JPH04126088A - プロモーター活性を有するｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物細胞内等で異種蛋白遺伝子を発現させる
時、好適に使用されるプロモーター活性を保持するＤＮ
Ａ断片、該ＤＮＡ断片か導入されたベクター及び該ベク
ターにより形質転換された宿主に関する。

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題〕遺伝子組
換え技術の分野では、遺伝子の発現量を増大させるため
に強力なプロモーターにより、産生ｍＲＮＡ量を増大さ
せることが行われている。

植物においては、その様な例としてカルフラワーモザイ
クウィルス３５　ｓ　（ＣａＭＶ３５　ｓ）プロモータ
ーが多用されている。しかしながら、このプロモーター
を使用して異種蛋白遺伝子を発現させた場合、必ずしも
期待通りの発現量か得られないことが多い。そこで、更
に強力なプロモーターの開発か望まれていた。

ところで、ペルオキシダーゼには、多くのアイソザイム
が存在すると言われ、ペルオキシダーゼを高生産する西
洋ワサビの培養細胞か既に獲得されている［　Ｙａｍａ
ｄａ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｔｅ
ｃｈ、Ｂｉｏｃｈ、、３８．３１（１９８７）］。また
、この西洋ワサビ培養細胞から得たベルオキシダーゼア
イソサイムのゲノム遺伝子の構造か決定され、その５°
上流にプロモーター配列が存在することか確認されてい
る（昭和６２年度日本醗酵工学会講演要旨集、　ｐ２＋
）。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、これらの事情に鑑み、各種研究を重ねた
結果、この西洋ワサビの培養細胞から、多種のペルオキ
シダーゼアイソザイム遺伝子のクローンを取得し、各ク
ローンのプロモーターを検索したところ、高いプロモー
ター活性を有するＤＮＡ断片を見い出し、本発明の完成
に至った。

即ち、本発明の特徴は、第１図に示す全部もしくは一部
の塩基配列、またはそれらと均等な塩基配列を有し、プ
ロモーター活性を有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡが挿入さ
れたベクター及び該ベクターにより形質転換された宿主
に存する。

以下にこれを詳述する。

本発明のＤＮＡ断片は次のようにして調製できる。

まず、本発明の出発遺伝子である各種ペルオキシダーゼ
アイソザイム遺伝子は西洋ワサビの培養細胞から常法に
従い、例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

（１９８９）、　ｐ、８．３．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ、）に記載の方法に従い、
ｃＤＮＡライブラリーを調製し、Ｗｅｌ　１ｎｄｅｒの
報告したＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　（１９７６）。

７２、１９記載の西洋ワサビのペルオキシダーゼのアミ
ノ酸配列に基づき調製したＤＮＡプローブを用いて、遺
伝子を選択することができる。また、例えば、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　（１９８９）、　ｐ、
９．４．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｓ、）に記載の方法に従い、西洋ワサビの培養細胞か
らゲノムライブラリーを調製し、既に得られているアイ
ソザイム遺伝子をプローブにして、更に多くのペルオキ
シダーゼアイソザイム遺伝子を選択することができる。

なお、これらのペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子の
選択方法は、既に本発明者等により発表されている。

すなわち、Ｆｕｊｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ
、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７３゜（１９８８）、　６
８１−６８７において、ｐｒＸｃｌａ及びｐｒｘｃｌｂ
と命名されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子が単
離されたことが記載されており、またＦｕｊｉｙａｍａ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　８９．　（１９９０）
、　　１６３−１６９において、ｐｒｘＣ２及びｐｒｘ
ｃ３と命名されたペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子
か単離されたことが記載されている。

本発明のＤＮＡ断片は、この様にして単離しただｐｒｘ
Ｃ！ａ、ｐｒｘｃｌｂ、ｐｒｘＣ２及びｐｒｘＣ３等の
クローンを種々の制限酵素によって切断し、異種蛋白を
発現させ、その量を測定することによって、最も高いプ
ロモーター活性を示した５′非翻訳領域の一部である。

ｐｒｘｃｌａの５′非翻訳領域については、制限酵素Ｘ
ｂａＩ（塩基配列−５２５）と制限酵素ＥｃｏＲ１（塩
基配列−５）で切断した断片を調製した。

ｐｒｘｃｌｂについては、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（塩基
配列−５３３）と制限酵素Ｎ５ｉＩ（塩基配列＋１）で
切断した断片を調製した。

ｐｒｘＣ２については、制限酵素ＸｂａＩ（塩基配列−
５２７）と制限酵素Ｎ５ｉＩ（塩基配列＋５）で切断し
た断片を調製した。

ｐｒｘＣ３については、制限酵素ＥｃｏＲ［（塩基配列
−４８４）と制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　（塩基配列＋６
３）で切断し、更に修飾酵素Ｅｘｏｎｕｃｕｌｅａｓｅ
Ｉ［［でＨｉｎｄｎ［サイトから−５の位置まで分解し
た断片を調製した。

これらの各遺伝子の５“非翻訳領域のプロモーター活性
の検索は、レポータ遺伝子としてベーターグルクロニナ
ーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を用い、それと５′非翻訳領域と
のキメラ遺伝子を作製し、それらとｐＵＣ系プラスミド
またはｐＢＩ系プラスミドとから発現プラスミドを構築
し、これらを植物プロトプラストに導入することにより
、または、植物形質転換体を作製し、ＧＵＳ遺伝子の発
現量を測定することにより行うことができる。その結果
、第１図に示すｐｒｘＣ２の５′非翻訳領域がＣａＭＶ
３５ｓプロモーターよりも高い活性を示し、更にｐｒｘ
ｃｌａ、ｐｒｘｃｌｂ、ｐｒｘＣ３の５′非翻訳領域よ
りも高い活性を示すことが見出された。

本発明では、第１図に示すＤＮＡ塩基配列は、プロモー
ター活性を損なわない範囲内で一部を削除あるいは改変
してもよい。

本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片はｐＵＣ
系プラスミド、ｐＢＩ系プラスミド等のプラスミドベク
ター中に挿入され、異種蛋白遺伝子を発現させるための
ベクターとして使用される。

プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の各種プラスミド
への挿入は、ＤＮＡ組換えの一般的方法、例えば、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　（１９８９）、（
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ、）
に記載の方法に従って行うことができる。例えばｐｒｘ
Ｃ２の５°非翻訳領域を含むＸｂａ　Ｉ　／Ｎｓｉ　Ｉ
断片はｐＵｃ１８のＸｂａ　ＩとＰｓｔＩで切断したマ
ルチクローニングサイトとライゲーションすれば、プラ
スミドｐＵｃ１８に挿入することができる。

本発明のＤＮＡ断片を含有するベクターは、ベーターグ
ルクロニナーゼ（ＧＵＳ）　、ペルオキシダーゼ、アス
コルビン酸オキシダーゼ、ルシフェラーゼ等各種動植物
、酵母等真核生物由来の遺伝子を発現させるのに好適で
ある。

また、本発明のベクターは、植物細胞または、酵母細胞
等の宿主を形質転換するのに好適に用いられる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、
本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に於いて
限定されるものではない。

実施例１ ［１］ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子の調製■　
西洋ワサビゲノムＤＮＡライブラリーの調製西洋ワサビ
の茎から誘導された細胞培養（Ｆｕｊｉｙａｍａ　ｅｔ
　ａｌ、、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏ
ｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｓｏｚｙ
ｍｅ　ｃ　ｇｅｎｅｓ、　Ｅｕｒ、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

１７３、　（１９８８）、　６８］−６８７）から［Ｂ
１１ｎ　ａｎｄ　５ｔａｆｆｏｒｄＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、３．　（１９７６）、　２３０３−
２３０８］の方法で全ＤＮＡを調製した。次にこれらを
Ｍａｎｉａｔｉｓの方法で制限酵素５ａｕ３Ａ　Ｉで部
分分解した。この部分分解断片を１０〜４０％シュクロ
ース密度勾配遠心分離（３３，０００ｒｐｍ、　１６時
間）で分画し、１０〜２０ｋｂの長さのＤＮＡ断片を回
収した。これを更にアルカリフォスファターゼで処理し
、脱リン化した後、あらかじめＢａｍＨＩと５ａｌＩで
処理したλＥＭＢＬ４（プロメガ製）とライゲーション
し、Ｈｏｒｎ（１９７９）の方法によりパッケージング
した。組換えファージで感染のためＥ、ｃｏｌｉ　ＮＭ
５３９を使用した。

■　西洋ワサビペルオキシダーゼゲノムの選択西洋ワサ
ビペルオキシダーゼのｃＤＮＡクローンをｐｓＫｌ　（
上記の文献の、Ｐｓｔｌで切り出した１、３ｋｂのＤＮ
Ａ）をマルチプライムＤＮＡラベリング系（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）を使用して０Ｐでラベルした。

Ｅ、ｃｏｌｊ　ＮＭ５３９に感染させて生じたプラーク
をナイロン膜に移した後、上記のラベルしたｃＤＮＡプ
ローブでプラークハイブリダイゼーションを行った。ポ
ジティブクローンを精製後、ファージＤＮＡの制限酵素
切断断片をサザーンブロツティングを行い、ｃＤＮＡと
ハイブリダイズするＤＮＡ断片をｐＵｃ１９にサブクロ
ーンした。

ｐｓＫｌに挿入されている″！Ｐ−ラベルｃＤＮＡとハ
イブリダイズする９個の組換えλＥＭＢ　Ｌ４ファージ
を６Ｘ１０’の組換えファージの中から分離した。これ
らのファージのハイブリダイゼーションの強度は、３ク
ラスに分離された。

ハイブリダイゼーションの強度が最も強いクローン（ク
ラスｌ）のうち、ｌクローンがｐｒｘＣｌａ、ｐｒｘｃ
Ｉｂ遺伝子をランダムに含んでいることがわかった。ハ
イブリダイゼーションの強度が余り強くないクローン（
クラス２）の４個の組換えクローンはｃＤＮＡプローブ
とハイブリダイズするＥｃｏＲＩ制限断片（４ｋｂ）を
含んでいた。

また、ハイブリダイゼーション強度が最も弱いクラス（
クラス３）は、プローブとハイブリダイズするＥｃｏＲ
Ｉ　（１，５ｋｂ、　０．８　ｋｂ）を含んでいた。こ
れらのＥｃｏＲＩ断片及びクラス２、クラス３のクロー
ンから得られる他の制限酵素切断断片とオーバーラツプ
する断片をｐｕｃ　Ｉ　９にサブクローンし、塩基配列
を決定した。

これらの塩基配列をｐｒｘｃｌａ及びｐｒｘＣｌｂの塩
基配列とそれから予測されるアミノ酸配列比較した結果
、ペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子ｐｒｘＣ２及び
ｐｒｘＣ３と命名した［２］　ＤＮＡ断片ノｗＲ製 前記［１］で得たｐｒｘＣ２を制限酵素Ｘｂａ　Ｉ（塩
基配列−５２７）とＮｓｉ！（塩基配列＋５）で切断し
、第１図に示すＤＮＡ断片を得た。

［３］タバコプロトプラストでのｐｒｘＣ２の５′非翻
訳領域のプロモーター活性の確認 ＤＮＡ組換えの為の一連の遺伝子操作は、基本的には、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　（１９８９）
、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ
、）に従って行った。前記［２］で得たｐｒｘＣ２の５
′非翻訳領域５３２ｂｐ　（第１図）とＧＵＳ遺伝子と
のキメラ遺伝子を作製し、更にそれらをｐＵｃｌＢにつ
なぎ、発現プラスミドを構築した。比較のために、ｐｒ
ｘＣ２の５′非翻訳領域Ｘｂａ　Ｉ　／　Ｎｓｉ　Ｉ断
片の代わりに、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターを用いた発
現プラスミドも構築した。これらの発現プラスミドをエ
レクトロポレーション法によりタバコプロトプラストに
導入し、２４時間後のＧＵＳ活性を測定した。ＧＵＳ活
性は以下のようにして測定した。酵素抽出液３００μｌ
に、２ＩＩＩＭメチルウンベリフェリルグルクロライド
を含む抽出液（５０ｍＭリン酸緩衝液。

ｐＨ７，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ＳＯ，１％トリトン
Ｘ−１０００，１％ラウリザルコシン、ＩＯＩＩＩＭ　
　β−メルヵブトエ名ノール）を３００μ！加え、３７
℃、１時間酵素反応を行った。０．２　Ｍ　ＮａｔＣＯ
＊　２．４−を加えて反応を停止させ、生成物４−メチ
ルウンベリフェロンの蛍光量を蛍光光度計を用いて測定
（ＥＸ、　３６５ｎｍ、　Ｅｍ、　４５５ｎｍ）した。

４−メチルウンベリフェロン量は４−メチルウンベリフ
ェロンを用いて作製した標準曲線より求め、それを基に
ＧＵＳ活性を算出した。蛋白質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ社
のプロティンアッセイキットを用いて測定した。その結
果を第１表に示す。この結果より、ｐｒｘＣ２の５°非
翻訳領域にはプロモーター活性があり、しかも汎用され
ているＣａＭＶ３５ｓプロモーターよりも約４倍以上の
強い活性を存することかわかる。

第１表 プロモーター領域　　　　　ＧＵＳ 比活性 なし　　　　　　　　　　　　８ ＣａＭＶ３５　ｓ　　　　　　　　１００”ｐｒｘＣ２
４４４ す２７．９　ｐｍｏｌ／ｍｉｎ　■　　蛋白［４１トラ
ンスジエニツクタバコ細胞でのｐｒｘＣ２の非翻訳領域
のプロモーター活性の確認ｐｒｘＣ２の５′非翻訳領域
とＧＵＳ遺伝子とのキメラ遺伝子のプラスミドｐＢ１１
０１へのつなぎ換えは第２図に示した。即ち、ｐｒｘＣ
２の５゛非翻訳領域、ＧＵＳ遺伝子、及びｐＵｃｌＢか
ら成る組換プラスミドからｐｒｘＣ２の５′非翻訳領域
とＧＵＳ遺伝子部分を含むＰｖｕＩ［／　Ｅｃ。

Ｒ［断片を切り出した。一方、ｐＢＩＩＯＩはＨｉ’ｎ
ｄ１［［／　ＥｃｏＲＩで切断後、ＨｉｎｄＩ［［切断
末端をクレノー酵素で修復し平滑末端とし、ＰｖｕｌＩ
／　ＥｃｏＲＩ断片を挿入した。

トランスジェニックタバコの作製は、目的のキメラ遺伝
子をＴｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　Ｍａｉｔｉｎｇ法により
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に
導入し、このキメラ遺伝子の入ったアグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いてＬｅａｆ　Ｄ
ｉｓｃ法によりタバコ細胞を形質転換した。

■　キメラ遺伝子のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）への導入 ｐｒｘＣ２の５°非翻訳領域とＧＵＳ遺伝子及びｐＢＴ
＋０１から構築された組換プラスミドで形質転換された
Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００（ドナーと称する）、ｐＲＫ２０
１３を保持するＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１０１　（ヘルパー
と称する）をそれぞれ５０μｇ／ｄカナマイシン含有Ｌ
Ｂ培地で３７°Ｃ１−夜培養した。アグロバクテリウム
ツメファシェンス（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ　４４０４株は、ＬＢ培地５
−で２５〜２８°Ｃ１約３６時間培養した。

各培養液は、１．５ｍｔ’容エッペンドルフチューブに
とり、遠心により集菌した。菌体は０．５〜ｌｄの１０
ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，で３回はと洗浄した後、約ｓｏμｐの
１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，に懸濁した。各菌体懸濁液は、ド
ナー、ヘルパー、アグロバクテリウムツメファシェンス
（Ａ、　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の順でＬＢプレート
上にスポットし、２５℃、−夜混合培養した。混合培養
菌体は、白金耳等でかき取り、ｌ−の１０ｍＭ　Ｍｇ５
Ｏ，に懸濁し、１０！〜ｌＯ″倍に希釈し、その５０μ
ｌを４００μｇ／ｄ　　カナマイシン含有Ｍｉ　ｎＡプ
レー）　［ＭｉｎＡ培地（第２表参照）の入ったシャー
レ〕に蒔き、２５〜２８°Ｃ１２〜３日培養し、キメラ
遺伝子が導入されたアグロバクテリウムツメファシェン
ス（Ａ、　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の単一コロニーを
取得した。

第２表 ＾、　　ＭｉｎＡ培地 に、ＨＰＯ。

ＫＨ，ＰＯ。

（ＮＨ４）＊５０４ Ｍｇ５Ｏａ・７８．０” １０．５　ｇ／１ ４．５ｇ／１ １．０ｇ／１ ０．２ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム　０．５ｇ／ｌ グルコースリ　　　　２．０ｇ／ｌ 寒天　　　　　　　１２　　ｇ／１ ０′別途殺菌 Ｂ、　除菌用培地 ＬＳ培地（ｐＨ５，６〜５．８） クラフオラン　　　　０．５ｇ／ｌ カナマイシン　　　　０．１ｇ／Ｉ Ｃ０シュート形成用培地 ＬＳ培地（ｐＨ５，６〜５．８） ベンジルアデニン　　１　■／１ ナフタレン酢酸　　　０．１■／１ クラフオラン　　　　０．５　ｇ／ｌ カナマイシン　　　　０．１ｇ／Ｉ Ｄ、　カルス誘導培地 ＬＳ培地（ｐＨ５，６〜５．８） ベンジルアデニン　　０．８■／ｌ ナフタレン酢酸　　　０．５■／１ カナマイシン　　　　０．１ｇ／ｌ ■Ｌｅａｆ　Ｄｉｓｃ法によるタバコの形質転換キメラ
遺伝子を保持するアグロバクテリウムツメファシェンス
（Ａ、　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を５０μｇ／ｒｄカ
ナマイシン含有ＬＢ培地５ｒｄ中、２５〜２８°Ｃ１夜
培養したものを、シャーレに移し、そこに５１１１ｍ角
に切った無菌タバコの葉を表皮を下に、気孔を上にして
３分間浸汐した。余分の菌液をキムワイブで除き、ＬＳ
培地プレートに置床し、２５°Ｃで培養した。２日後、
除菌用培地プレート（第２表）に移植、３日後、シュー
ト形成用培地（第２表）へ移植した。その後、５〜７日
間隔でシュート形成用培地へ移植し続けた。茎葉部の発
達したシュートが出てきたら切取り、除菌用培地に移植
した。

成育した幼植物体は、バーミキュライトとピートモスを
１＝１に混合し、これに約１　ｇ／ｌのハイボネックス
溶液を充分混合したものを含む植木鉢へ移し、−日の内
１４時間は１０．０００ルツクスの光を照射し、２５°
Ｃで栽培した。なお、水は毎日与え、ハイボネックス等
の肥料は週に一回与えた。

■　トランスジェニックタバコの各器官でのＧＵ活性 丈が約１０ｃｍまで成長した形質転換タバコを葉、茎、
根に分けて液体窒素で凍結させ、３００〜１０００■を
エッペンドルフチューブに分取した。抽出緩衝液（５０
ｍＭリン酸緩衝液、　ｐＨ７，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ
、０．１％トリトンＸ−１００，０，１％ラウリルザル
コン、１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール）３００
〜６００μｌと海砂を加え、ガラス棒で粉砕し、遠心分
離により上溝を回収した。ＧＵＳ活性及び蛋白量の測定
は前述（３）記載の方法に従った。その結果を第３表に
示した。プロモーターが存在しないとＧＵＳ遺伝子の発
現はほとんど認められないが、ｐｒｘＣ２のプロモータ
ーが存在すると葉、茎、根、いずれの器官でも高いＧＵ
Ｓ活性が認められ、ｐｒｘＣ２のプロモーターがいずれ
の器官でも高く発現しうることが示された。またｐｒｘ
Ｃ２のプロモーターは、同様に測定したｐｒＸｃｌａお
よびｐｒｘｃｔｂのプロモーターよりも高いＧＵＳ活性
を示した。

〔以下余白〕

第３表 野性型　　　　　＜２０　　　＜２０　　　＜２０なし
　　１　　　　＜２０　　２１　　　２６２　　　　　
　＜２０　　　　＜２０　　　　＜２０ＣａＭＶ３５ｓ
　１　　　　　３８０　　　１７０　　１１００ｐｒｘ
ｃ１ａ　　ｌ　　　　　　＜２０　　　２４０　　　３
３０２　　　　　　＜２０　　　　４５　　　　２８ｐ
ｒｘｃ１ｂ　　１　　　　　　＜　２０　　　　７５　
　　６８０ｐｒｘＣ２１５３０１１００２８００ （”　ｐｍｏｌ／ｍｉｎ　　■　　蛋白）［５］　　）
−ランスジェニックタバコ植物体のカルス化によるＧＵ
Ｓ活性の誘導 各種形質転換タバコ植物体の東部を５Ｍ〜１　ｃｍ角に
切取り、これをカルス誘導培地（第２表）に置床し、２
５°Ｃ１暗所下で２〜３週間培養し形成された各カルス
のＧＵＳ活性を前述［３］記載の方法に従い測定した。

その結果を第４表に示した。ＣａＭＶ３５ｓプロモータ
ーを導入したものではカルス化してもＧＵＳ活性は誘導
されず、比活性はむしろ低下した。他方、ｐｒｘＣ２の
プロモーターを導入したものではカルス化により更に約
４０倍活性が上昇し、ｐｒＸＣ２のプロモーターがカル
ス化に伴い、より誘導的に強く発現することが示された
。また、ｐｒｘＣ２のプロモーターは、同様に測定した
ｐｒｘｃｌａおよびｐｒｘｃｌｂのプロモーターよりも
カルス化に伴い、より誘導的に強く発現することが示さ
れた。

第４表 プロモーター　　ＧＵＳ活性１　　誘導性葉　　カルス なし　　　　　　６　　　１０　　　１．７ＣａＭＶ３
５ｓ　　　　４７５　　　１０４　　　０．２２ｐｒｘ
ｃ１ａ　　　　　　１６　　　２５７　　　１６ｐｒｘ
ｃｌｂ　　　　　　９　　　２５０　　　２８ｐｒｘＣ
２２２０９７００４４ （”　ｐｍｏｌ／ｌｌ１ｉｎ　ｗｇ　　蛋白）〔発明の
効果〕 本発明のＤＮＡ断片は、植物細胞内等で良好なプロモー
ター活性を有するので、各種異種遺伝子を発現し得る発
現ベクターに有利に使用し得る。

本発明のベクターは、種々の有用なポリペプチドを宿主
内で効率よく発現させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 第２図は、ｐｒｘＣ２の５′非翻訳領域をＧＵＳ遺伝子
のｐＢｌｌｏｌへの組換えの方法を示す。 なお、図中において、Ｃ２はｐｒｘＣ２を、ＧＵＳはベ
ーターグルクロニナーゼを、ＮＰＴＩＩはネオマイシン
リン酸転移酵素の遺伝子を表わしている。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記に示す全部もしくは一部の塩基配列、または
   それらと均等な塩基配列を有し、プロモーター活性を有
   するＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】
2. （２）ＤＮＡ断片が西洋ワサビのペルオキシダーゼアイ
   ソザイムの遺伝子に由来する請求項（１）記載のＤＮＡ
   断片。
3. （３）植物または酵母において、プロモーター活性を有
   する請求項（１）または（２）記載のＤＮＡ断片。
4. （４）請求項（１）記載のＤＮＡ断片が挿入されたベク
   ター。
5. （５）異種遺伝子がプロモーターの転写制御下にある請
   求項（４）記載のベクター。
6. （６）異種遺伝子が生理活性を有するポリペプチドをコ
   ードする遺伝子である請求項（５）記載のベクター。
7. （７）異種遺伝子がベーターグルクロニナーゼ、ペルオ
   キダーゼ、アスコルビル酸オキシダーゼ、ルシフェラー
   ゼの少なくとも一種から選ばれる遺伝子である請求項（
   ５）記載のベクター。
8. （８）請求項（４）記載のベクターにより形質転換され
   た宿主。
9. （９）宿主が植物または酵母である請求項（８）記載の
   宿主。