JPH0413696A

JPH0413696A - 新規生理活性物質

Info

Publication number: JPH0413696A
Application number: JP2117876A
Authority: JP
Inventors: Akira Shibata; 昭柴田; Yoshiaki Moriyama; 森山　美昭; Yasuyuki Kunihiro; 国広　靖之; Masahiro Nobuhara; 延原　正弘; Toshiyuki Kanamori; 金森　利至; Yoshikazu Ashida; 義和芦田; Hiromi Hagino; 萩野　博巳; Atsushi Arai; 新居　淳; Koichi Noda; 浩一野田
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-05-08
Filing date: 1990-05-08
Publication date: 1992-01-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、、新規生理活性物質およびその製造方法に関
する。　本発明は、また、該新規生理活性物質を有効成
分とする医薬組成物に関する。

〈従来の技術〉肝細胞に対する増殖因子は、近年確立されたラット肝細
胞の初代培養系（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ、等、ジャーナ
ル　オブ　バイオケミストリー　９４巻、１０２９−１
０３５頁、１９８３年）を利用して研究が進められてき
た。　その結果、肝細胞の増殖因子が正常ヒト血清やラ
ット血清中、および肝炎患者血清やラット血小板中に存
在することが報告され、それぞれＨＰＴＡおよびＨＧＦ
と呼ばれている（Ｒｅｚａ　Ｚａｒｎｅｇａｒ等・バイ
オケミカル　アンド　バイオフィジカルリサーチ　コミ
ュニケーションズ、１６３巻、１３７０−１３７６頁、
１９８９年；　ＫｅｉｊｉＭｉｙＢｚａｗａ等、バイオ
ケミカル　アンド　バ　イオフィジカル　リサーチ　コ
ミュニケーションズ、１６３巻、９６７−９７３頁、１
９８９年；およびＴｏｓｈｉｋａｚｕ　　Ｎａｋａｍｕ
ｒａ等、ネイチャー　３４２巻、４４０−４４３頁、１
９８９年）、　これらは、ともに、還元状態で、約７０
ｋＤａと約３５ｋＤａのサブユニットに分かれることが
知られている（にｅｉｊｉＭｉｙａｚａｗａ等、既出、
ｆｏｓｈｉｋａｚｕ　Ｎａｋａｍｕｒａ等、既出）、　
また、分子量約７．４ｋＤａのタンパク質であるＴＧＦ
−〇、分子量約６ｋＤａのＥＧＦにも、肝細胞に対する
増殖活性が認められている。　ところで、周知の通り、
生体内には同じような作用を有する増殖因子が多数存在
し、同じ組織に対して細胞増殖作用を示す複数の異なる
因子の存在も知られている。　肝組織は生体内で最も再
生力のある組織であり、肝細胞に対する増殖因子も多数
存在することは十分前えられ、また、これらの増殖因子
は、増殖抑制因子等とバランスをとりあって細胞増殖を
調節しているものと考えられる。　従って、生体内にお
ける肝細胞の増殖機構を解明し、医療の分野へ応用する
ためには、既に特定された上記肝細胞増殖因子とは異な
る新規な物質を見出し、それを特定することが必要と考
えられている。

〈発明が解決しようとする課題〉本発明の目的は、新規な生理活性物質およびその製造方
法を提供することにある。　本発明が提供する新規生理
活性物質は、肝細胞に対する増殖促進作用を有する。　
本発明の他の目的は、該新規生理活性物質を有効成分と
する医薬組成物を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉本発明者等は、ヒト肝癌由来の細胞株の培養上清中から
新規生理活性物質を単離し、この新規生理活性物質が肝
細胞の増殖を促進する作用を有することを確認し、本発
明の完成に至ったものである。

すなわち、本発明の第１の態様は、還元下のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法における分子量が８７
±１ｏｋＤａである蛋白質を構成蛋白質とすることを特
徴とする新規生理活性物質を提供するものである。

前記生理活性物質は、肝細胞の増殖促進作用を有するも
のであるのがよい。　また、前記生理活性物質は、ヒト
由来の蛋白質であるのがよく、なかでも、ヒト由来細胞
により産生される蛋白質であるのがよい。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に示された
新規生理活性物質の製造方法、なかでもヒト由来細胞を
用いる前記新規生理活性物質の製造方法を提供するもの
である。

該製造方法は、ヒト由来の細胞を培養し、前記新規生理活性物質を含む培養液を回収し、その
培養液を精製する工程を有する方法であるのがよい。

そして、精製には、下記より選ばれる少な（とも１つの
精製方法を実施するのがよい。

（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ｂ）ヘパリン
アフィニティークロマトグラフィー（ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィー（ｄ）逆相クロマトグラフィー前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、イオン交換基
としてクォータナリーアミノメチル基および／またはク
ォータナリーアミノエチル基が導入されている陰イオン
交換クロマトグラフィーであり、前記ヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィーが、ヘパリンを吸着させた親
水性ポリマーを使用したヘパリンアフィニティークロマ
トグフィーであり、前記色素アフィニティークロマトグ
ラフィーが、ブルー色素を吸着させた親水性ポリマーを
利用する色素アフィニティークロマトグラフィーであり
、前記逆相クロマトグラフィーが、オクタデシル基を結
合させたポリマーを用いることを特徴とする逆相クロマ
トグラフィーであることが特に好ましい。

本発明はまた、第３の態様として、前記新規生理活性物
質を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。

以下に、本発明の構成を詳細に説明する。

本発明が第１の態様として提供する新規生理活性物質は
、還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
における分子量が８７±１０ｋＤａである蛋白質を構成
蛋白質とすることを特徴とする。　すなわち、本発明の
生理活性物質は、還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で８７±１０ｋＤａの分子量を示す蛋白
質を、該生理活性物質の少なくとも一部として有する。

本発明の新規生理活性物質は、上記蛋白質を構成蛋白質
とするものであればいずれでもよいが、特に、肝細胞の
増殖促進作用を有するものであるのがよい。

本発明の新規生理活性物質は、その由来は限定されない
が、ヒト由来であることが好ましい。

本発明の新規生理活性物質は、これを産生するヒト由来
の組織や細胞、ヒト尿やヒト血液等のヒト体液中より適
当な手段によって得ることができるが、好ましくはヒト
癌由来細胞、なかでもヒトの肝臓にて分離された癌由来
細胞により産生されるものであるのがよく、さらには、
ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍにより産生され
るものであるのがよい。　なお、本発明者等は、本発明
の新規生理活性物質を産生ずるヒト転移性肝癌由来細胞
株ＳＰＴ−６Ｍを、１９８９年１０月１２日付で寄託し
ている（微工研菌寄第１１０４８号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１
１０４８））。

本発明の新規生理活性物質は、いかなる方法で製造され
たものであってもよいが、ヒト由来細胞、好ましくはヒ
ト癌由来細胞、なかでもヒトの肝臓にて分離された癌由
来細胞を利用して製造されたものであるのがよく、特に
、ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍを用いて製造
されたものであるのがよい。

本発明が第２の態様として提供する新規生理活性物質の
製造方法は、ヒト由来の細胞を利用する点に特徴を有す
る。

本発明の製造方法は、ヒト由来の細胞を利用しており、
最終的に本発明の新規生理活性物質を回収で餘る方法で
あればいかなる方法であってもよいが、好ましい例とし
て、ヒト由来の細胞を培養し、本発明の新規生理活性物
質を含む培養液を回収し、その培養液から精製するとい
う工程を有する方法が挙げられる。

次に、ヒト癌由来の細胞株であり、本発明の製造方法へ
の適用が特に好ましい細胞であるヒト転移性肝癌由来細
胞株ＳＰＴ−６Ｍを利用する製造方法について述べる。

ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍは、それが増殖
しうる培養条件にて培養する。　すなわち、ＳＰＴ−６
Ｍを増殖させるのに好適な濃度の血清や増殖因子、例え
ばウシ胎児血清やインスリン等を含む培地にて、３７℃
にて培養する。　培地は、例えば現在一般に使用されて
いるＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｏｓ　　Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）　、　Ｒ
ＰＭＩ１６４０等の培地から適宜選択して使用すればよ
い。

本発明の新規生理活性物質は、一般に行なわれている細
胞培養技術に準じた方法にて培養したＳＰＴ−６Ｍの培
養上清から回収し、精製することによって得ることがで
きるが、回収および精製をより効率的に行なうためには
、当該細胞を回収に適切な条件、例えば血清等を含まな
い完全合成培地に移して培養することが好ましい。

また、当該細胞は、動物個体を利用して培養することも
可能である。　すなわち、動物個体内に当該細胞を移植
するか、または動物個体内あるいは個体外に取り付けた
拡散チャンバー内にて動物゛の体液を利用して培養する
事ができる。　さらに、動物個体を利用して培養した当
該細胞を、動物個体から取り出して分散させ、適当な増
殖培地にてさらに培養することも可能である。

使用する動物としては、当該細胞が増殖しつる動物であ
ればいずれも使用可能であるが、胸腺摘出あるいは抗胸
腺抗体処理されたマウス、ラット、ハムスター等、ある
いはヌードマウスやヌードラットを使用することが好ま
しい。

本発明の新規生理活性物質を、本発明の新規生理活性物
質を含有する液、例えば培養上清から回収するに際して
は、蛋白性の生理活性物質を精製する方法として一般的
に行なわれている方法から適当な方法を選択し、それを
組み合わせればよい、　例えば、塩析法、限外濾過法、
等電点沈澱法、抗体アフィニティークロマトグラフィー
等の各種アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー　クロマトフオーカシング法
、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー等の方法の中から本発明の
新規生理活性物質の活性を損なわないような方法を選択
し、これらの方法を組み合わせて適当な順序で行なうこ
とにより、目的とする本発明の新規生理活性物質を濃縮
、精製することができる。

本発明においては、上記の方法いずれもが適用可能であ
るが、好ましくは、下記の精製方法のうちの少なくとも
１つを含む２種以上の精製方法を適宜組み合わせて実施
するのがよい。

（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ｂ）ヘパリン
アフィニティークロマトグラフィー（ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィー（ｄ）逆相クロマトグラフィーなお、陰イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換
基としてクォータナリーアミノメチル基および／または
クォータナリーアミノエチル基が導入されている陰イオ
ン交換クロマトグラフィーであるのがよく、また、ヘパ
リンアフィニティークロマトグラフィーは、ヘパリンを
吸着させた親水性ポリマーを使用したヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィーであるのがよ（、色素アフィ
ニティークロマトグラフィーは、ブルー色素を吸着させ
た親水性ポリマーを利用する色素アフィニティークロマ
トグラフィーであるのがよく、逆相クロマトグラフィー
は、オクタデシル基を結合させたポリマーを用いること
を特徴とする逆相クロマトグラフィーであるのがよい。

本発明の新規生理活性物質の活性は１例えば、肝細胞−
に対する増殖促進作用を測定することによって確認する
ことができる。　近年、肝細胞の初代培養系が確立され
（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｔ。

等、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー９４巻、１
０２９−１０３５頁、１９８３年）、ラットより採取し
た初代培養肝細胞を用い、肝細胞のＤＮＡ合成に対する
作用を指標として、様々な物質の肝細胞増殖作用が測定
されている。　そして、本発明の新規生理活性物質の肝
細胞増殖促進作用も、上記方法に準じ、ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏで肝細胞に当該生理活性物質を作用させ、そのＤＮＡ
合成に対する作用を指標として確認することができる。

本発明は、また、第３の態様として、本発明第１の態様
の新規生理活性物質を有効成分として含有することを特
徴とする医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、本発明の第１の態様に示した新
規生理活性物質に凍結乾燥や濾過滅菌等から適宜選ばれ
る製剤学的に必要な処理を施しただけのものであっても
、充分その効果を医療の分野に提供することができるが
、該医薬組成物には、上記の生理活性物質に加えて、さ
らに製剤学的に許容され得る各種補助成分を含有せしめ
ることも可能である。

この補助成分とは、基剤、安定剤、防腐剤、保存剤、乳
化剤、懸濁化剤、溶剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味剤、
着色剤、芳香剤、無痛化剤、賦形剤、結合剤、粘稠剤、
緩衝剤等のことであり、具体的には、炭酸カルシウム、
乳糖、蔗糖、ソルビット、マンニトール、デンプン。

アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ
脂、注射用蒸留水、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル溶
液、グルコース溶液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等
、医薬品添加物−覧表（財団法人東京医薬品工業協会薬
事法規委員会および大阪医薬品協会薬事法規研究委員会
発行）に記載のものが例示される。　本発明では、この
医薬品添加物−覧表等を参考にして補助成分を適宜選択
し、使用することが可能である。　使用する物質の種類
や量等は、製剤学的に許容されつる範囲より、医薬組成
物の薬剤形態等に応じて適したものを適宜選択すればよ
い。

本発明の医薬組成物の投与量は、治療を受ける患者の状
態、年齢、性別、体重等により適宜決定される。

本発明の医薬組成物は、患者の状態に応じ、経口投与、
筋肉的投与、腹腔内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈
内投与、直腸内投与等様々な投与方法にて使用され得る
が、特に、静脈内に投与する方法にて使用されることが
好ましい。

当該医薬組成物は、肝細胞の増殖もしくは再生を必要と
する疾患、もしくは肝機能の改善を必要とする疾患の治
療に有効な手段を提供する。

〈実施例〉以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明する
が、これらは実施の一例として示すものであり、本発明
はこれらにより同等限定されるものではない。　また、
以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣
用略号に基づくものである。

（実施例１）新規生理活性物質の製造 ■ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍの継代培養ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍの継代培養を以
下の方法で行なった。

まず、ウシ血清（アーバイン　サイエンティフィック社
製）１０％を含むダルベツコ変法イーグル培地（以下Ｄ
ＭＥＭと略す、ギブコ。

ライフチクノロシーズ社１１Ｊ）５０ｍβに、ヒト転移
性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍを１．６Ｘ１０’細胞／
ｍＩ２の濃度になるよう植え込み、底面積１５０ｃｍ”
のルーフラスコ（岩城硝子株式会社製）中で、５％ＣＯ
２存在下にて、３７℃で３日間培養した。　培養終了後
、培地を取り除き、ＥＤＴＡ含有トリプシン溶液２０ｍ
ｊ＋を加えて細胞を剥離せしめ、そこにウシ血清１０％
を含むＤＭＥＭ培地を加えて細胞浮遊液とした。　この
細胞浮遊液をピペットで採取し、ウシ血清１０％を含む
ＤＭＥＭ培地を加え、細胞浮遊液の濃度が１．６Ｘ１０
’細胞／　ｍ　ｉとなるように調製し、再びルーフラス
コ中で３７℃にて培養した。　以後、同様に継代培養を
行なった。

■生理活性物質回収のためのヒト転移性肝癌由来細胞株
ＳＰＴ−６Ｍの培養ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍの培養上清から
本発明の新規生理活性物質を回収する目的で、以下の方
法で、ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍの培養を
行なった。

まず、ウシ血清１０％を含むＤＭＥＭ培地３１！、に、
ヒト転移性肝癌由来細胞株ＳＰＴ−６Ｍ？ｉ−０，６ｘ
　１０’　〜０．７ｘ　１０’細胞／ｍβの濃度になる
よう植え込み、内容量２０Ｊ２のローラーボトル（鈴木
精工株式会社製）を用い、１０回転７時間、３７℃にて
、３日間回転培養した。　培養終了後、培地を取り除き
、新たにウシ血清１０％を含むＤＭＥＭ培地３Ｉ２を加
え、更に２日間、１０回回転時間、３７℃にて培養した
。　培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ−２１２にて
ボトル内を２回洗浄し、その後、血清不含のＤＭＥＭ培
地ｌβを加え、３７℃で２日間培養し１本発明の新規生
理活性物質を産生させた。

■本発明の新規生理活性物質の培養上清からの回収 ■で得た培養上清から、下記の方法で本発明の新規生理
活性物質を単離した。

まず、■で得た培養上清を孔径５μｍのフィルター（ポ
リプロピレン製ＰＰカートリッジ、ミリボア社製）　次
いで孔径０．２２μｍのフィルター（デュラボアＴＰカ
ートリッジ、ミリボア社製）を通過させ、細胞等の除去
及び濾過滅菌を行なった。　この濾液を分画分子量２０
０ｋＤａの限外濾過ＩＩＩ（プロスタツク、ミリボア社
製）を通過させた後、さらに、分画分子量６ｋＤａの限
外濾過膜（モルセップファイハーモシュール型弐ＦＳ−
１０膜、ダイセル化学工業株式会社製）を用いて５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対して脱塩濃縮を
行なった。

次いで、得られた脱塩濃縮液を、４℃の条件下にて、５
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＱ
−セファロースファストフローカラム（φ５ｃｍＸ２４
．４ｃｍ、ファルマシア社製）に流速６００ｍβ／時間
で添加し、陰イオン交換クロマトグラフィーを行なづた
。　溶出は、同緩衝液にてカラムを洗浄後、ＮａＣβを
含む５０　ｍ　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を
用い、ＮａＣ１濃度ｏＭ〜ＩＭ７５時間の直線濃度勾配
法により、流速９８０ｍＩ２／時間で行なった。　溶出
終了後、実施例２に記載の方法により、各画分の肝細胞
の増殖に対する作用を測定した。　その結果、ＮａＣｊ
２濃度約０．０８Ｍ　〜０．３４Ｍ付近の両分に肝細胞
の増殖活性が認められた。

次に、得られた活性画分に対し、ヘパリンアフィニティ
ークロマトグラフィーを行なった。　すなわち、あらか
じめ５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８、０）　／
　０　、５　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＩｔにて平衡化したＴＳ
Ｋゲル　ＡＦ−ヘパリントヨバール　６５０Ｍカラム（
φ１．５ｃｍＸ６ｃｍ、東ソー株式会社製）に、上記活
性画分に１１５倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）／２Ｍ　　ＮａＣ１を添加した液を、流速８０
　ｍ　１２／時間で添加した。　添加後、このカラムを
５０　ｍ　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０．
５Ｍ　　ＮａＣρ８０ｍｆｆで、流速８０ｍＩ２／時間
で洗浄した。　洗浄後、ＮａＣβを含む５０ｍＭ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用い、ＮａＣｊ２濃度０．
５Ｍ〜２Ｍ／８時間の直線濃度勾配法にて、流速２０ｍ
β／時間で溶出を行なった。　溶出終了後、実施例２に
記載の方法により、各画分の肝細胞の増殖に対する作用
を測定した。　その結果、ＮａＣＪ２濃度約０．５Ｍ〜
１．４Ｍ付近の画分に肝細胞の増殖活性が認められた。

得られた活性画分に対し、以下の方法で色素アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行なった。　すなわち、上記
活性画分に等量の蒸留水を添加し、それを、あらかじめ
ＰＢＳ−で平衡化したＴＳＫゲル　ブルーＳＰＷカラム
（φ７．５ｍｍＸ７５ｍｍ、東ソー株式会社製）に流速
６０ｍｇ／時間で添加した。　添加後、ＰＢＳ−／１．
４Ｍ　　ＮａＣｌ２（以下、Ａ液という）で洗浄し、次
に、Ａ液と１０ｍＭＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）／２Ｍ
塩酸グアニジン（以下、Ｂ液という）を用い、Ｂ液濃度
Ｏ〜１００％７２分の直線濃度勾配法にて溶出を行ない
、引き続き、Ｂ液にて流速３０ｍＪ２／時間で溶出した
。　溶出終了後、実施例２に記載の方法により、各画分
の肝細胞の増殖に対する作用を測定した。

Ｂ液にて溶出された活性画分を、以下の逆相クロマトグ
ラフィーに供した。　すなわち、０．０５％トリフルオ
ロ酢酸で平衡化したＴＳＫゲル　オクタデシル−ＮＰＲ
カラム（φ４．６ｍｍＸ３５ｍｍ、東ソー株式会社製）
に、上記活性画分を流速６０ｍβ／時間で添加し、０．
０５％トリフルオロ酢酸にて流速６０ｍβ／時間で洗浄
後、アセトニトリルを含む０．０５％トリフルオロ酢酸
を用いて溶出した。　なお、溶出は、アセトニトリル濃
度Ｏ〜１００％／２０分の直線濃度勾配法にて、流速６
０ｍβ／時間で行なった。

溶出終了後、実施例２に記載の方法により、各画分の肝
細胞の増殖に対する作用を測定した。　その結果、アセ
トニトリル濃度約４６％〜５５％付近の画分に、肝細胞
に対する増殖促進作用が認められた。

得られた活性画分は、再び、０．０５％トリフルオロ酢
酸で平衡化したＴＳＫゲル　オクタデシル−ＮＰＲカラ
ムに供し、同様の方法で溶出した。

溶出終了後、同様に各画分の肝細胞の増殖に対する作用
を測定した結果、アセトニトリル濃度約４６％〜５５％
付近に肝細胞に対する増殖促進作用が認められた。

■ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動■に示した方
法によって得られた高い増殖活性の認められた活性画分
の一部を用い、Ｌａｅｍｍｌｉ　　の方法（ネイチャー
２２７巻、６８０頁、１９７０年）に準じてＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
と略す）を行なった。

まず、上記活性画分を一晩減圧乾固したものを、２％Ｓ
ＤＳ１０．０５％ＢＰＢ／２０％グリセロール１５％２
−メルカプトエタノール７６２．５ｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ６，８）に溶解した。　溶解後、１００℃で５
分間の加熱処理を行ない、遠心分離して試料を全量回収
した。　回収した試料を１２．５％ゲル（１ｍｍｘ１４
ｃｍｘ１４ｃｍ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

　分子量標準品として、ＬＭＷキットＥ（ファルマシア
社製）を用い、ＩＱｍＡで４時間電気泳動を行なった。

　泳動終了後、銀染色キット（第−化学薬品株式会社製
）にて染色した。　染色の結果、分子量８７±１０ｋＤ
ａ付近にバンドが認められた。

（実施例２）本発明の新規生理活性物質の肝細胞増殖活
性の測定 ■ラットからの肝細胞の分離まず、第一還流液として、０．５ｍＭ　　グリコールエ
ーテルジアミン四酢酸（和光純薬工業株式会社製）　／
　Ｈａｎｋｓ’　ＢＳＳを、第二還流液として、０．０
５％コラゲナーゼ（シグマ社製）１５　ｍ　Ｍ　　Ｃａ
　”／　Ｒａｎｋｓ’　ＢＳＳを調製した。

なお、Ｈａｎｋｓ’　ＢＳＳはＣａ”、Ｍｇ”不含Ｈａ
ｎｋｓ　’ＢＳＳ　　（Ｈａｎｋｓ’　ｂａｌａｎｃｅ
ｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　、ギブコ、ライフチ
クノロシーズ社製）を用いた。

次に、７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットに、ネンプタ
ール（大日本製薬株式会社製）とヘパリンナトリウム注
射液（持田製薬株式会社製）を、それぞれ０．３ｍβ／
個体および０．２ｍβ／個体の用量で腹腔的投与した。

　７０％エタノールでラットの皮膚を消毒した後、ラッ
トを開腹した。　第一還流液を流しながら、門脈にカニ
ユーレを挿入し、腹部工大静脈を切断して還流液を放出
させた。　次に、胸部を切開し、胸部工大静脈にカニユ
ーレを挿入し、切断した腹部工大静脈を結紮した。　第
一還流液を約５分間流した後、液を第二還流液に交換し
、それを約１５分間還流させた。　還流終了後、肝臓を
シャーレに取り出し、肝細胞を冷Ｈａｎｋｓ’　Ｂ５５
（既出）中に懸濁させた。　この肝細胞懸濁液をピペッ
トで採取し、１５０メツシユの細胞濾過器（池本理化学
工業株式会社製）で濾過した後、濾液を４℃、１６×ｇ
で５分間遠心分離した。　上清を捨て、沈澱した細胞な
Ｒａｎｋｓ’　ＢＳＳに再懸濁し、再び４℃、１６×ｇ
で５分間遠心分離した。　同操作をさらに２回繰り返し
、肝実質細胞を分取した。　分取した肝実質細胞を、生
細胞が４．２Ｘ１０’個／　ｍ　１２となるように、５
％ウシ胎児血清（株式会社日本生物材料センター製）／
１μＭデキサメタシン（シグマ社製）／’０．１μＭイ
ンスリン（シグマ社製）　／　１ｌｌｉｌｌｉａａ＋’
ｓ　Ｅ培地（フローラボラトリー社製）に懸濁した。

■ラット肝細胞の増殖促進作用の測定実施例１の■の方法で得た活性画分に、ただちに１０倍
量の０．０５％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す
、シグマ社製）／ＰＢＳ−を添加した。　次いで、分画
分子量３５００の透析チューブ（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯ
Ｒモレキュラー　ボラース　メンブラン、スペクトラム
　メディカル　インダクション社製）を用いてＰＢＳ−
に対して一晩透析した。　透析後、分画分子量５０００
の限外濾過膜（ウルトラフリーＣＬ。

ミリボア社製）を用いて濃縮し、無菌の濾過膜（孔径０
．２２μｍ、ミリボア社製）にて濾過滅菌した。　これ
を、０．１％ＢＳＡ　（既出）／ＰＢＳ−で段階希釈し
てサンプルとし、本発明の新規生理活性物質の肝細胞に
対する増殖促進作用を測定した。

まず、■で調製したラット肝細胞懸濁液を、ＬｍＱ／ウ
ェルとなるように、２４ウエルのコラーゲンコートデイ
シュ（コーニング社製）に添加した。　このディッシェ
をＣＯ□インキュベーター（タバイエスペック株式会社
製）に入れ、３７℃、５％ＣＯｔの条件下で５時間培養
した後、培地交換を行なった。　培地交換は、各ウェル
から培地を取り除き、ｌＯＫ　Ｉ　Ｕ／ｍβのアプロチ
ニン（持田製薬株式会社製）を含む血清不含のＷｉｌｌ
ｉａｍ’ｓ　Ｅ培地（既出）を各ウェルに５００μβず
つ添加することによって行った。　さらに１８時間培養
し、再び培地を取り除き、５％ウシ胎児血清（既出）１
０．１μＭインスリン（既出）　／Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ
Ｅ培地（既出）を各ウェルに４００μ℃ずつ添加した。

　次いで、実験群には上述のサンプルを、対照群には０
．１％ＢＳＡ　（既出）／ＰＢＳ−を１００μβずつ添
加し、３７℃で培養した。　６時間後、各ウェルに［ｍ
ｅｔｈｙｌ−”Ｈｌ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下［”Ｈ
ｌＴｄＲと略す、アマジャムジャパン株式会社製）を０
．５μＣｉ／ウエルとなるように添加し、更に２２時間
培養した。　培養終了後、培地を取り除き、１ｍβ／ウ
ェルの氷冷ＰＢＳ−で３回洗浄した後、各ウェルに水冷
１０％トリクロロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）を１
ｍＪ２ずつ添加し、４℃で１５分間放置して細胞を固定
した。　細胞固定後、各ウェルに０．５Ｎ　　ＮａＯＨ
を５００μｍずつ添加して細胞を可溶化させ、３７℃で
１時間放置後、各ウェルより１００μβずつを、予め０
．１５Ｎ　　ＨＣＡ３２５μρを添加しておいたシンチ
レーションカウンター用バイアルに採取した。　ここに
、シンチレータ−（シンチゾールＥＸ−Ｈ１株式会社同
仁化学研究所製）３ｍｌを添加し、液体シンチレーショ
ンカウンター（アロカ社製）により、各ウェルの［”Ｈ
ｌＴｄＲの量を測定した。

その結果、実験群の［”Ｈｌ　ＴｄＲ量は対照群に比べ
て明らかに高値であり、実験群の細胞でＤＮＡ合成が促
進されたことがわかった。

（実施例３）本発明の新規生理活性物質の毒性に関する
試験実施例１の■の方法に従って得た活性画分に、ただちに
１０倍量の０．０５％ＢＳＡ　（既出）／ＰＢＳ−を添
加した。　次いで、分画分子量３５００の透析チューブ
（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲモレキュラー　ボラース　メ
ンブラン、スペクトラム　メディカル　インダクション
社製）を用いて生理食塩液に対して一晩透析した。　透
析後、分画分子量５０００の限外濾過膜（ウルトラフリ
ーＣＬ、ミリボア社製）を用いて濃縮し、無菌の濾過膜
（孔径０．２２μｍ、ミリボア社製）にて濾過滅菌した
。

ＩＣＲ系マウマウス１０匹群とし、上記の如く調製され
た本発明の生理活性物質溶液を静脈内投与し、２週間観
察した。　対照群には、生理食塩液を同様に投与した。

その結果、本発明の生理活性物質は、マウスに対して可
能な最大投与量を投与した場合にも毒性は認められなか
った。

従って、本発明の生理活性物質は、生体にとって安全で
あり、該生理活性物質を有効成分とする本発明の医薬組
成物も、生体に対して毒性の低いものであることが証明
された。

〈発明の効果〉本発明により、新規な生理活性物質およびその製造方法
が提供される。

また１本発明により、該新規生理活性物質を有効成分と
する医薬組成物が提供される。

本発明によって提供される新規生理活性物質は、肝細胞
に対する増殖促進作用を有するので、該新規生理活性物
質を有効成分とする医薬組成物は、肝細胞の増殖もしく
は再生を必要とする疾患、もしくは肝機能の改善を必要
とする疾患の治療に有効な手段を提供する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法における分子量が８７±１０ｋＤａである蛋白質を
構成蛋白質とすることを特徴とする新規生理活性物質。
（２）前記生理活性物質が肝細胞の増殖促進作用を有す
るものである請求項１に記載の新規生理活性物質。
（３）前記生理活性物質がヒト由来蛋白質である請求項
１または２に記載の新規生理活性物質。
（４）前記生理活性物質がヒト由来の細胞により産生さ
れるものである請求項１ないし３のいずれかに記載の新
規生理活性物質。
（５）ヒト由来の細胞を利用して請求項１ないし４のい
ずれかに記載の新規生理活性物質を製造することを特徴
とする新規生理活性物質の製造方法。
（６）ヒト由来の細胞を培養し、請求項１ないし４のい
ずれかに記載の新規生理活性物質を含む培養液を回収し
、その培養液を精製する工程を有する請求項５に記載の
新規生理活性物質の製造方法。
（７）下記より選ばれる少なくとも１つの精製方法を実
施する請求項５または６に記載の新規生理活性物質の製
造方法。（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ｂ）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー（ｃ）色素アフィニティークロマトグラフイー（ｄ）逆相クロマトグラフィー
（８）前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、イオン
交換基としてクォータナリーアミノメチル基および／ま
たはクォータナリーアミノエチル基が導入されている陰
イオン交換クロマトグラフィーであり、前記ヘパリンア
フィニティークロマトグラフィーが、ヘパリンを吸着さ
せた親水性ポリマーを使用したヘパリンアフィニティー
クロマトグフィーであり、前記色素アフィニティークロ
マトグラフィーが、ブルー色素を吸着させた親水性ポリ
マーを利用する色素アフィニティークロマトグラフィー
であり、前記逆相クロマトグラフィーが、オクタデシル
基を結合させたポリマーを用いることを特徴とする逆相
クロマトグラフィーである請求項７に記載の新規生理活
性物質の製造方法。
（９）請求項１ないし４のいずれかに記載の新規生理活
性物質を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。