JPH0413661B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は分析化学に関し、更に流体試料中の蛋
白質を分析する為の分析素子に関する。 近年、分析化学の分野において、溶液系で分析
反応を行なわしめる方法に対し、定量性、操作性
とも著しく向上した乾式多層分析素子の開発がな
されている。例えば、米国特許第3992158号記載
の如く、親水性コロイド物質の試薬層中に、あら
かじめ分析に必要な試薬を全て含有させた多孔性
展開層を積層したもの等である。 しかし、臨床化学の分野に用いられることを目
的とし、そのPH条件は比較的おだやかな中性、弱
アルカリ性及び弱酸性の領域で用いられる事が開
示されている。 ところが分析化学の分野においては、強アルカ
リ性下の如く、厳しい条件下で分析反応を行なわ
しめる有用な反応が種々知られている。 そして、例えば特開昭54−101398号には、高PH
条件下における液体分析用要素が提案されてい
る。上記特許は、実質的にナトリウムイオンを含
まないアルカリとアルカリ保護性ポリマーとの組
合わせにより、安定な層を構成するというもので
ある。しかしながら、これら要素に用いられるア
ルカリ保護性ポリマーも十分アルカリを保護する
事はできず長期間保存する場合には、空気中の水
分及び炭酸ガス等により劣化をきたし、分析にお
ける感度低下をまねくという欠点を有している。 また上記特許に開示されている分析要素では、
呈色濃度が低く、定量性を著しく損うという重大
なる欠点も有している。 本発明の目的は上記欠点を解消し、強アルカリ
性下における分析が可能な素子を提供することに
ある。 本発明者は、上記目的に沿つて鋭意研究を重ね
た結果、液体不浸透性光透過性の支持体と、該支
持体の一側に位置する流体試料中の成分と反応す
る少なくとも一種の試薬を含有する少なくとも一
層の試薬層と、該試薬層の該支持体とは反対側に
位置する少なくとも一層の多孔性展開層とから成
る多層分析素子において、該試薬層及び該多孔性
展開層の少なくともいずれか一層に、水溶性第二
銅塩、銅キレート化剤、そしてアルカリ金属の水
酸化物もしくはアルカリ金属又はアルカリ土類金
属の塩から選ばれる少なくとも二種以上のアルカ
リ性混合物を含有することを特徴とする蛋白質検
出用多層分析素子により上記目的を達成すること
ができた。尚本発明の実施態様として、水溶性第
二銅塩として硫酸銅、キレート化剤として酒石酸
またはその塩を用いることが好ましい。 以下、本発明の分析素子について更に詳細に説
明する。 本発明に係る試薬層は、流体試料中の成分と反
応する少なくとも一種の試薬を含有するバインダ
ーを少なくとも一層支持体に塗設して成る。尚該
バインダーを表面に担持する粉末濾紙或は叩解し
長さを整えられた繊維質、または高分子微小ビー
ズを塗設することによつて相互連絡空隙を有する
層としてもよい。 本発明に係る多孔性展開層は、バインダーを表
面に担持する前記試薬層に用いると同様な繊維質
または高分子微小ビーズを前記試薬層上に積層し
て少なくとも一層塗設して成る蛋白巨大分子の流
通する相互連絡空隙を有する層である。 本発明に係る第二銅塩、銅キレート化剤および
アルカリ性混合物は、単独にまたは混合して前記
試薬層、多孔性展開層に割当てて含有させられ
る。 本発明に係るアルカリ性混合物を含有しない他
の試薬層は親水性コロイド物質から成るものが好
ましい。 上記試薬層には、用いられる試薬の特性によ
り、写真業界で公知であるオイルプロテクト分散
法、直接分散法等の分散法及び溶解等により、試
薬を含有させる事が出来る。 本発明に係る第二銅塩としては、塩化銅、臭化
銅、酢酸銅、硫酸銅、硫酸銅等の水溶性の有機、
無機の第二銅塩が用いられるが、定量分析の信頼
性を保証する純度を保持しうる硫酸銅が好まし
い。 また銅キレート化剤としては、エチレンジアミ
ン或はニトリロ酢酸、くえん酸、酒石酸およびそ
の塩を用いることができるが、蛋白発色等の面か
ら酒石酸またはその塩が好ましい。 本発明に係るアルカリ金属の水酸化物としては
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチ
ウムであり、アルカリ金属またはアルカリ土類金
属の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウ
ム又はカルシウム、マグネシウム、バリウム、ベ
リリウムの炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、
ホウ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、沃化物、弗
化物等が挙げられる。 本発明における上記化合物を二種以上含有する
ということは、アルカリ金属水酸化物同志の組合
せの場合には、任意の割合でよいがいずれか一種
は少なくとも１％以上含有せしめる。アルカリ金
属水酸化物とアルカリ金属又はアルカリ土類金属
の塩と組合わせの場合には、アルカリ金属水酸物
の割合は99〜40％であり、好ましくは95〜50％で
ある。 該アルカリ性混合物は、バインダーに対して
種々の濃度で含有する事が可能であるが、100重
量倍以下、好ましくは70重量倍以下である。 本発明に係るアルカリ性混合物、水溶性第二銅
塩及び銅キレート化剤は、本発明の分析素子の試
薬層及び展開層の少なくともいずれか一層に単独
もしくは、同一層に混合して加えることも可能で
あり、例えばバインダーを含有する有機溶媒もし
くは、水溶液中に添加し、分散又は溶解せしめこ
れを所望の層として塗設する事が可能である。特
にアルカリ性混合物を試薬層に含有させる際は、
その目的及び効果に応じて他の試薬類と同層でも
別層でも可能である。 また蛋白質の如き巨大分子を収納する機能を有
している、特開昭58−70163号および同58−
123458号に記載の相互連絡空隙を有する試薬層に
適用することも可能である。 また多孔性展開層としては、例えば特公昭53−
21677号、特開昭55−164356号、同57−125847号、
同57−197466号、同58−90167号等に記載されて
いるものを使用することが可能であり、表面に開
口の稠密な高分子微小ビーズまたは繊維質が構成
される展開層を用いたものが好ましい。 本発明に用いられるバインダーとしては、有機
溶媒に可溶性の高分子物質、例えばポリスチレン
類、ポリアクリル酸エステル類、ポリメタクリル
酸エステル類、メチルセルロース、エチルセルロ
ース等のアルキルセルロース類、ポリビニルブチ
ラール、ポリビニルカーボネート等、または水溶
性高分子物質、例えばカルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース等の水溶性セル
ロース誘導体類、プルラン、カルボキシメチルプ
ルラン等のプルラン誘導体類、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミ
ド等の水溶性ビニルポリマー類等が挙げられる。
更に水溶性ポリアミド類等も用いる事が可能であ
り、上記水溶性単量体も種々の方法で用いる事が
可能である 例えば、アクリルアミド、メタアクリルアミド
等のビニル酸アミド類、Ｎ−ビニルピロリドン、
Ｎ−ビニルイミダゾール等のビニル異節環類等を
挙げる事が可能である。 上記バインダーは目的に応じて二種以上混合す
る事も可能であり、又その目的からはずれない限
り他のビニル化合物を共重合させる事も出来る。 又、本発明に付加的に用いられる添加剤として
例えば保恒剤、緩衝剤、界面活性剤等、種々の添
加剤も所望に応じて添加する事ができる。 特に界面活性剤は流体試料を本発明の素子に適
用した際の浸透速度の調節等有効に用いる事がで
きる。 使用可能な界面活性剤としては、イオン性（ア
ニオン性またはカチオン性）、非イオン性を問わ
ず界面活性剤を使用する事が可能であるが、好ま
しくは非イオン性界面活性剤が有効である。非イ
オン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−
ジ−ｔ−ブチルフエノキシポリエチレングリコー
ル、ｐ−オクチルフエノキシポリエチレングリコ
ール、ｐ−イソノニルフエノキシポリエチレング
リコール等のアルキル置換フエノールのポリアル
キレングリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアル
キレングリコールエステルなどが挙げられる。こ
れらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透速
度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグ
ラフイ現象」発生を抑制する効果を有する。 上記界面活性剤は広範に選択された量を用いる
ことが可能であるが、塗設液の重量に対して10重
量パーセント乃至0.005重量パーセント、好まし
くは６重量パーセント乃至0.05重量パーセント用
いることができる。 本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の
光透過性支持体（以下、本発明に係る支持体と略
す。）は液体不浸透性でかつ光透過性であればそ
の種類を問わないが、例えば酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、
またはポリスチレンのような種々の重合体材料が
この使用目的に適する。この場合の上記支持体の
厚さは任意であるが、好ましくは約50ミクロンか
ら250ミクロンである。また、本発明に係る支持
体の観察側の一側面は、その目的に応じて任意に
加工することは可能である。次に上記の支持体上
に本発明に係る前記試薬層を設ける場合、直接被
覆することもできるが、場合によつては光透過性
の下塗り層を使用して試薬層と支持体との間の接
着性を高めることは効果的である。 本発明の分析素子は種々の異なる配置のうち、
任意の一つをとることが可能である。更に本発明
の試薬層と各種の機能層、試薬含有層、及び部
材、例えば米国特許第3992158号記載の試薬層、
反射層、下塗り層、米国特許第4042335号記載の
放射線ブロツキング層、米国特許第4066403号記
載のバリヤー層、米国特許第4144306号のレジス
トレーシヨン層、米国特許第4166093号記載のマ
イグレーシヨン阻止層、米国特許第4127499号記
載のシンチレーシヨン層、特開昭55−90859号記
載の清掃層及び米国特許第4110179号記載の破壊
性ポツド状部材等を任意に組合わせて、本発明の
目的に合わせた分析素子を構成する事が可能であ
る。 上記の種々の層は、従来写真工業において公知
のスライドホツパー塗布法、押出し塗布法、浸漬
塗布法等を随時用いる事で任意の膜厚の層を塗布
する事が可能である。 本発明の分析素子を用いて検出可能な変化とし
て分析結果を得たのち、反射スペクトロフオトメ
トリー測定により測定される。このようにして得
られた測定値は、あらかじめ作製しておいた検量
線に当てはめる事で、未知被検物質の量を決定す
ることができる。 以上のように構成された本発明の分析素子は、
展開層から流体試料を供給した後、試薬層での分
析反応を透明支持体側から観察する事により目的
を達成できる。 本発明の分析素子に適用される流体試料の量は
任意に定めることができるが、好ましくは約50μ
から約5μであり、更に好ましくは約20μか
ら約5μである。通常約10μの流体試料を適用
するのが好ましい。 本発明の分析素子は、高アルカリ性下で蛋白質
を検出する為のビユーレツト反応を行うに適した
ものであり、その発色性、保存性及び定量性に優
れたものである。 以下に実施例をもつて更に具体的に説明するが
本発明はこれによつて限定されるものではない。 実施例 １ 透明な膜厚約180ミクロンの下塗り済ポリエチ
レンテレフタレート支持体上に、第１表に掲げた
組成の層を順次塗布して、本発明の多層分析素子
を作成した。

【表】 上記構成を有する多層分析素子を作成し、各々
を本発明の分析素子(1)〜(7)とした。 更に、比較としてアルカリ保護性ポリマーであ
るアガロース、硫酸銅及び酒石酸を含む試薬層と
微結晶性セルロース粒から成る展開層をポリエチ
レンテレフタレートフイルム支持体に塗設してな
る多層分析素子を作成し、比較多層分析素子とし
た。 上記の本発明の多層分析素子及び比較多層分析
素子を上記素子製造直後のもの及び25℃、55％
RHで60日間保存したものを用意し、牛血清アル
ブミンが２，５，７，10ｇ／dlの各水溶液を10μ
展開層上に滴下し、37℃７分間インキユベート
した後540nｍで支持体側から反射濃度を測定し
た。結果は下記第２表に示す。

【表】

【表】 上記第２表から明らかなように本発明の分析素
子は公知の比較分析素子に比べて良好な呈色濃度
を示し、また、長期間保存してもほとんど感度低
下を示さない良好な多層分析素子であることが判
る。 実施例 ２ 透明な膜厚約180ミクロンの下塗り済ポリエチ
レンテレフタレート支持体に、下記組成の層を順
次塗布して、本発明の多層分析素子を作成した。

【表】

【表】 上記構成を有する多層分析素子を作成し、各々
を本発明の分析素子(8)〜(10)とした。 実施例１と同様に、上記素子製造直後のもの及
び25℃、55％RHで60日間保存したものを用意
し、牛血清アルブミンが２，５，10ｇ／dlの各水
溶液を10μ展開層上に滴下し、37℃７分間イン
キユベートした後540nｍで支持体側から反射濃
度を測定した。結果は下記第４表に示す。

【表】 上記第４表の結果から明らかなように、本発明
の分析素子は、試薬層のバインダーとして疎水性
高分子物質のみ（試薬分散塗布）を用いても実施
例１に於て示した本発明の多層分析素子と同様に
良好な呈色濃度を示し、また長期間保存してもほ
どんど感度低下を示さない良好な多層分析素子で
あることが判る。 実施例 ３ 透明な膜厚約180ミクロンの下塗り済ポリエチ
レンテレフタレート支持体上に、下記組成の層を
順次塗布して、本発明の多層分析素子を作成し
た。

【表】

【表】 上記構成を有する多層分析素子を作成し、各々
を本発明の分析素子（11）〜（13）とした。 実施例１と同様に、上記素子製造直後のもの及
び25℃、55％RHで60日間保存したものを用意
し、牛血清アルブミンが２，５，10ｇ／dlの各水
溶液を10μ展開層上に滴下し37℃７分間インキ
ユベートした後、540nｍで支持体側から反射濃
度を測定した。結果は下記第６表に示す。

【表】 上記第６表の結果から明らかなように、本発明
の分析素子は、ポリビニルアルコール／スチレン
重合体粒子から成る相互連絡空隙を有する試薬層
を適用しても良好な呈色濃度を示し、また長期間
保存してもほとんど感度低下を示さない多層分析
素子であることが判る。 実施例 ４ 透明な膜厚約180ミクロンの下塗り済ポリエチ
レンテレフタレート支持体上に、第７表に掲げた
組成の層を順次塗布して、本発明の多層分析素子
を作成した。

【表】

【表】 上記構成を有する多層分析素子を作成し、各々
を本発明の分析素子（14）〜（16）とした。 更に、比較としてアルカリ保護性ポリマーであ
るアガロース、硫酸銅及び酒石酸を含む試薬層と
微結晶性セルロース粒から成る展開層をポリエチ
レンテレフタレートフイルム支持体に塗設してな
る多層分析素子を作成し、比較多層分析素子とし
た。 上記の本発明の多層分析素子及び比較多層分析
素子を上記素子製造直後のもの及び25℃、55％
RHで60日間保存したものを用意し、牛血清アル
ブミンが２，５，７，10ｇ／dlの各水溶液を10μ
展開層上に滴下し、37℃７分間インキユベート
した後、540nｍで支持体側から反射濃度を測定
した。結果は下記第８表に示す。 第８表の結果から明らかなように、本発明の多
層分析素子は長期間保存に耐えることが判る。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体不浸透性光透過性の支持体と、該支持体
   の一側に位置する流体試料中の成分と反応する少
   なくとも一種の試薬を含有する少なくとも一層の
   試薬層と、該試薬層の該支持体とは反対側に位置
   する少なくとも一層の多孔性展開層とから成る多
   層分析素子において、該試薬層及び該多孔性展開
   層の少なくともいずれか一層に、水溶性第二銅
   塩、銅キレート化剤、そしてアルカリ金属の水酸
   化物もしくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属
   の塩から選ばれる少なくとも二種以上のアルカリ
   性混合物を含有することを特徴とする蛋白質検出
   用多層分析素子。 ２ 上記水溶性第二銅塩が硫酸銅であり、そして
   上記銅キレート化剤が酒石酸またはその塩である
   特許請求の範囲第１項記載の蛋白質検出用多層分
   析素子。