、和光純薬社製のキット
の使用添付書に従って、インスリン値が低、中、高値を
示す３種の血清について、インスリン濃度の測定を行っ
た。

対照として、他のインスリン測定法ｌＮ５ＵＬＩＮ［Ｍ
ＩＴＳＩＩＩ　Ｉｆ］　　（カイノス社製）によりイン
スリンが含まれていないことが確認されたインスリン除
去血清についても同時に測定した。４２０ｎｍにおける
吸光度（ｎ＝４の平均値）を第１表に示す。

北笠班上 実施例１において、酵素標識抗体に何も添加しない場合
、ｐＧＥＭＡ４０万あるいはｐＧＥＭＡ１５万の代わり
にポリエチレングリコール（平均分子量６，０００）を
終濃度が３．０％（Ｗ／Ｖ）となるように添加した場合
についてそれぞれ測定を行った。その結果を第１表にま
とめて示す。

下記の第１表から明らかなように、本実施例の試薬を用
いると、比較例に対してインスリンが低値の血清につい
ても充分な吸光度が得られ、かつ正常なヒト血清につい
ても非特異反応がほとんど見られない等、感度及び特異
性について優れた結果が得られた。

（以下、余白） ２・　　−一ツクスー　による　ＴＰ ＴＰ菌体成分由来の抗原に対する抗体を定量する場合の
本発明の効果を、全自動分析装置を用いてラテックス診
断試薬の凝集を測定することにより確認した。なお、特
に断らない限り同名の試薬については実施例１と同一の
ものを使用した。

（Ａ）試薬及び検体の調製 ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）ニリン酸−ナトリウム（二水
和物）、リン酸二す）　ＩＪウム（十三水和物）、塩化
ナトリウム及びアジ化ナトリウムを精製水に溶解し、リ
ン酸、塩化ナトリウム及びＮａＮ、の終濃度がそれぞれ
０．０２Ｍ、０．１２７Ｍ及び０．１％（Ｗ／Ｗ）　、
ｐＨが７．４０となるように調製した。

Ｎａ　Ｃ／！−ＰＢＳ　：塩化ナトリウムの終濃度を０
．６３５Ｍとしたこと以外は、上記ＰＢＳと同じもの。

１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ　：　ＰＢＳに試薬特級ＢＳＡ（
ウシ血清アルブミン）を１％（Ｗ／Ｗ）となるように溶
解させて調製した。

１０ｍＭ　　ＫＰＢニリン酸−カリウム（無水）及びリ
ン酸二カリウム（無水）を精製水に溶解し、ｐＨを６．
０に調製したもの。

オクチルグルコピラノシド（１−０−ｎ−オクチル−β
−Ｄ−グルコピラノシド）　（以下、ＯＧと略す）：難
溶性タンパク質研究用（ナカライテスク■）を用いた。

１％ＯＧ　：　ＯＧを１０ｍＭのＫＰＢに１％（Ｗ／Ｗ
）になるように溶解したもの。

ＮａＮ、：東京化成■より購入したものを用いた。

梅毒抗原液：家兎こう丸中で１０−１４日間培養したト
レポネーマ・パリダム［Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉ
ｄｕｍ；　　ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ　　ｆｏｒ　　Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ。

ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　　Ｕ
、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｗｅｎｔ　ｏｆ）１ｅａｌｔｈ、Ｅ
ｄｕｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ、Ａｔｌ
ａｎｔａＧｅｏｒｇｉａ　）より入手されたものを家兎
こう丸に接種し、継代培養したものを用いた］を生理食
塩水に１０９個菌体／蔽となるように懸濁した菌体懸濁
液１ｄを採り、ＰＢＳ中で遠心分１ｍ（６，０００ｒｐ
ｍＸＳ分、３回）することにより洗浄した。

次いで、得られた沈澱に１％ＯＧをｌｄ添加し、３７℃
にて３０分間インキュベートした。その後、これを超遠
心にかけて（５０，０００ｒｐｍＸ１時間）、上清を採
取したものを１％ＯＧで１００倍希釈したものを梅毒抗
原液とした。

梅毒陽性家兎血清：こう丸にトレボネーマ・パリダムを
接種後、４５日間飼育した家兎から血清を採取した。市
販のＴＰＨＡキット［セロディアＴＰ（富士レビオ）及
び七ロクリフトＴＰ（化血研）］を用いて力価を測定し
たところ、いずれのキットにおいても１０，０００タイ
ターを示した。

この血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１００．２００．４０
０倍に希釈して用いた。

正常家兎血清：トレポネーマ・パリダムが接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販ＴＰＨＡキッ
トにより力価を測定したところ、陰性であった。この血
清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１００．２００．４００倍に
希釈して用いた。

ラテックス：粒径０．４００μｍのポリスチレンラテッ
クス（固型分１０％、種水化学工業■製）を用いた。

１００ｍＭ　　ＮａＰＢニリン酸−水素ナトリウム（無
水）、リン酸二水素ナトリウム（十三水和物）及びＮａ
Ｎ、を精製水に加えて、０．１％（Ｗ／Ｗ）ＮａＮｓを
含有する１００ｍＭ　　ＮａＰＢ　（ｐＨ７，４０）を
調製した。

１％ＢＳＡ−ＮａＰＢ：１００ｍＭ　　ＮａＰＢにＢＳ
Ａが１％（Ｗ／Ｗ）になるように調製したものを用いた
。

装置：日立７０５０型　全自動分析装置を用いて測定を
行った。

希釈液（Ｒ１）：　１００ｍＭ　　ＮａＰＢにＢＳＡｏ
、２５％（Ｗ／Ｗ）となるように溶解し、調製したもの
。

反応時に加える希釈液にＰＧＥＭＡ４０万、ｐＧＥＭＡ
１５万、共重合体の調製の項（３）に示したＧＥＭＡと
ビニルピロリドン共重合体（以下、ｐＧＥＭＡ／ＶＰと
略す、平均分子量３５万）、または共重合体の調製項（
４）に述べたＧＥＭＡとメタクリル酸との共重合体（以
下、ｐＧＥＭＡ／ＭＣと略す、平均分子量４２万）を、
反応時の終濃度が各々０．８．１．０．０．９．０．９
％（Ｗ／Ｖ）となるように希釈液に添加した。

（Ｂ）梅毒診断用ラテックス試薬の調製（１）抗原感作
液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで２５倍希釈したもの０゜０５Ｍ
！、ＮａＣｊ！−ＰＢＳを０．１０ｍ！、１０ｍＭ　　
ＫＰＢを０．０５ｍ、及び１％ＯＧを０．２０ＩＩ！ｌ
混合した計０．４０ｄの混合液を抗原感作液とした。

（２）抗原の固定化 ラテックスＯ，１ｊｌＩｌ！を４℃のインキュベーター
中でマグネチックスクーラーで撹拌しながら、抗原感作
液０．４ｍを素早く添加し、４℃にて１時間撹拌した。

その後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ５ｄを添加し、４℃にて続
けて１．５時間撹拌した。その後、１５．００Ｏｒｐｍ
にて１時間遠心分離した。得られた沈澱にさらに１％Ｂ
ＳＡ−ＮａＰＢ５ｄを添加し、よく分散させて固形分０
．２％のラテックス試薬とした。このようにして調製し
たラテックス試薬は４℃にて保存した。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 測定条件は以下の通りである。

検体容量　　　　　　　　：２０μ！ ラテツクス試薬（Ｒ２）　　　：５ｏμ！希釈液（Ｒ１
）　　　　　　　：ａｓｏμｌ測定波長　　　　　　　
　：５７０ｎｍ測定温度　　　　　　　　：３７℃ 測定開始後、８０秒と３２０秒の波長５７０ｎｍにおけ
る吸光度の差（ΔＯ，Ｄ、　ｓｗ。）を測定し、この吸
光度の変化量を１０４倍したものを第２表に示した。（
ｎ＝４の平均値）。

なお、検体としては、前述の梅毒陽性家兎血清を１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳにて１００．２００．４００倍希釈したも
のを用いた。対照として正常家兎血清を同様に希釈した
ものを用いた。

止較班１ 実施例２の希釈液の代わりに、希釈後に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコール６０００を反応時の終
濃度３．０％（Ｗ／Ｖ）となるように希釈液に添加した
ものを使用したこと以外は、実施例２と同様の操作を繰
り返した。結果を実施例２の結果と共に第２表に示す。

下記の第２表から明らかなように、本実施例による希釈
液では、従来の希釈液では凝集が見られなかった、高希
釈率の陽性血清においても、陽性と判定し得る結果が得
られた。正常血清については、比較例で見られていた非
特異反応による凝集が解消されるなど、本ラテックス試
薬は、特異性が高く、感度の良いものであることがわか
る。

（以下、余白） ３・　　　　　による　ＴＰ 血球凝集法を利用した抗ＴＰ抗体の測定系に本発明を適
用した０本実施例においては、次に挙げる試薬及び測定
用検体を使用した。特に断らない限りは実施例２と共通
の試薬及び検体を用いた。

（Ａ）試薬及び検体の調製 ＴＰＨＡキント：ＴＰ抗体検出用試薬（マイクロ法ＴＰ
ＨＡ）セロクリット−ＴＰ（化学及び血清療法研究新製
）を使用した。

ＧＥＭＡホモポリマー：実施例１に用いたｐＧＥＭＡ４
０万、及びｐＧＥＭＡ１５万を用いた。

ＨＥＡ−Ｇａｊ！ホモポリ？−：ｐＨＥＡ−Ｇａｌ（平
均分子量３０万）、及びｐＨＥＡ−Ｇａｊ！（平均分子
量４０万）を用いた。

キット構成品である希釈液に、それぞれｐＧＥＭＡ４０
万、ｐＧＥＭＡ１５万、ｐＨＥＡ−Ｇａｌ３０万または
ｐ　ＨＥＡ−Ｇａ　ｌ　４０万を添加し、反応系におけ
る終濃度が各々０．９．１．１．０゜８．０．９％（Ｗ
／Ｖ）になるように調製した。

この緩衝液を使用し、セロクリット−ＴＰのキットの使
用説明書に従って、各血清について抗ＴＰ抗体の測定を
行った。

対照として、上記の正常家兎血清についても同時に測定
した。この結果を第３表に示した。第３表及び後述の第
５表、第７表において、記号は以下の意味を示す。

＋＋；陽性（強い凝集） 十　；陽性（凝集） ＋１　；陽性（弱い凝集） ±　；偽陽性 ；陰性（非凝集） 五較■主 実施例３の希釈液の代わりに、希釈液に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコールを反応時の終濃度が３
．０％（Ｗ／Ｖ）となるように緩衝液に添加したものを
使用したこと以外は、実施例３と同様の繰作を繰り返し
た。結果を実施例３の結果と共に第３表に示す。

第３表の結果から明らかなように、本実施例による希釈
液では、従来の希釈液では凝集が見られなかった高希釈
率の陽性血清についても陽性と判定し得る結果が得られ
た。正常血清６二ついては、比較例で見られていた非特
異性反応による凝集が解消され、よりクリアーな陰性像
が得られる等、本実施例の希釈液では感度及び特異性に
優れた結果が得られた。

（以下、余白） ４・−一　クス　　　による　ＨＢｓ ラテックスを用いた凝集反応による抗ＨＢｓ抗体の測定
系に本発明を適用した０本実施例においては、次に挙げ
る試薬及び測定用検体を使用した。

（Ａ）試薬の調製 希釈液（Ｒ１）：　１００ｍＭ　　ＮａＰＢにＢＳＡを
０．２５％（Ｗ／Ｗ）となるように溶解し、調製したも
の。

反応時に加える希釈液にｐＧＥＭＡ４０万、ｐＧＥＭＡ
１５万、共重合体の調製の項（３）に示したＧＥＭＡと
ビニルピロリドンとの共重合体（以下、ｐＧＥＭＡ／Ｖ
Ｐと略す、平均分子量３５万）、または共重合体の調製
の項（４）に示したＧＥＭＡとメタクリル酸との共重合
体（以下、ｐＧＥＭＡ／ＭＣと略す。平均分子量４２万
）を、反応時の終濃度が各々１．０．１．　２．０．８
．０．９％（Ｗ／Ｖ）となるように希釈液に添加した。

ＨＢｓ抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製した精製ＨＢｓ抗原を使用した。抗
原はリン酸緩衝液に溶解し、濃度をローリ−法により測
定した。

使用直前に、リン酸緩衝液により希釈し、濃度を１〜１
０μｇ／ｄになるように調製して、抗原として用いた。

抗ＨＢｓ抗血清（陽性家兎血清）：精製１（Ｂｓ抗原を
フロイントの完全アジュバントと共に家兎に免疫して得
られた抗血清を正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収
操作をしてから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラ
ムはＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ４Ｂ　（ファルマ
シア社）を用い、メーカー（ファルマシア社）の説明書
に従って行った。

吸収操作を行った抗ＨＢｓ血清は１％ＢＳＡ・ＰＢＳに
より、１００．２００．４００倍に希釈して用いた。

正常家兎血清：ＨＢｓ抗原が接種されていない家兎から
採取した血清を用いた。市販ＥＩＡキット（ＨＢｓ　−
ＡＣＱＵＩＣＫテスト「ミズホ」ミズホメディー社製）
により抗体の有無を測定したところ、陰性であった。こ
の血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳで１００．２００．４００
倍に希釈して用いた。

ラテックス：種水化学工業■製の５８Ａ　（ポリスチレ
ンラテックス直径０．２３２μｍ、固形分１０％）を用
いた。

装置：日立７０５０型　全自動分析装置を用いて測定を
行った。

（Ｂ））（Ｂｓ抗体検出用ラテックス試薬の調製（１）
ＨＢｓ抗原の感作 ラテックス１００Ｊｆｆｉと、ＨＢｓ抗原液４００μｌ
とを素早く混合し、室温で撹拌した。１時間後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳを５Ｉ１１加え、１５．００Ｏｒｐｍで１
時間遠心した。これを２回繰り返し、ラテックスを洗浄
した。

洗浄後のペレットに１％ＢＳＡ−ＮａＰＢ５ｘｌを添加
し、よく分散し、固形分０．５％のラテックス試薬とし
た。これを４℃で保存した。

（２）抗原抗体反応 ＨＢｓ抗原に対する抗体を定量する場合の本発明の効果
を、全自動分析装置を用いてラテックス診断試薬の凝集
を測定することにより確認した。

（Ｃ）測定方法 （１）条件の設定 測定条件は下記の通りである。

検体容量　　　　　　　　＝２０μ！ ラテックス試薬（Ｒ２）　　　：５０μｌ希釈液（Ｒ１
）　　　　　　：３５０μ！測定波長　　　　　　　　
：５７０ｎｍ測定温度　　　　　　　　＝３７℃ 測定開始後、８０秒と３２０秒の波長５７０ｎｍにおけ
る吸光度の差（ΔＯ，Ｄｏ、、、　）を測定し、この吸
光度の変化量を１０４倍したものを第４表に示した＊　
　（ｎ　＝４の平均値、）なお、検体としてはＨＢｓ陽
性家兎血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いた１００．２０
０．４００倍に希釈したものを検体として用いた。対照
として正常家兎血清を同様に希釈したものを用いた。

ｌ較璽工 実施例４の希釈液の代わりに、希釈液に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコール６０００を反応時の終
濃度３．０％（Ｗ／Ｖ）となるように希釈液に添加した
ものを使用したこと以外は、実施例４と同様の操作を繰
り返した。結果を実施例４の結果と共に第４表に示す。

第４表から明らかなように、本実施例による希釈液では
、従来の希釈液では凝集が見られなかった、高希釈率の
陽性血清においても、陽性と判定し得る結果が得られた
。正常血清については、比較例で見られていた非特異反
応による凝集が解消される等、本ラテックス試薬は、特
異性が高く、感度の良いものであるという結果が得られ
た。

（以下、余白） ５°　　　　　によるＨＢｓ　　　の 血球凝集法を利用したＨＢｓ抗原の測定系に本発明を適
用した０本実施例においては、次に挙げる試薬及び測定
用検体を使用した。

（Ａ）試薬及び検体の調製 ＨＢｓ抗原検出用キット：オーセル（グイナボット社製
）を使用した。

ＨＢｓ抗原陽性家兎血清ニオ−セルキットの構成品であ
る陽性コントロールを、他のＨＢｓ抗原検出用キット（
ＨＢｓＡＧ　　ＱＵＩＣＫテスト「ミズホ」ミズホメデ
ィー社製）により測定し、ＨＢｓ抗原が陽性であること
を確認したコントロール血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて
、１００倍、２００倍、４００倍希釈したものを用いた
。

正常家兎血清：上記のＨＢｓＡＧ　　ＱＵＩＣＫテスト
により、ＨＢｓ抗原陰性であった家兎血清を用いた。

ＧＥＭＡホモポリマー：実施例１に用いたＴＡＧＥＭＡ
４０万及びｐＧＥＭＡ１５万を用いた。

ＧＥＭＡコポリマー：実施例２に用いたｐＧＥＭＡ／Ｖ
Ｐ　（平均分子量３５万）、及びｐＧＥＭＡ／ＭＣ（平
均分子量４２万）を用いた。

キット構成品である緩衝液にｐＧＥＭＡ４０万ＰＧＥＭ
Ａ１５万、ｐＧＥＭＡ／ＶＰまたはｐＧＥＭＡ／ＭＣを
各々添加し、反応系における終濃度が各々、０．８．１
．０．０．７．０．９％（Ｗ／Ｖ）になるように調製し
た。この緩衝液を使用し、グイナボット社のキットの使
用説明書に従って、ＨＢｓ抗原陽性家兎血清についてＨ
Ｂｓ抗原の測定を行った。

対照として、上記の正常家兎血清についても同時に測定
した。この結果を第５表に示した。

且藍■立 実施例５の緩衝液の代わりに、緩衝液に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコールを反応時の終濃度が３
．０％（Ｗ／Ｖ）となるように緩衝液に添加したものを
使用したこと以外は、実施例５と同様の操作を繰り返し
た。結果を実施例５の結果と共に第５表に示す。

第５表の結果から明らかなように、本実施例による緩衝
液では、従来の緩衝液では凝集が見られなかった高希釈
率の陽性血清についても陽性と判定し得る結果が得られ
た。正常血清については、比較例で見られていた非特異
反応による凝集が解消され、よりクリアーな陰性像が得
られる等、本実施例の希釈液では感度及び特異性に優れ
た結果が得られた。

（以下、余白） ６；　　　　　　法　ＥＩＡ　　による　カ酵素免疫測
定法を利用したプラスチックプレートを用いた抗カルジ
オライピン抗体の測定系に本発明を適用した０本実施例
においては、次に挙げる試薬及び測定用検体を使用した
。なお、特に断らない限り、同名の試薬については実施
例１，２と同様のものを使用した。

（Ａ）試薬及び検体の調製 カルジオライピン抗原液ニガラス仮性抗原（住人製薬社
製）を用いた。

ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体：マイルズ・ラボラ
トリーズ社のポルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ　（但し、Ｎ　ａ　Ｎ　ｓは含まない）
で１，０００倍に希釈して用いた。

マイクロタイタープレート：ヌンク社の９６穴マイクロ
タイタープレート（平底）を用いた。

リン酸−クエン酸緩衝液：精製水に溶解させた０、２Ｍ
リン酸二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を混合し、ｐＨ
５，５０±０．０１となるように調製した。

ペルオキシダーゼ基質ニリン酸−クエン酸緩衝液に０−
フ二二レンジアミン（二塩酸塩）を２■／ｄ、そして過
酸化水素水０．０３％（ＨｔＯりとなるように加えた。

基質の調製は使用直前に行った。

ＩＮ硫酸：市販されている硫酸のＩＮ規定液をそのまま
用いた。

梅毒陽性家兎血清：実施例２に挙げた希釈液［１００ｍ
Ｍ　　ＮａＰＢ　（ｐＨ７，４０）、０゜２５％ＢＳＡ
　（Ｗ／Ｗ）となるように調製したもの］に、実施例２
で用いたｐＧＥＭＡ４０万、ｐＧＥＭＡ１５万、ｐＧＥ
ＭＡ／ＶＰ、ｐＧＥＭＡ／ＭＣを各々、０．９．１．１
．０．８．１．０％（Ｗ／Ｖ）となるように添加して調
製したものを検体希釈液とし、実施例２に挙げた梅毒陽
性家兎血清を１００．２００．４００倍に希釈して用い
た。

正常家兎血清：実施例２に挙げた正常家兎血清を、梅毒
陽性家兎血清を希釈するのに用いたものと同様のＰＧＨ
ＭＡ溶液を用いて１００．２００４００倍に希釈して用
いた。

（１）抗原の固定化 カルジオライビン抗原液を、マイクロタイタープレート
の各ウェルに５０ｐｌずつ分注し室温で１時間インキュ
ベートした。１時間後、抗原液を吸引除去し、次いで１
％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００μＥで１回洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ２００μ！を加えて室温で１時間インキュ
ベートし、ブロッキングを行った。その後、１％ＢＳＡ
−ＰＢＳを吸引除去し、０．９％Ｎａ　Ｃｊ！水溶液２
００μｌで３回洗浄を行った。

（２）抗カルジオライピン抗体の測定 第１抗体として前述の１００．２００．４００倍に希釈
した梅毒陽性家兎血清を各ウェルに５０ｐｌずつ分注し
、室温で１時間インキュベートした。対照として正常家
兎血清を同様に希釈したものを各ウェルに分注・インキ
ュベートした。

１時間後、反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ２
００μｌで３回洗浄した後、第２抗体としてペルオキシ
ダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを各ウェルに５０μｌずつ分
注した。室温で１時間インキュベートした後、反応液を
吸引除去し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　（但し、Ｎ　ａ　Ｎ
　ｓは含まない）２００μ！で３回洗浄した。洗浄後、
直ちに各ウェルに結合した酵素活性を測定した。

各ウェルに１００μｌずつペルオキシダーゼ基質を分注
し、室温で１５分間インキエベートした。

基質ブランクとして、第１抗体及び第２抗体のいずれも
添加していないウェルを用意し、同様に基質液を添加し
てインキュベートした。インキュベート後、ＩＮ硫酸を
１００μ１分注し、酵素反応を停止させた。各ウェルの
酵素反応時間が一定となるように操作を行った。

反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー　（Ｍ
ＴＰ−１００，コロナ社）により、基質ブランクを対照
として４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第６
表に示す（ｎ＝４の平均ｆｆ１ｆ）。

工較■旦 実施例６の緩衝液の代わりに、緩衝液に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコールを反応時の終濃度が３
．０％（Ｗ／Ｖ）となるように緩衝液に添加したものを
使用したこと以外は、実施例６と同様の操作を繰り返し
た。結果を実施例６の結果と共に第６表に示す。

第６表の結果から明らかなように、本実施例の試薬を用
いると、比較例に対してカルジオライビンが低値の血清
についても充分な吸光度が得られ、かつ正常な家兎血清
についても、非特異反応がほとんどみられない等、感度
及び特異性について優れた結果が得られた。

（以下、余白） ７・−一　クス゛　によるヒトＣＲＰの！ 抗ヒトＣＲＰ抗体：ヒトＣＲＰ陽性血清をアフィニティ
ークロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ濃度１■／Ｍ
１に調製したもの。

０．１Ｍ　グリシン緩衝液ニゲリシン（ナカライテスク
社製、試薬特級）、ＩＮ　　ＮａＯＨを用いてｐＨ８，
８に調製したものを用いた。

ラテックス：積水化学社製のポリスチレンラテックス（
固型分１０％、平均粒径０．２６μｍ）のものを用いた
。

ＰＢＳ　（ｐ７．０）（リン酸緩衝液）ニリン酸−ナト
リウム（二水和物）、リン酸二ナトリウム（二水和物）
、塩化ナトリウム及びアジ化ナトリウム（ＮａＮｓ、以
上すべてナカライテスク社製、試薬１級）を精製水に溶
解し、リン酸、塩化ナトリウム及びＮａＮ、の濃度が、
それぞれ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ及び０．　１％（Ｗ／
Ｗ）　、ｐ　Ｈ７゜０となるように調製した。

１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　（ｐＨ７，０）：ＰＢＳ（ｐＨ７
，０）にＢＳＡを１％（ｗ　／　ｗ　）となるように溶
解させて用いた。

（１）抗ヒ）ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製抗ヒト
ＣＲＰ抗体を１■／ｄのＩｇＧ濃度で０゜１Ｍ　グリシ
ン緩衝液（ｐＨ８，８）に溶解した。

この溶液１０Ｈ１に、平均粒径０．２６μｍのポリスチ
レンラテックス（固形分１０％、積水化学社製）ＩＪ１
！を添加し、３７℃にて６０分間撹拌した。

次いで、この液を４℃にて６０分間、１８．００Ｏｒｐ
ｍで遠心分離した。

得られた沈澱物にＢＳＡを０．５％（Ｗ／Ｗ）、ｐＧＥ
ＭＡ４０万、ｐＧＥＭＡ１５万、実施例２で用いたｐＧ
ＥＭＡ／ＶＰ、ｐＧＥＭＡ／ＭＣを各々添加し、検体と
の反応時の終濃度が各々０゜８．１．０．０．９．０．
９％（Ｗ／Ｖ）　となるように含有させた０、１Ｍ　グ
リシン緩衝液（ｐＨ８，８）１（ｌｄを添加し、ラテッ
クスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製
した。

（２）標準ＣＲＰ液の調製 ＣＲＰを１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　（ｐＨ７，０）で希釈し
、０．００．０．１０．０．５０．１．００．２．００
．ｕｇ／ｄ濃度に調製したもの。

（３）抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液５０μｌを判定板上に採り、これに上記（
１）項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを滴下
し混和する０判定板を手に持ち、緩やかに揺動し２分後
に凝集の度合を肉眼で観察した。結果を第７表に示した
。

工較■工 実施例７の希釈液の代わりに、希釈液に何も添加しない
もの及びポリエチレングリコール６０００を反応時の終
濃度３．０％（Ｗ／Ｖ）となるように希釈液に添加した
ものを使用したこと以外は、実施例７と同様の操作を繰
り返した。結果を実施例７の結果と共に第７表に示す。

第７表において、標準ＣＲＰｆｉ濃度が０．００（ゼロ
）μｇ／ｄで凝集を示したものは、ＰＥＧによってラテ
ックスそのものが凝集してしまったことによる。

第７表において、ｐＧＥＭＡ４０万、ｐＧＥＭＡ１５万
を使用した場合の検出感度は０．２５Ｍｇ／ｄであるが
、ＰＥＧの場合のそれは、０．５０Ｍｇ／ｄｌであるこ
とがわかる。従って、本実施例のように、ｐｃｉＨＭＡ
のホモポリマー及びコポリマーを使用した方が高感度の
得られることがわかる。

（以下、余白）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）被測定物質である抗原または抗体に、対応する抗
   体または抗原を反応させる抗原抗体反応を利用した免疫
   測定法において、該反応系に、下記の一般式（ I ）で
   表される少なくとも１種のグリコシド誘導体をモノマー
   単位として含む水溶性重合体及び／または水溶性共重合
   体を存在させることを特徴とする免疫測定法。 （ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇ−Ｏ−は保護基を有しない糖残基を示す。Ｒ
   は水素原子、メチル基またはエチル基を示す。ｍは１〜
   ３の整数を示す。ｎは１〜４の整数を示す。）。