JPH0413676A - 腫瘍壊死因子遊離抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は腫瘍壊死因子の遊離抑制剤に関する。

従来の技術とその課題 ＢＣＧやＣ，ｐａｒｖｕｍなどの菌体成分を前注射した
マウス、ウサギあるいはラットにエンドトキシンを注射
すると血中にサイトカインが出現し、これは分子量的１
７０００のペプチドであり、マウス皮下に移植された癌
を出血性壊死に陥らしめる作用を示すことから腫瘍壊死
因子（ｌｕｒｎｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｔ　
、以下ＩＴＮＦＪという）と呼ばれている（Ｃａｒｓｗ
ｅｌｌ、　Ｅ、＾、、ｅｔ、ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１
ｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　７２．３６６６−３６７０　（１
９７５））。

上記ＴＮＦは腹腔や肺胞のマクロファージ、脳の星状膠
細胞、肝臓のタッパ−細胞、末梢血単球など全身の単球
−マクロファージ系の細胞で産生され、産生を誘発する
刺激因子としては細菌のエンドトキシン、ウィルス、補
体のＣ１１、カビあるいは寄生虫の構成成分、糖化蛋白
、神経ペプチド、インターロイキン−１およびＴＮＦ自
身などが知られティる（Ｌｏｔｒ、Ｍ、、　　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　　２４１．１２１８−１２２１（１９８８）
）。

動物にＴＮＦを産生させる方法としては、プライミング
物質（ｐｒｉｍｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　）としてＢ、Ｃ，
Ｇ、、Ｐ、　　ａｃｎｅｓ、　０Ｋ−４３２などとエリ
サイティング物質（ｅｌｉｃｉｌｉＢ　ａｇｅｎｌ　）
としてＬ　Ｐ　Ｓ、　０Ｋ−４３２、レンチナンなどの
２種類の刺激剤が必要とされている。その際プライミン
グ物質はエリサイティング物質の約１０〜２週間前に投
与しておくのが好ましい。また、あらかじめプライミン
グ物質で処理した動物からマクロファージを取り出し、
エリサイティング物質を試験管の中で加えることによっ
てインビトロでもＴＮＦメツセンジャーＲＮＡの発現を
再現することができる。また、ある種の樹立細胞株では
プライミングを必要とせず、エリサイティング物質だけ
でＴＮＦの発現を刺激することが出来ることが知られて
いる。例えば、ＩＩ　Ｌ　−６０、Ｕ−９３７、Ｐｔｌ
−５−１，８、ＲＡＷ２６４　、Ｐ３８ｇ［ＩＤ　。

Ｊ７７４などのマクロファージの培養系を用いたインビ
トロの系ではＰＭＡ　（ｐｈｏｒｂｏｌｎ＋ｙｒｉｓｌ
ａ１ｃａｃｅｔａｔｅ　）やＬＰＳ単独の刺激でＴＮＦ
を産生ずることが知られている（Ｇｏｃｄｄｅｌ、Ｄ、
Ｖ、、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｓｙ
ｍｐｏｓａｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌ
ｏｇ７゜Ｌｌ、５９７−６０９　（１９８６））。

ＴＮＦの測定方法には細胞障害性を指標とした例えば、
Ｌ９２９細胞株、アクチノマイシンＤ処理し９２９細胞
株、アクチノマイシンＤ処理１１ＥＨＩ細胞株などを指
標とした生物学的測定法、モノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法
）、アイトソープ（１２５ｉ）を用いたラディオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ法）、イムノラディオメトリックアッ
セイ、エンザイム・イムノメトリックアッセイなどがあ
る。

一方、ＴＮＦの生物活性作用としては、抗腫瘍作用の他
に、リポ蛋白リパーゼ活性の抑制作用、内炎症作用、エ
ネルギー蓄積の抑制作用、組織の破壊と再構築、内皮細
胞障害作用、骨吸収促進作用、関節機能障害作用など多
くのものが知られている。

ＴＮＦは当初、腫瘍細胞株に対し細胞融解又は増殖抑制
を示し、正常細胞の増殖は抑制しないことから、癌の治
療薬として期待されていたが、１９８５年にビュートラ
−（Ｂｅｕｔｌｅｒ　）らによって、癌などの消耗性疾
患の患者においてみられる悪液質の誘発因子であるカケ
クチンと同一物質であることが証明された（Ｂｅｕｌｌ
ｅｒ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　　３１６゜５５２−５５４
　（１９８５））。

更にＴＮＦは臨床においても消耗性疾患患者や敗血性シ
ョック患者においてその血中濃度が測定され、２等患者
では血中ＴＮＦ値の上昇が認められることが報告された
。その他の疾患との関係でも、ＴＮＦはその病因に免疫
異常が想定されている炎症性腸疾患、ＳＬＥ、川崎病な
どで血中値が高値を示すこと、また慢性関節リウマチで
は関節液中のＴＮＦ濃度が上昇することなどが知られて
いる。

また臨床における癌患者の治療中に、ＴＮＦ投与により
発熱、全身倦怠感が認められ、高用量投与によれば血圧
低下などのショック状態も認められると報告されている
。更にＴＮＦはエンドトキシンや他のサイト力インと少
量であっても著しい作用を発揮することが報告されてい
る。更にエンドトキシンによるＴＮＦ産生は補体Ｃ５，
により相乗的に亢進することや逆に補体Ｃ５，が欠損し
ているとＴＮＦの作用が出現しないことも知られてぃる
。

之等のことは以下の各種文献に詳述されている。

Ｏ前出征洋、消化器と免疫、　２２，３０９−３１２　
（１９８９）○Ｍａｕｒｙ、　Ｃ，Ｐ、　Ｊ、、　＾ｒ
ｌｈｒｉｌｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、、　　３２．１４６−１
５０○Ｆｕｒｕｋａｗａ、　Ｓ、、　Ｃｌ１ｎ、　１ｍ
ｍｕｎｏｌ、　１ｍｍｕｎｏｐａｊｈｏｌ。

４８、２４７−２５１　（１９８９） ＱＨｕｓｂｙ、　Ｇ、　、　　Ｊ、Ａｕｔｏｏｍｍｕｎ
、　、　　１．　３６３−３７１　（１９８８）○Ｎｅ
１ｌｓｏｎ、Ｉ、Ｒ，，Ｓｕｒｇｅｒｙ、　１０６．４
３９　（１９８９）ＱＯｘａｋｉ、Ｙ、、　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈｒｍａｃｏｌ、、　　２
３○Ｒｏｌｈｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｌ、、　　Ｊ、　Ｅｅｐ
、　Ｍｅｄ、、　　１６８．　２００７（１９８８）。

以上のように過剰のＴＮＦは、ときとして生体内の少量
のサイト力イン等と相互作用を示し、エンドトキシン様
症状を発症させることが危惧される。故に、血中ＴＮＦ
濃度が過剰に高値をとることを抑制し、あるいはＴＮＦ
が生体活性物質と互いに作用しあって起こすとされてい
るショック様症状を改善したり、癌の悪液質を改善する
作用を有する薬剤の開発が当業界で望まれている。

しかして、上記ＴＮＦの抑制には、従来よりグルココル
チコイド、プロスタグランデインＥ２．０□スカベンジ
ヤー、ホスホリパーゼＡ２、シクロオキシゲナーゼ、リ
ポキシゲナーゼなどが有効であるとされ、２等薬物につ
き臨床上の副作用の軽減作用や動物実験による毒性試験
結果が報告され、またＴＮＦの作用経路にはアラキドン
酸系の活性化が関与していると報告されている（Ｂｅｕ
ｔｌｅｒ、Ｂ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３２．９
７０　（１９８６）Ｓａｌｏｍｉ、Ｎ、、　　Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｅｄ、、　７．５４（１
９８ｇ）など参照）。

しかるに、上記シクロオキシゲナーゼ等のアラキドン酸
誘導体の合成阻害剤は、長期使用にあたって副作用、例
えば食欲不振、消化性潰瘍などの消化器系の副作用や、
肝、腎、血液等の障害作用が知られており、グルココル
チコイドも血管透過性亢進、易感染性、糖尿病、消化性
潰瘍などを伴い易く、更にはＴＮＦの抗腫瘍作用をも減
弱させるとされており、２等公知の薬物はいずれも尚Ｔ
ＮＦの抑制剤としての医薬品分野での利用には難点があ
り、之等に変わる新しい作用機序によるＴＮＦの抑制剤
であって、より安全性の高い薬剤の研究開発が望まれて
いる（Ｍａｒｑｕｅｆ、Ｒ，Ｌ、、　　Ｉｎｌ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、４０．　５５０−５５３　（１９
８７））。

課題を解決するための手段 本発明者らは、上記の課題について鋭意研究を重ねた結
果、下記式で表わされるセスキテルペン類縁体並びに之
等化合物の塩から選ばれた少なくとも１種が、斯界で要
望されている新しい作用によるＴＮＦの遊離抑制剤の有
効成分化合物として有効であることを見出だし、ここに
本発明を完成するに至った。

本発明によれば、式 ％式％ 及び式 Ｃ）Ｔ３ＣＨ３ で表わされるセスキテルペン類縁体並びに之等化合物の
塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有す
ることを特徴とするＴＮＦ遊離抑制剤が提供される。

本発明薬剤において、有効成分として用いられる上記式
（１）及び式（２）で表わされる化合物は、本願人が先
に開発した化合物であり、例えば西独特許第２８２１４
０３号（特開昭５４−３６２５５号及び特開昭５４−３
７８３２号）公報や特開昭６４−６２１４号公報に記載
されるように、潰瘍性大腸疾患治療剤を含むある種の医
薬用途に有用であることが知られている。しかるに、本
発明者らは、別途研究の結果、該化合物が上記各公報に
記載された医薬用途からは全く予期できない新しい医薬
用途、即ちＴＮＦ遊離抑制剤として有効であることを見
出だし、この知見により本発明を完成したのである。

上記式（１）で表わされる化合物（結晶）は、溶媒特に
塩基性溶媒に溶解させると、該化合物の互変異性体であ
る上記式（２）で表わされるモノカルボン酸との平衡混
合物となる。即ち化合物（１）をジメチルスルホキシド
溶媒に溶解後、経時的に測定したＮＭＲスペクトル分析
によれば、溶解２０分後には、ラクトールの特徴的シグ
ナルを示す６．３６ｐＨｍの他にアルデヒドプロトン（
−ＣＨＯ）の特徴的シグナルである９、８９ｐｐｍに若
干のピークが認められ、両者の積分比は前者約７３対後
者約２７であり、２時間後には上記ｇ、８９ｐｐｍのピ
ークが更に若干増大し、積分比で７０対３０に達し、こ
の積分比は６３時間経過後のＮＭＲ分析図においても変
化せず、化合物（２）は上記溶媒中では化合物（１）と
３対７の比で存在する。

本発明のＴＮＦ遊離抑制剤は、かかる平衡混合物の形態
にある化合物（１）及び化合物（２）を有効成分とする
ことができる。尚、上記化合物（１）の互変異性体であ
る化合物（２）は、溶媒としてメタノールやピリジンを
用いる場合には生成しない。

本発明のＴＮＦ遊離抑制剤は、また上記各化合物及び之
等の混合物と同様に、之等各化合物の塩基性化合物塩を
有効成分とすることができる。上記塩は、化合物（１）
及び化合物（２）の有する酸性基、即ちフェノール性水
酸基及び化合物（２）の有するラクトール環を構成する
カルボキシル基のうちの少なくとも１つの官能基を塩基
性化合物と反応させることにより得られる。ががる塩の
製造に利用され得る塩基性化合物としては、具体的には
、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カ
ルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナ
トリウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸
化物、炭酸化物等を例示できる。また例えばメチルアミ
ン、エチルアミン、イソプロピルアミン、モルホリン、
ピペラジン、ピペリジン、３．４−ジメトキシフェネチ
ルアミン等の有機アミン類も上記塩基性化合物として利
用できる。

本発明薬剤の有効成分とする各化合物は、また立体異性
体を有しており、本発明はかがる立体異性体をも有効成
分として利用することを当然に包含する。

本発明ＴＮＦ遊離抑制剤は、通常有効成分化合物と共に
製剤担体を用いて製剤組成物の形態とされ実用される。

上記製剤担体としては、使用形態に応じた製剤を調製す
るために通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿
剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦
形剤を例示でき、之等は得られる製剤の投与単位形態に
応じて適宜選択される。

本発明薬剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療
目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、例
えば錠剤、火剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、
カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等を例示
できる。錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担
体としてこの分野で慣用される各種のものを広く使用す
ることができる。その例としては、例えば乳糖、白糖、
塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カル
シウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カ
リウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパツール、単
シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼチラン溶液、カ
ルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結
合剤、カルボキシメチルセルワースナトリウム、カルボ
キシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシ
プロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリ
ウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム
、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ス
テアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステ
アリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第
４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸
収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン
、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等
の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポ
リエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することがで
きる。更に錠剤は、必要に応じて通常の剤皮を施した錠
剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィル
ムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることが
できる。火剤の形態に成形するに際しては、製剤担体と
してこの分野で通常用いられる各種のもの、例えばブド
ウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリ
ン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末
、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カン
テン等の崩壊剤等を広く使用することができる。坐剤の
形態に成形するに際しては、製剤担体としてこの分野で
慣用される各種のもの、例えばポリエチレングリコール
、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステ
ル類、ゼラチン、半合成グリセライド等をいずれも使用
することができる。カプセル剤は、常法に従い通常本発
明の有効成分化合物又はその塩を、上記で例示した各種
の製剤担体と混合して、例えば硬質ゼラチンカプセル、
軟質カプセル等に充填して調製することができる。本発
明薬剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製され
る場合、之等は殺菌されかつ血液と等張であるのが好ま
しい。之等の形態に成形するに際しては、希釈剤として
一般に用いられる公知の各種のもの、例えば水、エチル
アルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソス
テアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアル
コール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
類等をいずれも使用することができる。尚この場合、等
張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、ブドウ糖あ
るいはグリセリンを本発明の薬剤中に含有させてもよく
、また之等の製剤中には通常よく知られている各種の添
加剤、例えば溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加す
ることもできる。更に本発明薬剤中には、必要に応じて
この種製剤中に添加配合できることの知られている着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含
有させることも可能である。

本発明のＴＮＦ遊離抑制剤中に含有されるべき前記式（
１）及び／又は式（２）で表わされる有効成分化合物並
びに之等の塩の量は、特に制限されるものではなく広範
囲から適宜選択されるが、通常全医薬製剤組成物中に約
１〜７０重量％、好ましくは約１〜７０重量％程度含有
される量とするのが適当である。

本発明薬剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形
態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応
じて決定することができる。例えば錠剤、火剤、液剤、
懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与する
ことができる。注射剤は単独でまたはブドウ糖、アミン
酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することができ
、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮肉、皮下もしくは
腹腔内投与することもできる。半開は直腸内投与するこ
とができる。

本発明薬剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他
の条件、疾患の程度等により適宜選択され、特に限定さ
れるものではないが、通常有効成分が１日成人１人当り
約５０■〜１ｇ程度投与される量から選択されるのが適
当であり、該製剤は１日に１〜４回に分けて投与するこ
とができる。

実施例 以下、本発明ＴＮＦ遊離抑制剤の有効成分化合物の製造
例及びこれを用いた本発明薬剤の製剤例を挙げる。尚、
以下は製造の一例であり、これで拘束されるものではな
い。

製造例　１ スタキボトリス　エスピー・Ｋ７６（微工研菌寄第３８
０１号）を、下記組成の培地１００ｙ／を入れた５００
ｙＡ’容坂ロフラスコにて、２８℃、ｐ　Ｈ６で４日間
往復振盪培養を行なった。

グリセリン　　　　　　　　０．５％ デンプン　　　　　　　１．０％ 乳　　　　糖　　　　　　　　　　　　０．　２％大豆
粉　　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．　１％麦芽エキス　
　　　　　　　　０．１％ＣａＣＯ３０，３％ Ｍｇ　ＳＯ４０，０５％ 上記で得られた種培養１本を、上記組成の培地２ＯＡ’
を入れた３０１１容ジャーファーメンタ−にて、培養温
度２８℃、通気量１１１／ＩＩ培地・分、攪拌数３００
回転／分で５日間培養した。

得られた培養液を８０００回転／回転速心分離し、菌体
を除去し、上澄液に５１のメタノールを加え、攪拌して
３時間放置した後、遠心分離して沈澱物を除去し、等量
の酢酸エチルで抽出した。

酢酸エチル層の溶媒を減圧下留去した後、残渣をメタノ
ールに溶かし、活性炭カラムを通過させ、溶出液を減圧
乾固後、クロロホルム：酢酸エチル−１：　１　（ｖ／
ｖ）に溶解させ、セファデックスＬＨ−２０カラムでゲ
ル濾過し、薄層クロマトグラフィー〔酢酸エチル−クロ
ロホルム−酢酸（容積比５０：５０：２）の混液を展開
溶媒とする〕にて、Ｒｆ＝０．３４に相当する抗補体活
性画分または同様の薄層クロマトグラフィー〔ベンゼン
−ブタノール−酢酸（容積比６０：１５：５）の混液を
展開溶媒とする〕にて、Ｒｆ＝０．５８に相当する抗補
体活性画分を集め、これから溶媒を留去することにより
、抗補体活性を有する淡黄色の弱酸性物質である６、７
−シヒドロキシー２゜５．５．８ａ−テトラメチル−１
，２，３，４゜４ａ、５，６，７．８．８ａ−デカヒド
ロナフタレン−１−スピロ−２−−（６＝、７＝−ジホ
ルミル−４−一ヒドロキシ−２′　３′−ジヒドロベン
ゾフラン）２．０ｇを得た。

上記化合物の生成は、以下の理化学的特性より確認され
る。

−ル） ○元素分析値（Ｃ２３Ｈ３００６として）計算値（％）
Ｃ６８，６４Ｔ１７．　５１実測値（％’）　　Ｃ６８
，５８１１７，５５０紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）分
析 ３０７ｎｍ（ε＝　　６６５９） 製造例　２ １　ｙｌの水に硝酸銀２．１ｇを溶かし、これに５．８
モル水酸化ナトリウム水溶液３．５ｘｌを加え、室温下
で２０分間攪拌後、製造例１で得た６゜７−シヒドロキ
シー２．５，５．８ａ−テトラメチル−１，２，３，４
，４ａ、５．６．７，８゜８ａ−デカヒドロナフタレン
−１−スピロ−２′−（６＝、７−−ジホルミルー４′
−ヒドロキシ２′　３′−ジヒドロベンゾフラン）の１
．０ｇをエタノール３７Ａ’に溶かした液を加えた。

反応媒体を室温下に１．５時間攪拌した後、２Ｎ塩酸で
ｐＨを約２に調整し、反応液を同量の酢酸エチルで抽出
し、抽出溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー〔シリカゲル［ワコウＣ−２
００Ｊ、和光純薬社製品、溶出液：クロロホルムー酢酸
エチル−酢酸（容積比１００：５０：２））で精製した
。薄層クロマトグラフィー〔酢酸エチル−クロロホルム
−酢酸（容積比５０：５０：２）の混液を展開溶媒とす
る〕にて、Ｒｆ＝０．３７に相当する両分又は同様の薄
層クロマトグラフィー〔ベンゼン−ブタノール−酢酸（
容積比６０：１５：５）の混液を展開溶媒とする〕にて
、Ｒｆ＝０．７１に相当する両分を集め、これより溶媒
を留去することにより、淡黄色無定結晶の４，８−ジヒ
ドロキシ６−オキソ−２，３，６，８−テトラヒドロ−
フロ（３，４−ｇ）ベンゾフラン−２−スピロ−１−−
（６−，７−−ジヒドロキシー２′　５−５”、８−ａ
−テトラメチル−１−，２−３−４−，４−ａ、　　５
−＋　　６”、７″、８−　８−ａデカヒドロナフタレ
ン）［前記式（１）の化合物］の７００■を得た。

上記化合物は、次の理化学的性質を示し、このことから
その生成が確認された。

０元素分析値（Ｃ２３Ｈ３００７として）計算値（％）
　　Ｃ６６，０３Ｈ７，１８実測値（％）　Ｃ６５，９
３Ｉ（７，２１製造例　３ ０．４Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液５３Ｆ／及びエタノ
ール５１１！に、４．８−ジヒドロキシ−６−オキソ−
２，３，６，８−テトラヒドロ−フロ〔３゜４−ｇ〕ベ
ンゾフラン−２−スピロ−１′（６”、７−−ジヒドロ
キシー２”　　５−　５−８−ａ−テトラメチル−１−
，２−，３”　　４”４−ａ、５”、６−、？−８−８
−ａ−デカヒドロナフタレン）４１８■を加え、窒素気
流下に３０〜４０℃で３０分間攪拌した。反応終了後、
減圧下に溶媒を留去し、乾固し、残渣にアセトン１０ｘ
ｌを加え溶解する部分を濾去した。

得られた粗結晶を水−アセトンから再結晶して、淡黄色
無定形結晶の、ジソディウム　６．７−シヒドロキシー
２．　５．　５．　８ａ−テトラメチル−１、２，３，
−４，４ａ、　　５．　６．　７．　８．　８ａ　−デ
カヒドロナフタレン−１−スピロ−２′（６−−カルボ
キシレートー７′−ホルミル−４′−オキシド−２−，
３−−ジヒドロベンゾフラン）［前記式（２）の化合物
のジナトリウム塩］３４２■を得た。

得られた化合物は、次の理化学的性質を示し、このこと
からその生成が確認された。

０元素分析値（Ｃ２３Ｈ２ｇ０７Ｎａ２として）計算値
（％）　　Ｃ５９，７４１１６，１０実測値（％’）　
　Ｃ５９，４８Ｈ５，９１０紫外線吸収スペクトル（Ｕ
Ｖ）分析 ＝３３０ｎｍ（ε＝４５９００） また、上記において原料化合物に対して等モル量程度、
通常約１゜２倍モル量の水酸化ナトリウムを使用して同
様にして、ソディウム　６，７−シヒドロキシー２．５
，５．８ａ−テトラメチル−１，２，３，’　　４．４
ａ、５．６．７．８；　８ａ−デカヒドロナフタレン−
１−スピロ−２−（６′−カルボキシレート−７′−ホ
ルミル−４−−オキシド−２−，３−−ジヒドロベンゾ
フラン）［前記式（２）の化合物のカルボキシル基のモ
ノナトリウム塩］を得た。

製剤例　１ 製造例３で得た化合物　　　　　　５００■Ｅ式（２）
の化合物の２Ｎａ塩］ ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　２５０■注射用蒸
留水　　　　　　　　　　適　　壷金　　量　　　　　
　　　　　　　　　　　５ｘｌ注射用蒸留水に製造例３
で得られた化合物及びブドウ糖を溶解後、５ｘｌのアン
プルに注入し、窒素で置換後、１２１℃で１５分間加圧
滅菌を行ない、注射剤形態の本発明ＴＮＦ遊離抑制剤を
得た。

製剤例　２ 製造例２で得た化合物　　　　　　５００■［式（１）
の化合物］ 半合成グリセライド基剤　　　　　適　　壷金　　　量
　　　　　　　　　　　　　　　５００■半合成グリセ
ライド基剤に、製造例２で得られた化合物を加え、５０
℃で混合、懸濁させた後、成形鋳型に流しこみ、自然冷
却した後、取り出し、半割形態の本発明ＴＮＦ遊離抑制
剤を得た。

製剤例　３ 製造例３で得た化合物　　　　　　５００ｇ［式（２）
の化合物の２Ｎａ塩］ アビセル（商標名、無化成社製）　　　４０ｇコンスタ
ーチ　　　　　　　　　　　３０ｇステアリン酸マグネ
シウム　　　　　　２ｇＴＣ−５（商標名、ヒドロキシ
プ　　１０ｇ口ピルメチルセルロース） ポリエチレングリコール−６０００３ｇヒマシ油　　　
　　　　　　　　　　　４０ｇエタノール　　　　　　
　　　　　　　４０ｇ製造例３で得られた化合物、アビ
セル、コンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを取
り、混合研磨後、糖衣Ｒ１０ｍｍのキネで打錠した。

得られた錠剤を、ＴＣ−５（ヒドロキシプロピルメチル
セルロース）、ポリエチレングリコール−６０００、ヒ
マシ油及びエタノールからなるフィルムコーティング剤
で被覆して、フィルムコーティング錠形態の本発明ＴＮ
Ｆ遊離抑制剤を得た。

製剤例　４ 製造例２で得た化合物　　　　　　１００ｇアビセル　
　　　　　　　　　　　　　４０ｇコンスターチ　　　
　　　　　　　　３０ｇステアリン酸マグネシウム　　
　　　　２ｇアクリル酸メチル−メタクリル酸 共重合体　　　　　　　　　　　　５．７ｇトリアセチ
ン　　　　　　　　　　０．６ｇエタノール　　　　　
　　　　　　５０．４ｇ製造例２で得られた化合物、ア
ビセル、コンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを
取り、混合研磨後、糖衣Ｒ１０ｍｍのキネで打錠した。

得られた錠剤をアクリル酸メチル−メタクリル酸共重合
体、トリアセチン及びエタノールからなるフィルムコー
ティング剤で被覆し、腸溶錠形態の本発明ＴＮＦ遊離抑
制剤を得た。

以下、本発明ＴＮＦ遊離抑制剤の薬理試験例を挙げる。

試験例　１ ヒトマクロファージ細胞株（ＴＨＰ−１）からのＴＮＦ
遊離に対するＴＮＦ遊離抑制剤の作用Ｔ　ＨＰ　−１細
胞株は１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０培養液（日本
製薬社製）にて３７℃、５％ＣＯ□存在下で９６時間培
養したものを使用した。

４８ウエルマイクロプレート（コーニング社製）中にＴ
　）（Ｐ　−１細胞を１ウェル当り１０６個となるよう
に、１％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０培養液（日永製薬
社製）にて調整し、１１１ずつ加えた。

次に本発明ＴＮＦ遊離抑制剤（製造例２で得たもの、以
下ＭＸ−１と略す）の１４■粉末を１０１１のＲＰＭＩ
−１６４０培養液に溶解後、各ウェルに加えた時点での
終濃度が３．１０，３０゜１００、　３００　ｎｇ／ｚ
ｌの濃度となるように希釈調整した。

上記ＴＨＰ−１細胞中に各濃度のＭＸ−１希釈液を加え
た。−ＴＨＰ−１及びＭＸ−１希釈液を混合後、２〜５
分間インキュベーションを行ない、次に終濃度１μｇ　
／　ｙｌとなるようにリポポリサッカライド（以下ＬＰ
Ｓと略す、Ｅ、　　ｃｏｌｉ、　０．５５　：Ｂ５．　
ＢｏｉｖｉｎＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ社製）を加えて３７℃
、５％ＣＯ２存在下で、２時間インキュベートした後、
１１０００ｔｐ、１０分間の条件で遠心分離（日立王様
社製）した。得られた各セル中の上清０．１１１を取り
出し、上清中のＴＮＦを抗ヒト・リコンビナントＴＮＦ
−α（ＰＴ−０５０：大日本製薬製）を標準抗原として
、両部らの開発した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によ
り測定した（両部原人、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ、　＾
ｃｔａ、、１７６、　２１３−２１８　（１９８Ｂ）　
）。

その結果を第１図に示す。

図において横軸はＭＸ−１の濃度（ｎｇ／ｙ／）を、縦
軸はＴＮＦの濃度（ｐｇ／ｚ／）を示す。

第１図よりＭＸ−１はＴＨＰ−１セルからのＬＰＳ刺激
によるＴＮＦの遊離を３１ｇ／ｌｌから１０．３０，１
００．３００ｎｇ／ｚＡ’まで強く抑制することが認め
られた。

試験例　２ ヒト末梢血マクロファージからのＩＬ−１（インターロ
イキン−１）遊離に対するＭＸ−１の作用 ヒト末梢単核球はヒト末梢ヘパリン加末梢血として採取
し、クリーンベンチ内でｆｉｃｏｌｌ−ｉｓｏｐａｑｕ
ｅ比重遠沈法にて分離した後、１％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−
１６４０培養液にて３回洗浄し再び同培養液にて細胞数
を調整した。

４８ウエルマイクロプレート上に上記により調整した単
核球を終濃度が１０６個／ウェルとなるように各ウェル
に０．５ｚｌずつ加えた。次にＭＸ−１を終濃度が３０
，１００，３００．１１０００ｎ／ｚｚとなるように調
整したものを各ウェルに加えた。２〜５分後、終濃度１
μｇ／ｙｌとなるようＧ、：　Ｌ　Ｐ　Ｓを加え、３７
℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間インキュベーションし
た。その後、上清を１０００ｒｐｒＩｌ、１０分間遠心
することにより分離した。

分離した上清中のＩＬ−１の活性はマウス胸腺細胞を指
示細胞としたｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ法にて測定した
。即ち、９６マイクロプレートに、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞を１ウェル当り１×１０６個加え、更にＰＨ
Ａ　（フェトヘマグルチニン）を５９６ＦＣ３−ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培養液ニテ調整したものを終濃度１μｇ　
／　ｘｌとなるように加えた。

更に、培養上清を各ウェルに終濃度５０％となるよう加
えた。３７℃、５％ＣＯ２存在下で６６時間インキュベ
ーションした後、各ウェルに０．５μＣｉの３Ｈ−チミ
ジンを加えて６時間インキュベーションした後、細胞を
回収した。

上記操作にて回収された細胞中に取り込まれた３Ｈ−チ
ミジンの量を液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏ
ｋｘ社製）にて測定した。

測定された３Ｈ−チミジンの値はマウス胸腺細胞刺激活
性を示し、これはマクロファージからの遊離Ｉ　Ｌ−１
量を現している。

その結果を第２図に示す。

図において横軸はＭＸ−１の濃度（ｎｇ／ｙ／）を、縦
軸は３Ｈ−チミジン取り込み量（Ｘ　１００−３ｃｐ　
）を示す。

該図よｉｌ）ＭＸ−１（Ｄ量を３０．１００，３００゜
１０００　ａｘ／ｘｉと変化させても３Ｈ−チミジンの
取り込みに影響を与えなかった。上記結果より、ＭＸ−
１はヒトマクロファージからのＩＬ−１の遊離には影響
を及ぼさないことが確認された。

第１図及び第２図の結果から、ＭＸ−１はＩＬ−１に作
用せずＴＮＦの遊離を抑制することから選択的にヒトマ
クロファージからのＴＮＦの遊離を３　Ｂ／ｚｌ　〜３
００　ｎｇ／ｘｉの範囲で強力に抑制することが確認さ
れた。

試験例　３ 急性毒性試験 製造例２で得たセスキテルペン類縁体（式（１）％式％ 物）の急性毒性試験を１．Ｖ、　ラットにつき行なった
。

その結果、該化合物のＬ　Ｄ　ｓｏ値は、５００■／聴
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、薬理試験例１に従う本発明有効成分化合物が
ヒトマクロファージ細胞株からのＴＮＦ遊離に対して抑
制作用を示すことを明らかにするグラフである。 第２図は、薬理試験例２に従う本発明有効成分化合物が
ヒト末梢血マクロファージからのｒＬ−１の遊離に及ぼ
す影響を示すグラフである。 （以　上） 第 図 ＸＸ− １（ｎ／ｍｌ） ＭＸ−１ （ｎｇ／ｍｌ　）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 及び式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるセスキテルペン類縁体並びに之等化合物の
   塩から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有す
   ることを特徴とする腫瘍壊死因子遊離抑制剤。