JPH04128239A - 安定化されたｆｇｆ蛋白質組成物およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、安定化された線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ　　ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ；本願
にあっては、ＦＧＦと略称する。）蛋白質、安定化され
たＦＧＦ蛋白質含有組成物およびＦＧＦ蛋白質を安定化
する方法に関する。 蔽來皇鼓簀 ＦＧＦは、当初ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞などの線維芽細
胞に対して強い増殖促進作用を示す因子として分離され
た［ゴスポクロウ゛イッツ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）　：　２４９巻、１２３頁（１９７４年）］。 現在では、ＦＧＦが、中胚葉由来のほとんどすべての細
胞に対して増殖促進作用を有することが知られている。 ＦＧＦは、その等電点に基づいて、塩基性ＦＧＦ（以下
、ｂＦＧＦと略称する。）および酸性ＦＧＦ（以下、ａ
Ｆ　Ｇ　Ｆと略称する。）の２つに大別される。これら
のＦＧＦは、血管内皮細胞に対して強い増殖促進作用や
プラスミノゲンアクチベーター誘導作用を有するため、
血管新生促進剤、創傷治療薬、抗血栓薬、抗動脈硬化剤
などの予防治療薬としての用途が期待されている。 従来から、ＦＧＦは動物由来の臓器、たとえばウシ脳下
垂体、から単一にまで精製されていたが、その供給量に
は限度があり、また異種動物由来であるために抗原性が
懸念されるなどの問題点を有していた。最近、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、クローン化されたヒトＦＧＦ遺伝子
を微生物や動物細胞で発現させることにより、ＦＧＦを
大量に生産する方法が開発された（フェンス・レターズ
（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　Ｌ　ｅｌｄｅｒｓ）、第２１３巻
、＋８９−１９４頁（１９８７年）；ヨーロッパ特許出
願公開第２３７．９６６号公報参照）。 また、ポリペプチド生成因子を安定化することについて
、ヒトの有糸分裂促進活性を有するポリペプチド成長因
子及び生物学的活性の低下に対して該成長因子を安定化
するために十分な量の水溶性多糖を含有することを特徴
とする水性医薬組成物が提案されたく特開昭６３−１５
２３２４　；ヨーロッパ特許出願公開第２６７．０１５
に対応）。 発明が解決しようとする課題 ＦＧＦ蛋白質は不安定なものが多く、水溶液中で急速に
失活するばかりでなく、凍結乾燥操作によっても容易に
その生物活性が低下する。さらに、点滴静注など長時間
かけてＦＧＦ蛋白質を投与する場合には、その間の力価
低下が避けられず大きな問題となっていた。 また、上述した水溶性多糖を含有する水性医薬組成物、
特にセルロース類中のアンヒドログルコース単位当り少
なくとも０．３５のエーテル置換度（Ｄ、Ｓ、）のセル
ロース誘導体を含有する水性医薬組成物の場合には、生
薬としてＦＧＦ蛋白質を用いると、固状の医薬組成物粉
体とすることが困難であり、単に混合・乾燥工程を経る
だけで力価が低下する。 課題を解決するための手段 上記の事情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねたとこ
ろ、意外にもＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキシプロ
ピルセルロースを配合することにより、ＦＧＦ蛋白質の
安定性が増大することを見い出した。 特に、上述のＦＧＦ蛋白質及び水溶性多糖を含有する水
性医薬組成物に比し、ＦＧＦ蛋白質の安定性をはるかに
向上させた固状組成物を得ることができることを見い出
した。 本発明者らは、これらに基づきさらに研究した結果、本
発明を完成した。 本発明は（１）ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキンプ
ロピルセルロースを配合した、安定化されたＦＧＦ蛋白
質組成物；　　（２）ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロ
キシプロピルセルロースヲ配合することを特徴とする安
定化されたＦＧＦ蛋白質組成物の製造法、および（３）
ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキンプロピルセルロー
スを配合スることを特徴とするＦＧＦ蛋白質の安定化方
法である。 本発明で用いられるＦＧＦ蛋白質としては、塩基性ＦＧ
Ｆ　（以下、ｂＦＧＦと略称することもある。）でもよ
く、酸性ＦＧＦ　（以下、ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆと略称するこ
ともある。）でもよい。 該ＦＧＦとしては、哺乳動物由来のものが挙げられる。 該哺乳動物としては、ヒト、サル、ブタ。 ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。 また、該ＦＧＦとして、脳や下垂体などの既にその存在
が明らかにされている各種臓器から抽出されるものが挙
げられる。 また、該Ｆ　Ｇ　Ｆとしては、組換えＤＮＡ技術により
得られるものが挙げられる（フエブス・レターズ、第２
１３巻、１８９−１９４頁（１９８７年）ヨーロッパ特
許出願公開第２３７，９６６号公報）。 本明細書においては、リコンビナントヒト塩基性ＦＧＦ
をｒｒｈｂＦＧＦＪと略称することもある。 本発明で用いられるＦＧＦ蛋白質としては、さらに、Ｆ
ＧＦムティンが挙げられる。 該ＦＧＦのムティンとしては、たとえばバイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｌ！１ｉｃａｌ　　ａｎｄＢｉ
ｏｐｈｙｓｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ　）第１５１巻第７０１〜７０８頁（１
９８８年）、ヨーロッパ特許出願公開（以下、ＥＰと略
称すこともある。 ）第２８１，８２２Ａ２．日本特許出願平成１年第１５
６６２号明細書（ＥＰ−３２６，９０７Ａ１に対応）に
記載のムティン、日本特許出願平成２年第１０９０１４
号（平成２年４月２５日出願）明細書（ヨーロッパ特許
出願第９０１０７７３７０号明細書）に記載の少なくと
も１個の糖鎖結合部位を導入したＦＧＦムティンか挙げ
られる。 該ＦＧＦムティンとしては、本来光のペプチドあるいは
蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであり、ＦＧＦの
性質（すなわち、血管新生作用細胞増殖促進作用および
細胞分化促進作用のうちの少なくとも一つを有している
。）を有しているものであればよい。したがって該変異
としては、アミノ酸の付加、構成アミノ酸の欠損、他の
アミノ酸への置換が挙げられる。さらに、糖鎖結合部位
を導入したＦＧＦムティンが挙げられる。 該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。 該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。 該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。 ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。 付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。 さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。 ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。 該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端側１０残基；Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐＧ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｓ　ｅｒ。 ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側１４残基：Ｍｅｔ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ。 ヒトｂＦＧＦのアミ／末端側４ １残基 ヒトｂＦＧＦのカルボキンル末端側６１残基・などか挙
げられる。 さらに、ムティンとして、ｂＦＧＦの元のペプチドある
いは蛋白質のカルボキシル末端側の７個〜４６個の構成
アミノ酸が欠損したものが挙げられる。 該欠損の好ましい例としては、 ｒ　ｈ　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの アミノ酸番号１０２以降のアミノ酸配列〃　　１０５　
　　　ｌ／ 〃　　ｌ１５　　　　ｌｌ ”１１９　　　　　　　〃 〃１２４ツノ 〃　　　ｌ　３０　　　　　　〃 〃　　　１３８　　　　　　／ｌ が欠損したものが挙げられる。 ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数としては、
ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。 置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。 システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。 置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、インロ
インン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリンスレオニン、メチオニンなどが挙
げられる。特に、セリン、スレオニンが好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、銖水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸かアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。 スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。 置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。 スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン。 グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。 置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。 置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。 置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。 置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。 上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。 該ムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つまたは
３つが組み合わさったものでもよい。 該ムティンとしては、少なくとも１個のヒト塩基性ＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムティ
ンが好ましい。　特にヒトｂＦＧＦの７０位および８８
位のｃｙｓがそれぞれＳｅｔに置換されたｒｈｂＦ　Ｇ
　ＦムティンＣ５２３が好ましい。 糖鎖結合部位を導入したＦＧＦムティンとしては、少な
くとも１個の糖鎖結合部位を導入したものが挙げられる
。さらに、これに糖鎖の結合したムティンが挙げられる
。 該糖鎖結合部位としては、それを構成するアミノ酸配列
が式Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアミノ酸残基を、Ｙは
Ｔ　ｈｒ、　　Ｓ　ｅｒまたはＣｙｓをそれぞれ小す。 ）で表わされる配列か挙げられる。 上記式におけるＸとしては、Ｐｒｏ以外のアミノ酸か好
ましく、さらにはＧ　ｌｙ、　Ｔ　ｙｒ、　Ａ　ｒｇ、
　　Ｓ　ｅｒＬ　ｙｓ、　　Ｖ　ａｌまたはＡｌａか好
ましい。さらに、Ｘとしては、Ｇｌｙ、　　Ｌｙｓ、　
　Ｖａｌ、　　Ａｌａが好ましい。 上記式におけるＹとしては、ＴｈｒまたはＳｅｔか好ま
しい。 上記糖鎖付加型ｂＦＧＦに付加する糖鎖の種類は、一般
に知られている糖タンパクに見い出される糖ならば何で
もよく、特に種類を問わない。例えば、Ｎ−アセチルグ
リコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース
、ガラクトース、フコース、／アル酸なとをあげること
が出来る。 また、糖鎖の長さは、１種以上の糖が付加しておればよ
い。好ましくは、１０〜２０の糖鎖をもつｂＦＧＦが挙
げられる。 該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ａｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及
びジエイ・ビー・レフ、り（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、
　）、ジエ不テイノク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　、アノＪデミ、ク
ブレス社（１９８３年）第３１−５０頁、に示されてい
る。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・
スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍ、）及びニス・牛ラム（Ｇｉ
ｌｌａｍ、　Ｓ、）、ジエネテイ・ツク・エンジニアリ
ング・原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３
巻　１−３２頁に示されている。 該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 （ａ）ＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮ
Ａを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形
成させる（この１本鎖で代替えすべきシスティン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリプレットを包含する領域に対して上記プライ
マーは相補的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ）
ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、突然
変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形
成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。 このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。 本発明において用いられる水不溶性のヒドロキンフロビ
ルセルロースとしては、低置換度ヒドロキンフロビルセ
ルロースが挙げられ、これはセルロース（Ｄ低置ＰＡＲ
ヒドロキシプロピルエーテルである。 低置換度ヒドロキシプロピルセルロースは、１０５℃で
１時間乾燥したものを定量するとき、ヒドロキシプロピ
ルシル基５．０〜１６．０％を含む（日本薬局方第十−
改正Ｄ−７７３〜Ｄ−７８０および米国薬局方第２１改
正　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ第５１８０〜５１８１頁参照
）。 該低ｆｆｆ　Ｊｌ　度ヒドロ牛ジプロピルセルロースの
例としては、たとえば低置換度ヒドロキシプロピルセル
ロース（ＬＨ−１ｔ、　　ＬＨ−２０，Ｌ！−１−２１
，ＬＨ−２２，ＬＨ−３１；信越化学工業（株）製）な
どが挙げられる。 本発明におけるＦＧＦ蛋白質と水不溶性のヒドロキンフ
ロビルセルロースとのｆｆ１ｆｆｔ比は、約１対０．０
１−１００万が好ましく、さらに約ｌ対ｌ〜１０万が好
ましい。該比としては、さらに約１対５００〜２万、特
に１対５００〜１万が好ましい。 さらに、本発明の組成物は、さらに糖類、蛋白質類、ア
ミノ酸類、塩化ナトリウムおよびアラビアゴムの１種ま
たは２種以上を含有したものでもよい。 該糖類としては、たとえば、／ニークロース。 トレハロース、　麦芽糖、　果Ｌ　　イノシトール、ア
ミロースなどが挙げられる。蛋白質類としては、たとえ
ばカゼイン、アルブミン、ゼラチン、卵白などが挙げら
れる。アミノ酸類としては、たとえばシスティン、フェ
ニールアラニン、ロイシン。 グリシン等が挙げられる。本発明におけるＦＧＦ蛋白質
と糖類、蛋白質類、アミノ酸類、塩化ナトリウムまたは
（および）アラビアゴムとの重量比は約１対０．Ｏ１〜
１００万が好ましく、さらに約１対１〜１０万が好まし
い。該比としては、さらに約ｌ対５００〜２万、特に１
対５００〜１万が好ましい。 本発明の組成物は、ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキ
シプロピルセルロースを配合することにより製造される
。本発明の組成物は、たとえば粉末状の水不溶性のヒド
ロキシプロピルセルロースに、ＦＧＦ蛋白質の水溶液を
添加し、混合することにより製造される。該ＦＧＦ蛋白
質の水溶液のｐｔｉを約３〜１０に、さらに好ましくは
約５〜９に調整するのが好ましい。 該添加、混合は、たとえば約１０〜３０℃、さらに好ま
しくは約１０〜２０℃で行なう。 混合は、通常、撹拌造粒に用いられる装置［例えば乳鉢
、ポニーミキサー（線用鉄工所ｖ）、バーチカルグラニ
ユレータ−（富士産業製）、スーパーミキサー（軸周鉄
工所製）などコ、流動造粒［例えば、グラ、ト（大河原
製作所製）など］。 転勤造粒［例えば、ＣＦ（フロイント社製）なと］に用
いられる装置で充分に混合する。 このようにして混合された組成物は、たとえば室温（約
１０〜３０℃）減圧下（約Ｉ　Ｑ　５５１１ｇ以下）乾
燥、もしくは凍結乾燥することにより、生物活性が安定
化された固状組成物とすることができる。 糖類、蛋白質類、アミノ酸類、塩化ナトリウムまたは（
および）アラビアゴムは、水不溶性ヒドロキシプロピル
セルロースとＦＧＦ蛋白質とを混合する際に、同時に添
加または水不溶性ヒドロキシプロピルセルロースと糖類
、蛋白質類、アミノ酸類、塩化ナトリウムまたは（およ
び）アラビアゴムを混合したものにＦＧＦ蛋白質を添加
して、混合することにより製造される。この製造方法は
、前記した水不溶性のヒドロキシプロピルセルロースと
ＦＧＦ蛋白質とを配合した組成物の製造方法と同様にし
て行なわれる。 なお、上記の混合の際に用いられるＦＧＦＩ白質の水溶
液は、硫酸化グルカンにより安定化されたものを用いて
もよい。 該硫酸化グルカンとしては、たとえばデキストラン硫酸
、シクロデキストリン硫酸およびβ−１゜３−グルカン
硫酸などが挙げられる。これらは、いずれもＤ−グルコ
ース重合体の硫酸エステル誘導体である。該硫黄酸化グ
ルカンとしては、硫黄含量が約３％（ｗ／ｗ）以上のも
のが好ましく、さらに硫黄含量が約１２〜２０％（ｖ／
ｗ）のものが好ましく、特に硫黄含量が約１６〜２０％
のものが好ましい。なかでも、デキストラン硫酸が好ま
しい。 該デキストラン硫酸としては、シュークロースからロイ
コノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ　　ａｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）などの微生物
の作用によって生成するデキストランの硫酸エステルが
挙げられる。デキストラン硫酸は、α（ｌ→６）結合を
主体とするデキストランの部分的硫酸エステルであり、
硫黄含量は通常約１２％（Ｗ／Ｗ）以上であり、好まし
くは約１６〜２０％（Ｗ／Ｗ）である。平均分子量は約
手〜４０００万の範囲にあり、好ましくは３，０００〜
５０万の範囲にあり、水に極めて溶は易い。デキストラ
ン硫酸は、既に知られている化合物であり、自体公知の
方法で製造される。 該シフロブキストリ硫酸におけるシクロデキストリンと
しては、デンプンからバチルス・マセランス　（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　）などの微生物の作用
によって生成するシクロデキストリンが挙げられる。シ
クロデキストリンは、Ｄ−グルコースがα（ｌ→４）結
合で環状構造を形成したもので、環を形成するＤ−グル
コースの分子の数によって、α体（６分子）、β体（７
分子）、７体く８分子）などがある。本発明においては
、これらのいずれでもよい。 シクロデキストリン硫酸は、これらシクロデキストリン
を硫酸エステル化したものであり、硫酸エステル化は既
に知られている方法に従って行なわれる。硫酸エステル
化方法としては、たとえば米国特許筒２，９２３，７０
４号公報、特開昭５０３６４２２号公報に記載の方法が
挙げられる。 ンクロデキストリン硫酸の硫黄含量は、通常約３％（Ｗ
／Ｗ）以上であり、好ましくは約１２〜２４％（Ｗ／Ｗ
）である。／クロデキストリン硫酸は、水に極めて溶は
易い性質を有する。 該ンクロデキストリン硫酸の硫酸エステル化の度合いは
硫黄含量として約１２％Ｕ／Ｗ）以上のものであればい
ずれでも良く、とりわけ約１６〜２１％（Ｗ／Ｗ）のも
のが有利である。また、硫酸エステル化度の異なるもの
の混合物をそのまま使っても良いし、精製して得られる
単一の硫酸エステル化度のものを用いてもよい。該精製
法としては、たとえば、β−シクロデキストリン硫酸エ
ステルアルカリ金属塩を含有する反応液を濃縮乾固し、
濃縮物を水に溶解しこの水溶液を親水性溶媒と混合して
目的物を析出させることにより行なうことができる。 該β−１，３−グルカン硫酸におけるβ−１，３グルカ
ンとしては、直鎖β−１，３−グルカンが挙げられ、こ
れはアルカリ土類金属もしくはアグロバクテリウム属に
属する微生物によって生産される。また、直鎖β−１，
３−グルカンの加水分解によって得られた同じく直鎖β
−１，３−グルカン構造を有している低重合体でもよい
。 カードラン（［加熱凝固性多糖類ＰＳＪとしても知られ
ており、和光純薬工業株式会社より販売されている）は
、アルカリ土類金属もしくはアグロバクテリウム属に属
する微生物菌株が生産する直鎖β−１，３−結合のみを
有する分岐を含まない水不溶性、加熱凝固性のグルカン
として知られている［特公昭４３−７，０００号、特公
昭４８−３２．６７３号、特公昭４８−３２，６７４号
各公報］。 カードランの生産菌であるアルカリゲネス・フェカリス
・バラエティ・ミクソゲネス （＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｒａｅｃａｌｉｓ　　ｖ
ａｒ、　ｓｙｘｏｇｅｎｅｓ　）ＮＴＫ−ｕＬアグロバ
クテリウム・ラジオバクター（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）株およびアグロバク
テリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
−ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｕ　−１９株はそれぞれＡ
ＴＣＣ２＋　６８０．−６４６６および−２１６７９と
してアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション・
カタログ・オブ・ストレインズ（ＡＴＣＣ・Ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ）Ｉ、第１５版、１９
８２年に記載されているリスト収載株である。 カードランの部分加水分解物の性状およびその製造法は
、既に特開昭５５−８３７９８号公報に詳細に記載され
ている。 すなわち、該直鎖β−１，３−グルカンは式：［式中、
ｎは４〜約１０００の整数を示す］で表わされる化合物
である。 また、上記β−１，３−グルカンとしては、平均重合度
（ＤＰ：　Ｄｅｇｒｅｅ　　ｏｒ　　Ｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ）約］　０００以下のものであればいずれ
でもよいが、とりわけその部分加水分解物である叶が６
〜約３００のものが良く、とりわけ１５〜約２００のも
のが有利である。 なお、式（１）におけるｎとＤＰは、Ｄｒ　−２＝　ｎ
の関係にある。 該直鎖β−１，３−グルカンの硫酸エステルは、これら
のβ−１，３−グルカンまたはその低重合体の中間の単
糖の３つの水酸基および両端の単糖の水酸基がスルホン
化されたものであり、その平の平均の置換度（ＤＳ：　
Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が各
単糖力たり０．５〜３のものが通常用いられ、好ましく
はＤＳが１〜２のものが有利に用いられる。 直鎖β−１，３−グルカンもしくはその低ｍ合体に硫酸
化剤たとえばクロルスルホン酸、無水硫酸などを作用さ
せるか、無水硫酸と有機塩基たとえばピリジン、ジメチ
ルホルムアミド、トリメチルアミン、ジメチルアニリン
等との複合体を反応させることによって硫酸化を行なう
ことができる。 ［ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ
、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅａ、）、２３９．２９８６
（１９６４年）］。 該β−１，３−グルカン硫酸エステルは、水に対する溶
解性が高（、低毒性である。 β−１，３−グルカン硫酸の硫黄含量は通常約５％（璽
／冒）以上、好ましくは約１０〜２４％（璽／璽）であ
り水に極めて溶は易い。 該硫酸グルカンは、温血動物に対する毒性が極めて低く
、本発明のＦＧＦもしくはそのムティンおよび硫酸化グ
ルカンからなる安定化された組成物を温血動物に経口的
にもしくは非経口的に投与する際に有利である。 該硫酸化グルカンは、遊離のものでも良（、また塩の形
のものでも良い。該塩としては、たとえば、ナトリウム
塩、カリウム塩、アンモニウム塩。 トリメチルアンモニウム塩などが挙げられる。 また、ＦＧＦもしくはそのムティンに水媒体中で接触さ
せる際に、硫酸化グルカンの遊離のものを加え、次に適
当量のアルカリまたは酸を加えて所望のｐｉ目こしても
よい。アルカリを加えることにより、硫酸化グルカンは
、水性媒体中で塩の形となっていてもよく、遊離のもの
と塩の形のものとが混在していてもよい。 Ｆ　Ｇ　Ｆもしくはそのムティンを硫酸化グルカンに水
性媒体中で接触させる際に、さらに二または三塩基性カ
ルボン酸の存在下に行なうと、ＦＧＦもしくはそのムテ
ィンがより安定化されるので有利である。 該二塩基性カルボン酸としては、たとえば酒石酸、マレ
イン酸、リンゴ酸、フマル酸なとが挙げられる。 該三塩基性カルボン酸としては、たとえばクエン酸、イ
ンクエン酸などが挙げられる。 上記カルボン酸は遊離のものでも良くまた塩の形のもの
でもよい。該塩としてはたとえばナトリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。 また、水性媒体にカルボン酸の遊離のものを加え、次い
で適当量のアルカリまたは酸を加えて所望のｐＨにして
もよい。アルカリを加えることにより、水媒体中で、カ
ルボン酸は、塩の形となっていてもよく、遊離のものと
塩の形のものが混在していてもよい。 ＦＧＦもしくはそのムティンを硫酸化グルカンに水性媒
体中で接触させる際に、硫酸化グルカンの使用量は、Ｆ
ＧＦもしくはそのムティン１モルに対し、硫酸化グルカ
ンが約０．１〜１００モル、さらに好ましくは約０．５
〜４モルの範囲で加えることが好ましい。 水性媒体中における硫酸化グルカンの濃度は、約０．０
００５〜５冒／Ｖ％が好ましく、さらに、約０．０１−
１冒／Ｖ％が好ましい。 水性媒体中におけるＦＧＦもしくはそのムティンの濃度
は、約０．０００５〜５１／ｖ％が好ましく、さらに約
０．Ｏ１〜ｌ璽／Ｖ％が好ましい。 該カルボン酸の使用量としては、水性媒体中の濃度が約
１ａＭ〜ＩＭが好ましく、さらに約１０−Ｍ〜５００　
ｍＭが好ましい。 水性媒体中で接触させるには、ＦＧＦもしくはそのムテ
ィン硫酸化グルカン、さらに場合によりカルボン酸を水
性媒体中で単に混合するだけで目的を達し得る。 該水性媒体としては、注射用水性媒体であればいかなる
ものでもよいが、とりわけ注射用蒸留水。 生理食塩水、ブドウ糖溶液を用いるのが好ましい。 該水性媒体としてはリン酸緩衝液、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタン−ＨＣＱ緩衝液などの緩衝液を用いる
こともできる。 混合する際の条件としては、ＦＧＦもしくはそのムティ
ン、硫酸化グルカン、さらに場合によりカルボン酸のそ
れぞれを水溶液として混合しても良く、また固体のまま
添加して水性媒体中で溶液と成しても良い。混合の際の
温度は約０〜４０℃。 ｐＨは約３〜１０の範囲にあることが好ましく、さらに
約５〜９の範囲にあることが好ましい。混合に要する時
間は通常約１〜３０分である。 このようにして、硫酸化グルカンにより安定化されたＦ
ＧＦ蛋白質の水溶液が得られる。 本発明の組成物は、上記したＦＧＦ蛋白質と水不溶性の
ヒドロキシプロピルセルロースとの組成物を、さらに腸
溶性ポリマーでコーティングしてもよい。 該腸溶性ポリマーの例としては、たとえばヒドロキンプ
ロピルメチルセルロースフタレート、カルホキ７メチル
エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート　
ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、
アクリル酸系ポリマー「例、メタアクリル酸アクリル酸
エチルコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ　Ｌ３０Ｄ−５５
，ＥｕｄｒａｇｉＬ　Ｌｌｏｏ−５５）、　　メタアク
リル酸アクリル酸メチルコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ
　Ｌ−１００）、　　メタアクリル酸メタアクリル酸メ
チルコポリ？　　（Ｅｕｄｒａｇｉｔ　５１００）、　
　ｏ−ム社製、西ドイツ］などが挙げられる。 コーティングには自体公知の方法が採用されるすなわち
、パンコーティング法、流動コーティング法、転勤コー
ティング法などにより、コーティング基剤を水あるいは
有機溶媒に分散あるいは溶解したものをスプレーして行
なう。コーティングされる組成物の温度が約２５〜７０
°Ｃ２好ましくは約２５〜５０°Ｃでコーティングされ
ることが望ましい。コーテイング量は組成物に対して腸
溶性ポリマーとして約２０〜３００％、好ましくは約５
０〜１００％コーティングするのがよい。 さらに、本発明の固状の組成物（粉体）と融点４０〜８
０℃の粒状ポリグリセリン脂肪酸エステルとを加熱・流
動させて造粒物を得ることもできる。該造粒物によると
、本発明の固状の組成物中の有効成分（ＦＧＦ蛋白質）
を安定に溶出および放出し、かつ有効成分を長期に亘り
安定化できる。 なお、ポリグリセリン脂肪酸エステルが混合物である場
合、明瞭な融点を示さず、特定の温度で軟化する場合が
あるが、本明細書において、「融点」とは、このような
混合物か示す軟化温度をも含む意味に用いる。 上記で用いられるポリグリセリン脂肪酸エステルは、ポ
リグリセリンと脂肪酸とのエステルである限り、モノエ
ステル、ジエステルまたはポリエステルのいずれであっ
てもよい。ポリグリセリン脂肪酸エステルは、硬化油な
どと異なり、結晶多形性を示さず、しかも、薬物などの
有効成分との相互作用が殆どないという特性を有する。 ポリグリセリンは、［１分子中にｎ個（環状）〜ｎ＋２
個（直鎖・分枝状）の水酸基と、ｎ−１個（直鎖・分枝
状）〜ｎ個（環状）のエーテル結合を有する多価アルコ
ール」　［“ポリグリセリンエステル”阪本薬品工業株
式会社ｉｉＱ集、発行（１９８６年５月２日）第１２頁
］であり、例えば下記式（式中、ｎｌｉ重合度を示し、
２以上の整数である）で表される化合物などが使用でき
る。ｎは、通常、２〜５０、好ましくは２〜２０、さら
に好ましくは２〜ＩＯである。なお、ポリグリセリンは
、直鎖状に限らず、分岐していてもよい。 このようなポリグリセリンの具体例としては、例えば、
ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペ
ンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン
、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン
、ペンタデカグリセリン、エイコサグリセリン、トリア
コンタグリセリンなどが挙げられる。これらのポリグリ
セリンの中で、例えば、テトラグリセリン、ヘキサグリ
セリン、デカグリセリンなどが繁用される。 また、脂肪酸には、例えば、炭素数８〜４０、好ましく
は１２〜２２の飽和または不飽和高級脂肪酸などが含ま
れる。このような脂肪酸としては、例えば、パルミチン
酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リルン酸
、ミリスチン酸、ラウリン酸、リシノール酸、カプリル
酸、カプリン酸、ベヘニン酸などが挙げられる。これら
の脂肪酸の中で、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、
ラウリン酸、リシノール酸などが好ましい。 ポリグリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、例え
ば、カプリル酸モノ（デカ）グリセリド、カプリル酸ジ
（トリ）グリセリド、カプリン酸ジ（トリ）グリセリド
、ラウリン酸モノ　（テトラ）グリセリド、ラウリン酸
モノ（ヘキサ）グリセリド、ラウリン酸モノ　（デカ）
グリセリド、オレイン酸モノ　（テトラ）グリセリド、
オレイン酸モノ（ヘキサ）グリセリド、オレイン酸モノ
・（デカ）グリセリド、オレイン酸ジ（トリ）グリセリ
ド、オレイン酸ジ（テトラ）グリセリド、オレイン酸セ
スキ（デカ）グリセリド、オレイン酸ペンタ（テトラ）
グリセリド、オレイン酸ペンタ（へ牛す）グリセリド、
オレイン酸デカ（デカ）グリセリド、リノール酸モノ（
ヘプタ）グリセリド、リノール酸ジ（トリ）グリセリド
、リノール酸ジ（テトラ）グリセリド、リシール酸ジ（
ヘキサ）グリセリド、ステアリン酸モノ（テトラ）グリ
セリド、ステアリン酸モノ（ヘキサ）グリセリド、ステ
アリン酸モノ（デカ）グリセリド、ステアリン酸トリ（
テトラ）グリセリド、ステアリン酸トリ（ヘキサ）グリ
セリド、ステアリン酸セスキ（ヘキサ）グリセリド、ス
テアリン酸ペンタ（テトラ）グリセリド、ステアリン酸
ペンタ（ヘキサ）グリセリド、ステアリン酸デカ（デカ
）グリセリド、ノずルミチン酸モノ　（テトラ）グリセ
リド、パルミチン酸モノ（ヘキサ）グリセリド、パルミ
チン酸モノ（デカ）グリセリド、パルミチン酸トリ（テ
トラ）グリセリド、パルミチン酸トリ（ヘキサ）グリセ
リド、パルミチン酸セスキ（ヘキサ）グリセ１７ド、パ
ルミチン酸ペンタ（テトラ）グリセＩＪ　ｌ；、ｔ＜ル
ミチン酸ペンタ（ヘキサ）グリセリド、ノ寸ルミチン酸
デカ（デカ）グリセリドなどが挙１ヂら４する。 好ましいポリグリセリン脂肪酸エステルは、例えば、ス
テアリン酸ペンタ（テトラ）り゛リセζノド（例えば、
版本薬品工業（株）製、商品名ＰＳ−３１０など）、ス
テアリン酸モノ（テトラ）グＩＪセリド（例えば、版本
薬品工業（株）製、商品名ＭＳ３１０など）、ステアリ
ン酸ペンタ（ヘキサ）グリセリド（例えば、版本薬品工
業（株）製、商品名Ｐ８　５００など）、ステアリン酸
セスキ（ヘキサ）グリセリド（例えば、版本薬品工業（
株）製、Ｑ品名５ｓ−５００など）、ステアリン酸モノ
（デカ）グリセリドなどである。 これらのポリグリセリン脂肪酸エステルは、１種または
２種以上の混合物として用いられる。 ポリグリセリン脂肪酸エステルの融点は４０〜８０℃、
好ましくは４０〜６０℃程度である。 ポリグリセリン脂肪酸エステルの分子量は、通常、２０
０〜５０００、好ましくは３００〜２０００である。Ｈ
Ｌ　Ｂ　（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−１ｙｐｏｐｈｉｌｅ
ｂａｌａｎｃｅ　；親水性親油性バランス）は１〜２２
、好ましくは１〜１５のものが用いられ、ＨＬＢを調整
することにより、粉体の有効成分の溶出性を制御できる
。ＨＬＢは、二種以上のポリグリセリン脂肪酸エステル
を混合して調整してもよい。 ポリグリセリン脂肪酸エステルは、脂質と共に使用する
ことも可能である。脂質としては、製剤などの用途に応
じて許容しうる水不溶性物質が使用される。好ましい脂
質の軟化点または融点は、４０〜１２０℃、特に４０〜
９０℃程度である。 脂質の具体例としては、例えば、ヒマシ油、綿実油、大
豆油、菜種油、牛脂などの油脂の硬化油：蜜ロウ、カル
ナバロウ、鯨ロウ、レシチン、パラフィン、マイクロク
リスタリンワックス；ステアリン酸、パルミチン酸など
の脂肪酸、またはナトリウム塩、カリウム塩などの脂肪
酸塩；ステアリルアルコール、セチルアルコールなどの
脂肪アルコール；グリセライドなどが挙げられる。これ
らの脂質の中で、例えば、硬化綿実油、硬化ヒマシ油、
硬化大豆油、カルナバロウ、マイクロクリスタリンワッ
クス、ステアリン酸、ステアリルアルコールなどが好ま
しい。 ポリグリセリン脂肪酸エステルに対する脂質の割合は、
通常、ポリグリセリン脂肪酸エステル１００重量部に対
して、脂質１００重量部以下であり、上記範囲内で適宜
選択できる。 該造粒物の製造においては、ポリグリセリン脂肪酸エス
テルに粉体（本発明の固状の組成物）を多量に付着乃至
包含させると共に、ポリグリセリン脂肪酸エステルの形
状および粒径に対応した造粒物を得るため、粒状、好ま
しくは球状のポリグリセリン脂肪酸エステルが使用され
る。球状のポリグリセリン脂肪酸エステルを用いる場合
には、流動造粒により多量の、例えば造粒物全体のうち
８０重量％程度の粉体（本発明の固状の組成物）を混入
でき、かつ表面が比較的平滑で、しかも粒度分布の狭い
球状の造粒物を得ることができる。 場合によっては、粉体は造粒物全体のうち８０重量％以
上、例えば８５重量％程度混入できる。 球状のポリグリセリン脂肪酸エステルは、例えば、噴霧
冷却、好ましくはスプレーチリングなとにより得ること
ができる。スプレーチリングは、表面か平滑なアルミニ
ウム製円盤などの回転ティスフを回転させ、回転中のテ
ィスフ上へ、溶融したポリグリセリン脂肪酸エステルを
滴下することにより行なうことかできる。回転ディスク
の大きさは、特に制限されないか、例えば、直径５〜１
００ｃｍ、好ましくは１０〜２０ｃｍ程度である。 また、回転ディスクの回転速度およびポリグリセリン脂
肪酸エステルの滴下速度は、所望する粉体の径などに応
じて決定できる。回転ディスクの回転速度は、通常、１
０〜６０００回転／分、好ましくは９００〜６０００回
転／分、さらに好ましくはＩ　０００〜３０００回転／
分程度である。ポリグリセリン脂肪酸エステルは、一定
流速下、例えば、２〜２００ｇ／分、好ましくは５〜１
ｏ。 ｇＺ分程度の速度で滴下することができる。 粒状ポリグリセリン脂肪酸エステルの粒径ハ、所望する
造粒物の粒径に応じて選択でき特に制限されないか、通
常、１０−１５０メソンユ、好ましくは２５〜１００メ
ツ／ユ程度である。 また、粉状の希釈剤を本発明の固状の組成物（粉体）と
共に用いてもよい。該希釈剤としては、例えば、乳糖、
コーンスターチ、アビセル（微結晶性セルロース、旭化
成工業（株）製）、粉糖、ステアリン酸マグネ／ウムな
どの賦形剤、澱粉、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム末
、メチルセルロース、カルボキンメチルセルロースナト
リウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム、Ｌ−ヒドロキノプロピルセルロースな
どの崩壊剤；着色剤；矯味剤；吸着剤防腐剤　湿潤剤；
帯電防止剤：崩壊延長剤なとか挙げられる。 前記ポリグリセリン脂肪酸エステルと粉体（本発明の固
状の組成物）との割合は、所望する造粒物の粒径および
薬物活性成分の含有量なとに応じて設定できるが、通常
、ポリグリセリン脂肪酸エステル１００ｆｆｉ量部に対
して、粉体１０−１０００重量部、好ましくは５０〜５
００重量部である。 加熱・流動による造粒は、慣用の流動層造粒法に従って
行なうことができる。この造粒法による加熱温度は、前
記ポリグリセリン脂肪酸エステルの融点近傍、好ましく
はポリグリセリン脂肪酸エステルの融点から、融点を５
°Ｃ下まわる温度範囲である。加熱温度が高過ぎる場合
には、粒状ポリグリセリン脂肪酸エステル同志が融着し
て合体し、粒度分布の広い造粒物となり易く、低い場合
には、粒状ポリグリセリン脂肪酸エステルにより粉体（
本発明の固状の組成物）を造粒するのが困難である。 造粒は、粒状ポリグリセリン脂肪酸エステルと粉体（本
発明の固状の組成物）とを浮遊させて流動層を形成する
と共に、所定の温度で加熱・流動させることにより行な
うことができる。流動層内で浮遊する粉体粒子の有無に
より、造粒が完了したか否かを確認できる。 このようにして得られた造粒物は、通常、細粒又は顆粒
状である。 なお、該造粒物を顕微鏡で観察すると、通常、ポリグリ
セリン脂肪酸エステルの形状に対応した形状であり、粉
体（本発明の固状の組成物）か、粒状のポリグリセリン
脂肪酸エステルに少なくとも部分的に埋没して、好まし
くは内包されて一体化しているようである。 このようにして製造された本発明の組成物は、固状のも
のである。 本発明の組成物は、該固状のものを含む医薬用組成物（
例、軟膏剤、坐剤）をも包含する。すなわち、軟膏剤の
場合は、軟膏基剤中に回状である本発明の組成物が分散
されており、坐削の場合は、坐剤基剤中に固状である本
発明の組成物が分散された医薬用組成物である。 本発明の安定化されたＦＧＦ蛋白質組成物はそのまま、
または他の薬理学的に許容されうる添加剤（例、担体、
賦形剤、希釈剤）とともに医薬組成物（例えば、錠剤、
カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟膏、坐剤）とし
て、温血動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター
、ウサギ、犬。 ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与する
ことができる。 これら製剤をｆＪ　造する際には、添加剤として、例え
ば賦形剤（例えば、乳糖、コーンスターチ。 軽質無水ケイ酸、微結晶セルロースなど）、結合剤（例
えば、α化デンプン、メチルセルロース。 カルホキンメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセル
ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドンなど）、崩壊剤（例えば、−カルホキジ
メチルセルロースカルシウム。 デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなど
）、界面活性剤［例えば、ツイーン８０（花王アトラス
社製）、プルロニックＦ６８（旭電化工業社製、ポリオ
キシエチレン・ポリオキシプロピレン共重合物）などコ
１抗酸化剤（例えば、Ｌ−システィン、亜硫酸ナトリウ
ム、アスコルビン酸ナトリウムなど）、滑沢剤（例えば
、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）を用いて、
自体公知の手段に従い、錠剤、カプセル剤、散剤。 顆粒剤、細粒剤などの経口投与に適した剤形にすること
かできる。 さらに、錠剤、顆粒剤、細粒剤に関しては、味のマスキ
ング、　Ｆ７溶性、＃！！溶性あるいは持続性の目的の
ため自体公知の方法でコーティングしてもよい。そのコ
ーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセ
ルロース　ヒドロキンプロピルセルロース、ボオキンエ
チレングリコール、ツイーン８０．プルロニックＦ６８
．　　ヒマ／油、セルロースアセテートフタレート　ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロ
キシメチルセルロースアセテートサクソネート。 アクリル酸系ポリマー（オイドラギットＬ１００ＳＳ、
Ｌ−１００，ローム社製、西ドイツ）。 カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルアセタ
ルジエチルアミノアセテート、ワックス類およびタルク
、酸化チタン、ベンガラ等の色素が用いられ、これら小
独あるいは２種以上を組み合せて一層あるいは二層以上
にコーティングしてもよい。 コーティングには、自体公知の方法が採用される。すな
わち、パンコーティング法、流動コーティング法、転勤
コーティング法などにより、コーティング基剤を水ある
いは有機溶媒に分散あるいは溶解したものをスプレーし
て行う。錠剤、顆粒剤、細粒剤が、約２５〜７０℃、好
ましくは約２５〜５０℃でコーティングされることが好
ましい。 また、軟膏、坐剤を、自体公知の手段に従い、次に示す
添加剤を用い製造することができる。 軟膏を製造する際に用いられる添加剤（基剤）としては
たとえば、ワセリン、ミツロウ、パラフィ７、　流ｅ／
ｆラフイン、コレステロール、ステアリルアルコール、
ラノリン、セチルアルコール、ポリエチレングリコール
等があげられる。 坐剤を製造する際に用いられる添加剤（基剤）としては
、たとえば、カカオ脂、水添植物油、モノグリセライド
、トリグリセライド、グリセロゼラチン、ポリエチレン
グリコールなどが挙げられる、 上記の方法により得られるＦＧＦ蛋白質組成物は線維芽
細胞の増殖を促進させる作用等を有し、安定性が高く、
毒性は低いので、火傷、創傷、術後組織などの治癒促進
剤、あるいは血管新生作用による血栓症や動脈硬化症な
との治療薬として用いることができる。また、細胞培養
を促進させるための試薬として用いることができる。 本発明の方法により得られたＦ　Ｇ　Ｆ　ｇｉ白質組成
物を上記した医薬として用いる場合には、たとえば上記
した温血動物に、投与ルート、症状などを考慮して、Ｆ
ＧＦ蛋白質の量として１日ｍ約１ｎｇないし１００μｓ
／ｋｇの中から適当ｍを選んで投与される。 後述の実施例において用いられたりコンビナンドヒト塩
基性ＦＧＦムティンＣ５２３（以下、ｒｈｂＦＧＦムテ
ィンｃｓ２３と略称することもある。）は、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ’１ｆ１５１＠第７０１〜７０８頁（１９
８８年）に記載の方法やＥＰ２８１．８２２Ａ２号公報
に記載の方法で製造される。後述の実施例で用いられた
ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３は、形質転換体エン
エリヒア・フリ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６２（ＩＦＯ１
４６１３、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４５）を用いて、Ｅ
Ｐ２８１．８２２Ａ２号公報の実施例１，２，７　２４
に記載の方法の方法で！２造、精製されたものである。 上述の形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９４　／　
ｐＴ　Ｂ２Ｏ２は、ＩＨ団法人発酵研究所（ＩＦＯ）お
よび通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ

【
＜１）に寄託されている。それらの受託番号および受託
日を次の表１に示す。なお、ＦＲＩへの寄託については
、当初国内寄託かなされＦＥＲＭＰ番号で示される受託
番号が付され、該寄託はブタペスト条約に基っ（寄託に
切換えられて、、ＦＥＲＭ　　ＢＰ番号で示される受託
番号が付され、同研究所（ＦＲＩ）に保管されている。 参考例１ 後述の実施例におけるＦＧＦ活性の測定は、次に示した
方法によって行なった。 １０％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地で２倍ずつ段階的に
希釈した試料をヌンク社製９６穴マイクロタイタープレ
ート（平底）に１穴あたり５０μρ添加したのち、アメ
リカンタイプ力ルチャーコレク／ヨンから購入した牛胎
児心臓内皮細胞（ＣＲＬ１３９５）を１穴あたり５０，
１）（２ｘ１０’個）ずつ播種し、３日間培養した。そ
の後、ＭＴＴ［：３−　（４，５−ジメチルチアゾリル
−２−イル）２．５−ジフェニルテトラゾリウムブロマ
イド］［Ｊｏｕｎａｌ　ｏｒ　Ｉａｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ、　ル銚］　５７頁（１９８６年）
］液（５ｌｌ１ｇ／滅ＰＢＳ、　　シグマ社）を各式の
２０μＱずつ加えた。 ４．５時間後１０％５ＤＳ−０，０１ＮＨＣＩ！を１０
０μｇ加え一晩培養器内で放置したのち、タイターチッ
クマルチスキャンを用いて５９０　＋ｖにおける吸光度
を測定した［炙出ら、　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｒＩｍ＊
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　；　　９３
巻、１５７頁（１９８６年）　コ　。 実施例１ ４５０μｇ／ｄの濃度のｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８
２３を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ
８，０）に平均分子量７５００のデキストラン硫酸す）
　ＩＪウム（生化学工業（株））を２１０μｇ／ｄとな
るように添加したしのｌｄを、低置換度ヒドロキノプロ
ピルセルロース（Ｌ−ＮＰＣ）（ＬＨ−２０（ヒドロキ
／プロボキ／ル基：１３０〜１６．０％）、信越化学工
業（株））５ｇに添加し、十分混合し、室温減圧（約２
０°Ｃ１約５＋ｎｍｎｍ１ｌで２０時間乾燥し、ｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣ３２３および＋−−ＨＰ　Ｃを含
む粉末組成物を得た。 対照として、上記の方法において、Ｌ　−ＨＰ　Ｃの代
わりに乳糖５ｇを用いて、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
３２３および乳糖を含む粉末組成物を製造した。 これらの残存活性を参考例１の方法で測定し、結果を表
２に示した。 表　　２ Ｌ−ＨＰＣ１２７ 実施例２ ５００ｔｔｇ／ａｌｌの濃度のｒｈｂＦ　Ｇ　３１”ム
ティンＣ８２３を含有する５ＱｍＭクエン酸ナトリウム
溶液（ｐＨ８，０）に平均分子量７５００のデ牛ストラ
ン硫酸ナトリウムを２３３μｇ／−となるように添加し
たものｌ左Ｊを、Ｌ−ＨＰＣ（ＬＨ−１１（ヒドロ牛シ
プロポキシル基：ＩＯ，０〜１３．０）、信越化学工業
（株））または乳糖５ｇにそれぞれ添加し、十分混合し
、凍結乾燥し、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ３２３およ
びＬ−ＨＰＣまたは乳糖を含む粉末組成物をそれぞれ得
た。これら残存活性を表３に示す。 表　　３ −ＨＰＣ 実施例３ 実施例１で得たｒｈｂＦ　ｃ　？ムティンＣ３２３およ
びＬ　−１−Ｉ　Ｐ　Ｃを含む粉末組成物を用いて下記
の製造法により顆粒を得た。すなわち、ノンバレル（２
０〜２８メツシーＬ）８５ｇをミニＣＦ装置（フロイン
ト社製）に入れ、ローター回転速度を４０Ｏｒｐｍとし
、ヒドロキシプロピルセルロース（ヒドロキシプロピル
／ル基：５３．４〜７７．５％）１％（ｗ　／　ｖ　）
溶液（５０ａｆ）を２．５ｍ／ｓｉｎで噴霧しながら下
記組成の散布剤を、５ｇ／ｓｉｎで散布コーティングし
、４０℃、１６時１ｔｆＪ真空乾燥後、丸部を用いて１
２から３２メツシユの球形ｔａ粒を得た。 ［散　剤］ 実施例１で得たｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３およ
びＬ　−ＨＰ　Ｃを含む 粉末組成物　　　　　　　　　　　２０ｇグラニーウ糖
　　　　　　　　　　２０ｇコーンスターチ　　　　　
　　　　　２０ｇこのようにして得られた顆ｆｉ　６０
　ｇをミニＣ装置（フロイント社製）に入れ、ローター
回転速度を４００ｒｐ■とじ、送風温度４０’Ｃ，品温
３５°Ｃにコントロールし、下記組成の腸溶性フィルム
液を５Ｍｌ／ｓｉｎで噴霧して腸溶性コーティングを行
ない腸溶性顆粒を得た。 ［腸溶性フィルム液］ ヒドロキシプロピルメチル セルロースフタレート　　　　２０ｇ ヒマシ油　　　　　　　　　　　　　　　２ｇタルク　
　　　　　　　　　　　　　　０．４ｇアセトン　　　
　　　　　　　　　　２００ｄ実施例４ １　ｍｇ／　Ｍ　（１）濃度（７）ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ　
ムｆインＣ３２３を含有する５０−Ｍクエン酸ナトリウ
ム溶液（ｐＨ７，０）２＃１１！をＬ−ＨＰＣ（ＬＨ−
２０，信越化学工業（株乃２ｇに添加し十分混合し室温
減圧（約２０℃、　　５ａａｆ（ｇ）　’ｔ’２０時間
乾燥し、粉末組成物を得た。この組成物の残存活性は１
００％であった。 実施例５ １　ｍｇ／　＃１１！　（１）濃度のｒｈｂＦＧＦムチ
イアＣ３２３を含有する５０ｇＭクエン酸ナトリウム溶
液（ｐＨ７，０）２Ｍｌを、１−ＨＰＣ（ＬＨ−２帆信
越化学工業（株））１．６ｇと糖類として粉糖（シュー
クロースを粉砕したもの）０．４ｇを混合したものに添
加し、更に十分混合し室温減圧（約２０℃、　　５ｍｓ
Ｈｇ）で２０時間乾燥し、粉末組成物を得た。この組成
物の製造直後、４０’Ｃ２力月後、４０°Ｃ６力月後の
残存活性を示す。 Ｌ　−ＨＰ　Ｃ十粉糖 製造直後　　　　　　　　９５％ ４０℃　２力月　　　　　８１％ ４０℃　６力月　　　　　　８１％ 実施例６ （１）　ステアリン酸ペンタ（テトラ）グリセライド（
版本薬品工業（株）製、商品名ＰＳ−３１０）５００ｇ
に、ステアリン酸モノ（テトラ）グリセライド（版本薬
品工業（株）製：ＭＳ−３１０）５００ｇを添加し、９
０°Ｃに加温、溶融し、１０００　ｒｐｍで回転してい
る直径１５ｃｍのアルミニウム装ディスクに２０ｇ／分
の速度で滴下することにより、３２メ、／ユの櫛を通過
し、かつ４２メツ／２の櫛を通過しない球形のポリグリ
セリン脂肪酸エステルを：Ａ製した。 上記で得た球形のポリグリセリン脂肪酸エステル１００
ｇ、実施例４で得られた粉末組成物５ｇおよびＬ−Ｈｐ
Ｃ（Ｌ）Ｉ−２０，信越化学工業（株）製）９５ｇを流
動造粒機（富士産業（株）製、ＦＤ−３５型）に投入し
、給気温度を５４°Ｃに設定して加熱流動させ、流動層
内で浮遊するＬ　−ＨＰＣ粒子かなくなったことを確認
してから、熱源を停止して冷却することにより、）￥ｉ
粉粒物得た。 （２＞１！己（１）で得たｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
３２３の造粒物１００ｇを流動造粒機（富士産業（株）
製、ＦＤ−３３型）に投入し、コーテイング液（ヒドロ
キシプロピルメチルセルロースフタレ−Ｈ（Ｐ−５５３
（信越化学工業（株）製）ｌｏｎｇをアセトン゛エタノ
ール（−１：Ｉ）の混液ＩＱに溶解したもの。）を２ｇ
／分の液通、給気温度４８°Ｃの条件でコーティングさ
れたｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３含有造粒組成物
を得た。 実施例７ Ｌ−ＨＰＣ（Ｌｌｌ−２０，信越化学工業（株））１．
６ｇと蛋白質類としてヒト血清アルブミン（１＋ＳＡ）
、　　カセインまたは精製セラチン０４ｇとを混合した
ものに、Ｉｔｎｇ／Ｊの濃度のｒｈｂＦＧＦムティ：／
Ｃ３２３を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（
ｐＨ７，０）２ｍｌを添加し、更に十分混合し、室温減
圧（約２０°Ｃ＋　　５ｍｍ）（ｇ）で２０時間乾燥し
、それぞれ粉末組成物を得た。 実施例８ Ｌ−ＲＰＣ（ＬＨ−２０，信越化学工業（株））］、６
ｇと塩化ナトリウム０，４ｇとを混合したものに、１ｍ
ｇ／ｈｆの濃度のｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ８２３を
含有する５０１１ＩＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７
，０）　２ｒｒ１１．を添加し、更に十分混合し、室温
減圧（約２０°Ｃ１Ｃ１５ＩＩＩＩＩＨで２０時間乾燥
し、粉末組成物を得た。 実施例９ Ｌ−ＨＰＣ（ＬＨ−２０，信越化学工業（株））１．６
ｇとアミノ酸類としてＬ−７ステイン０４ｇとを混合し
たものに、ｌ　ｍｇ／威の濃度のｒｈｂ　ＦＧ　Ｆムテ
ィンＣ３２３を含有する５０＋ｎＭクエン酸ナトリウム
溶液（ｐＨ７，０）２ｈ＆を添加し、更に十分混合し、
室温減圧（約２０°Ｃ，５＋＋１ｍＨｇ）で２０時間乾
燥し、粉末組成物を得た。 実施例１０ Ｌ−ＨＰＣ（ＬＨ−２０，信越化学工業（株））１．２
ｇとＬ−システィン０４ｇおよび塩化ナトリウム０．４
ｇとを混合したものに、ｌｌｌ１ｇ／！の濃度のｒｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＦムティンＣ３２３を含有する５０ｍＭクエン
酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，０）２ｈ、Ｉｌを添加し、
更に十分混合し、室温減圧（約２０°Ｃ５Ｃ５１ＩＩＩ
ＩＨで２０時間乾燥して、粉末ｉｎｎ成金得た。 実施例１１ Ｌ−ＮＰＣ（ＬＨ−２０，信越化学工業（株））１．２
ｇとし一システィン０．４ｇおよび粉糖０．４ｇとを混
合したものに、ｌ　ｍｇ／杼の濃度のｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ
ムティンｃｓ２３を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム溶ｉ＆　（ｐｔｌ　７．０）　２Ｊを添加し、更に十
分混合し、室温減圧（約２０　’Ｃ，５ｍ＋＋ｎＨｇ）
で２０時間乾燥し、粉末組成物を得た。 実施例ｌ２ Ｌ−ＨＩ）Ｃ（ＬＨ−２０，信越化学工業（株））１６
ｇとアラビアゴム０４ｇとを混合したものに、１ｍｇ／
−ノ濃度（１）　ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆ　ムチイアＣ３２３
を含有する５０＋ｎＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７
，０）２ｒｔｌｌを添加し、更に十分混合し、室温減圧
（約２０℃、　　５　ｍｍ１−１　ｇ）で２０時１７ｆ
ｌ乾燥し、粉末組成物を得た。 実験例１ ２００１１ｇ／ｄ、ノａ度ノｒｈｂＦＧＦムティンｃｓ
２３を含有する５０ＩＩＩＭクエン酸ナトリウム溶液（
ｐＨ８，０）に平均分子ｆｆｔ７５００のデキストラン
硫酸ナトリウムを９３２μｇ／−となるように添加した
もの】−を、Ｌ　−ＲＰ　Ｃ（Ｌト２０）またはヒドロ
キンプロピルセルロース（ヒドロキシブロボキンル基、
６１％月ｇにそれぞれ添加し、十分混合し、室温減圧（
約２０°Ｃ２約５　ｍｍＨｇ）で２０時間乾燥し、ｒｈ
ｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３および１、−　ＨＩ）　
Ｃｔ　ｔ：はヒドロキンプロピルセルロースを含む粉末
組成物を製造した。 これらの残存活性を表４に示す。 表　　４ 添　加　物　　　　　残ｊ７　Ｆ　Ｇ　Ｆ活性（％）Ｌ
−ＨＰＣ１００ 発明の効果 本発明のＦＧＦ蛋白質組成物は、安定化されているので
、医薬として有利に用いることができる。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）、ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキシプロピル
   セルロースを配合した、安定化されたＦＧＦ蛋白質組成
   物。
2. （２）、ＦＧＦ蛋白質がＦＧＦムテインである請求項１
   記載の組成物。
3. （３）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩基
   性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
   ムテインである請求項２記載の組成物。
4. （４）、さらに腸溶性ポリマーでコーティングした請求
   項１記載の組成物。
5. （５）、ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキシプロピル
   セルロースを配合することを特徴とする安定化されたＦ
   ＧＦ蛋白質組成物の製造法。
6. （６）、ＦＧＦ蛋白質がＦＧＦムテインである請求項５
   記載の製造法。
7. （７）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩基
   性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
   ムテインである請求項６記載の製造法。
8. （８）、さらに腸溶性ポリマーでコーティングした請求
   項５記載の製造法。
9. （９）、ＦＧＦ蛋白質に水不溶性のヒドロキシプロピル
   セルロースを配合することを特徴とするＦＧＦ蛋白質の
   安定化方法。
10. （１０）、ＦＧＦ蛋白質がＦＧＦムテインである請求項
    ９記載の安定化方法。
11. （１１）、ＦＧＦムテインが、少なくとも１個のヒト塩
    基性ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されてい
    るムテインである請求項１０記載の安定化方法。
12. （１２）、さらに腸溶性ポリマーでコーティングした請
    求項９記載の安定化方法。