JPH04126087A - 新規組換えプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はサッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ）より
抽出したα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領
域、分泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミド及
びその利用に関するものである。

また本発明は、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造を解
明するのにも成功したものであって、αガラクトシダー
ゼの大量生産はもとより他の異種蛋白を効率よく分泌さ
せる技術にも応用することができるものである。

（従来の技術） α−ガラクトシダーゼは、メリビオースやラフィノース
の様なα−ガラクトシドに作用して糖鎖の非還元末端の
α−ガラクトシドを分解する酵素であって甜菜糖製造工
業においては糖液中に含有するラフィノースが蔗糖の結
晶作用を阻害するなど製糖作業に有害物となっているこ
とより、アブシディアあるいはモルチェレラ等の糸状菌
菌体含有のα−ガラクトシダーゼを利用して糖液中のラ
フィノースの分解除去を行い、製糖作業の改善、砂糖収
量歩留りの向上を図っている。

一方、製パン業におけるパン用酵母に使用されているサ
ツカロマイセス・セレビシェ （Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養に用いる糖質源
は甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜などの糖蜜が用いられているが甜
菜糖蜜にあっては、その中に非醗酵性糖分を含むため、
含有する全糖質分を醗酵原料に利用することができない
。

また近年の製糖技術の発達に伴いこれら糖蜜中の醗酵性
糖分は減少傾向にあり、パン用酵母の培養には好ましく
ない無機、有機化合物の濃度が高くなっている。

前記甜菜糖蜜中における非醗酵性糖分は主にラフィノー
スであるが、パン用酵母サツカロマイセス・セレビシェ
はこれを資化できないため、甜菜糖蜜を使用する場合ラ
フィノースの糖分利用について、１／３醗酵といわれて
いるものしか行われていない。すなわち、ラフィノース
はガラクトース、グルコース、フラクトースからなる３
糖類であるが、これに対してサツカロマイセス・セレビ
シェは、グルコースとフラクトースの結合は切るがガラ
クトースとグルコースからなるメリビオースを残してい
るものである。

また、本発明は、このような技術の現状におり）で、α
−ガラクトシド結合を切断する酵素であるα−ガラクト
シダーゼの効率的利用を遺伝子レベルでとらえ且つそれ
にはじめて成功したものである。

α−ガラクトシダーゼまたはメリビアーゼの遺伝子に関
し、サツカロマイセス・カールスペルゲンシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｓｉｓ
）由来のものは最近になってその構造が解明されてはし
１るが（特表昭６２−５０２０２５号）、本発明に係る
サッカロマイセス・オレアギノーサス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｏｌｅａ　ｊｎｏｓｕｓ）由来のα−ガラ
クトシダーゼ遺伝子とは後記するところからも明らかな
ようにその構造が相違しており、両者は全く別異のもの
である。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、ラフィノースを含有する糖蜜を充分に発酵資
化しうるパン酵母の開発、つまり特にビート糖蜜培地を
用いても充分に培養しうるパン酵母の開発を目的として
なされたものである。

またそれに関連して、本発明は、ビート糖液中に存在す
るラフィノースを分解してビート糖の収率を高めるため
に従来用いられていた糸状菌に代りうる新しい菌体を開
発する目的でなされたものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は上記目的を達成するためになされたものであっ
て、目的とする微生物を遺伝子工学的手法によって創製
することとした。

そこで本発明者らは、上記の様な糖質源とじて糖蜜中に
含まれている非醗酵性糖分、特にラフィノースについて
注目し、パン酵母と同属の酵母中より抽出したα−ガラ
クトシダーゼ発現に関与している遺伝子をプラスミドベ
クターに挿入した組換えＤＮＡを得、この組換えＤＮＡ
をサツカロマイセス・セレビシェに導入して形質転換す
れば非醗酵性糖分のラフィノースも資化し得るパン用酵
母となし得るので、本発明者らは、先ずはしめに、この
パン用酵母に導入し得るプラスミドを開発することとし
た。

そして酵母におけるα−ガラクトシダーゼ遺伝子を求め
て、本発明者らは酵母中よりラフィノース醗酵性の強い
菌株について順次スクリーニングを行った結果、サッカ
ロマイセス・オレアギノーサス（針ｏ１ｅ吐帥亜匹）に
その存在を認め、α−ガラクトシダーゼ遺伝子を抽出す
る菌株としてサッカロマイセス・オレアギノーサスＩＦ
０１９９８を選択した。

以下本発明について詳細に説明する。

まずα−ガラクトシダーゼの発現に関与している遺伝子
を含有するＤＮＡの調製について述べると、サッカロマ
イセス・オレアギノーサスは通常の酵母培養法により培
養して培養物を得ることができる。培養する培地として
はＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコ
ース２％）などが使用できる。

このようにして得られた培養物は、通常３０００ｒｐｍ
で３分間程度遠心集菌し、サッカロマイセス・オレアギ
ノーサスの菌体を得る。

得られた菌体から例えばロドリゲスらの方法第１６７頁
〜第１６９頁（Ｒｏｄｏｒｉｇｕｅｚ　ａｎｄ　Ｔａ１
ｔ　：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　（ＡｄｄｉｓｏｎＪｅｓｌｅｙＰｕｂ、　Ｃ
ｏ、　）（１９８３）］により染色体ＤＮＡを得ること
ができる。

ついでこの染色体ＤＮＡは突出末端を生じさせる制限酵
素Ｂａｔ　ＨＩ（日本ジーン製）またはＢａ１ＩＨＩと
アイソシゾマーである制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩ（日本ジ
ーン！１りで部分分解し、部分分解ＤＮＡを得る。

このようにして得た部分分解ＤＮＡは調製用電気泳動装
置ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ製）を使用しアガ
ロース電気泳動法により分画して、サッカロマイセス・
オレアギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの
発現に関与している遺伝子を含む分画した部分分解ＤＮ
Ａを得る。

次に本発明において用いることができるベクター　ＤＮ
Ａとしては、酵母と大腸菌の両方を形質転換できるシャ
トルベクターを使用するもので、例えばプラスミドベク
ターＹＥｐ　１３　（Ｊａｍｅｓ、　Ｒ，Ｂｒｏａｃｈ
ｅｔ、　ａｌ、　：　ＧＥＮＥ　Ｖｏｌ、　８１２１−
１３３（１９７９））などが好ましい。

上記シャトルベクターＹＥｐ　１３のテトラサイクリン
耐性遺伝子部位に唯一存在する制限酵素Ｂａ１ｌＨＩ切
断部位を制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ（日本ジーン製）で酵素
濃度２〜３　ｕｎｉｔｓ／ベクター１μｇ、温度３７℃
で１時間以上作用させて切断してベクターＤＮＡを得る
。

次いでＤＮＡリガーゼを作用させた場合ベクター自身で
の自己環状化を防ぐため、切断したベクターをアルカリ
フォスファターゼで処理しＤＮＡの５′末端の燐酸基を
除去する。使用できるアルカリフォスファターゼにはＢ
ＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ）あるいはＣＩＰ（Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）がある。

ＣＩＰ　（ベーリンガーマンハイム製）を、切断したベ
クターＤＮＡに酵素濃度０．００３ｕｎｉｔｓ／ベクタ
一１μｇ、温度４５℃で１時間作用させた後、同量の酵
素を再添加し温度４５℃で１時間作用させ５′末端の脱
燐酸を行なったベクターＤＮＡを得る。

次いで先に述べたサッカロマイセス・オレアギノーサス
より抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺
伝子を含有する部分分解ＤＮＡ　（以下パラセンジャー
ＤＮＡという）とベクターＤＮＡ　を混合して、ＤＮＡ
リガーゼを用いて組換え体ＤＮＡを作成する。例えばＤ
ＮＡライゲーションキット（全酒造製）を使用した場合
、ＤＮＡ混合溶液１容に対し４〜５倍容のＡ液と１容の
Ｂ液を添加混合し温度１６℃で３０分から１２時間保温
し作用させ、反応後にイソプロパツール沈殿として組換
え体ＤＮＡを回収する。

この組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌ＡＧＩあるいは５Ｃ
５Ｉ（いずれもフナコシ薬品より購入）等の形質転換を
塩化カルシウム／塩化ルビジウム法により行い、組換え
体ＤＮＡの増幅を行い、増幅した組換え体ＤＮＡはアル
カリ金属法により抽出する。

この組換え体ＤＮＡを用いてサツカロマイセス・セレビ
シェ例えばＤＢＹ　７４６株の形質転換を行い、形質転
換した菌体はグルコース１％、ウラシル、トリプトファ
ン、ヒスチジンを各々２４ρｐｇ含むＩ寒天培地に塗抹
し、通常３０℃、好ましくは２５℃でコロニーが形成す
るまで培養した後α−ガラクトシダーゼ生産株を検出し
得ることができる。

この組換え体ＤＮＡによる酵母の形質転換はプロトプラ
スト法、アルカリ金属法等によって行うことができる。

また、α−ガラクトシダーゼ生産株の検出には指示薬を
用いる方法が適宜使用される。例えば指示薬としては、
Ｘ−α−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用い、このＸ−
ａ　−ｇａｌ　（和光紬薬製）を２００ｐｐｍ含む軟寒
天Ｉ培地を重層すれば、コロニーが染色されるので目的
菌株を検出することができる。

上記の様にして得られたサッカロマイセス・オレアギノ
ーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に関与
する遺伝子を含有するパラセンジャーＤＮＡ　をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡにより形質転換され
てα−ガラクトシダーゼを生産する酵母について、これ
を培養することにより酵素を発現せしめる。

そしてこの発現したα−ガラクトシダーゼについて、５
Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、ニトロ
セルロース膜にブロッティングし、抗α−ガラクトシダ
ーゼ血清と結合したものをプロティンＡ法により分子量
を測定したところ、６２．０００付近と検出され、サッ
カロマイセス・オレアギノーサスの生産するα−ガラク
トシダーゼの分子量と一致し、他の生化学的性質も一致
した。

また、α−ガラクトシダーゼを発現した酵母を形質転換
したサッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出した
パラセンジャーＤＮＡを組込んだＹＥＰ１３組換え体ベ
クターは、発現した酵母より抽出して大腸菌に導入し、
大腸菌形質転換体を得たが、それらの菌株は後記するよ
うに微生物工業技術研究所にそれぞれ寄託されている。

上記したように、本発明によれば大腸菌形質転換体が作
成できるだけでなく、本発明のサッカロマイセス・オレ
アギノーサスより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現
に関与する遺伝子を含有するパラセンジャーＤＮＡを含
むＤＮＡはサツカロマイセス・セレビシェを始めＹＥｐ
　１３の持つ２μｓ　ＤＮＡ複製開始点を利用しプラス
ミドの複製を行える酵母及びその他の微生物に導入して
形質転換することができ、それぞれの形質転換体を得る
ことができる。

そして本発明にはこれらの形質転換体も包含されるので
あるが１本発明に係る形質転換体とは。

単離した形質転換体自体のほか、それを培養して得た培
養液及び／又は菌体含有物等の培養物、これらを濃縮、
乾燥、又は希釈した処理物を広く指すものである。

これらの形質転換体を適宜培養すればα−ガラクトシダ
ーゼが菌体外及び／又は菌体内に産生されるので、酵素
製法における常法にしたがって、酵素含有物、酵素液、
粗製酵素等としてこれを採取し、必要あれば精製して純
粋な酵素として分離すれば、α−ガラクトシダーゼが得
られる。

このように本発明に係る形質転換体は、α−ガラクトシ
ダーゼ産生能にすぐれているので、ラフィノースやメリ
ビオースを分解ないし発酵せしめることができ、ガラク
トース及びグルコースとすることができる。また、例え
ばＳ、セレビシェ等にあってはグルコースとフラクトー
スの結合も本来切断しうるものであるので、この形質転
換体を用いた場合には、メリビオースはもとよりラフィ
ノースも完全に３種類の単糖に分解することができる。

換言すればメリビオース、ラフィノースからガラクトー
ス、グルコース、更にはフラクトースを製造することが
できるのである。

上記のほか、この形質転換体の有用な応用としては特に
ビート糖液の処理が挙げられる。ビート糖液には砂糖の
結晶作用を阻害する有害物質としてラフィノースが含有
されているのであるが、糖液をこの形質転換体で処理す
れば、それが産生ずるα−ガラクトシダーゼの作用によ
ってラフィノースが分解除去されるため、製糖作業が向
上し砂糖の収率も大幅に増加する。

また、従来、ビート廃糖蜜やビート糖洗液その化ビート
工場からの廃水にはラフィノースといった罷発酵性ない
しは非発酵性糖が含まれているが、本発明によれば上記
したような形質転換体を用いて廃糖蜜、又はそれを含ん
だ廃水を処理することが可能となり、公害防止技術とし
ても本発明はすぐれている。もちろん、ビート糖蜜やそ
の関連廃水のみでなく、ラフィノースやメリビオース等
α−ガラクトシド結合を有する糖類を含有する廃水であ
ればすべての廃水も本発明によって有効に処理すること
ができる。

そのうえ、廃糖蜜は、バイオテクノロジーや発酵工業に
おいて培地として多用されるものであるが、従来、パン
酵母はラフィノースをｌ／３シが発酵することができな
いため、ラフィノースを含有する甜菜糖蜜はパン酵母の
培養には適してぃなかった。しかしながら、本発明に係
る形質転換体で廃糖蜜を予じめ処理しておいたり、ある
いは本発明にしたがって形質転換したパン酵母を使用し
たりすれば、甜菜糖蜜もパン酵母用の好適培地として充
分に使用することができる。このようにして甜菜糖蜜を
処理しておけば、パン酵母のみならずα−ガラクトシダ
ーゼを有しない微生物であっても、これを甜菜糖蜜で充
分効率的に生育、培養することができるのである。

更にまた本発明においては、上記のようにしてＳ、オレ
アギノーサスＩＦ０１９９８よりクローニングしたα−
ガラクトシダーゼ遺伝子について、デイレ−ジョンプラ
スミドを用いる方法を利用してその構造を解明し、塩基
配列を決定するのにも成功したものである。

すなわち、先ずはじめにＤＡＮ発現用のベクター（ＹＥ
ｐ　１３等）に挿入されているＤＮＡ断片をシーフェン
ス用ベクターにつなぎ換える。ここに、シーフェンス用
ベクターは、外来ＤＮＡを組み込むためにそのベクター
をただ１ケ所切断する制限酵素の切断点を複数個連ねた
構造（マルチクローニングサイト）を持ち、挿入された
外来ＤＮＡをＭ１３ファージ粒子に組み込ませて培地中
に放出するためのＤＮＡ配列と、外来ＤＮＡ　を鋳型と
してシーフェンス反応を行うための相補鎖の合成開始部
位（プライマー）等を備えたベクターである。

シーフェンス用ベクターとしては、ｐＵｃ１１８、ｐＵ
ｃ１１９といったＰＵＣ系ベクターのほかにｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ等が知られているが、本発明における塩基
配列の決定には後者のベクターを用いた。

塩基配列の決定はシーフェンス用ベクターに繋ぎかえら
れたＤＮＡ断片の一端から順に行うが、度に読み取れる
範囲は最大で４００ベースなので。

読み取るＤＮＡを一端から順に３００ベ一ス程度ずつ何
段階か欠失させたプラスミド（デイレ−ジョンプラスミ
ド）を作成しなければならない。

このようにして多数のデイレ−ジョンプラスミドを作成
した後、オートシークエンサーでデータを読み取りこれ
らをつなぎ合わせて、α−ガラクトシダーゼ遺伝子のプ
ロモーター、分泌配列、構造遺伝子のすべてを含む塩基
配列を決定し、第３図に示すような結果を得た。

これらの塩基配列は、Ｓ、カールスベルゲンシス由来の
メリビアーゼ遺伝子のそれとは異なることも明らかにさ
れ（第４図、第６図）、本発明に係るα−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子が新規物質であることも確認された。

本発明に係るα−ガラクトシダーゼ遺伝子を利用するこ
とによって、前記したようにα−ガラクトシダーゼ関連
の各種の有効用途の途が拓けるほか、この遺伝子には菌
体外に蛋白質を分泌するためのシグナル配列が含有され
ているので、この分泌能力を利用した異種蛋白分泌ベク
ターも構築することができ、各種の蛋白質の大量生産に
本発明を利用することも可能である。

（実施例） 以下実施例を挙げてさらに具体的に説明する。

（１）酵母染色体ＤＮＡ　（パンセンジャーＤＮＡの調
！１）サッカロマイセス・オレアギノーサスＩＦ０１９
９８株をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、
グルコース２％）５００ｍＱに接種し温度３０℃で約３
６時間振盪培養し培養物を得た。この培養物を３　、　
ＯＯＯｒｐｍで３分間遠心分離処理し、得られた湿潤菌
体を２０鵬ΩのＳＢ液（０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ、　Ｃ１、
ＬＭ　５ｏｒｂｉｔｏｌ、０．１ＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ
　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ｐＨ７，５）
に懸濁し、これに細胞壁溶解酵素ザイモリエース２０−
Ｔ　（生化学工業製）をＴＥＮ液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
、　Ｃ１，１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ
７，５）に３Ｂ／’ｍｆｌの濃度で溶解した物を１ｍｆ
ｌ加え、３０℃で時々撹拌して１時間保温する。

これを遠心集菌し、再びこの菌体に２０鵬ΩのＳＢ液を
加え均一に混合し、次いで、この混合物にＴＥＮ液２０
＋ｎｆｌ、リボヌクレアーゼ溶液〔０，１阿Ｎ６−ａＣ
ｅｔａｔｅ、０．３Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐ）１４．８にリ
ボヌクレアーゼＡ　（シグマ製）を］Ｏ＋ａｇ／＋ｅΩ
溶解し沸騰水中で１０分間加熱したもの）０．２５ｍｆ
ｌ及び界面活性剤ＳＤＳ　（和光紬薬）の２０％水溶液
２ｍＱを加え２時間静かに振盪処理、さらにプロナーゼ
溶液ＣＴＥＮ液にプロナーゼＥ（科研化学製）を２　ｍ
ｇ　／　ｍＱ溶解し３７℃で１５分間保温したもの〕を
０　、５＋ａＱ添加し、３７℃で時々撹拌しながら２時
間保温した。ついで、これを６５℃に昇温し３０分静置
、ついで室温まで冷却する処理で溶液中のＲＮＡ、蛋白
質の分解を行った。次にフェノール処理、クロロホルム
処理を行った後、液量の２．５倍のエタノールを加え混
合、水中に静置し糸状に沈殿したＤＮＡを採取した。採
取したＤＮＡは再びＴＥＮ液２５ｍｆｌに溶解してリボ
ヌクレアーゼ溶液０．０５鵬Ω加え３７℃で１時間処理
し残存したＲＮＡを分解し、フェノール処理、クロロホ
ルム処理を行いリボヌクレアーゼを除いた後、前記同様
のエタノール沈殿によって酵母染色体ＤＮＡを得た。

次いで制限酵素Ｂａｇ　ＨＩとアイソシゾマーである制
限酵素Ｓａｕ　３ＡＩを用いた部分分解によるパンセン
ジャーＤＮＡの調製条件は、モレキュラー・クローニン
グ第２８２頁〜第２８５頁記載の段階希釈法［Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　Ｔ、　ｅｔ、　ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ｃｌｏｎｉｎｇ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８２）により、
酵素添加量をＤＮＡ１μｇ当りＢａａ　ＨＩは２．３１
　ｕｎｉｔｓ、　５ａｕ３ＡＩは０．１２７　ｕｎｉｔ
ｓと決定し、３７℃で１時間作用させ、各々の認識部位
を切断させた後、反応液を常法通りフェノール処理、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行い、部分分解
ＤＮＡを３３０μｇ調製し、これを分取用電気泳動装置
ＥＬＦＥシステム（Ｇｅｎｏｆｉｔ製）により分画した
。

分画後４フラクションおきに５μΩずつ採取し、アガロ
ース電気泳動を行い分画された大きさを確認し、適当な
りＮＡの長さごとにまとめてフェノール処理、クロロホ
ルム処理の後、エタノール沈殿処理を行い、部分分解Ｄ
ＮＡを回収し、パンセンジャーＤＮＡとした。分画した
長さと収量を第１表に示す。

第 １表 ２．０１〜２．６６ ２．６６〜３．５４ ３．１９〜３，８９ ３．６７〜４．６２ １３．７ １１．３ １］、３ １６．９ ２．０１〜２，６０ ２．６０〜３．３４ ３．３４〜３．９８ ３．９８〜４．６２ ６．０９〜７．５６ １３．７ ６．６８〜８．５１ １５．３ ６．７３〜７．５９ ８．２２〜９．３８ １７．６ １６．０ １３．６５〜１９．２８ ２１．８ Ｓ−１２１６，６０〜２１．１３ １８．４ （２）ベクターＤＮＡの調製とベクターＤＮＡとパンセ
ンジャーＤＮＡのライゲーション シャトルベクターＶＥｐ　１３に対して、ベクター１μ
ｇ当り２　ｕｎｉｔｓのＢａｍ　ＨＩを３７℃で１＠作
用させてＹＥｐ　１３の制限酵母Ｂａｍ　ＨＩ部位を完
全に切断し、常法通りフェノール処理、クロロホルム処
理、エタノール沈殿処理した後、このＢａｍ　ＨＩで切
断されたＤＮＡ断片の自己環状化を防止するため、　モ
レキュラー・クローニング第１３３頁〜第】３４頁記載
の方法（Ｍａｎｉａｔｊｓ　Ｔ、　ｅｔ、　ａｌ、：Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｒｎｉＢ　（Ｃｏ］ｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８
２）によりＣＩＰ処理を行いベクターＤＮＡを調製した
。

さらにこのベクターＤＮＡは、前記（１）において得た
パンセンジャーＤＮＡとともにＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）を使用してライゲーションを行い、２
つのＤＮＡを反応連結させた。ついで反応液１容に対し
５Ｍ塩化ナトリウム０．２５容とインプロパツール０．
７５容を添加しインプロパツール沈殿によって組換え体
ベクターを得た。

（３）組換え体ベクターの調製 上記ライゲーションにより作成した組換え体ベクターは
大腸菌ＡＧＩ（フナコシ薬品（株）により入手）を使い
モレキュラー・クローニング第２５２頁〜第２５３頁記
載の塩化カルシウム／塩化ルビジウム法［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　Ｔ、　ｅｔ、　ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　１９８２）により形質転
換菌ＡＧＩとした。ついでこの形質転換菌をアンピシリ
ン（シグマ製）４０ｐｐｌｉを添加したＬＢ培地（トリ
プトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム２％
、ｐ）１７．５）　５　ｆｆ１（ｌで３７℃で１晩培養
した後、この１ｒｒ＋Ｑを４０ｐｐｍのアンピシリンを
含むＬＢ培地１Ωに接種し３７℃で３〜４時間攪拌しつ
つＯＤ、、、。＝０．５〜０．６まで培養した後、クロ
ラムフェニルコール（シグマ製）を２００ｐｐｍ添加し
て再び３７℃で１４〜１５時間攪拌しつつ培養を続けた
あと３００Ｏｒｐｍ、１０分の遠心で集菌し、モレキュ
ラー・クローニング第３６８頁〜３６９頁記載のアルカ
リＳＤＳ法［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　ｅｔ。

ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　ｃｌｏｎｉｇ（Ｃｏｌｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　
１９８２）の試薬量を５０倍に変更して組紐換え体ベク
ターを抽出した。これを超遠心機で精製した後、セント
リコン１０（アミコン社製）で脱塩し、エタノール沈殿
を行い精製組換えベクターを得た。増幅し超遠心で精製
した組換え体ベクターの種類と使用したパンセンジャー
ＤＮＡの対応関係を第２表に示す。

第２表 ＹＥｐ　Ｓｌｌ　　　　Ｓ５．　Ｓ６．　Ｓ７．５８ｙ
Ｅｐ　Ｓ７　　　　Ｓ５．　Ｓ６．　Ｓ７．５８ＹＥｐ
　Ｓ８　　　　Ｓ９．　Ｓ］Ｏ，Ｓｌｌ、　５１２ＹＥ
ｐ　Ｂ４−］　　　Ｂ９．　ＢＩＯＹＥｐ　Ｂ６　　　
　Ｂ４．　Ｂ５．　Ｂ６■乍８８　　　　ＢＩＯ，Ｂｌ
ｌ、Ｂ１２１　：　］　　　　　　　　　２６０ ３：］　　　　　　　　　７０７ ３　：　］　　　　　　　　　８６］ １　：　１　　　　　　　　８６２ ３：１　　　　　　　　７２９ ３　：　１　　　　　　　　６９３ （４）酵母の形質転換及びα−ガラクトシダーゼ生産株
の検出 サツカロマイセス・センビシよりＢＹ７４６　（α接合
型、ｔｒｐｌ　ｈｉｓ３１ｅｕ２　ｕｒａ３）　　をＹ
ＰＤ培地５０ＩＩＩＱ中で５×１０７個／ｍＱとなるま
で振盪培養し３，０００ｒｐ＋ｎ、３分間で遠心集菌を
行いＴＥ緩衝液で洗浄した。つしで菌体を４ｍＱの酢酸
リチウム中に懸濁し３０℃で４分振盪した後１．５社の
エッペンドルフチューブ番；１００μρずつ分注し、こ
れに（３）記載の精製したカン力ロマイセス・オレアギ
ノーサスにより抽出したα−ガラクトシダーゼの発現に
関与する遺伝仔を含む部分分解ＤＮＡを組み込んだ組換
え体ベクターを１０μｇ添加して３０℃で３０分振盪、
対いで７０％ＰＥＧ４０００を１１０μＱ添加し１時間
静置した後４２℃て５分間熱処理してサツカロマイセス
・セレビシ：内に組換え体ベクターを導入した。次いで
室温で放冷し、上澄を遠心分離で除き菌体は滅菌水で６
浄して形質転換をおえだ。

次いで形質転換酵母菌体はグルコース１％、ウラシル、
トリプトファン、ヒスチジンを２４ｐｐｍｉ加したり寒
天培地に適宜希釈して塗抹して３０℃で培養を行い成育
してきたコロニーに２００μΩｍのＸ−α−ｇａｌと１
％のメリビオースを含む軟寒天ＭＭを５ｍ１重層すると
α−ガラクトシダーゼを生産する菌扮は、Ｘ−α−ｇａ
ｌを分解しコロニーが青色に染色したことによって検出
した。α−ガラクトシダーゼを発現させることのできた
組換え体ベクターの菌株名と得られた発現株数を第３表
に示す。

第３表 ＹＥｐ　Ｓ４　　　　４．７６〜９．３８　　　　１８
６４　　　　　　　　４ＹＥｐ　Ｓ７　　　　４．７６
〜９．３８　　　　３１３６　　　　　　　　５ＹＥｐ
　Ｓ４　　　　８．０３〜１１．４８　　　　４４８６
　　　　　　　　４１ＹＥｐ　Ｂ４−１　　　３．９８
〜６．７３　　　　６６６４　　　　　　　　１前記に
より検出したＸ−α−ｇａｌを分解する菌株は各プレー
トより各１株を釣菌し単コロニーに分離して２０ｍｆｌ
のＭ阿培地で３０℃、２日間振盪培養し遠心によって集
菌し一旦滅菌水で洗浄後、ＳＮバッファー（ＩＭ　５ｏ
ｒｂｉｔｏｌ、０．１Ｍ　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈ
ａｎｏｌ）　５ｍＲに懸濁し３７℃で１０分間振盪して
遠心集菌してこれを１ｙｓｉｓバツフア　−（ＩＮ　５
ｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１０ｍＭ
　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　２０
−Ｔ　１００ｕｎｉｔｓ／ｍρ）５１に懸濁してスフ二
口プラストが生成するまで３７℃に保温し、　その後Ｓ
ｏ１．　　ＩＩ　（０，２Ｎ　ＮａＯＨ１１％５ＤＳ）
　２００μΩを加えて溶菌し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
）１ｓ、０）を１５０μＱを添加混合して一２０℃に１
０分装いた後１５，０ＯＯｒｐ諺で１０分間遠心分離し
た。

上澄液にはα−ガラクトシダーゼを発現するために必要
なりＮＡ配列をパラセンジャーＤＮＡとして持つ組換え
体ベクターが抽出されているのでフェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿処理によって回収する。

上記によって得た組換え体ベクターを使用し大腸菌５Ｃ
５Ｉ（フナコシ薬品より購入）の形質転換を行い８処理
について形質転換体を得ることができたので、その結果
髪第４表に示す。

第４表 酵母菌株名　５４−Ｉ　　５７−Ｉ　　　５７−２　　
８６−１大腸菌形質転換体数　　１０　　　　２８　　
　　４０　　　　　１また、上記形質転換体はアンピシ
リン耐性を持つ物であったことで、形質転換で導入され
た組換え体ベクターはＹＥｐ　１３を作用した組換えベ
クターであることが確認できた。

この結果、サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽
出のα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺伝子を含
むパラセンジャーＤＮＡを組み入れた組換え体ベクター
名はその発現した酵母名をとってＹＥＢ８−１と命名し
、それによって形質転換した大腸菌形質転換体は、それ
ぞれ、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ８−１（微工研菌寄第１０
８１１号）、同様にＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ６−１（ＹＥＢ
６−１形質転換体）（微工研菌寄第１０８０８号）、同
様にＥ、　ｃｏｌｉ　５４−１（ＹＥＳ４−１形質転換
体）（微工研菌寄第１０８０７号）、同様にＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｓ７−１（ＹＥＳ７−１形質転換体）（微工研菌
寄第１．０８０９号）、同様にＥ、　ｃｏｌｉＳ７−２
　（ＹＥＳ７−２形質転換体）（微工研菌寄第１０８１
０号）として微生物工業技術研究所に寄託しである。

なお、酵母菌株Ｂ８−１．８８−１１、Ｂ８−１３、Ｂ
８−１４は同一の組換えプラスミドによる形質転換体で
あったのでＹＥＢ８−１による大腸菌形質転換体Ｅ、　
ｃｏｌｉＢ８−１を代表とした。

これら形質転換体に挿入されているパラセンジャーＤＮ
Ａの制限酵素地図を第１図に示した。

（５）形質転換体によるα−ガラクトシダーゼの生産、
及びこのα−ガラクトシダーゼとサッカロマイセス・オ
レアギノーサスの生産するα−ガラクトシダーゼの同一
性の確認。

組換え体ベクターにより形質転換した酵母を用いてα−
ガラクトシダーゼを生産せしめ、この酵母が生産したα
−ガラクトシダーゼとサッカロマイセス・オレアギノー
サスの生産したα−ガラクトシダーゼが同一であること
を確認するため、ウェスタンブロッティングを行いプロ
ティンＡ法で検出した。試料には（４）項においてα−
ガラクトシダーゼの発現のあった形質転換酵母の培養を
行った上清とサッカロマイセス・オレアギノーサスを形
質転換体と同様にして培養したものをセントリコン１０
（アミコン製）で約４００倍↓こ脱塩濃縮したものを使
用した。

これらの試料の蛋白質をローリ−法（Ｅ、　Ｆ。

Ｈａｒｔｒｅｅ　：　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８，４２２−４２７（１９７２
）により求め、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行った。体動は２０穴のコームを使ったゲルの右
端から分子量マーカー（オリエンタル酵母製）、形質転
換酵母培養液８点、サッカロマイセス・オレアギノーサ
ス培養液の順にル−ス当り２μｇ添加し、　同じサンプ
ルを同し順番に残りの穴に添加した。泳動終了後ゲルを
半分に切り一方を通常通り染色し、他の一方はエレクト
ロブロッティングを行いニトロセルロースメンブレンに
蛋白を転写した。その結果を第２図に示す。

第２図の結果から明らかなように、通常の染色を行った
ものは多数のバンドが検出されたが抗αガラクトシダー
ゼ血清と反応したものはただ１つのバンドのみが検出さ
れ、両者を比較した結果同一のものと判定された。

（６）形質転換酵母の醗酵力試酸 形質転換酵母として（４）項で述にた組換えベクターＹ
ＥＢ８−１を組み込んだサツカロマイセス・セレビシよ
りＢＹ　７４６を使用し次の条件で醗酵力試酸を行った
。

■　好気的培養の結果 ０．５％グルコース、０．５％メリビオースを炭素源と
したＭ阿培地を使用し、サツカロマイセス・セレビシよ
りＢＹ　７４６に組換えベクターＹＥＢ８−１　を組み
込んだ場合と、組み込まない場合で振盪培養を行い収量
と残存糖分の分析を行った。この際、それぞれの菌株の
要求する核酸、アミノ酸は２４ｐｐｔｎ添加した。結果
は第５表に示す。

第５表 形質転換体　　　Ｎ、　Ｄ、　　　　　　　Ｎ、　Ｄ、
　　　　　　２１０非転換体　　０．５３　　　　　　
Ｎ、　０．　　　　８０上記の結果からも明らかなよう
に、パン酵、母を、ビート糖蜜等ラフィノース、メリビ
オース含有糖液を使用して培養しても、これらの糖を充
分に資化し、培養、増殖できることが判る。

■　醗酵試験の結果 前記において好気的培養した菌体を使用して醗酵試験を
行った。

醗酵培地■：ビート糖蜜１０％（１１！酵性糖分）、０
．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファ （ｐＨ５，５）２（１０＋ｏＱ ＠酵培地■：ビート糖蜜１０％（ｒＲ酵性糖分）、要求
するアミノ酸、核酸を添加した ＭＭ培地２００＋ｎ１２ 接種菌体量：形質転換体〜１．３７　Ｘ　ＩＱ’個非転
換体〜１，３７Ｘ１０Ｓｇ ｗｌ酵試験は２週間行い、炭酸ガス発生量と残存糖分組
成を分析した。その結果及び使用した糖蜜の糖分組成、
ｒＲ＃収量時の残存糖分組成、炭酸ガス発生量（ＣＯ２
ｇ）を第６表に示す。この表のとおり形質転換酵母にあ
っては明らかにα−ガラクトシダーゼによりメリビオー
ス醗酵が行われ、炭酸ガス発生量も多く、非形質転換酵
母に比へ高い醗酵力を示した。

第 表 形質転換体　１　０．３３　０．０７　０．２０　１．
５４　０．４９　２．８８　３．４０Ｕ　　　Ｏ，２２
０，０６０，１５０，６７０，５２２，００４，９０非
転換体　Ｉ　　Ｏ，７８０，０７１，０６１，６９Ｎ、
Ｄ、　２．９３２．５５ＩＩ　　　１．０４　０．１４
　０．７４　０．５８　　Ｎ、Ｄ、　　２．９３　２．
４５使用糖蜜　　　２．＋３６．８７　　　０．４２　
　　０．５９したがって、本発明によれば、メリビオー
スやラフィノース等α−ガラクトシド含有物、例えばビ
ート廃糖蜜、ビート糖洗液その他ビート１１Ｆ製造工場
やビート処理工場からの廃液、を有利に処理することが
できる。また、ビート廃糖蜜を予じめ本発明に係る形質
転換体を作用せしめてガラクトースとグルコースの結合
を切断しておけば、ケーン廃糖蜜と同様に使用すること
ができ、各種発酵培地として有効に利用することができ
る。

（７）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造Ｉ）デイレ−
ジョンプラスミドの作成 シーフェンス用ベクターとしてｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ
を用い、先に得たα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を再クローニングした。

このようにして再クローニングしたｐＢＩ−ｕｅｓｃｒ
ｉｐｔを制限酵素Ｎｏｔ　Ｉ及びＳａｃ　Ｉで処理した
。

次いで、Ｋ１１ｏ−５ｅｑｕｅｎｃｅ用デイレ−ジョン
キット（全酒造製）を利用して、先ずＥｘｏｍで処理し
た。

Ｅｘｏ　ｍはＤＮ、Ａの５′末端側が平滑末端もしくは
突出末端の場合にのみ相補ＤＮＡ鎖を３′から５′末端
側へ削り取って行く。したがって制限酵素Ｎｏｔ　！及
び５ａｃＩでプラスミドを二重切断しておけばＳａｃ　
Ｉは５′陥没末端を形成するので、５′突出末端を形成
するＮｏｔ　Ｉ側のみが削り取られた。

次にＭＢヌクレアーゼ（ＨｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼ
）で処理し、１本１！ｉ　ＤＮＡ部分を切除し平滑末端
にした。しかしＭＢヌクレアーゼだけでは完全に平滑化
できない場合があるので、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅ
ｎｔで完全に平滑な２本鎖に修復し、ライゲーションを
行い閉環状のプラスミドとした。ここでＥｘｏｍの作用
時間を段階的に変えることにより、適当なデイレ−ジョ
ンを持ったプラスミドを作成した。

これらのプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られたコ
ロニーから抽出したプラスミドの大きさを電気泳動で確
認し、デイレ−ジョンプラスミドのスクリーニングを行
い、デイレ−ジョン系列を作成した。

ｉ）α−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造上記によって作
成したデイレ−ジョンプラスミドにより読み取ったデー
タを繋ぎ合わせて、αガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ
ーター、分泌配列、構造遺伝子の全てを含む塩基配列を
決定した。

このデータは第３図に示した。

シーフェンスデータの解析は、個々のディレージョンプ
ラスミドからオートシークエンサーで得られたデータの
接続を含め、ＤＮＡ塩基配列の解析はＤＮＡ解析用ソフ
トＧＥＮＥＴＹＸ　（ＳＤＣ製）を使用して行った・ ｉ）　０ＲＦ（オープンリーディングフレーム）の検索
シーフェンスしたＤＮＡ配列の中からＤＮＡの遺伝情報
がメツセンジャーＲＮＡへ転写され蛋白へと翻訳される
部分であるＯＲＦを検索した。

ＤＮＡコードでは、メツセンジャーＲＮＡの転写開始部
分はＡＴＧ、転写停止部分は、丁ＡＧ、　丁ＧＡ、子局
のいずれかであるので、開始コード、停止コードの検索
を行ないＯＲＦ決定を行った。

精製したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の分子量は６２，
５００ダルトンであった。　１ｋｂＤＮＡはアミノ酸３
３３個をコードでき、　そのアミノ酸の分子量はおよそ
３７，０００ダルトンなので、およそ１，５００塩基の
ＱＲＦが存在すると考えられた。

検索の結果、転写開始コードは第３図に示した塩基配列
において５２１番目のＡＴＧであり、転写停止コードは
１９３４番目のＴＡＡであること、その長さは１４１３
塩基でアミノ酸に翻訳された場合４７１残基であること
が分かった。

リ　α−ガラクトシダーゼ遺伝子の相同性の比較すでに
決定されているＳ、　ｃａｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｓｉｓ及
び今回決定したＳ、　ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を比較し１両者の相
同性を調べた。

ＤＮＡレベルでは９４．３％の相同性（全塩基に占める
同一塩基の割合）があり、蛋白質レベルでは４７１アミ
ノ酸中１７個が異なったアミノ酸で、相同性は９６．４
％であった。アミノ酸組成と、それらから推定される蛋
白質の分子量は第７表に示した。

第７表。

Ｓ＋ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのアミノ酸組成＾Ｌ
＾＝　３４７．２２％ ＣＹＳ＝　１０２．１２％ ＨＩＳ＝　　７１．４％ ＮＥＴ＝　１３２．７６％ ＴＨＲ＝　２４５．］、００ ％＊＝　　Ｏ，００％ ＡＳＮ＝　３５７．４３％ ＧＬＮ＝　１４２．９７％ ＩＬＥ＝　２３４．８８％ ＰＨＥ＝　２１４．４６％ ＴＲＰ＝　１２２．５５％ ？？？：　　０．００％ ＡＳＰ−３７１，８６％ ＧＬＵ＝　１７３．６］％ ＬＥ［Ｉ＝　３８８．０７％ ＰＲＯ＝　１６３．４は ＴＹＲ＝　２５５．３１％ ＡＲＧ＝　１７３．６１％ ＧＬＹ＝　４６９．７７％ ＬＹＳ＝　１９４．０３％ ５ＥＲ＝　４３９．１３％ ＶＡＬ＝　２０４．２５％ 第７表、２　Ｓ、ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのアミノ酸組
成ＡＬＡ＝　３７７．８６％　ＡＳＮ＝ ＣＹＳ＝　１０２．１？Ｊ　　ＧＬＮ：ＨＩＳ＝　　９
１．９１％　ＩＬＥ＝ ＮＥＴ＝　１３２．７６％　ＰＨＥ＝ ＴＨＲ＝　２５５．３１％　ＴＲＰ＝ 木＊＊二　　０　　．００％　　？？？二分子量＝５２
１３０．２２ ３１６．５８％ ］４２．９７％ ２１４゜４６％ ２１４．４６％ １２２．５５％ ０　．０Ｏ％ ＡＳＰ＝　３９８．２８％ ＧＬＵ＝　１７３．６１％ ＬＥＵ＝　３７７．８６％ ＰＲＯ＝　１７３．６１％ ＴＹＲ＝　２５５．３１％ ＡＲＧ＝　１７３．６１％ ＧＬＹ＝　４５９．５５％ ＬＹＳ＝　２０４．２５％ ５ＥＲ＝　４０８．４９％ ＶＡＬ＝　２１４．４６％ また、Ｓ、　ｏｌｅａ　１ｎｏｓｕｓの１番目から２８
５０番目までを≦、姐此岨肛駐匝江のものと比較した結
果は第４図として示した。なお図中、上段（ファイル名
：　ＴＡＭＥＬ　５）はト１朋１凹臣憇及び下段（ファ
イル名：　ＳＣＭＥＬＩＣＡ）はＳ、　ｃａｒｌｓｂｅ
ｒ　ｅｎｓｉｓのα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配
列をそれぞれ示した。

同一の塩基は本で示し、また１の下に示した数字はシー
フェンスされた塩基の端からの番号である。

これらの結果から明らかなように、両者の遺伝子は明ら
かに相違しており、本発明に係るα−ガラクトシダーゼ
遺伝子が新規な構造を有していることが確認された。

マ）α−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターの構造 Ｓ、　ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓとＳ、　ｃａｒｌｓｂｅ
ｒｇｅｎｓｉｓのα−ガラクトシダーゼ遺伝子のホモロ
ジー解析をプロモータ一部分及び、ＯＲＦの一部ではあ
るがシグナル配列部分について詳しく行った。

ｍ−ＲＮＡへの転写を促進するとされるＬＩＡＳ領域な
塩基配列（第５図ＵＡＳの下に記載した配列のうち口で
囲った部分）が開始コード（ＡＴＧのＡを起点Ｏベース
とする）より上流−２５９から−２０６にかけて存在し
、恒組■珪肛■匣■のＵＡＳより８ベース下流に存在し
ていた。

また、ＲＮＡポリメラーゼ■が転写開始部位を認識する
ためのＴＡＴＡボックスは、旦、７ヨヨと同位置の−１
１９、−１１０、−６３に存在していた。

ｖｉ）分泌配列（シグナル配列）の構造蛋白を菌体外に
分泌されるには細胞膜の脂質の層を通過する際の先導役
の働きをする１５〜３ｏ残基の疎水性の蛋白質が分泌さ
れる蛋白のＮ末端側に付着している必要がある。

シーフェンシングの結果、蛋白を分泌生産するためのシ
グナル配列は旦１組ム珪肛り旦赳のシグナル配列（下段
に示した）と比較して塩基で４個、アミノ酸で２個の違
いがあった。

第６図には両者を並記し、同一塩基は＊印で示した。

両者のシグナル配列を構成している１８個のアミノ酸と
α−ガラクトシダーゼのＮ末端側１２アミノ酸を次に示
したアミノ酸の親水性、疎水性のパラメーター（第８表
、正の値が大きくなる程、疎水的である。）を用い隣り
合う５アミノ酸間の相加平均をプロットしたのが第７図
である。図中、実線はＳ、　ｏｌｅａ　１ｎｏｓｕｓ、
　破線は互、　ｃａｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｓｉｓを示し、
双方型なり合う部分は実線で示した。

１１ｅ（Ｉ）＝　４．５０ Ｌｅｕ（Ｌ）＝　３．８０ Ｃｙｓ（Ｃ）＝　２．５０ Ａｌａ（Ａ）＝　１．８０ Ｔｈｒ（Ｔ）＝　−，７０ Ｓｅｒ（Ｓ）＝　−，８０ Ｐｒｏ（Ｐ）＝−１，６０ Ｇｌｕ（Ｅ）　＝−３，５０ Ａｓｐ（Ｄ）　＝−３，５０ １ｙｓ（Ｋン＝−３，９０ ２、Ｖａｌ（Ｖ）＝　４．２０ ４、　Ｐｈｅ（Ｆ）＝　２．８０ ６、　Ｎｅｔ（Ｍ）＝　１．９０ ８、　Ｇｌｙ（Ｇ）＝　−，４０ １０、Ｔｒｐ（Ｗ）＝　−，９０ １２、Ｔｙｒ（Ｙ）＝−１，３０ １４、Ｈｉｓ（Ｈ）＝−３，２０ １６、６ｉｎ（Ｑ）＝−３，５０ １８、Ａｓｎ（Ｎ）＝−３，５０ ２０、Ａｒｇ（Ｒ）＝−４，５０ Ｓ、　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓでＩｌｅ　（イソ
ロイシン二疎水性）Ｓｅｔ　（セリン：親水性）の部分
が恒剋９１凹臣肝では２個のＴｈｒ　（スレオニン二親
水性）に置換されていることから疎水性は低くなってい
る可能性はあるが、両者の分泌能力の差はこのデータか
らは分からない。

６）蛋白分泌用ベクターの構築 Ｓ、　ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのα−ガラクトシダーゼ
ニハ菌体外に蛋白質を分泌するためのシグナル配列が付
加しているので、本遺伝子のプロモーター、シグナル配
列以後に異種遺伝子を接続することで、異種遺伝子に由
来する蛋白質を分泌生産することが可能である。

以下に、この分泌能力を利用した異種蛋白分泌用ベクタ
ー設計の一例を示す。

第８図にはプロモーター領域、転写終結領域に存在する
各種制限酵素による切断地図を示した。

異種遺伝子産物を分泌発現させるにはα−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のＯＲＦ中のシグナル配列以後の構造遺伝子
部分に異種遺伝子を組み込む必要がある。

そのためにはα−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を除去
しなければならないので、シグナル配列の中程に存在す
るｓｐｈ　Ｉと停止コード部分に存在するＡｆｌ　ＩＩ
で切断した。

次いで、切除されたシグナル配列の修復と異種遺伝子の
挿入部位としての制限酵素切断部位の導入及び、各導入
部位に停止コードを対応させるためＴＡＡを１塩基ずつ
ずらして設けた合成りＮＡを作成した（第９図）。

この合成りＮＡを構造遺伝子を切除したベクターにライ
ゲーションし、異種蛋白分泌用ベクターを構築した。こ
のベクターを用いることにより異種遺伝子で発現させる
ことができる。

なお本明細書において各種操作を行うに当り、その参考
とした文献例は次のとおりである。

参考文献 Ｏ酵母のα−ガラクトシダーゼ遺伝子シークエンシング
に関して ・Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ　Ｐ、Ｌ、　：　Ｎｕｅｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３７２５７°Ｓｕｍｎｅｒ−５
ｍｉｔｈ　　Ｍ　　ｅｔ、ａｌ、：　Ｇｅｎｅ　３６　
３３３−３４０Ｏ−射的な遺伝子組換え技術に関して ＋Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ　ｅｔ、ａｌ、　：　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈｅｒｂｏ　　−ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒａｔｏｒｙ
）・村松正実：実験医学（羊上社）　５　（１１）Ｏ遺
伝子シーフェンシングに関して ＋Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　：　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
　ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１０１・Ｍ１３ファ
ージによるクローニングとＤｉｄｅｏｘｙシークエンス
法 （アマジャムジャパン） Ｏ蛋白質の親−疎水性について ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ，Ｆ、　ｅｔ、　ａｌ、　：
　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５７（発明の効果） 本発明のサッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出
したα−ガラクトシダーゼの発現に関与する遺伝子を含
有するパラセンジャーＤＮＡを含むＤＮＡは、サツカロ
マイセス・セレビシェを始めＹＥｐ１３の持つ２μ■Ｄ
ＡＮ複製開始質点を利用しプラスミドの複製を行える酵
母でα−ガラクトシダーゼ生産能のない酵母に導入し形
質転換した場合に、その形質転換体にα−ガラクトシダ
ーゼ生産能を付与することができる。

したがって本発明によれば、α−ガラクトシダーゼの工
業生産が可能となるばかりでなく、メリビオース、ラフ
ィノースの発酵ないし分解も可能となり、そのためにこ
れらの糖を含有する廃液処理も有利に行え、また、ビー
ト糖蜜を工業用培地として自由に使用することもできる
。

また本発明によってα−ガラクトシダーゼ遺伝子の構造
が新たに解明されたので、上記効果が更に増進されるだ
けでなく、例えばそのシグナル配列を利用すれば異種蛋
白分泌用ベクターも構築することができるので、各種の
異種蛋白の効率的製造も可能となる。

したがって本発明は、この面からしてもバイオテクノロ
ジーに大きく貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各組換え体プラスミドに挿入されているパラ
センジャーＤＮＡの制限酵素地図であり、図中のＢ、Ｅ
、Ｐ、Ｓ、Ｘは、それぞれ次の制限酵素による切断位置
を示す。 Ｂ：Ｂａｍ　ＨＩ　Ｅ：Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｐ：Ｐｓｔ　Ｉ
　Ｓ：Ｓａｕ　３ＡＩ　Ｘ：ｂａ　　Ｉ 第２図は、形質転換体の生産するα−ガラクトシダーゼ
とサッカロマイセス・オレアギノーサスの生産するα−
ガラクトシダーゼの比較図であり、図中の数字はそれぞ
れ次のことを表わす。 １：分子量マーカー、２　：　Ｂ８−１．３　：　Ｂ８
−１１．４　：　Ｂ８−１３．５　：　Ｂ８−１４．６
　：　５４−１．７：Ｓ７−１８：５７−１．９：Ｂ６
−１．１０　：　Ｓ、ｏｌｅａ　１ｎｏｓｕｓＩＦＯ１
９９８第３図は、本発明に係るα−ガラクトシダーゼ遺
伝子の塩基配列を図示したものであり、第４図は、互０
組１穂肛駐旦江のα−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配
列（下段）との相同性を比較した図面である。 第５図は、３．　ｐ１６Ｂ　１ｎｏｓｕｓのα−ガラク
トシダーゼプロモーターの構造を図示したものである。 第６図は、そのシグナル配列（上段）を図示するととも
に、Ｓ、　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓのシグナル配
列の塩基配列（下段）とを比較したものであり、第７図
は親木−疎水プロット図である。 第８図は、α−ガラクトシダーゼ構造遺伝子周辺部分の
制限酵素地図を図示したものであり、第９図は、合成り
ＮＡによる分泌ベクターの作成図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 図面の浄Ｗ（内存１、 第 Ｓ［）Ｓ−ポリアクリフレアミド＠う１め：変更なし） 図 ｐｒｏ士ｐｉｎ−Ａｍ ＡＨＡ− ３曹贅ミ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出し
   たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
   泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミド。
2. （２）サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出し
   たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
   泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミドをＹＥｐ
   １３のテトラサイクリン耐性遺伝子のＢａｍＨＩ部位に
   挿入したプラスミドベタクー。
3. （３）サッカロマイセス・オレアギノーサスより抽出し
   たα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域、分
   泌配列領域、構造遺伝子領域を含むプラスミドをＹＥｐ
   １３のテトラサイクリン耐性遺伝子のＢａｍＨＩ部位に
   挿入したプラスミドベタクー、を用いて菌体を形質転換
   してなる形質転換体。
4. （４）特許請求の範囲第３項に記載した形質転換体を使
   用するα−ガラクトシダーゼの製造方法。
5. （５）特許請求の範囲第３項に記載した形質転換体を使
   用するメリビオース及び／又はラフィノースの分解ない
   し発酵方法。
6. （６）特許請求の範囲第３項に記載した形質転換体を使
   用するビート糖液の処理方法。
7. （７）特許請求の範囲第３項に記載した形質転換体を使
   用するビート糖蜜の処理方法。
8. （８）形質転換体が、その培養物及び／又はその処理物
   である特許請求の範囲第３〜７項のいずれか１項に記載
   の菌体又は方法。
9. （９）第３図に示す塩基配列を有するα−ガラクトシダ
   ーゼ構造遺伝子。
10. （１０）第３図に示されるプロモーター領域のＤＮＡ配
    列を実質上含むものであることを特徴とするα−ガラク
    トシダーゼ遺伝子のプロモーター。
11. （１１）、第５図に示されるＴＡＴＡボックスの少なく
    とも１つ及び／又はＵＡＳ領域を含むものであることを
    特徴とするα−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター
    。
12. （１２）次式で示されるアミノ酸配列に対応する塩基配
    列からなることを特徴とするシグナル配列。 【遺伝子配列があります】
13. （１３）次式で示される塩基配列からなることを特徴と
    するシグナル配列。 【遺伝子配列があります】
14. （１４）第３図に示したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の
    ＯＲＦ中のシグナル配列、及び（１１）項記載のα−ガ
    ラクトシダーゼプロモーターを利用して異種蛋白を分泌
    させる方法。
15. （１５）第３図に示したα−ガラクトシダーゼ遺伝子の
    ＯＲＦ中のシグナル配列以後の構造遺伝子部分に異種遺
    伝子挿入部位となる塩基配列を配してなることを特徴と
    するＤＮＡ配列。
16. （１６）異種遺伝子挿入部位の塩基配列が次式で示され
    る配列を含むものであることを特徴とする請求項１４に
    記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】
17. （１７）請求項１４又は１５に記載のＤＮＡ配列を用い
    て構築してなることを特徴とする異種蛋白分泌用ベクタ
    ー。