JPH0412718B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物を用いる不飽和脂肪酸およびそ
の誘導体の製造法に関する。 〔従来の技術およびその問題点〕 不飽和脂肪酸およびその誘導体は、香料、薬
剤、塗料、界面活性剤、化粧品等として、またこ
れらの合成原料として広く使用されている。 従来、斯かる不飽和脂肪酸およびその誘導体
は、動物性または植物性の油脂を加水分解する方
法、あるいは、化学合成する方法が知られてい
る。 しかしながら、油脂を加水分解する方法は、炭
素鎖長の異なる多種多様のものが生成され、また
化学合成では多工程を要するとともに、シス体と
トランス体の立体異性体が混合状態で得られ、い
ずれの方法も分離が困難であるという欠点があつ
た。 一方、不飽和脂肪酸製造において微生物を利用
する方法としては、特公昭61−37096号のタムニ
デイム属菌を用いるγ−リノレン酸醗酵、特公昭
58−22199号のモルテイエラ属菌を用いるγ−リ
ノレン酸醗酵等の生産方法が知られているが、収
量が低く、反応時間も長く、また生産物である不
飽和脂肪酸が菌体内に蓄積されるため、その回収
が困難であるという欠点があつた。 脂肪酸誘導体を不飽和化する酵素とて、微生
物、動物、植物由来の酵素としてアシルCoA不
飽和化酵素（Acyl−CoA desaturase、E.
C.1.14.99.5）等が知られているが、酵素活性が低
く、かつ非常に不安定で、工業生産には適してい
ない。 また、本発明者らは、特開昭63−202392号にお
いてロドコツカス（Rhodococcus）属に属する
不飽和脂肪酸生産菌を利用して不飽和脂肪酸等を
製造する方法を報告したが、該方法を用いた場
合、生産量が未だ十分とはいえず、工業的生産性
を十分に満足するものとはいえなかつた。 〔問題点を解決するための手段〕 斯かる現状において、本発明者らは鋭意研究を
行つた結果、土壌から分離し、さらに参考例１に
示すような変異操作を行つて得られた微生物が脂
肪酸およびそ誘導体を不飽和脂肪酸およびその誘
導体に変換する能力を有すること、ならびに生産
された不飽和脂肪酸およびその誘導体は菌体外に
排出され、容易に回収できることを見出した。さ
らには、本菌株の菌体を用いた反応により不飽和
脂肪酸およびその誘導体を高収量で製造する方
法、すなわち、菌体と基質である脂肪酸またはそ
の誘導体より成る反応液に、Ｌ−グルタミン酸、
Ｌ−アスパラギン酸等のアミノ酸や、クエン酸、
グルコース酸等の炭水化物を加え、さらにチアミ
ンまたは硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等のマ
グネシウム塩若しくはマンガン塩を添加すること
により不飽和脂肪酸およびその誘導体の生産性を
大幅に向上させることを見出し本発明を完成し
た。 すなわち本発明は、ロドコツカス属に属する不
飽和脂肪酸生産菌の菌体を用い、炭水化物もしく
はアミノ酸存在下に、脂肪酸またはその誘導体を
該菌体に作用せしめ不飽和脂肪酸またはその誘導
体を製造するに際し、系内にチアミンまたは無機
金属塩を存在させることを特徴とする不飽和脂肪
酸およびその誘導体の製造法を提供するものであ
る。 本発明者らが見出した本発明で使用されるロド
コスカス属に属する不飽和脂肪酸生産菌は、参考
例１の方法で沖縄県の土壌より取得した菌株を変
異により育種した株であり、次の菌学的性質を有
する。 (A) 形態 桿菌で、細胞は多形性で、若い培養では桿菌
状、古い培養では球状となる。大きさは0.5〜
0.8μｍ×1.0〜5.0μｍである。 (B) 各培地における生育状態 シユークロース・硝酸塩寒天培地 生育は貧弱であり、コロニーの色は淡い肌
色で、滑らかでにぶい光沢がある。 グルコース・アスパラギン寒天培地 生育は貧弱であり、コロニーの色は淡い肌
色で、滑らかで光沢がある。 グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は乳白
色で、滑らかでにぶい光沢である。スムーズ
とラフなコロニーが見られる。 スターチ寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は乳白
色で、滑らかでにぶい光沢がある。 チロシン寒天培地 生育は旺盛で、コロニーの色は肌色で、滑
らかで光沢である。スライム状になるコロニ
ーが見られる。 栄養寒天培地 生育は旺盛で、コロニーの色は淡いオレン
ジ色で、滑らかで光沢がある。スムーズとラ
フなコロニーが見られる。 イースト・麦芽寒天培地 生育は旺盛で、コロニーの色はオレンジ色
で、しわ状で光沢がある。スライム状になる
コロニーが見られる。 オートミール寒天培地 生育は中程度であり、コロニーの色は淡い
オレンジ色で、にぶい光沢がある。 (C) 生理学的性質 生育範囲 温度：15〜37℃（最適25〜35℃） PH：５〜9.5（最適６〜８） ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地）陰性。 スターチの加水分解（スターチ寒天培地）
陰性。 脱脂牛乳凝固、ペプト化共に陰性。 メラニン様色素の生成（チロシン培地、ペ
プトン・イースト・鉄培地）陰性。 (D) 炭素源の資化性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ シユークロース ＋ イノシトール ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ (E) 化学分類学的性質 グルコリルテスト グリコリル型。 メナキノン システム MK−８（H₂）。 以上の菌学的性を有する微生物について、バー
ジーズ・マニユアル・オブ・システマテイツク・
バクテリオロジー（Bergey′s Manual of
Systematic Bacteriology）、第２巻（1986年）
に基づき検索した結果、ロドコツカス
（Rhodococcus）属に属する菌株と認められた
が、他のロドコツカス属菌と不飽和脂肪酸の生産
性の生産性が著しく異なるため、ロドコツカス・
エスピー・KSM−Ｂ−3M（Rhodococcus sp.
KSM−Ｂ−3M）と名し、通産省工業技術院微生
物工業技術研究所に微工業研条寄第1531号
（FERM BP−1531）として寄託してある。 本発明方法を実施する際の原料となりうる脂肪
酸およびその誘導体としては例えば次の一般式
（）で表されものが挙げらえる。 Ｒ−COCR₁ （） 〔式中Ｒは炭素数１〜22の直鎖もしくは分岐、飽
和もしくは不飽和の炭化水素基を表し、R₁は水
素原子、炭素数１〜10の直鎖もしくは分岐炭化水
素基あるいは芳香族炭化水素基、アルカリ金属ま
たは、 （R₂、R₃は水素原子、もしくは炭素数１〜５の
直鎖もしくは分岐炭化水素基を示す）で表す基を
表す〕 本発明においては、Ｒが炭素数14〜20の直鎖の
炭化水素基、R₁は炭素数２〜４の直鎖もしくは
分岐炭化水素基のものが好ましく用いられる。 そして本発明によれば、上記脂肪酸およびその
誘導体は、対応する不飽和脂肪酸およその誘導体
に変換される。具体例を示すならば、ｎ−ヘキサ
デカン酸、ｎ−テトラデカン酸等の脂肪酸のメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−
ブチル、イソブチル、ターシヤリイブチル等の各
エステルからは、それぞれ、ヘキサデセン酸、テ
トリデセン酸等の脂肪酸のメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチ
ル、ターシヤリイブチル等の各エステルが生産さ
れる。 本発明においては、該菌の菌体を取得するには
通常の微生物の培養方法によれば良く、培養に際
しては、用いる培地、PH、温度、培養時間等につ
いては、当該菌株が生育すれば、何れの条件でも
よい。好ましくは、30℃で１〜２日間、好気的に
培養する。 かくして得られた、培養液をそのまま、あるい
は遠心分離または濾過等により菌体を取得し以下
の反応に供する。 菌体を用いた反応液の調製、ならびに反応は以
下のごとく行う。 上記の培養液または集めた菌体を0.1〜90％、
好ましくは菌体乾燥重量として0.2〜0.5％を水あ
るいは緩衝液（PH６〜８）に懸濁し、反応させる
脂肪酸及びその誘導体を１〜70％、好ましくは10
〜30％、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸
等のアミノ酸または、ぶどう糖、コハク酸糖の炭
水化物を0.05〜10％、好ましくは0.5〜２％を含
有するものを基本反応液とし、さらに、チアミン
の塩酸塩等を0.001〜２％、好ましくはチアミン
含量として0.01〜0.3％、または硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン等のマグネシウム塩若しくはマ
ンガン塩を0.01〜２％、好ましくは硫酸マグネシ
ウムを0.01〜0.3％を加え本発明の反応液とし、
20〜37℃、好ましくは25〜30℃で、好気条件下で
反応を行う。この反応により反応液中に加えた脂
肪酸およびその誘導体に対応する不飽和脂肪酸お
よびその誘導体が生成する。 反応液中の、チアミン、または硫酸マグネシウ
ム等の添加は、不飽和脂肪酸及びその誘導体の生
産性を大幅に向上させるためであり、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等のアミノ酸との組
合せが好ましいが、他の炭水化物との組合せや、
それぞれ単独でアミノ酸や炭水化物と組合せて反
応してもよい。また、菌体を取得する時にこれら
を添加しておいてもよい。 チアミンはソルトフリー、塩酸塩、硫酸塩等の
いずれの状態でもよい。いずれの状態でもよい。
マグネシウム塩若しくはマンガン塩としては硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンが例示される。 また、アミノ酸、炭水化物、チアミン、無機金
属塩等を含む混合物として、天然物に由来するエ
キス類やアミノ酸混合物、例えば、肉エキス、酵
母エキス、カザミノ酸等も添加して用いることが
できる。 反応時間は、回分反応を行う場合、１〜３日程
度で良いが、原料となる脂肪酸およびその誘導
体、アミノ酸、ビタミン、金属塩等を補いながら
さらに延長することも可能である。 また、一度使用した菌体を遠心分離、濾過等に
より回収し、再反応することも可能である。 反応液中に生成した不飽和脂肪酸およびその誘
導体の同定、定量方法は、通常の天然物に含まれ
る有機化合物の同定、定量方法により行われる。
例えば、反応液の一定量より有機溶剤にて抽出を
行つた後、ガスクロマトグラフイー（GC）ある
いはガスクロマトグラフ・質量分析計（GC−
MS）等による分析を行うことにより、同定、定
量することができる。また、不飽和化合物の二重
結合の位置決定には、ジメチルジスルフイド処理
後、GC−MS分析を行うメチルチオエーテル化
法（芝原ら、油化学34巻619頁（1985年）他〕等
が利用できる。 反応液中に生成した不飽和脂肪酸およびその誘
導体は、通常の天然物からの有機化合物の抽出・
単離方法により、回収・分離できる。例えば、反
応液を遠心分離により菌体、油層、水層に分け油
層を分取したり、あるいは反応液をそのまま、も
しくは濾過等により菌体を除去した後、有機溶剤
で抽出することにより、極めて簡便に目的物を回
収できる。また、さらに精製する必要のある場合
は、通常のカラムクロマトグラフイー、分配抽出
などにより精製・単離が可能である。 〔発明の効果〕 本発明によれば、ロドコツカス族に属する不飽
和脂肪酸生産菌の菌体を使用して不飽和脂肪酸お
よびその誘導体を工業的に有利に製造することが
できる。 〔実施例〕 次に実施例を挙げて説明する。 実施例 １ グルコース2.5ｇ、ポリペプトン〔大五栄養(株)
製〕17ｇ、ポリペプトンＳ〔大五栄養(株)製〕３ｇ、
リン酸２水素１カリウム2.5ｇ、塩化ナトリウム
５ｇおよびイオン交換水１よりなる培地50mlを
入れた500ml容坂口フラスコにロドコツカス・エ
スピー・KSM−Ｂ−3M株を移植し、30℃にて１
日間振盪培養を行つた。後、この培養液１mlを同
じ組成の培地100mlを入れた500ml容坂口フラスコ
に移植し、30℃にて１日間振盪培養を行つた。こ
の培養液を5000×ｇで遠心分離を行い菌体２ｇを
得た。菌体１ｇを１％グルタミン酸モノナトリウ
ム、0.1％チアミン塩酸塩、0.1％硫酸マグネシウ
ムを含む0.25Mリン酸緩衝液（PH7.0）20mlに懸
濁し、パルミチン酸プロピル（Palmitic acid ｎ
−propyl ester、propyl hexadecanoate）４ml
を加え、500ml容坂口フスコ中で26℃で２日間振
盪し反応を行つた。 反応後、反応液に含まれる主生成物を酢酸エチ
ルで抽出し、ガスクロマトグラフイー（GC）、ガ
スクロマトグラフ・質量分析計（GC−MS）あ
るいはガスクロマトグラフ・赤外分析計（GC−
FT−IR）による分析（図１）を行い、主生成物
がシス−６−ヘキサデセン酸プロピル（propyl
cis−６−hexadecenoate）であることを確認し
た。なお、二重結合の位置決定はジメチルジスル
フイド誘導体化後、マススペクトルの解析により
行つた（図２）。主生成物のマススペクトルを図
３に示した。 反応後１mlを酢酸エチル３mlで抽出し、シス−
６−ヘキサデセン酸プロピルの量をガスクロマト
グラフイーにより測定したところ、15ｇ／・２
日間の生産性であつた。 実施例 ２ 実施例１のパルミチン酸プロピルの代わりに、
パルミチン酸メチル（methyl hexadecanoate）、
パルミチン酸エチル（ethyl hexadecanoate）、
パルミチン酸イソプロピル（iso−propyl
hexadeca−noate） パルミチン酸ブチル（iso
−butyl hexadecanoate）、パルミチン酸ブチル
（ｎ−butyl hexadecanoate）を用いた以外は実
施例１と同様の操作を行い、反応させた。 反応液中の不飽和脂肪酸エステルを実施例１と
同様の操作により同定・定量を行つたところ、下
記表−に示す如き結果を得た。

【表】 実施例 ３ 実施例１のパルミチン酸プロピルの代わりに、
パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸イソプロ
ピル、ミリスチン酸エチルを用いた以外は実施例
１と同様の操作を行い、反応させた。 反応液中の不飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸エ
ステルを実施例１と同様の操作により同定・定量
行つたところ、下記表−２に示す如き結果を得
た。

【表】 比較例 １ グルコース2.5ｇ、ポリペプトン17ｇ、ポリペ
プトンS3ｇ、リン酸２水素１カリウム2.5ｇ、塩
化ナトリウム５ｇおよびイオン交換水１よりな
る培地50mlを入れた500ml容坂口フラスコにロド
コスカス・エスピー・KSM−Ｂ−3M株を移植
し、30℃にて１日間振盪培養を行つた。後、この
培養液１mlを同じ組成の培地100mlを入れた500ml
容坂口フラスコに移植し、30℃にて１日間振盪培
養を行つた。この培養液を5000×ｇで遠心分離を
行い菌体２ｇを得た。菌体１ｇを1.0％グルコー
スを含む0.25Mリン酸緩衝液（PH7.0）20mlに懸
濁し、パルミチン酸イソプロピル４mlを加え、
500ml容坂口フスコ中で26℃で２日間振盪し反応
を行つた。 反応液１mlを酢酸エチル３mlで抽出し、ヘキサ
デセン酸イソプロピルを実施例１と同様の操作に
より、同定・定量を行つたところ、4.0ｇ／・
２日間の生産性であつた。 比較例 ２ 比較例１の1.0％グルコースを含む0.25Mリン
酸緩衝液の代わりに1.0％Ｌ−グルタミン酸モノ
ナトリウムを含む0.25Mリン酸緩衝液を用いた以
外は比較例１と同様の方法で反応させた。 反応液中のヘキサデセン酸イソプロピルの量を
実施例１と同様の操作により、同定・定量を行つ
たところ、5.2ｇ／・２日間の生産性であつた。 実施例 ４ 比較例１の1.0％グルコースを含む0.25Mリン
酸緩衝液の代わりに 1.0％グルコース、0.1％チアミン塩酸塩を含
む0.25Mリン酸緩衝液、 1.0％Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム、0.1
％硫酸マグネシウムを含む0.25Mリン酸緩衝液 1.0％Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム、0.1
％チアミン塩酸塩を含む0.25Mリン酸緩衝液、 1.0％Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム、0.1
％チアミン塩酸塩、0.1硫酸マグネシウムを含
む0.25Mリン酸緩衝液、 1.0％Ｌ−アスパラギン酸モノナトリウム、
0.1％チアミン塩酸塩、0.1％硫酸マグネシウム
を含む0.25Mリン酸緩衝液、 1.0％グリシン、0.1％チアミン塩酸塩を含む
0.25Mリン酸緩衝液、 1.0％Ｌ−チロシン、0.1％チアミン塩酸塩、
0.1％硫酸マグネシウムを含む0.25Mリン酸緩
衝液、 1.0％Ｌ−スレオニン、0.1％チアミン塩酸
塩、0.1％硫酸マグネシウムを含む0.25Mリン
酸緩衝液、 1.0L−プロリン、0.1％チアミン塩酸塩、0.1
％硫酸マグネシウムを含む0.25Mリン酸緩衝
液、 1.0％Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム、0.1
％硫酸マンガンを含む0.25Mリン酸緩衝液をそ
れぞれ用いた以外は比較例１と同様の方法で反
応させた。 反応液中の不飽和脂肪酸エステルを実施例１と
同様の操作により同定・定量を行つたところ、下
記表−３に示す如き結果を得た。

【表】 参考例 １ 採取した沖縄県の土壌サンプル約0.5ｇを滅菌
水10mlに懸濁し、充分撹拌後、この懸濁液0.2ml
を下記組成の液体培地（）10ml（試験管φ25×
200mm）に接種し、30℃で４日間振盪培養を行つ
た。 液体培地（）： ｎ−ヘキサデカン 100ｇ （NH₄）₂SO₄ 20ｇ KH₂PO₄ 20ｇ 酵母エキス ２ｇ MgSO₄・7H₂O 0.5ｇ FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ MnSO₄・４〜6H₂O 0.008ｇ イオン交換水 １ PH ７ 上記培養により増殖を示した培養液を滅菌水に
より適度に希釈した後、普通寒天培地（栄研化学
製）に移植して30℃にて２日間培養し、生じた複
数のコロニーが相互間に相違しないことを肉眼的
およに顕微鏡的に確認できるまで、普通寒天培地
への移植を繰り返した。 本分離菌株を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸
濁し、紫外線を90秒間照射した。そのあと取得し
たコロニーをグルコース2.5ｇ、ポリペプトン17
ｇ、ポリペプトンS3ｇ、リン酸２水素１カリウ
ム2.5ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよびイオン交換
水１よりなる培地50mlを入れた500ml容坂口フ
ラスコに移植し、30℃にて１日間振盪培養を行つ
た。この培養液から遠心分離により得た菌体を
0.5％グルコースを含む0.25Mリン酸緩衝液（PH
7.0）19mlに懸濁し、ヘキサデカン１mlを加え、
500ml容坂口フラスコ中で30℃にて３日間振盪し
た。振盪後、反応液に含まれる主生成物を抽出
し、ガスクロマトグラフイー（GC）等による分
析を行い、ヘキサデセンを生産する菌株について
取得した。 このヘキサデセンを生産する菌株を滅菌水によ
り適度に希釈した後、普通寒天培地に移植して30
℃にて２日間培養し、生じた複数のコロニーが相
互間に相違しないことを肉眼的および顕微鏡的に
確認できるまで、普通寒天培地への移植を繰り返
した。 その後、普通寒天培地に生育してきたコロニー
のうち、10個のコロニーをそれぞれ、下記組成の
傾斜寒天培地（）に接種し、30℃にて３日間培
養し、10本の斜面寒天培地上の菌株が肉眼的およ
び顕微鏡的に同一菌株であること、およびこれら
10菌株の各培地上での性状および生理学的性質が
同一であることを確認した。 斜面寒天培地（）： ｎ−ヘキサデカン 20ｇ （NH₄）₂SO₄ 20ｇ KH₂PO₄ ２ｇ 酵母エキス ２ｇ MgSO₄・7H₂O 0.5ｇ FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ MnSO₄・４〜6H₂O 0.008ｇ ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウリン
酸 0.05ｇ エステル（平均付加EO数20モル）寒天 20ｇ イオン交換水 １ PH ７ 次いで、上記操作により得られた菌株につい
て、斜面寒天培地から一白金耳を、滅菌した10％
グリセリン水溶液（２ml）の入つた凍結保存用の
バイアルに懸濁し−80℃にて凍結保存した。 斯くして３ケ月保存後、迅速に解凍して得られ
る懸濁液の一白金耳を寒天培地で蘇生後、前記と
同条件下に各培地上での性状および生理学性質を
調べた結果、変化がないことを確認した。 また。上記凍結および解凍を１ケ月毎に５回繰
返した菌株を就いても、同様に各培地上での性状
および生理学的性質を調べたが、変化は認められ
なかつた。 なお、本菌株の各培地上での性状および生理学
的性質は前述したとおりである。

【図面の簡単な説明】

図１に本発明により製造したヘキサデセン酸プ
ロピルのGC−FT−IRによるスペクトルを示し
た。図２に本発明により製造したヘキサデセン酸
プロピルのビスメチルチオエーテル誘導体のマス
スペクトルを示した。図３に本発明により製造し
たヘキサデセン酸プロピルのマススペクトルを示
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ロドコツカス属に属する不飽和脂肪酸生産菌
   の菌体を用い、炭水化物もしくはアミノ酸存在下
   に、脂肪酸またはその誘導体を該菌体に作用せし
   め不飽和脂肪酸またはその誘導体を製造するに際
   し、系内にチアミンまたはマグネシウム塩若しく
   はマンガン塩を存在させることを特徴とする不飽
   和脂肪酸およびその誘導体の製造法。 ２ 不飽和脂肪酸生産菌がロドコツカス・エスピ
   ー・KSM−Ｂ−3M株である特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 ３ 炭水化物がグルコース、ソルビトール、アラ
   ビノース、キシロース、フラクトース、イノシト
   ール、ラムノース、マンニトール、酢酸、コハク
   酸、クエン酸である特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。 ４ アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラ
   ギン酸、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシ
   ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリンである特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ５ 脂肪酸またはその誘導体がｎ−ヘプタデカン
   酸、ｎ−ヘキサデカン酸、ｎ−ペンタデカン酸、
   ｎ−テトラデカン酸、またはそのメチル、エチ
   ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、
   イソブチル、ターシヤリイブチル、ｎ−ヘプチ
   ル、ｎ−ヘキシルの各エステルからなる群より選
   ばれたものである特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。