JPS61246132A - 血管新生阻害剤 - Google Patents
血管新生阻害剤Info
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- JPS61246132A JPS61246132A JP61040115A JP4011586A JPS61246132A JP S61246132 A JPS61246132 A JP S61246132A JP 61040115 A JP61040115 A JP 61040115A JP 4011586 A JP4011586 A JP 4011586A JP S61246132 A JPS61246132 A JP S61246132A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
一発重量
本発明は血管新生を阻害する物質、その製造方法および
使用に関する。
使用に関する。
血管新生は一部の重要なヒト疾患、たとえば糖尿病性網
膜症、老人性黄斑部変性、腫奉、慢性関節リウマチ、お
よび創傷治癒時の過剰痘痕形成において決定的な役割を
果たしている。糖尿病性網膜症では、視神経乳頭および
網膜から新しい血管が発生し、これが最終的には失明を
招くことになる。レーデ−治療によってこの疾患での失
明は減少してきたが、網膜搬痕の形成による破壊は周辺
視力や夜間視力の著しい低下を生じる。
膜症、老人性黄斑部変性、腫奉、慢性関節リウマチ、お
よび創傷治癒時の過剰痘痕形成において決定的な役割を
果たしている。糖尿病性網膜症では、視神経乳頭および
網膜から新しい血管が発生し、これが最終的には失明を
招くことになる。レーデ−治療によってこの疾患での失
明は減少してきたが、網膜搬痕の形成による破壊は周辺
視力や夜間視力の著しい低下を生じる。
老人性黄斑部変性では、ゲルツク基底膜を通して新しい
血管が発生し、これが網膜を侵襲する。
血管が発生し、これが網膜を侵襲する。
この網膜侵襲は光受容細胞の崩壊を生じ、視力が低下す
る。血管新生の阻害剤は視力の喪失を防止または制限で
きる。
る。血管新生の阻害剤は視力の喪失を防止または制限で
きる。
腫瘍の生育および侵襲過程は、工業化された国では主た
る死因のひとつになっている。血管新生の阻害は腫瘍の
減少を惹起することが明らかにされている。血管新生の
強力な阻害剤の利用は、現在の癌療法に重要な助力とな
るものと思われる。
る死因のひとつになっている。血管新生の阻害は腫瘍の
減少を惹起することが明らかにされている。血管新生の
強力な阻害剤の利用は、現在の癌療法に重要な助力とな
るものと思われる。
慢性関節リウマチでは、罹患した関節の軟骨が血管増通
によって侵襲される。この血管組織が正常の平滑な軟骨
表面を破壊する。血管新生の阻害は慢性関節リウマチに
起こる関節破壊を軽減すると考えられる。
によって侵襲される。この血管組織が正常の平滑な軟骨
表面を破壊する。血管新生の阻害は慢性関節リウマチに
起こる関節破壊を軽減すると考えられる。
ケロイドのような創傷治癒時の過剰鍛痕は美容上問題忙
なることがある。血管新生は創傷の治癒と壷痕形成の重
要な要素であるから、その阻害はケロイｒ形成を制御で
きる◇ 血管新生の制御がこれらの疾患の治療に役立つという可
能性から、新しい血管の形成を阻害する物質の研究が広
範に行われてきた。これまで知られている血管新生阻害
剤の大部分は駆血性の組織たとえば軟骨、ガラス体、水
晶体等から抽出されている。たとえば、ヤコプセン（Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ）らは、ヒトガラス体由来の数種の分離
体において、大動脈内皮細胞の増殖を阻害する低分子量
（１３，０００ダルトン未満）物質を発見した。分離体
はガラス体から物理的抽出され、遠心分離し、ゲルクロ
マトグラフィーえ付されたものである〔ヤコプセン（Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ）ほか、アーカイゾズ・オプ・オフタル
モロジー（Ａｒｃｈ、 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、） ｓ
１０２．１５４３（１９８４））。ウィリアムズ（
ｗｉｌｌｉａｍａ） ラバ、ウシ大動脈内皮細胞の増殖
を阻害する分子量１００．０００未満の物質について報
告している。
なることがある。血管新生は創傷の治癒と壷痕形成の重
要な要素であるから、その阻害はケロイｒ形成を制御で
きる◇ 血管新生の制御がこれらの疾患の治療に役立つという可
能性から、新しい血管の形成を阻害する物質の研究が広
範に行われてきた。これまで知られている血管新生阻害
剤の大部分は駆血性の組織たとえば軟骨、ガラス体、水
晶体等から抽出されている。たとえば、ヤコプセン（Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ）らは、ヒトガラス体由来の数種の分離
体において、大動脈内皮細胞の増殖を阻害する低分子量
（１３，０００ダルトン未満）物質を発見した。分離体
はガラス体から物理的抽出され、遠心分離し、ゲルクロ
マトグラフィーえ付されたものである〔ヤコプセン（Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ）ほか、アーカイゾズ・オプ・オフタル
モロジー（Ａｒｃｈ、 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、） ｓ
１０２．１５４３（１９８４））。ウィリアムズ（
ｗｉｌｌｉａｍａ） ラバ、ウシ大動脈内皮細胞の増殖
を阻害する分子量１００．０００未満の物質について報
告している。
この物質はヒトおよびウシの水晶体から１Ｍグアニジン
塩酸塩で抽出され、分子量１００，０００ダルトンでカ
ットする膜を通過させたものである〔ウイリア°ムズ（
ｗｔｘｘｉａｍｓ）ほか、アメリカン・ジャーナル・オ
デ・オフタルモロジー（Ａｍ、Ｊ。
塩酸塩で抽出され、分子量１００，０００ダルトンでカ
ットする膜を通過させたものである〔ウイリア°ムズ（
ｗｔｘｘｉａｍｓ）ほか、アメリカン・ジャーナル・オ
デ・オフタルモロジー（Ａｍ、Ｊ。
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、） 、 ９７ ｅ ３６６ （
１９８４） 〕。
１９８４） 〕。
ラッテイー（Ｌｕｔｔ７）らは、成熟ウシガラス体から
血管新生を阻害する抽出物を得ている。この抽出物は、
ガラス体をホモジナイズし、アスコルビン酸ナトリウム
とインキユベートシ、透析に付しく分子量１２，０００
〜１４，０００をカットオフ）、透析液を滅菌濾過して
得られたものである〔ラッテイー（Ｌｕｔｔｙ）ほか、
インベステイｒイテイデ・オフタルモロジー・アンｒ・
ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔ、 Ｏｐｈｔｈ
ａｌｍｏｌ、 Ｖｉａ、８ｃｉ、 ） 、 ２３゜５
２（１９８３））、ゾレム（Ｂｒｅｍ）らは、ウサギ角
膜にｍ瘍によって誘導された新しい血管の生長を阻害す
る因子をウサギガラス体から抽出した。
血管新生を阻害する抽出物を得ている。この抽出物は、
ガラス体をホモジナイズし、アスコルビン酸ナトリウム
とインキユベートシ、透析に付しく分子量１２，０００
〜１４，０００をカットオフ）、透析液を滅菌濾過して
得られたものである〔ラッテイー（Ｌｕｔｔｙ）ほか、
インベステイｒイテイデ・オフタルモロジー・アンｒ・
ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔ、 Ｏｐｈｔｈ
ａｌｍｏｌ、 Ｖｉａ、８ｃｉ、 ） 、 ２３゜５
２（１９８３））、ゾレム（Ｂｒｅｍ）らは、ウサギ角
膜にｍ瘍によって誘導された新しい血管の生長を阻害す
る因子をウサギガラス体から抽出した。
この因子はガラス体を遠心分離し、上清を透析し、分子
量制限１２，０００のセルロースチューブを用いて抽出
された〔デレム（Ｂｒｅｍ）ほか、アメリカン・ジャー
ナル・オデ・オフタルモロジー（Ａｍ。
量制限１２，０００のセルロースチューブを用いて抽出
された〔デレム（Ｂｒｅｍ）ほか、アメリカン・ジャー
ナル・オデ・オフタルモロジー（Ａｍ。
Ｊ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、）、ｊＬＡｔ ３２３ （
１９７７）］。
１９７７）］。
残念ながら、これらの物質は現在、血管新生阻害剤があ
る疾患に利用されるに至っていない。上述の原料から抽
出できる阻害剤の量はきわめてわずかであり、また、阻
害剤は部分精製されたのみで、その性質も一部しかわか
っていない。実際、これらの物質は、きわめて微量が精
製されていない状態で得られたのみで、疾患の治療に用
いた場合の効力を評価することさえ困難である。
る疾患に利用されるに至っていない。上述の原料から抽
出できる阻害剤の量はきわめてわずかであり、また、阻
害剤は部分精製されたのみで、その性質も一部しかわか
っていない。実際、これらの物質は、きわめて微量が精
製されていない状態で得られたのみで、疾患の治療に用
いた場合の効力を評価することさえ困難である。
ケトナー（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ）の米国特許第４，３５６
，２６１号には、軟骨から誘導される血管新生阻害剤の
製造方法が記載されている。これは、このような物質が
わずかしか供給できないとい゛う問題点の解決を意図し
たものである。この方法では、軟骨産生細胞を高密度で
培養し、この培養液から阻害剤を抽出する。抽出方法に
ついては、同じくケトナーほかの米国特許第４，０４２
，４５７号に開示されている。この方法は、抽出すべき
蛋白性物質を不可逆的に変性することがない溶質を含む
水性抽出メジウム１好ましくは１．０〜６．０Ｍグアニ
ジン塩酸塩水溶液を使用し、抽出物を分離し、分子量約
５０、［） ００以下の物質を回収し、この物質を処理
して塩類を除去し、得られた物質を脱水するものである
。この分子量５０，０００またはそれ未満の物質は内皮
細胞の増殖率を低下させる。これは部分的忙精製された
のみで、また性質も一部しか明らか処されておらず、し
たがって、上述の疾患の治療への使用に適していない。
，２６１号には、軟骨から誘導される血管新生阻害剤の
製造方法が記載されている。これは、このような物質が
わずかしか供給できないとい゛う問題点の解決を意図し
たものである。この方法では、軟骨産生細胞を高密度で
培養し、この培養液から阻害剤を抽出する。抽出方法に
ついては、同じくケトナーほかの米国特許第４，０４２
，４５７号に開示されている。この方法は、抽出すべき
蛋白性物質を不可逆的に変性することがない溶質を含む
水性抽出メジウム１好ましくは１．０〜６．０Ｍグアニ
ジン塩酸塩水溶液を使用し、抽出物を分離し、分子量約
５０、［） ００以下の物質を回収し、この物質を処理
して塩類を除去し、得られた物質を脱水するものである
。この分子量５０，０００またはそれ未満の物質は内皮
細胞の増殖率を低下させる。これは部分的忙精製された
のみで、また性質も一部しか明らか処されておらず、し
たがって、上述の疾患の治療への使用に適していない。
糖尿病性網膜症で起こる眼内の血管新生は、新しい血管
の退行を誘導し、将来の血管新生ｆ、阻止できる治療法
が存在する点で独特である。この治療法は、糖尿病性網
膜症が絡脈網膜鍛痕がある眼にはほとんど起こらないと
いう観察に基づいている。これがフルビンレゾ−および
キセノン光凝固を広く採用させることになり、治療的に
絡脈網膜＃ｌ痕の形成を誘発させるようになった。絡脈
網膜廠痕を誘発する光凝固を行うと、増殖性糖尿病性網
膜症の眼での眼内血管新生が急速に退行する。
の退行を誘導し、将来の血管新生ｆ、阻止できる治療法
が存在する点で独特である。この治療法は、糖尿病性網
膜症が絡脈網膜鍛痕がある眼にはほとんど起こらないと
いう観察に基づいている。これがフルビンレゾ−および
キセノン光凝固を広く採用させることになり、治療的に
絡脈網膜＃ｌ痕の形成を誘発させるようになった。絡脈
網膜廠痕を誘発する光凝固を行うと、増殖性糖尿病性網
膜症の眼での眼内血管新生が急速に退行する。
この退行は、元ＮＵおよびその結果の絡脈網膜帳痕の形
成が新しい血管から離れた場所に行われた場合にも認め
られる。
成が新しい血管から離れた場所に行われた場合にも認め
られる。
この現象を説明するために多くの理論が提起されている
が、まだ実証されたものはない。光凝固が眼内に放出さ
れる酸素を増加させ、これが血管新生を阻害するという
説がある。しかしながら、この一連の事実は証明されて
いない〔ステ７アンソン（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ）ほか
、オフタルミック・サージエリ−（Ｏｐｈｔｈａｌ、
Ｓｕｒｇ、）、ＬＡ、２０９（１９８３））。光凝固が
血管新生の刺激を放出する網膜を破壊するとの説もある
が、これも立証されていない。この説が疑わしい主な理
由は、血管新生のシュテイミュレーターが産生されると
考えられている網膜の内部相を光凝固が均一に破壊する
わけではないという事実がるるかうである。
が、まだ実証されたものはない。光凝固が眼内に放出さ
れる酸素を増加させ、これが血管新生を阻害するという
説がある。しかしながら、この一連の事実は証明されて
いない〔ステ７アンソン（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ）ほか
、オフタルミック・サージエリ−（Ｏｐｈｔｈａｌ、
Ｓｕｒｇ、）、ＬＡ、２０９（１９８３））。光凝固が
血管新生の刺激を放出する網膜を破壊するとの説もある
が、これも立証されていない。この説が疑わしい主な理
由は、血管新生のシュテイミュレーターが産生されると
考えられている網膜の内部相を光凝固が均一に破壊する
わけではないという事実がるるかうである。
第三の説は、光凝固が眼から血管新生シュテイミニレ−
が離脱できる経路を作るとするものである〔７アウルズ
（Ｆｏｕｌｄｓ） 、トランズアクション・オフ・オフ
タルモロジール・ソサイアテイー・オフ・ニューシーラ
ント（Ｔｒａｎｓ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、 Ｓａｃ。
が離脱できる経路を作るとするものである〔７アウルズ
（Ｆｏｕｌｄｓ） 、トランズアクション・オフ・オフ
タルモロジール・ソサイアテイー・オフ・ニューシーラ
ント（Ｔｒａｎｓ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、 Ｓａｃ。
ＮＺ）、３２．８２（１９８０））。この説を支持する
証明もまだない。
証明もまだない。
本発明者は、絡脈網Ｍ鍛痕の細胞成分が血管新生を阻害
する物質を放出すること、さらＫこのような阻害剤が搬
機中に見出される特定の種類の細胞によって放出される
ことを発見した。絡脈網膜搬痕は主として星細胞、Ｎ４
膜色素上皮細胞および多分、線維芽細胞から構成される
。これらの６種の細胞について、１ｎｖｉｔｒｏで新し
い血管の退行を起こさせる物質の放出能を試験した結果
、本発明はある種の網膜色素上皮細胞および線維芽細胞
が培養液中でこのような物質を放出することを発見した
。この物質を単離し、精製し、その性質を調べた。
する物質を放出すること、さらＫこのような阻害剤が搬
機中に見出される特定の種類の細胞によって放出される
ことを発見した。絡脈網膜搬痕は主として星細胞、Ｎ４
膜色素上皮細胞および多分、線維芽細胞から構成される
。これらの６種の細胞について、１ｎｖｉｔｒｏで新し
い血管の退行を起こさせる物質の放出能を試験した結果
、本発明はある種の網膜色素上皮細胞および線維芽細胞
が培養液中でこのような物質を放出することを発見した
。この物質を単離し、精製し、その性質を調べた。
この発見は、絡脈網膜＃！痕形成の効果を説明するため
に主張されている多くの説や、最近の文献から本技術分
野の熟練者は血管新生阻害剤の起源として網膜色素上皮
細胞を考えないようになった事実を思うと、全く予期で
きないものである。たとえばコルテ（ｘｏｒｔｅ）らや
ヘリオツド（Ｈｅｒｉａｔ）らは、網膜色素上皮細胞が
血管の維持に必要な物質を放出することを示唆している
〔コルテ（Ｋｏｒｔｅ）ほか、インベステイｒイテイゾ
・オフタルモロジー・アンｒ・ビジュアル・サイエンス
（Ｉｎｖｅｓｔ。
に主張されている多くの説や、最近の文献から本技術分
野の熟練者は血管新生阻害剤の起源として網膜色素上皮
細胞を考えないようになった事実を思うと、全く予期で
きないものである。たとえばコルテ（ｘｏｒｔｅ）らや
ヘリオツド（Ｈｅｒｉａｔ）らは、網膜色素上皮細胞が
血管の維持に必要な物質を放出することを示唆している
〔コルテ（Ｋｏｒｔｅ）ほか、インベステイｒイテイゾ
・オフタルモロジー・アンｒ・ビジュアル・サイエンス
（Ｉｎｖｅｓｔ。
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、 Ｍｉｓ、 Ｓｃｉ、） 、２
５ 、 １１３５（１９８４）：ヘリオフ） （Ｈｅｒ
ｉｏｔ）ほか、オフタルモロジー（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ
ｌｏｇｙ）、９１，１６０３（１９８４））。
５ 、 １１３５（１９８４）：ヘリオフ） （Ｈｅｒ
ｉｏｔ）ほか、オフタルモロジー（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ
ｌｏｇｙ）、９１，１６０３（１９８４））。
本発明の血管新生阻害剤は、ヒトや動物の網膜色素上皮
細胞、ヒト線維芽細胞を含めた細胞を培養することによ
って産生ずる。これは血管新生阻害剤を軟骨、ガラス体
、水晶体から抽出で製造する方法より多くの点で優れて
いる。第一に、この技術分野でよく知られている大量細
胞培養技術を用いて大量の阻害剤を製造できるので、抽
出方法に比べて阻害剤の収量は有意に増大する。十分量
の血管新生阻害剤の製造により、その単離、精製および
さらに研究するための特性の解明を可能にし、また上述
の疾患の治療のような応用に十分な量の製造を可能にす
る。第二に、阻害剤を産生ずる細胞の培養能は、活性物
質をコードするＤＮＡの単離、このＤＮＡ １７）細菌
または他の生物体への導入、活性分子の大規模合成の達
成の機会を提供する。
細胞、ヒト線維芽細胞を含めた細胞を培養することによ
って産生ずる。これは血管新生阻害剤を軟骨、ガラス体
、水晶体から抽出で製造する方法より多くの点で優れて
いる。第一に、この技術分野でよく知られている大量細
胞培養技術を用いて大量の阻害剤を製造できるので、抽
出方法に比べて阻害剤の収量は有意に増大する。十分量
の血管新生阻害剤の製造により、その単離、精製および
さらに研究するための特性の解明を可能にし、また上述
の疾患の治療のような応用に十分な量の製造を可能にす
る。第二に、阻害剤を産生ずる細胞の培養能は、活性物
質をコードするＤＮＡの単離、このＤＮＡ １７）細菌
または他の生物体への導入、活性分子の大規模合成の達
成の機会を提供する。
このような遺伝子工学技術の採用により、血管新生阻害
剤が大量細胞培養法よりもさらに安価に製造できる可能
性、活性を増大させたアナログを製造する分子修飾の可
能性も出てくる。
剤が大量細胞培養法よりもさらに安価に製造できる可能
性、活性を増大させたアナログを製造する分子修飾の可
能性も出てくる。
発明の要約
本発明は、血管新生阻害剤、その製造方法、血管新生が
関与するヒトまたは動物の疾患たとえば糖尿病性網膜症
、老人性黄斑部変性、腫瘍、慢性関節リウマチ、創傷治
癒時の過剰鍛痕形成の治療へのその使用方法に関する。
関与するヒトまたは動物の疾患たとえば糖尿病性網膜症
、老人性黄斑部変性、腫瘍、慢性関節リウマチ、創傷治
癒時の過剰鍛痕形成の治療へのその使用方法に関する。
本発明の目的は、精製された血管新生阻害剤および生物
学的に活性なアナログを提供することにある。阻害剤は
培養可能な細胞、とくにヒト細胞、たとえば線維芽細胞
、網膜色素上皮細胞から回収される。また、タペタムを
欠く動物の眼、たとえばブタの眼の、網膜色素上皮細胞
からも回収される。この阻害剤は、酸性環境たとえば一
約２〜６で安定である。生物学的に活性なアナログは、
ヒト網膜色素上皮細胞から回収された天然の血管新生阻
害剤とホモロジーを有し、このような細胞から回収され
た阻害剤の生物学的に同等に機能できる少なくとも１個
の血管新生阻害剤活性部位をもつポリペイテドである。
学的に活性なアナログを提供することにある。阻害剤は
培養可能な細胞、とくにヒト細胞、たとえば線維芽細胞
、網膜色素上皮細胞から回収される。また、タペタムを
欠く動物の眼、たとえばブタの眼の、網膜色素上皮細胞
からも回収される。この阻害剤は、酸性環境たとえば一
約２〜６で安定である。生物学的に活性なアナログは、
ヒト網膜色素上皮細胞から回収された天然の血管新生阻
害剤とホモロジーを有し、このような細胞から回収され
た阻害剤の生物学的に同等に機能できる少なくとも１個
の血管新生阻害剤活性部位をもつポリペイテドである。
この部位は血−１新生阻害剤活性が高められたポリペブ
チＶを形成するように改変することもできる。本発明の
好ましい態様によれば、血管新生阻害剤はヒト網膜色素
上皮細胞から回収され、分子量約５７，０００±３，０
００、等電点的４．６±０．３のポリペプチドである。
チＶを形成するように改変することもできる。本発明の
好ましい態様によれば、血管新生阻害剤はヒト網膜色素
上皮細胞から回収され、分子量約５７，０００±３，０
００、等電点的４．６±０．３のポリペプチドである。
本発明によれば、ｆ！１４Ｍ色素上皮細胞またはヒト線
維芽細胞を培養して血管新生阻害剤を含有する培養メジ
ウムを産生させ、この培養メジウムから阻害剤を回収す
ることにより、血管新生阻害剤の製造方法が提供される
。また、本発明は、網膜色素上皮細胞またはヒト線維芽
細胞を集め、この細胞から阻害剤を抽出することによる
血管新生阻害剤の製造方法を提供するものである。網膜
色素上皮細胞はタペタムを欠く動物の眼、とくにブタの
眼から得るのが好ましい。ヒト線維芽細胞としては皮膚
線維芽細胞が好ましい。
維芽細胞を培養して血管新生阻害剤を含有する培養メジ
ウムを産生させ、この培養メジウムから阻害剤を回収す
ることにより、血管新生阻害剤の製造方法が提供される
。また、本発明は、網膜色素上皮細胞またはヒト線維芽
細胞を集め、この細胞から阻害剤を抽出することによる
血管新生阻害剤の製造方法を提供するものである。網膜
色素上皮細胞はタペタムを欠く動物の眼、とくにブタの
眼から得るのが好ましい。ヒト線維芽細胞としては皮膚
線維芽細胞が好ましい。
この阻害剤はその物理的および化学的性質、とくＫその
疎水性と分子量に基づいて精製することができる。好ま
しい態様においては、阻害剤はヒト網膜色素上皮細胞を
血清含有メジウム中で過集密まで増殖させ、細胞からメ
ジウムを除去し、細胞に血清を含まないメジウムを加え
、細胞の生育をさらに継続し、メジウムを細胞から分離
し、分離したメジウムを酸性透析に付して透析液を産生
させ、透析液中の阻害剤を疎水的相互作用クロマトグラ
フィーによって精製し、この精製された阻害剤をサイズ
排除クロマトグラフィーによりさらに精製して製造され
る。
疎水性と分子量に基づいて精製することができる。好ま
しい態様においては、阻害剤はヒト網膜色素上皮細胞を
血清含有メジウム中で過集密まで増殖させ、細胞からメ
ジウムを除去し、細胞に血清を含まないメジウムを加え
、細胞の生育をさらに継続し、メジウムを細胞から分離
し、分離したメジウムを酸性透析に付して透析液を産生
させ、透析液中の阻害剤を疎水的相互作用クロマトグラ
フィーによって精製し、この精製された阻害剤をサイズ
排除クロマトグラフィーによりさらに精製して製造され
る。
本発明はまた、このような阻害剤を産生じｄ６つ培養メ
ジウム中で生育して血管新生阻害剤を含有する培養メジ
ウムを産生できる細胞を培養し、メジウムを細胞から分
離し、このメジウムを血管新生阻害剤に対する固定化抗
体と接触させてメジウム中の血管新生阻害剤を固定化固
体に結合させ、結合した阻害剤が除かれたメジウムを除
去し、血管新生阻害剤を固定化抗体から分離することに
よって血管新生阻害剤を製造する方法を提供する。
ジウム中で生育して血管新生阻害剤を含有する培養メジ
ウムを産生できる細胞を培養し、メジウムを細胞から分
離し、このメジウムを血管新生阻害剤に対する固定化抗
体と接触させてメジウム中の血管新生阻害剤を固定化固
体に結合させ、結合した阻害剤が除かれたメジウムを除
去し、血管新生阻害剤を固定化抗体から分離することに
よって血管新生阻害剤を製造する方法を提供する。
好ましい態様においては、分離は阻害剤−抗体複合体の
環境のｐＨを約２〜３に低下させ、阻害剤を固定化抗体
から溶出させること忙よって行われる。
環境のｐＨを約２〜３に低下させ、阻害剤を固定化抗体
から溶出させること忙よって行われる。
また、本発明は血管の新生が関与しているヒトおよび他
の動物の疾患を、精製血管新生阻害剤の有効量を担体と
混合して投与することにより治療する方法を提供する。
の動物の疾患を、精製血管新生阻害剤の有効量を担体と
混合して投与することにより治療する方法を提供する。
投与方法としては、静脈内、局所、眼内、結膜下、筋肉
内もしくは包膜下投執または直接注射がおる。治療でき
る疾患は、糖尿病性網膜症、老人性黄斑部変性、慢性関
節リウマチ、充実性腫瘍、創傷治癒時の過剰鍛痕形成を
挙げることができる。好ましい態様においては、治療有
効量の血管新生阻害剤を医薬的に許容される担体と混合
して静脈内投与する。
内もしくは包膜下投執または直接注射がおる。治療でき
る疾患は、糖尿病性網膜症、老人性黄斑部変性、慢性関
節リウマチ、充実性腫瘍、創傷治癒時の過剰鍛痕形成を
挙げることができる。好ましい態様においては、治療有
効量の血管新生阻害剤を医薬的に許容される担体と混合
して静脈内投与する。
本発明はまた、治療有効量の血管新生阻害剤を医薬的に
許容される担体と混合してなる組成物に関する。
許容される担体と混合してなる組成物に関する。
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の記述にお
いて一部説明する。また、一部は以下の記述から自明で
あり、また発明の実施によって習得できるものである。
いて一部説明する。また、一部は以下の記述から自明で
あり、また発明の実施によって習得できるものである。
これらの目的および利点は、とくに特許請求の範囲に指
摘の手段および組合せによって実現できる。
摘の手段および組合せによって実現できる。
発明の詳細な記述
本発明の好ましい態様について詳細に論及する。
この記述と以下の実施例によって、本発明の原理を明確
にするものである。
にするものである。
本発明は、血管新生阻害剤、とくに単離され、精製もし
くはほぼ精製されｔ形の阻害剤に関する。
くはほぼ精製されｔ形の阻害剤に関する。
本明細書において用いられる「血管新生阻害剤」の語は
、新しい血管の形成を阻害するおよび（ま几は）新しく
形成され友血管を退行させる物質を意味する。本発明の
血管新生阻害剤は、好ましくは、分子量約５７，０００
±３．０００、等電点的４．６±０．３のポリペプチド
であり、酸性環境で安定である。この酸性環境は約２〜
６程度の−でよい。
、新しい血管の形成を阻害するおよび（ま几は）新しく
形成され友血管を退行させる物質を意味する。本発明の
血管新生阻害剤は、好ましくは、分子量約５７，０００
±３．０００、等電点的４．６±０．３のポリペプチド
であり、酸性環境で安定である。この酸性環境は約２〜
６程度の−でよい。
本発明の血管新生阻害剤は網膜色素上皮細胞およびヒト
線維芽細胞の分路液中に発見され、はじめて単離され、
精製された形に製造されたものである。本発明の目的に
おいて、開示され九血管新生阻讐剤について用いられる
「純粋な」または「精製されｋ」の語は、血管新生阻害
剤ポリペプチドでない他のポリペプチドを含まない形を
意味する。本発明の［＃され友血管新生阻害剤は、少な
くとも９０％、好ましくは９５％の純度を有する。
線維芽細胞の分路液中に発見され、はじめて単離され、
精製された形に製造されたものである。本発明の目的に
おいて、開示され九血管新生阻讐剤について用いられる
「純粋な」または「精製されｋ」の語は、血管新生阻害
剤ポリペプチドでない他のポリペプチドを含まない形を
意味する。本発明の［＃され友血管新生阻害剤は、少な
くとも９０％、好ましくは９５％の純度を有する。
さらに、本発明のほぼ精製され几血管新生阻害剤は有意
な抗血管新生活性をもっことが明らかにされｔ０開示さ
れ几血管新生阻害剤について用いられる「はぼ精製され
几」の語は少なくとも約７０％の阻害剤であることを意
味する。
な抗血管新生活性をもっことが明らかにされｔ０開示さ
れ几血管新生阻害剤について用いられる「はぼ精製され
几」の語は少なくとも約７０％の阻害剤であることを意
味する。
本発明の血管新生阻害剤は、以下の方法によって純粋な
形に製造さｎる。
形に製造さｎる。
（ａ） 網膜色素上皮細胞またはヒト線維芽細胞を集
める （ｂ） この細胞を培養メジウム中で生育させる（Ｃ
） このメジウムから血’ｔＷＲ生阻害剤を回収する （ｄ） 血管新生阻害剤を精製する 本発明の好ましい形態においては、網膜色素上皮細胞は
ヒトの眼から得られる。しかしながら、コノヨうな細胞
は、他の動物から、とくにタペタムを欠く動物の眼から
も得ることができる。このような眼は形態学的にヒトの
眼に類似し、したがってその網膜色素上皮細胞には、タ
ペタムを有する動物の眼から誘導さｎる細胞よりも高レ
ベルの皿・ぎ新生阻害剤の産生が期待できる。ブタは、
本発明者により、血−ｖｔ新生阻沓剤の産生が発見され
た網膜色素上皮細胞をもつ動物の１檎である。
める （ｂ） この細胞を培養メジウム中で生育させる（Ｃ
） このメジウムから血’ｔＷＲ生阻害剤を回収する （ｄ） 血管新生阻害剤を精製する 本発明の好ましい形態においては、網膜色素上皮細胞は
ヒトの眼から得られる。しかしながら、コノヨうな細胞
は、他の動物から、とくにタペタムを欠く動物の眼から
も得ることができる。このような眼は形態学的にヒトの
眼に類似し、したがってその網膜色素上皮細胞には、タ
ペタムを有する動物の眼から誘導さｎる細胞よりも高レ
ベルの皿・ぎ新生阻害剤の産生が期待できる。ブタは、
本発明者により、血−ｖｔ新生阻沓剤の産生が発見され
た網膜色素上皮細胞をもつ動物の１檎である。
別の態様においては、血管新生阻害剤の原料として、ヒ
ト線維芽細胞が使用さ詐る。とくにヒト反膚巌維芽細胞
が好ましい。
ト線維芽細胞が使用さ詐る。とくにヒト反膚巌維芽細胞
が好ましい。
これらの細胞に本技術分野においてよく知られた各櫨手
段により東めることかできる。九とえばカンホキアロほ
か（Ｐ、Ａ、 Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ Ｊ 、Ａ。
段により東めることかできる。九とえばカンホキアロほ
か（Ｐ、Ａ、 Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ Ｊ 、Ａ。
Ｊｓｒｄａｎ ＆ Ｂ、Ｍ、 ＧＬａｓｅｒ ）により
アーカイプズ・オデ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ、
ＯｐｈｔｈａＬｍｏＬ、）、１０２．１８３０（１９８
４）に記述され九ように、アイバンクから得次死後のヒ
トの眼より収穫できる。ヒト線維芽細胞は、培養生物寄
託所に寄託された細胞系から得ることができる。このよ
うな細胞系の例としてはＡＴＣＣ／ｌ６ＣＲＬ １５５
４があり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ、 Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｓｃｔｉｏｎ。
アーカイプズ・オデ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ、
ＯｐｈｔｈａＬｍｏＬ、）、１０２．１８３０（１９８
４）に記述され九ように、アイバンクから得次死後のヒ
トの眼より収穫できる。ヒト線維芽細胞は、培養生物寄
託所に寄託された細胞系から得ることができる。このよ
うな細胞系の例としてはＡＴＣＣ／ｌ６ＣＲＬ １５５
４があり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ、 Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｓｃｔｉｏｎ。
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｖｎ Ｄｒ、、 Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ。
ｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ。
ＵＳＡ、 ２０８５２ ］から入手できる。
血ｆ耕生阻害剤座生細胞は、本技術分野でよく矧ら′ｔ
′Ｌ７を方法を用いて冶誉液中で生育させることができ
る。好ましい感体においては、網膜色素上皮細胞を、血
清含有最少必須培地〔たとえば２０チウシ胎仔血清（Ｍ
Ｅ！Ｍ ／ ２０ ） ｔ−含むイーグル最少必須培地
〕を入れたフラスコ中で生育させる。
′Ｌ７を方法を用いて冶誉液中で生育させることができ
る。好ましい感体においては、網膜色素上皮細胞を、血
清含有最少必須培地〔たとえば２０チウシ胎仔血清（Ｍ
Ｅ！Ｍ ／ ２０ ） ｔ−含むイーグル最少必須培地
〕を入れたフラスコ中で生育させる。
しかしながら、唾乳類動物細胞の生育用に設計されｍ任
意の培養メジウムがこの目的に適している。
意の培養メジウムがこの目的に適している。
細胞はメジウム中に約６．６ Ｘ １０５個／７Ｅｌｌ
Ｉ”フラスコの密度で置く。細胞をメジウム中に加えて
から約１０〜１１日で過果密に達する。デキサメサゾン
を好ましくは約１０−７Ｍの濃度、細胞が過果密に到達
後にメジウムに添加すると、阻害剤の産生を増大させる
ことができる。細胞が過果密疼到達し友のち、フラスコ
ヲ況浄して、ウシ胎仔血清ｔ−除去し、血清を含まない
必須培地を加える。
Ｉ”フラスコの密度で置く。細胞をメジウム中に加えて
から約１０〜１１日で過果密に達する。デキサメサゾン
を好ましくは約１０−７Ｍの濃度、細胞が過果密に到達
後にメジウムに添加すると、阻害剤の産生を増大させる
ことができる。細胞が過果密疼到達し友のち、フラスコ
ヲ況浄して、ウシ胎仔血清ｔ−除去し、血清を含まない
必須培地を加える。
血清の除去は阻害剤の回収２よびｎＩ展を容易にするが
、本発明の実施に際して必須ではない。約２４〜７２時
間後、好ましくは４８時間後に、調節され九メジウム、
すなわち血管新生阻害剤を含むメジウムを取り、遠心分
離して残つｆｃ細胞を分離し、除去する。別の態様にお
いては、網膜色素上皮細胞を亜ｊ１！密まで生育させる
。これは細Ｉｉ８をメジウム中に上述の濃度に置いてか
ら約６〜４日で到達する。細胞が亜果慴に遅し几のち、
デキサメサゾンを好ましくは１０−’ Ｍの濃度に添即
する。
、本発明の実施に際して必須ではない。約２４〜７２時
間後、好ましくは４８時間後に、調節され九メジウム、
すなわち血管新生阻害剤を含むメジウムを取り、遠心分
離して残つｆｃ細胞を分離し、除去する。別の態様にお
いては、網膜色素上皮細胞を亜ｊ１！密まで生育させる
。これは細Ｉｉ８をメジウム中に上述の濃度に置いてか
ら約６〜４日で到達する。細胞が亜果慴に遅し几のち、
デキサメサゾンを好ましくは１０−’ Ｍの濃度に添即
する。
メジウムを洗浄してウシ胎仔血清′を除去し、血清を含
まないメジウムを添加する。ついで細胞を血清を含まな
いメジウム中で生育させ、メジウムを取って阻害剤を回
収する。上述の方法および別法の態様において、網膜色
素上皮細胞の代わりにヒト線維芽細胞とくに皮膚線維芽
細肥を使用することができる。
まないメジウムを添加する。ついで細胞を血清を含まな
いメジウム中で生育させ、メジウムを取って阻害剤を回
収する。上述の方法および別法の態様において、網膜色
素上皮細胞の代わりにヒト線維芽細胞とくに皮膚線維芽
細肥を使用することができる。
皿ｆ新生阻害剤は本技術分野でよく知られ几技術により
、メジウムから単一され、精製される。
、メジウムから単一され、精製される。
この槌の技術としては、電気泳動、遠心分離、ｒル濾過
、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交埃クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免
役衣層アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液
体クロマトグラフィーおよびｒル浸透萬速液坏クロマト
グラフィーを含ｔｒ）、等電点゛醒気泳動ならびにそれ
らの変法および組脅せがある。これらの技術の１櫨また
は２櫨以上を順次、分子の＊埋的および化学的特性に応
じて分離するように設計されり操作に使用する。
、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交埃クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免
役衣層アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液
体クロマトグラフィーおよびｒル浸透萬速液坏クロマト
グラフィーを含ｔｒ）、等電点゛醒気泳動ならびにそれ
らの変法および組脅せがある。これらの技術の１櫨また
は２櫨以上を順次、分子の＊埋的および化学的特性に応
じて分離するように設計されり操作に使用する。
これらの特性としては、阻害剤の疎水性および分子量が
ある。それぞれの技術で得られ穴材料の各フラクション
について、血管新生まｆｃは血管新生に関与する細胞過
程の阻害能を試験する。この試験のうちの６ａｌ［を以
下の例６．４および５に記述する。抗血管新生活性を示
すフラクションを次に一連の操作における次の方法に付
し、また新しいフラクションについて再び試験を行う。
ある。それぞれの技術で得られ穴材料の各フラクション
について、血管新生まｆｃは血管新生に関与する細胞過
程の阻害能を試験する。この試験のうちの６ａｌ［を以
下の例６．４および５に記述する。抗血管新生活性を示
すフラクションを次に一連の操作における次の方法に付
し、また新しいフラクションについて再び試験を行う。
この方法を、血管新生阻害能を有する唯一のフラクショ
ンが残り、そのフラクションがポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単一のバンドを示すようになるまでくり返す
。
ンが残り、そのフラクションがポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単一のバンドを示すようになるまでくり返す
。
好ましい態様に２いては、調節されたメジウムから細胞
を除去し、これを酸性環境中、分子量３．５００未満の
＠＊をすべて除去できるように設訂され九セルロース膜
を通して透析する。このような４１硯の−は約２〜６と
することが好ましい。
を除去し、これを酸性環境中、分子量３．５００未満の
＠＊をすべて除去できるように設訂され九セルロース膜
を通して透析する。このような４１硯の−は約２〜６と
することが好ましい。
酸性積項でのこの透析により、血ｐＨを新生阻害剤の活
性ｔ−阻薔する物質が除去されるようであるが、それは
本発明の契施に対し必須ではない。まｔｌこの透析は精
製過程の任意の段階で実施できるが、調歪メジウムの回
収、遠心分離後直ちに実施するのが好ましい。血管新生
阻害剤を含有する透析液は、以後の精製操作を妨害する
可能性がある懸濁固体があれば、それを除去するために
遠心分離してもよい。しかしながら、この遠心分離は本
発明の実施に必須ではない。得られ九上清を疎水的相互
作用クロマトグラフィー、とくに逆相高速液体クロマト
グラフィーに付す。これにより純度的７０％の血管新生
阻害剤が得られる。この時点で、この物質は明らかな抗
血管新生活性を示す。最終的な精製は、サイズ排除クロ
マトグラフィー、とくにｒル浸透＾速液体クロマトグラ
フィーによって行われる。こｎにより純置約９５％の血
管新生阻害剤が得られる。
性ｔ−阻薔する物質が除去されるようであるが、それは
本発明の契施に対し必須ではない。まｔｌこの透析は精
製過程の任意の段階で実施できるが、調歪メジウムの回
収、遠心分離後直ちに実施するのが好ましい。血管新生
阻害剤を含有する透析液は、以後の精製操作を妨害する
可能性がある懸濁固体があれば、それを除去するために
遠心分離してもよい。しかしながら、この遠心分離は本
発明の実施に必須ではない。得られ九上清を疎水的相互
作用クロマトグラフィー、とくに逆相高速液体クロマト
グラフィーに付す。これにより純度的７０％の血管新生
阻害剤が得られる。この時点で、この物質は明らかな抗
血管新生活性を示す。最終的な精製は、サイズ排除クロ
マトグラフィー、とくにｒル浸透＾速液体クロマトグラ
フィーによって行われる。こｎにより純置約９５％の血
管新生阻害剤が得られる。
本発明の他の態様に２いてゆ、血管新生！ｌｌ蕾剤を、
網膜色素上皮細胞ま九はヒト線維芽細胞から、本技術分
野においてよく仰られた方法によって直接抽出する。こ
のような方法のひとつとして、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ ）ら〔アメリカン・ジャーｆル・オデ・オフ
タルモロジー（Ａｍ、Ｊ。
網膜色素上皮細胞ま九はヒト線維芽細胞から、本技術分
野においてよく仰られた方法によって直接抽出する。こ
のような方法のひとつとして、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ ）ら〔アメリカン・ジャーｆル・オデ・オフ
タルモロジー（Ａｍ、Ｊ。
ＯｐｈｔｈａＬｍｏｌ、 ）、 ９Ｌ ５６６
（１９８４） ） の方法を用いグアニジン塩
酸塩で抽出する方法がある。抽出後、血管新年阻害剤は
、本技術分野においてよく知られ几、上述の方法を含む
他の方法で精製できる。
（１９８４） ） の方法を用いグアニジン塩
酸塩で抽出する方法がある。抽出後、血管新年阻害剤は
、本技術分野においてよく知られ几、上述の方法を含む
他の方法で精製できる。
ヒト網膜色素上皮細胞からの血管新生阻害剤の発見およ
びｎＩ製により、阻害剤に対する抗体の産生が可能にな
った。抗体は、それに対して産生ずるポリペプチドに高
度に％異的で高い親和性を示す。これを不浴性マトリッ
クスに納会させれば、それに対して産生ずるポリペプチ
ドを蛋白性のおよび他の物質の夜会混合物として容易か
つ効率的に分離できる。このような抗体の利用方法は本
技術分野においてよく知られていて、次とえばスニープ
ス（５ｃｏｐｅｓ ）著のｒｉ白質の精製：原理と実際
Ｊ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ：
Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ ）、
スジリンガ−・フエルラーク刊（８ｐｒｉｎｇ＊ｒ Ｖ
ｅｒｌａｇ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ） 、１３２〜１３６
頁（１９８２）に記載されている。これによってヒトＮ
４膜色素上皮細胞から誘導され几血管新生阻害剤に対す
る抗体と本技術分野においてよく知られ友技術を用い、
この阻害剤を産生ずる任意の細胞から、精製され九血ｆ
新生、阻害剤を回収することがはじめて可能になつ几。
びｎＩ製により、阻害剤に対する抗体の産生が可能にな
った。抗体は、それに対して産生ずるポリペプチドに高
度に％異的で高い親和性を示す。これを不浴性マトリッ
クスに納会させれば、それに対して産生ずるポリペプチ
ドを蛋白性のおよび他の物質の夜会混合物として容易か
つ効率的に分離できる。このような抗体の利用方法は本
技術分野においてよく知られていて、次とえばスニープ
ス（５ｃｏｐｅｓ ）著のｒｉ白質の精製：原理と実際
Ｊ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ：
Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ ）、
スジリンガ−・フエルラーク刊（８ｐｒｉｎｇ＊ｒ Ｖ
ｅｒｌａｇ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ） 、１３２〜１３６
頁（１９８２）に記載されている。これによってヒトＮ
４膜色素上皮細胞から誘導され几血管新生阻害剤に対す
る抗体と本技術分野においてよく知られ友技術を用い、
この阻害剤を産生ずる任意の細胞から、精製され九血ｆ
新生、阻害剤を回収することがはじめて可能になつ几。
したがって、このような精製され九血管新生阻沓剤も本
発明の範囲内に包含される。
発明の範囲内に包含される。
好ましい態様においては、精製され九血管新生阻薔剤は
、この阻害剤を産生じ、培養可能な任意の種類の細胞か
ら回収される。この方法は次のとおりである。
、この阻害剤を産生じ、培養可能な任意の種類の細胞か
ら回収される。この方法は次のとおりである。
（ａ） 血管新生阻害剤を産生じ、培養メジウム内で
生育可能な細胞を培養する （ｂ） 阻害剤を含有するメジウムを細胞から分離す
る （Ｃ） このメジウムを阻害剤に対する固定化抗体と
接触させて、メジウム中の阻害剤を抗体に結合させる （ｄ） 結合しｆｃ阻害剤を含まないメジウムを喀去
する （ｓ） 固定化抗体から阻害剤を分離し、精製されｔ
形で阻害剤を回収する 細胞の血’ｆｆｒ生阻害剤並生能を評価するには、本明
細書に開示し几方法を含めて本技術分野において知られ
た多くの方法がある。培養メジウム中で生育できる細胞
は、本明細書に開示し迄方法を含め友よく知らｎる方法
で培養できる。培養で生育できない細胞から公知の抽出
ま九は回収方法で血管新生阻害剤を回収する場合にも抗
体を使用できるが、限られた量のｎＩ製阻害剤しか回収
できないと思われる。
生育可能な細胞を培養する （ｂ） 阻害剤を含有するメジウムを細胞から分離す
る （Ｃ） このメジウムを阻害剤に対する固定化抗体と
接触させて、メジウム中の阻害剤を抗体に結合させる （ｄ） 結合しｆｃ阻害剤を含まないメジウムを喀去
する （ｓ） 固定化抗体から阻害剤を分離し、精製されｔ
形で阻害剤を回収する 細胞の血’ｆｆｒ生阻害剤並生能を評価するには、本明
細書に開示し几方法を含めて本技術分野において知られ
た多くの方法がある。培養メジウム中で生育できる細胞
は、本明細書に開示し迄方法を含め友よく知らｎる方法
で培養できる。培養で生育できない細胞から公知の抽出
ま九は回収方法で血管新生阻害剤を回収する場合にも抗
体を使用できるが、限られた量のｎＩ製阻害剤しか回収
できないと思われる。
血管新生阻害剤に対する抗体は本技術分野でよく知られ
比容４方法で製造できる。阻害剤をウサギ、ヤギ、ウマ
ま九は他の動物に注射してポリクロナール抗体を成虫さ
せてもよい。ついで動物から採血し、抗体の存在を二夏
拡歓法または１２５Ｉ標識プロテインＡを用い次抗体−
抗原集塊の検出によって調べることができる。ついで阻
害剤に対する抗体を血清から回収する。一般には、抗体
は部分精製するのみでよい。別の態様では、ポリクロナ
ール抗体の代わりにポリクロナール抗体を使用する。
比容４方法で製造できる。阻害剤をウサギ、ヤギ、ウマ
ま九は他の動物に注射してポリクロナール抗体を成虫さ
せてもよい。ついで動物から採血し、抗体の存在を二夏
拡歓法または１２５Ｉ標識プロテインＡを用い次抗体−
抗原集塊の検出によって調べることができる。ついで阻
害剤に対する抗体を血清から回収する。一般には、抗体
は部分精製するのみでよい。別の態様では、ポリクロナ
ール抗体の代わりにポリクロナール抗体を使用する。
抗体は、回収、製造を求めている特定な阻害剤を抗原と
して製造する必要にない。別の４類の細胞によって産生
される血管新生阻害剤も几がいに同一ま九は実質的にホ
モロジーを有すると考えられるので、ヒト網膜色素上皮
細胞から回収される阻害剤に対する抗体も別種の細胞で
産生する血管新生阻害剤に結合することを期待してよい
。
して製造する必要にない。別の４類の細胞によって産生
される血管新生阻害剤も几がいに同一ま九は実質的にホ
モロジーを有すると考えられるので、ヒト網膜色素上皮
細胞から回収される阻害剤に対する抗体も別種の細胞で
産生する血管新生阻害剤に結合することを期待してよい
。
抗体の固定化には種々の方法を使用できる。次にこの抗
体を血管新生阻害剤を含有する上清と接触させる。この
場合、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーの技
術上用いるのが好ましい。
体を血管新生阻害剤を含有する上清と接触させる。この
場合、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーの技
術上用いるのが好ましい。
この技術では、抗体ｔカラム中で吸着剤、たとえばシア
ノデンプロミド活性化アがロースにカップリングさせる
。上清をカラムに、阻害剤が固定化抗体と先金に相互作
用できる十分遅い速度で通過させる。カラムを洗浄し、
次に溶出して阻害剤を抗体から除去する。阻害剤の分離
には界面活性剤ま九は他の緩衝液を使用できるが、ｐＨ
を約２〜６に低下させてカラムから阻害剤′ｔ−除去し
、阻害剤を溶出するの力（好ましい。
ノデンプロミド活性化アがロースにカップリングさせる
。上清をカラムに、阻害剤が固定化抗体と先金に相互作
用できる十分遅い速度で通過させる。カラムを洗浄し、
次に溶出して阻害剤を抗体から除去する。阻害剤の分離
には界面活性剤ま九は他の緩衝液を使用できるが、ｐＨ
を約２〜６に低下させてカラムから阻害剤′ｔ−除去し
、阻害剤を溶出するの力（好ましい。
共通の構造要素と作用機構を有し、たがいにわずかなア
ミノ酸残基で相違する一群の血管新生阻害剤群を考える
ことも可能である。細胞から単一された阻害剤に加えて
、本発明の教示によりこのような一群の阻害剤が確認さ
れ比以上、化学的修飾によって上述のような阻害剤群を
製造することも可能であろう。このような修飾ははじめ
の阻害剤の活性を高めるように行うこともできるし、ま
ｍ活性には影４１を与えないように行うこともできる。
ミノ酸残基で相違する一群の血管新生阻害剤群を考える
ことも可能である。細胞から単一された阻害剤に加えて
、本発明の教示によりこのような一群の阻害剤が確認さ
れ比以上、化学的修飾によって上述のような阻害剤群を
製造することも可能であろう。このような修飾ははじめ
の阻害剤の活性を高めるように行うこともできるし、ま
ｍ活性には影４１を与えないように行うこともできる。
また、本発明により、油性阻害剤をコードする遺伝子の
クローニングも可能になる。この遺伝子がいつ九んクロ
ーニングされれば、活性物質の数多くの修飾が塩基のｔ
換により可となり、この修飾遺伝子の各種宿主への導入
が実現できる。したがって、本発明には、このような一
群の血管新生阻害剤を包含するものである。
クローニングも可能になる。この遺伝子がいつ九んクロ
ーニングされれば、活性物質の数多くの修飾が塩基のｔ
換により可となり、この修飾遺伝子の各種宿主への導入
が実現できる。したがって、本発明には、このような一
群の血管新生阻害剤を包含するものである。
Ｉｆｃ、本発明の血管新生阻害剤は、その活性に不必要
な１個または２個以上のアミノ酸配列を含有することが
考えられる。このような配列は、本技術分野においてよ
く知られた方法によって除去することができる。不必要
なアミノ酸配列は、トリジシンもしくはパパインまたは
関連蛋白分解酵素のような酵素を用いて限定され几蛋自
分解を行うことにより容易に除去できる。したがって、
このような阻害剤も、本発明の範囲内に包含される。
な１個または２個以上のアミノ酸配列を含有することが
考えられる。このような配列は、本技術分野においてよ
く知られた方法によって除去することができる。不必要
なアミノ酸配列は、トリジシンもしくはパパインまたは
関連蛋白分解酵素のような酵素を用いて限定され几蛋自
分解を行うことにより容易に除去できる。したがって、
このような阻害剤も、本発明の範囲内に包含される。
本発明の血管新生阻害剤は、血管新生が関与する扶患の
治療に使用できる。九とえば、本発明の血管新生阻害剤
は楯尿病性Ｎ４膜症や老人性黄斑部変性における血管新
生の阻害に用いられる。さらに、侵襲性腫瘍に供給され
る血管の形成を阻害し、腫瘍の退行を一発するｔめに使
用できる。本発明の皿’１ｆｆｉ生阻害剤はま九、リウ
マチに罹患した関節の軟骨の新生血管組織による侵襲を
防止するのに使用できる。また皮膚、腸ま九個の生体臓
器の過％鍛弧が問題になる場合、その血管新生を阻害す
るために使用できる。本発明の阻害剤は、創傷治癒時の
血管新生が問題を生じる他の疾患、友とえば、外傷、感
染、変性による角膜の何回もの傷害に続く角膜の血管新
生などにも使用できる。
治療に使用できる。九とえば、本発明の血管新生阻害剤
は楯尿病性Ｎ４膜症や老人性黄斑部変性における血管新
生の阻害に用いられる。さらに、侵襲性腫瘍に供給され
る血管の形成を阻害し、腫瘍の退行を一発するｔめに使
用できる。本発明の皿’１ｆｆｉ生阻害剤はま九、リウ
マチに罹患した関節の軟骨の新生血管組織による侵襲を
防止するのに使用できる。また皮膚、腸ま九個の生体臓
器の過％鍛弧が問題になる場合、その血管新生を阻害す
るために使用できる。本発明の阻害剤は、創傷治癒時の
血管新生が問題を生じる他の疾患、友とえば、外傷、感
染、変性による角膜の何回もの傷害に続く角膜の血管新
生などにも使用できる。
本発明の血管新生阻害剤は、血管新生阻害活性を有する
医薬製品の形でヒトおよび動物への使用を意図するもの
である。この医薬用製品は、活性成分の少なくともひと
つとして本発明の血管新生阻害剤を、適当な医薬的に許
容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤、および目的の
剤型に応じた他の賦形剤とともに含有する。経口投与の
場合には、活性蛋白質の消化管内での分解を防止する几
めの工程が必要になる。経口投与の場合に適当な剤型の
ひとつとして、腸溶性のコーティングを施した剤型があ
る。血管新生阻害剤を含有する医薬用製品は注射ま友は
局所通用剤型として局所的に、静脈内、眼内、結膜下、
筋肉内および包膜内に投与することもできる。投与方法
は関係する疾患に応じて必然的に決定される。
医薬製品の形でヒトおよび動物への使用を意図するもの
である。この医薬用製品は、活性成分の少なくともひと
つとして本発明の血管新生阻害剤を、適当な医薬的に許
容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤、および目的の
剤型に応じた他の賦形剤とともに含有する。経口投与の
場合には、活性蛋白質の消化管内での分解を防止する几
めの工程が必要になる。経口投与の場合に適当な剤型の
ひとつとして、腸溶性のコーティングを施した剤型があ
る。血管新生阻害剤を含有する医薬用製品は注射ま友は
局所通用剤型として局所的に、静脈内、眼内、結膜下、
筋肉内および包膜内に投与することもできる。投与方法
は関係する疾患に応じて必然的に決定される。
血管新生阻害剤の投与量は、治療すべき特定の疾患によ
って決定される。このような決定は本技術分野の通常の
熟練者により治療用量の決定に際し定常作業として行わ
れるものであり、過度の実験を行わずに定常的に実施さ
れる課題の範囲内である。しかしながら、本発明の血管
新生阻害剤の効果をウシ含有犬動脈内皮細胞の生存率に
ついてみ７ｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験から、本発明の
血管新生阻害剤は大過剰に与えても拗性を発現しないし
、またヒトあるいは他の動物に投与しても不都合な反応
は生じないと考えられる。
って決定される。このような決定は本技術分野の通常の
熟練者により治療用量の決定に際し定常作業として行わ
れるものであり、過度の実験を行わずに定常的に実施さ
れる課題の範囲内である。しかしながら、本発明の血管
新生阻害剤の効果をウシ含有犬動脈内皮細胞の生存率に
ついてみ７ｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験から、本発明の
血管新生阻害剤は大過剰に与えても拗性を発現しないし
、またヒトあるいは他の動物に投与しても不都合な反応
は生じないと考えられる。
本発明の教示を特定の問題ま几は撰境に適用するに際し
ては、本明細誉における教示を参照に、本技術分野にお
ける通常の熟練者の能力が必要であることを理解すべき
である。以下の実施例に電率発明の生成物、その製造方
法およびその利用方法を例示する。
ては、本明細誉における教示を参照に、本技術分野にお
ける通常の熟練者の能力が必要であることを理解すべき
である。以下の実施例に電率発明の生成物、その製造方
法およびその利用方法を例示する。
例 １
網膜色承上皮（ＲＰＥ）細胞は、メリーランドのメディ
カル・アイ・バンク〔カンホキアロほか（Ｐ。
カル・アイ・バンク〔カンホキアロほか（Ｐ。
Ａ、 Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ＊ Ｊ、Ａ、 Ｊｅｒｄ
ａｎ ＆ Ｂ、Ｍ、 Ｇｌａｓｅｒ ）：アーカイデズ
・オフ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ。
ａｎ ＆ Ｂ、Ｍ、 Ｇｌａｓｅｒ ）：アーカイデズ
・オフ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ。
ｏｐｈｔ、ｈａｌｍｏｌ、）、 １０２ｔ １８３０
（１９８４）参照〕から得九死後のヒトの眼より収穫し
た。この細）ｍｔ２０％ウシ胎仔血清含有イーグル最少
必須培地（′ＭＸＭ／２０）を取つに７５信にフラスコ
中、５％ＣＯ２通気下６７℃で生育させｔ。ＲＰＢ細胞
は１週間に１回継代培養した。２回ないし４回継代し几
細胞を使用し九〇 例 ２ 網膜色素上皮細胞調螢メジウム（′ＲＰｇ−ＣＭ ）は
次のようにして製造し友。’ＦＪ？Ｂ細胞は、７５ｃｒ
ｎ”組織培養フラスコを用い、２０−のＭＦ、Ｍ ／
２０中、６．６Ｘ１０’個の密度で播い友。メジウムは
６日に１回交換し丸。６日後、培養物μ集密状態に達゛
し九〇集密時の’ａｐｇ細胞の濃度は３．５〜４．０×
１０６個／ ７５ ｃ、ｖにフラスコであつ几。ついで
、各フラスコを１０−のへンク平衡塩類溶液で６回洸浄
した。最終洗浄後、各フラスコに血清を含まないイーグ
ルの最少必須培地（ＭＥＭｌｏ ） １［１ｍを加え九
０４８時間後にａ１１メジウムを取り出御遠心分離して
ＲＰＥ細胞を砿去した。上清（ＲＰＢ −ＣＭ ）は使
用時まで一２０℃に保存し次。ＲＰＢ細胞をＭＦ！Ｍ
／ ０に移すまで１０チウシ胎仔血清含有イーグル最少
必須培地（ＭＥＭｌｏ）で生育しても同じ結果が得られ
ｍ０過果密培養から得られ九ＲＰＦ！−ＣＭを以下の例
６〜７の実験に用い次。
（１９８４）参照〕から得九死後のヒトの眼より収穫し
た。この細）ｍｔ２０％ウシ胎仔血清含有イーグル最少
必須培地（′ＭＸＭ／２０）を取つに７５信にフラスコ
中、５％ＣＯ２通気下６７℃で生育させｔ。ＲＰＢ細胞
は１週間に１回継代培養した。２回ないし４回継代し几
細胞を使用し九〇 例 ２ 網膜色素上皮細胞調螢メジウム（′ＲＰｇ−ＣＭ ）は
次のようにして製造し友。’ＦＪ？Ｂ細胞は、７５ｃｒ
ｎ”組織培養フラスコを用い、２０−のＭＦ、Ｍ ／
２０中、６．６Ｘ１０’個の密度で播い友。メジウムは
６日に１回交換し丸。６日後、培養物μ集密状態に達゛
し九〇集密時の’ａｐｇ細胞の濃度は３．５〜４．０×
１０６個／ ７５ ｃ、ｖにフラスコであつ几。ついで
、各フラスコを１０−のへンク平衡塩類溶液で６回洸浄
した。最終洗浄後、各フラスコに血清を含まないイーグ
ルの最少必須培地（ＭＥＭｌｏ ） １［１ｍを加え九
０４８時間後にａ１１メジウムを取り出御遠心分離して
ＲＰＥ細胞を砿去した。上清（ＲＰＢ −ＣＭ ）は使
用時まで一２０℃に保存し次。ＲＰＢ細胞をＭＦ！Ｍ
／ ０に移すまで１０チウシ胎仔血清含有イーグル最少
必須培地（ＭＥＭｌｏ）で生育しても同じ結果が得られ
ｍ０過果密培養から得られ九ＲＰＦ！−ＣＭを以下の例
６〜７の実験に用い次。
別に、細胞濃度の影響を−ぺる几めに、亜果密４養物を
用い７′Ｃ″！Ｉ４験のために細胞を播い友のち６〜４
日でメジウムを調整し、また過果イ培養物を用い九実験
の几めに細胞を播い友のＰ）１０〜１１日でメジウムを
調整し几。亜集密および過集密培誉から得らｎ 九ＲＰ
Ｆ！−ＣＭは以下の例５および８の実験に用い友。
用い７′Ｃ″！Ｉ４験のために細胞を播い友のち６〜４
日でメジウムを調整し、また過果イ培養物を用い九実験
の几めに細胞を播い友のＰ）１０〜１１日でメジウムを
調整し几。亜集密および過集密培誉から得らｎ 九ＲＰ
Ｆ！−ＣＭは以下の例５および８の実験に用い友。
例 ６
トリ胚卵嚢上での皿ｆ新生に対するＲＰＥ−ＣＭの効果
音ティラーらの方法の変法を用いて評価し九〔ティラー
ほか（Ｓ、 ＴａｙＬｏｒ ＆ Ｊ 、 Ｆｏｌｋｍａ
ｎ ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２９７． ３
０７ （１９８２）ｌ。
音ティラーらの方法の変法を用いて評価し九〔ティラー
ほか（Ｓ、 ＴａｙＬｏｒ ＆ Ｊ 、 Ｆｏｌｋｍａ
ｎ ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２９７． ３
０７ （１９８２）ｌ。
Ｓ日齢の白色レグホンの受精卵を開き、その内容物をプ
ラスチック製の小コツプ上に渡したグラスチックラップ
上に注意深く置き、トリ胚および血管新生阻害剤が完全
に観察できるようにし九。卵を６７℃で６時間インキュ
ベー）Ｌ＊ｏｐ４整メジウムは、アミ：＝ｙ ｙ （Ａ
ｍ１ｃｏｎ ）ＹＭ １０フイルターを用いて限外ろ過
して、５倍に濃縮し九〇フィルターディスク〔径１６繕
、臥ＴＦＯ１３００；ミリボア社（ＭｉＬＬｉｐｏｒｅ
）、ＭＡ］の中心部に４鴎の円形の孔部を設け、濃縮
調整メジウムに１時間浸漬した。ついでフィルターディ
スクを血−新生卵黄素上に置い九。２４時間後に、卵黄
嚢の血管新生をフィルターディスクの中央孔部内でツア
イス（Ｚｅｉｓｓ ）操作顕！鏡（Ｍａｇ ＝ ２６０
Ｘ ）を用イて観察し、退行の徴候を調ぺｍ０フイル
ターデイスクの中央孔部内の卵黄嚢血管新生に対する副
査メジウムの効果を、血管新生の退行、有（＋）ま几は
無（−）と判定し一〇フィルターの中央孔部内面積の少
なくとも７５％が無皿管の場合、退行：有とじ九。
ラスチック製の小コツプ上に渡したグラスチックラップ
上に注意深く置き、トリ胚および血管新生阻害剤が完全
に観察できるようにし九。卵を６７℃で６時間インキュ
ベー）Ｌ＊ｏｐ４整メジウムは、アミ：＝ｙ ｙ （Ａ
ｍ１ｃｏｎ ）ＹＭ １０フイルターを用いて限外ろ過
して、５倍に濃縮し九〇フィルターディスク〔径１６繕
、臥ＴＦＯ１３００；ミリボア社（ＭｉＬＬｉｐｏｒｅ
）、ＭＡ］の中心部に４鴎の円形の孔部を設け、濃縮
調整メジウムに１時間浸漬した。ついでフィルターディ
スクを血−新生卵黄素上に置い九。２４時間後に、卵黄
嚢の血管新生をフィルターディスクの中央孔部内でツア
イス（Ｚｅｉｓｓ ）操作顕！鏡（Ｍａｇ ＝ ２６０
Ｘ ）を用イて観察し、退行の徴候を調ぺｍ０フイル
ターデイスクの中央孔部内の卵黄嚢血管新生に対する副
査メジウムの効果を、血管新生の退行、有（＋）ま几は
無（−）と判定し一〇フィルターの中央孔部内面積の少
なくとも７５％が無皿管の場合、退行：有とじ九。
ＲＰＢ細胞で調整され九メジウム（ＲＰＬｉ！−ＣＭ）
に浸漬しｍろ紙ディスクを、血管新生阻害剤の表面に置
くと、隣接毛細管の退行を生じ、局限され几無血管領域
を生じ友。ＲＰＴ！、−ＣＭ ＩＣ浸漬したろ紙に隣接
し几卵黄嚢の血管を組織学的に検査し九ところ、血小板
によって閉基さｎ、赤血球が光填してい九〇これは角膜
における血管退行の外観と類似する。
に浸漬しｍろ紙ディスクを、血管新生阻害剤の表面に置
くと、隣接毛細管の退行を生じ、局限され几無血管領域
を生じ友。ＲＰＴ！、−ＣＭ ＩＣ浸漬したろ紙に隣接
し几卵黄嚢の血管を組織学的に検査し九ところ、血小板
によって閉基さｎ、赤血球が光填してい九〇これは角膜
における血管退行の外観と類似する。
例 ４
リフキン（Ｒｌｆｋｉｎ）らは、ウシ毛細管へ皮細胞を
網膜抽出物で刺激するとプラスミノーデンアクテイペー
ターとコラ−ゲナーゼの産生が増大すると報告している
〔リフキンら（Ｄ、Ｂ、 Ｒｌｆｋｉｎ。
網膜抽出物で刺激するとプラスミノーデンアクテイペー
ターとコラ−ゲナーゼの産生が増大すると報告している
〔リフキンら（Ｄ、Ｂ、 Ｒｌｆｋｉｎ。
Ｊ、Ｌ、 Ｇｒｏｓｓ、 Ｄ、 Ｍｏ５ｃａｔｓＬｌｉ
＆ｌ Ｅ、 Ｊａｆｆｅ ）、内ＭＬａ胞の病理生物
学（Ｐａｔｈｏｂｉ＊１ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅＦ！ｎｄ
ｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａ１ｌ ）、ノセルほか（Ｈ，Ｌ
。
＆ｌ Ｅ、 Ｊａｆｆｅ ）、内ＭＬａ胞の病理生物
学（Ｐａｔｈｏｂｉ＊１ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅＦ！ｎｄ
ｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａ１ｌ ）、ノセルほか（Ｈ，Ｌ
。
Ｎｏ５ｓｅｌ ＆ Ｊ 、Ｈ，Ｖｏｇｅｌ ） ｄ４、
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）刊、１９８２年、１９１〜１
９７頁〕。グレーデー（Ｇｌａｓｅｒ）らμ、ＦＢＡＥ
細胞も網膜抽出物（凹）に応答し、ゾラスミノーデンア
クテイベーターとコラーデナーゼの放出が増大すると報
告している〔グレーデーほか（Ｂ、Ｍ、 ＧＬａｓｅｒ
、 Ｔ、ＫａＬｅｂｉｃ、 ８． Ｇａｒｔ）ｉｓａ＋
Ｔ、Ｂ、 Ｃｏｎｎｏｒ Ｊｒ、＆ Ｌ、Ａ、 Ｌｉｏ
ｔｔａ ） 、脈管系の発達、チバ基金シンポジウム１
００ （ＤｅｖｅＬｏｐ−ｍｓｎｔ ｏｆ ｔｈｅ
Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔａｍ、Ｃ１ｂａ
Ｆｏｕｎｄａ−ｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉ ［
］ Ｑ ） 、ヌジエントはか（Ｊ。
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）刊、１９８２年、１９１〜１
９７頁〕。グレーデー（Ｇｌａｓｅｒ）らμ、ＦＢＡＥ
細胞も網膜抽出物（凹）に応答し、ゾラスミノーデンア
クテイベーターとコラーデナーゼの放出が増大すると報
告している〔グレーデーほか（Ｂ、Ｍ、 ＧＬａｓｅｒ
、 Ｔ、ＫａＬｅｂｉｃ、 ８． Ｇａｒｔ）ｉｓａ＋
Ｔ、Ｂ、 Ｃｏｎｎｏｒ Ｊｒ、＆ Ｌ、Ａ、 Ｌｉｏ
ｔｔａ ） 、脈管系の発達、チバ基金シンポジウム１
００ （ＤｅｖｅＬｏｐ−ｍｓｎｔ ｏｆ ｔｈｅ
Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔａｍ、Ｃ１ｂａ
Ｆｏｕｎｄａ−ｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉ ［
］ Ｑ ） 、ヌジエントはか（Ｊ。
Ｎｕｇｅｎｔ ＆ Ｍ、 Ｏ’Ｃｕｎｎｏｒ ）編、ピ
ットマン（Ｐｉｔｍａｎ、 Ｌｏｎｄｏｎ ）、１９８
６年刊、１５８〜１６２頁；カレビツクほか（Ｔ、Ｋａ
ｌｅｂｉｃ、 Ｓ。
ットマン（Ｐｉｔｍａｎ、 Ｌｏｎｄｏｎ ）、１９８
６年刊、１５８〜１６２頁；カレビツクほか（Ｔ、Ｋａ
ｌｅｂｉｃ、 Ｓ。
Ｇａｒｂｉｓａ、 Ｂ、 Ｍ、 ＧＬａｓｅｒ ＆ Ｌ
、Ａ、 Ｌｉｏｔｔａ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｓ）、 ２２１ 、２８１ （１９８３））。
、Ａ、 Ｌｉｏｔｔａ ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｓ）、 ２２１ 、２８１ （１９８３））。
したがって、これらの生物学的マーカーに関しては、Ｆ
ＢＡＥは毛細管内反細胞に類似する。さらに、軟骨、大
動脈および水晶体からの血管新生阻害剤は大血管および
毛細管からの内皮細胞の増殖を阻害することが明らかに
されている〔アインシュタインほか（Ｒ，Ｋ１ｎ５ｔｓ
ｉｎ、 Ｎ、 Ｓｏｒｇｅｎｔｅ、 Ｌ、Ｓ。
ＢＡＥは毛細管内反細胞に類似する。さらに、軟骨、大
動脈および水晶体からの血管新生阻害剤は大血管および
毛細管からの内皮細胞の増殖を阻害することが明らかに
されている〔アインシュタインほか（Ｒ，Ｋ１ｎ５ｔｓ
ｉｎ、 Ｎ、 Ｓｏｒｇｅｎｔｅ、 Ｌ、Ｓ。
５ｏｂｌｅ、 Ａ、 Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｋ、Ｆ、、 Ｋ
ｕｅｔｔｎｅｒ ）、アメリカン・ジャーナル・オフ・
パンロジ−（Ａｍ、Ｊ。
ｕｅｔｔｎｅｒ ）、アメリカン・ジャーナル・オフ・
パンロジ−（Ａｍ、Ｊ。
Ｐａｔｈａｍ、）、７３，７６５（１９７３）；−？レ
ンほか（Ｓ、Ｂ、 Ｇｕｒｅｎ、 Ｒ，Ｅｉｎｓｔｓｉ
ｎ ＆ Ｌ Ｃｈｒｏｍｏｋｏｓ）。
ンほか（Ｓ、Ｂ、 Ｇｕｒｅｎ、 Ｒ，Ｅｉｎｓｔｓｉ
ｎ ＆ Ｌ Ｃｈｒｏｍｏｋｏｓ）。
アメリカン・ジャーナル・オフ・オフタルモロジー（Ａ
ｍ、 Ｊ、 ＯｐｈｔｈａｌｍｏＬ、）、８４ 、 ３
０５ （１９７７）；ウィリアムズはか（Ｇ、Ａ、 Ｗ
ｉｌＬｉａｍｓ、 Ｒ，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ。
ｍ、 Ｊ、 ＯｐｈｔｈａｌｍｏＬ、）、８４ 、 ３
０５ （１９７７）；ウィリアムズはか（Ｇ、Ａ、 Ｗ
ｉｌＬｉａｍｓ、 Ｒ，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ。
Ｂ、 ８ｃｈｕｍａｃｈｅｒ、 Ｋ、Ｈｓｉａｏ ＆
Ｄ、Ｇｒａｎｔ ）、アメリカン・ジャーナル・オフ・
オフタルモロジー（Ａｍ。
Ｄ、Ｇｒａｎｔ ）、アメリカン・ジャーナル・オフ・
オフタルモロジー（Ａｍ。
Ｊ、 ０ｐｈｔｈａ１．ｍｏｌ、 ）、９７． ３６６
（１９８４））。
（１９８４））。
これらを考慮すると、大血管、小血管いずれの内皮細胞
も血管新生阻害剤に感受性を示すものと思われる。
も血管新生阻害剤に感受性を示すものと思われる。
ウシ含有犬動脈内皮（ＦＢＡＥ）細胞を、グレーデー（
ＧＬａｓｅｒ）ら〔ジャーナル・オフ・セル、／々イオ
ロジー（Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、８４，２９
８（１９８０））の方法を用い、ＭＥＭ ／ １０含有
７５♂フアルコンフラスコ中で生育され友。細胞は３７
”０１５％ＣＯ２下にインキュベートし、１週間に２回
継代培養し九〇４〜１３回継代培養し上細胞を実験に用
い几。すべての実験は６櫨の別のプレバレージョンから
の内皮細肥ヲ用いて反復したが、結果は同じであった。
ＧＬａｓｅｒ）ら〔ジャーナル・オフ・セル、／々イオ
ロジー（Ｊ 、 Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、８４，２９
８（１９８０））の方法を用い、ＭＥＭ ／ １０含有
７５♂フアルコンフラスコ中で生育され友。細胞は３７
”０１５％ＣＯ２下にインキュベートし、１週間に２回
継代培養し九〇４〜１３回継代培養し上細胞を実験に用
い几。すべての実験は６櫨の別のプレバレージョンから
の内皮細肥ヲ用いて反復したが、結果は同じであった。
培養したＦＢＡ３細胞を２４個のウェルをもつプレート
（Ｆａｌｃｏｎ ）に、ＭＸＭ／１０中各ウェルにつき
４５，０００細廊の濃度で播き、３７℃、５−ＣＯ２で
インキュベートし九。１６時間後にウェルを■温１０で
洗浄し、１ＷＬｔの匹Ｍ／Ｃｌま九は’ＲＰＥ−ＣＭで
ｆＲたし、希釈（１：２０）網膜抽出物（ＲＥ）は添加
ま九は非添加とし友。部は、グレーデーほか（Ｂ、Ｍ、
Ｇｌａｓｅｒ、 Ｐ、Ａ、 Ｄ’Ａｍｏｒｅ、 Ｒ，
Ｇ。
（Ｆａｌｃｏｎ ）に、ＭＸＭ／１０中各ウェルにつき
４５，０００細廊の濃度で播き、３７℃、５−ＣＯ２で
インキュベートし九。１６時間後にウェルを■温１０で
洗浄し、１ＷＬｔの匹Ｍ／Ｃｌま九は’ＲＰＥ−ＣＭで
ｆＲたし、希釈（１：２０）網膜抽出物（ＲＥ）は添加
ま九は非添加とし友。部は、グレーデーほか（Ｂ、Ｍ、
Ｇｌａｓｅｒ、 Ｐ、Ａ、 Ｄ’Ａｍｏｒｅ、 Ｒ，
Ｇ。
ＭｉｃｈａＬａ ； Ａ、 Ｐａｔｚ ＆ Ａ、 Ｆｅ
ｎ５ｅＬａｕ ）の記載〔ジャーナル・オフ・セλ・バ
イオロジー（Ｊ、ＣｅＬＬＢｉｏｌ、）、８４，２９８
（１９８０））に従って調製した。２４時間後に細胞を
トリプシン処理し、コールタ−カウンターで計数しｍｏ
すべ【の非希釈１４壷メジウムの濃度は、ウシ血清アル
ブミンを標準としてローｊＪ −（Ｌ＋ｏｗｒｙ）法で
測定し九カｔ４００〜５００μｓ／ｍｌの範囲であつ几
〔ローリ−はカ）（０，Ｈ，Ｌｏｖｒｙ、 Ｎ、Ｊ、
Ｒｏｇｅｂｒ＊ｕｇｈ、 Ａ、Ｌ、 Ｆａｒｒ ＆ＲＪ
、 ＲａｎｄａＬｌ ）、ジャーナル・オフ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ −Ｃｈｅｍ、
） −１９３ｅ２６５（１９５１））。
ｎ５ｅＬａｕ ）の記載〔ジャーナル・オフ・セλ・バ
イオロジー（Ｊ、ＣｅＬＬＢｉｏｌ、）、８４，２９８
（１９８０））に従って調製した。２４時間後に細胞を
トリプシン処理し、コールタ−カウンターで計数しｍｏ
すべ【の非希釈１４壷メジウムの濃度は、ウシ血清アル
ブミンを標準としてローｊＪ −（Ｌ＋ｏｗｒｙ）法で
測定し九カｔ４００〜５００μｓ／ｍｌの範囲であつ几
〔ローリ−はカ）（０，Ｈ，Ｌｏｖｒｙ、 Ｎ、Ｊ、
Ｒｏｇｅｂｒ＊ｕｇｈ、 Ａ、Ｌ、 Ｆａｒｒ ＆ＲＪ
、 ＲａｎｄａＬｌ ）、ジャーナル・オフ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ −Ｃｈｅｍ、
） −１９３ｅ２６５（１９５１））。
ａｗｒｖ＠加前にＦ’ＢＡ３細１ａｔ−各機濃度＋７）
ＭＢ−ＣＭでプレインキュペートシ几場合の効果につ
いても検討した。細胞を播いて１６時間後に、囮１０で
洗浄した。ついで調整メジウムをＭＩｉＭ ／ ０によ
り種々の濃度に希釈し、プレート上のウェルに添加し九
。第２のプレートのウェルはすべてＭＨ，ｈν′０単独
で満し露。各ウェル内の最終容量に１−とじ九。２４時
間後に各ウェルにＲ１１ｅｆ、加え、最終希釈度が１：
２０になるようにし友。さらに２４時間後に、細ｍｔ−
）！７ゾシン処理し計数した。
ＭＢ−ＣＭでプレインキュペートシ几場合の効果につ
いても検討した。細胞を播いて１６時間後に、囮１０で
洗浄した。ついで調整メジウムをＭＩｉＭ ／ ０によ
り種々の濃度に希釈し、プレート上のウェルに添加し九
。第２のプレートのウェルはすべてＭＨ，ｈν′０単独
で満し露。各ウェル内の最終容量に１−とじ九。２４時
間後に各ウェルにＲ１１ｅｆ、加え、最終希釈度が１：
２０になるようにし友。さらに２４時間後に、細ｍｔ−
）！７ゾシン処理し計数した。
ＲＰＦ！−ＣＭは網膜抽出物に対するＦＢＡＢ細胞の増
殖応答を阻害した。Ｎ４膜抽出物に応答しｚ ＦＢＡＫ
細胞の増殖に対するＲＰ］ｌｉ！−ＣＭの阻害能は、Ｎ
４膜抽出物の添加前にＦＢＡＥをＲＰｇ−ＣＭで２４時
間前処置することにより増大した。他の刺滅に応答した
ＦＢＡ３の増殖もＲＰ］ｌｅ−ＣＭが阻害できるかどう
かを調べるため、ウシ含有血清誘発ＦＢＡ３ ＠胞増殖
に対するＲＰＩｌｉ！−ＣＭの効果を検討し７？ｏ ５
％ウシ胎含有清中２４時間後のＦＢＡＫ ＠胞の生育は
即］１ｉ［’、−ＣＭの存在下に６０％低下し友。
殖応答を阻害した。Ｎ４膜抽出物に応答しｚ ＦＢＡＫ
細胞の増殖に対するＲＰ］ｌｉ！−ＣＭの阻害能は、Ｎ
４膜抽出物の添加前にＦＢＡＥをＲＰｇ−ＣＭで２４時
間前処置することにより増大した。他の刺滅に応答した
ＦＢＡ３の増殖もＲＰ］ｌｅ−ＣＭが阻害できるかどう
かを調べるため、ウシ含有血清誘発ＦＢＡ３ ＠胞増殖
に対するＲＰＩｌｉ！−ＣＭの効果を検討し７？ｏ ５
％ウシ胎含有清中２４時間後のＦＢＡＫ ＠胞の生育は
即］１ｉ［’、−ＣＭの存在下に６０％低下し友。
例 ５
ＣＭの作用
血管新生における第一工程のひとつは、将来新しい血管
が発生する部位の細胞外間質の局部的分解である。プラ
スミノーデンアクテイペーターによるシラスミノ−ｒン
の活性化はゾロテアーゼプラスミンを生成させ、この過
程に重要な役割を果にしていると思われる。したがって
、血管新生阻害剤はプラスミンま７ｔはゾラスミノーデ
ンアクテイペーターを阻害するものと考えられる。
が発生する部位の細胞外間質の局部的分解である。プラ
スミノーデンアクテイペーターによるシラスミノ−ｒン
の活性化はゾロテアーゼプラスミンを生成させ、この過
程に重要な役割を果にしていると思われる。したがって
、血管新生阻害剤はプラスミンま７ｔはゾラスミノーデ
ンアクテイペーターを阻害するものと考えられる。
ヒトＲＰＢ−ＣＭは ｚｇａｌ標繊フイデリンのゾラス
ミン仲介分％およびｏｇ、４質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌ−Ｌ７ａ−ｐ−ニトロアニリンのプラスミン仲
介分解を阻害し丸。さらに、ＲＰｇ−ＣＭに、ウロキナ
ーゼ様ゾラスミノーデ／アクティベーターの発成基質Ｎ
−Ｃｂｚ−Ａｒｇ−ＡＭＣの分解速度を低下させ次。さ
らに、＃１膜色素上皮細胞に−４されるプロテア−ぜ阻
害剤の放出は、ＲＮＡ（アクチノマイシンＤ）および蛋
白質（シクロヘキシイミド）仕成阻沓剤によって停止し
九。これに反し、細胞分裂の阻害（ヒドロキシ尿素）は
阻害剤の放出を低下させなかった。ヒト’ａｐｇａ胞の
亜集密および過集密培養では、３ＪＡ密培養に比べて有
意に高い阻害活性を示した。
ミン仲介分％およびｏｇ、４質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌ−Ｌ７ａ−ｐ−ニトロアニリンのプラスミン仲
介分解を阻害し丸。さらに、ＲＰｇ−ＣＭに、ウロキナ
ーゼ様ゾラスミノーデ／アクティベーターの発成基質Ｎ
−Ｃｂｚ−Ａｒｇ−ＡＭＣの分解速度を低下させ次。さ
らに、＃１膜色素上皮細胞に−４されるプロテア−ぜ阻
害剤の放出は、ＲＮＡ（アクチノマイシンＤ）および蛋
白質（シクロヘキシイミド）仕成阻沓剤によって停止し
九。これに反し、細胞分裂の阻害（ヒドロキシ尿素）は
阻害剤の放出を低下させなかった。ヒト’ａｐｇａ胞の
亜集密および過集密培養では、３ＪＡ密培養に比べて有
意に高い阻害活性を示した。
例 ６
ＲＰＢ−ＣＭの阻害効果の可逆性
例４に記載し丸ように、ＦＢＡＪ細胞を、■Ｍ１０、■
彊／Ｑ＋’ＲＩｅｔ九は舒Ｂ−Ｃ’Ｍ ＋ ’ＲＥで培
養した。
彊／Ｑ＋’ＲＩｅｔ九は舒Ｂ−Ｃ’Ｍ ＋ ’ＲＥで培
養した。
２４時間後にＦＢＡＩＢ細胞をトリプシン処理し、計数
し九。この時、ＭＢＭ ／ ＯまｆｃはＭｇＭ／ ０
＋ ’ＲＢ中に生育させ＊場寮細胞はそれまで生育させ
たと同じ新しいメジウムで洗浄し、再光填し九が、ＲＰ
Ｅ−ＣＭ ＋ ｌを含むウェルは一１０＋ＲＥの新しい
メジウムで況浄し、これに置換した。さらに２４時間後
に細胞をトリプシン処理し、計数し友。
し九。この時、ＭＢＭ ／ ＯまｆｃはＭｇＭ／ ０
＋ ’ＲＢ中に生育させ＊場寮細胞はそれまで生育させ
たと同じ新しいメジウムで洗浄し、再光填し九が、ＲＰ
Ｅ−ＣＭ ＋ ｌを含むウェルは一１０＋ＲＥの新しい
メジウムで況浄し、これに置換した。さらに２４時間後
に細胞をトリプシン処理し、計数し友。
ＲＰＥ−・ＣＭの除去により、ＦＢ超細胞の増殖は藺Ｅ
−ＣＭなしで生育させ几対照培養細胞の速度を回復し友
。
−ＣＭなしで生育させ几対照培養細胞の速度を回復し友
。
したがって、ＲＰＥ−ＣＭの阻害効果は可逆性であつ九
例 ７ ＦＢＡ３細胞の生存率に対するＲＰＦ；−ＣＭの影響Ｒ
ＰＥ−ＣＭが血管内１反細胞に対して毒性を示すかどう
かを調べる几め、ＦＢＡＥ細胞を濃ＲＰＥ−ＣＭ中で２
４時間生育させ友。ヒナの血管新生に用いた濃度でのＲ
ＰＥ−ＣＭは、トリパンブルー排除によって調べたが、
ＦＢＡＥ細胞に毒性を示さなかった。
例 ７ ＦＢＡ３細胞の生存率に対するＲＰＦ；−ＣＭの影響Ｒ
ＰＥ−ＣＭが血管内１反細胞に対して毒性を示すかどう
かを調べる几め、ＦＢＡＥ細胞を濃ＲＰＥ−ＣＭ中で２
４時間生育させ友。ヒナの血管新生に用いた濃度でのＲ
ＰＥ−ＣＭは、トリパンブルー排除によって調べたが、
ＦＢＡＥ細胞に毒性を示さなかった。
ＰＲＥ−ＣＭが血管退行を起こす能力は、１０分間の煮
沸およびトリプシン処理で消失し九。
沸およびトリプシン処理で消失し九。
さらに、予め標識しｆｃＦＢＡＥ細胞モルイヤーからの
↓４Ｃ−チミジンの消失によるＲＰＥ−ＣＭ添加後の細
胞の死滅の評価に用い九〔ニッケルほか（Ｒ，Ｈ，Ｅｃ
ｋｅｌ ＆ Ｗ、Ｙ、 Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ）、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）。
↓４Ｃ−チミジンの消失によるＲＰＥ−ＣＭ添加後の細
胞の死滅の評価に用い九〔ニッケルほか（Ｒ，Ｈ，Ｅｃ
ｋｅｌ ＆ Ｗ、Ｙ、 Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ）、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）。
１１４．１１８（１９８１））。ＦＢ憇細胞は例４に記
載し九と同様にして培養し九〇細胞を７５ ｄ ７ラス
コ中、フラスコア几り２Ｘ１０’細胞の濃度に播き、０
．００４μ（３１４Ｃ−チミジンを官むＭＥＭ／１Ｑと
４日間インキュベートシ友。
載し九と同様にして培養し九〇細胞を７５ ｄ ７ラス
コ中、フラスコア几り２Ｘ１０’細胞の濃度に播き、０
．００４μ（３１４Ｃ−チミジンを官むＭＥＭ／１Ｑと
４日間インキュベートシ友。
標識細胞をトリプシン処理し、２４個のウェルをもつプ
レートに、上述のようにウェルあ’；ｒｃｖ４５．００
０細胞濃度になるように細胞を播い九。
レートに、上述のようにウェルあ’；ｒｃｖ４５．００
０細胞濃度になるように細胞を播い九。
１６時間後ウェルを′ＭＢＭ ／ Ｑで洗浄し、臼１０
または各種濃度になるようにＲＰＥ−ＣＭを口１０で希
釈して加えｍ０全ウエルに１：２０希釈ＲＥを加えた。
または各種濃度になるようにＲＰＥ−ＣＭを口１０で希
釈して加えｍ０全ウエルに１：２０希釈ＲＥを加えた。
プレートをさらに２４時間、６７°０５ ％ ＣＯ２に
おいてインキュベートした。ついで、１μＣ１の３Ｈ−
チミジンを各ウェルに加え、さらに２時間インキュベー
トシ上。細胞の１′Ｃ−チミジンま几は３Ｈ−チミジン
含量をグレーデーの方法で測定し几〔グレーデーほか（
Ｂ、Ｍ。
おいてインキュベートした。ついで、１μＣ１の３Ｈ−
チミジンを各ウェルに加え、さらに２時間インキュベー
トシ上。細胞の１′Ｃ−チミジンま几は３Ｈ−チミジン
含量をグレーデーの方法で測定し几〔グレーデーほか（
Ｂ、Ｍ。
Ｇｌａｓｅｒ、 Ｐ、Ａ、 Ｄ’Ａｍｏｒｅ、 Ｒ，Ｇ
、 Ｍｉｃｈｅｌｓ、 Ａ、Ｐａｔｚｇｏ Ａ、 Ｆｓ
ｎｓｅｌａｕ ）、ジャーナル・オフ・セル・バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｃｓ１ｌ Ｂｌｏｌ、）、８４，２９８（
１９８０））。ＦＢＡＥ細胞へのＲＰＢＣ−ＣＭの添加
は、１４ｃｍチミジンの消失は生じなかったが ３Ｈ−
チミジンの取り込み低下から明らかなように細胞の増殖
を阻害し几。
、 Ｍｉｃｈｅｌｓ、 Ａ、Ｐａｔｚｇｏ Ａ、 Ｆｓ
ｎｓｅｌａｕ ）、ジャーナル・オフ・セル・バイオロ
ジー（Ｊ、 Ｃｓ１ｌ Ｂｌｏｌ、）、８４，２９８（
１９８０））。ＦＢＡＥ細胞へのＲＰＢＣ−ＣＭの添加
は、１４ｃｍチミジンの消失は生じなかったが ３Ｈ−
チミジンの取り込み低下から明らかなように細胞の増殖
を阻害し几。
例４〜７の一連の実験は、細胞毒として働くのではなく
、かなり％異的な血管内反細胞増殖阻害剤として作用す
ることを示している。
、かなり％異的な血管内反細胞増殖阻害剤として作用す
ることを示している。
例 ８
ＲＰＥ細胞濃度が阻害剤の放出に与える影響以上の実験
では、ＲＰＥ−ＣＭはすべて来賓培養から収穫し友。し
ｍがって、例４に記載し友ＦＢＡＥ細胞の増殖試験を用
いて、血管新生阻害剤の放出に対する’ａｐｇ細胞濃度
の影響を検討した。来賓ＲＰＥ細胞は、亜来賓ＲＰＦ、
細胞より阻害剤の産生が有意に低いことが明らかにされ
た。ＲＰＥ、細胞を培養し７’ｃ’Ｅま４〜５日間放置
して過来賓に到達し九とき、調整メジウム中の阻害活性
は再び上昇し九〇この阻害活性の増加に対応して、ＲＰ
Ｅ細胞は単層以上に生育を始め、局部的に多細胞層を形
成し九〇したがって、’ａｐｇが果密単層を形成すると
、調整メジウムの！ｌｌＩ害活性は低下した。その後培
養が進み、’ａｐｇ細胞が単層の拘束から離脱すると、
再び阻害剤の産生が上昇し友。
では、ＲＰＥ−ＣＭはすべて来賓培養から収穫し友。し
ｍがって、例４に記載し友ＦＢＡＥ細胞の増殖試験を用
いて、血管新生阻害剤の放出に対する’ａｐｇ細胞濃度
の影響を検討した。来賓ＲＰＥ細胞は、亜来賓ＲＰＦ、
細胞より阻害剤の産生が有意に低いことが明らかにされ
た。ＲＰＥ、細胞を培養し７’ｃ’Ｅま４〜５日間放置
して過来賓に到達し九とき、調整メジウム中の阻害活性
は再び上昇し九〇この阻害活性の増加に対応して、ＲＰ
Ｅ細胞は単層以上に生育を始め、局部的に多細胞層を形
成し九〇したがって、’ａｐｇが果密単層を形成すると
、調整メジウムの！ｌｌＩ害活性は低下した。その後培
養が進み、’ａｐｇ細胞が単層の拘束から離脱すると、
再び阻害剤の産生が上昇し友。
例 ９
例１および２に記載の方法に従って、デタＲＰＥ細胞か
ら血清を含まない調整メジウムを得几（２７μｇ蛋白３
ｔ／ｍ７ ）。このメジウムについて例６０方法に従っ
て試験を行い、血管新生の阻害を見出した。
ら血清を含まない調整メジウムを得几（２７μｇ蛋白３
ｔ／ｍ７ ）。このメジウムについて例６０方法に従っ
て試験を行い、血管新生の阻害を見出した。
例１０
７５ｃｒＩＬ２組織培養フラスコを用い、Ｗ／２０の２
０ｄ中に６．６ Ｘ １０５細胞の濃度テＲＰＥ細胞を
播き、ＲＰＥ−ＣＭを調製し友。メジウムは６日ごとに
交換し友。１０〜１１日後にＲＰＥ細胞に過集密となつ
几。この時点で、各フラスコ中のメジウムｔ−１０−’
Ｍデキサメサゾン添加ＭＰ、Ｍ ／ ２ Ｑに交換し
友。さらに２４時間後、各フラスコｔ−１０−のバンク
平衡塩類浴液で６回洗浄し几。最終洗浄後、各７２スコ
に１０−７Ｍデキサメサゾン添加Ｍｌｌｉ！Ｍ／Ｑを１
０ｍ加えた。４８時間後に調整メジウムｔ−取り、遠心
分離しに０上清を使用まで一２０°Ｃに保存し次。
０ｄ中に６．６ Ｘ １０５細胞の濃度テＲＰＥ細胞を
播き、ＲＰＥ−ＣＭを調製し友。メジウムは６日ごとに
交換し友。１０〜１１日後にＲＰＥ細胞に過集密となつ
几。この時点で、各フラスコ中のメジウムｔ−１０−’
Ｍデキサメサゾン添加ＭＰ、Ｍ ／ ２ Ｑに交換し
友。さらに２４時間後、各フラスコｔ−１０−のバンク
平衡塩類浴液で６回洗浄し几。最終洗浄後、各７２スコ
に１０−７Ｍデキサメサゾン添加Ｍｌｌｉ！Ｍ／Ｑを１
０ｍ加えた。４８時間後に調整メジウムｔ−取り、遠心
分離しに０上清を使用まで一２０°Ｃに保存し次。
上−ｒ＃を０．１％三フッ化酢酸（ＴＦＡ）水溶液に対
して１６時間透析しｆｃ＜分子量カットオフ＝ ３，５
００）、透析液を２０．０００ ｒｐｍ１４℃で２０分
間遠心分離し次。
して１６時間透析しｆｃ＜分子量カットオフ＝ ３，５
００）、透析液を２０．０００ ｒｐｍ１４℃で２０分
間遠心分離し次。
カラム： μＢｏｎｄｐａｋｃ １８ｔ １９ｘ １
５０ｇ１１（ウォーターズ） 溶媒： Ａ ； ０．１ ｑｂ ＴＦＡ水溶液、ＢａＯ
−１％ＴＦＡインプロパツール浴液 流速：１１．２５１１Ｌｌ／分 検知器：ウォーターズ４４１，２１４ｎｍカラムをｌず
溶媒人で千宵化する。上述のよ５にして調製しｆＣ’Ｒ
ＰＢ−ＣＭ ２ Ｑ〜３０ゴを力、ＦＡＯ上に注入し、
指示流速で流し友。カラム溶出液の吸着がベースライン
に復したのち、カラムを溶媒Ｂの直線上昇勾配で、Ｂの
濃度が６５％に達するまで溶出した。この溶媒混曾物を
８分間流し友。
５０ｇ１１（ウォーターズ） 溶媒： Ａ ； ０．１ ｑｂ ＴＦＡ水溶液、ＢａＯ
−１％ＴＦＡインプロパツール浴液 流速：１１．２５１１Ｌｌ／分 検知器：ウォーターズ４４１，２１４ｎｍカラムをｌず
溶媒人で千宵化する。上述のよ５にして調製しｆＣ’Ｒ
ＰＢ−ＣＭ ２ Ｑ〜３０ゴを力、ＦＡＯ上に注入し、
指示流速で流し友。カラム溶出液の吸着がベースライン
に復したのち、カラムを溶媒Ｂの直線上昇勾配で、Ｂの
濃度が６５％に達するまで溶出した。この溶媒混曾物を
８分間流し友。
ついで溶媒の濃度を徐々に６８％まで上げ、このレベル
に８分間保持し友。次に溶媒Ｂの濃度を４０９６まで上
げ、この混合溶媒でさらに５分間カラムを溶出し＊ｏ４
０％Ｂ溶媒混会物での浴出中にカラムから溶出し友物質
を集め友。このフラクションがＲＰＢ！細胞の血ｆｆｒ
生阻害剤を含有し、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定
した純度は約７０％であつｔｏこのフラクションは凍結
乾燥しに０ カラム： Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ、
Ｂｌｏ−５ｉＩＴ８に２５０．２１．５Ｘ６００ｍ１
１ 溶媒： ０．１ ’Ａ ＴＦＡ＊溶液と０．１チＴＦＡ
アセトニトリル溶液５０１５０混合物 流速：３−７分 検知器：ウォーターズ４４Ｌ２１４ｎｍ上記工程で得ら
れた凍結乾燥物を上記溶媒１１１Ｌｔに浴解し、カラム
に注入し几。活性阻害剤を含む大きなピークは保持時間
的６６．５分で溶出した。
に８分間保持し友。次に溶媒Ｂの濃度を４０９６まで上
げ、この混合溶媒でさらに５分間カラムを溶出し＊ｏ４
０％Ｂ溶媒混会物での浴出中にカラムから溶出し友物質
を集め友。このフラクションがＲＰＢ！細胞の血ｆｆｒ
生阻害剤を含有し、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定
した純度は約７０％であつｔｏこのフラクションは凍結
乾燥しに０ カラム： Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ、
Ｂｌｏ−５ｉＩＴ８に２５０．２１．５Ｘ６００ｍ１
１ 溶媒： ０．１ ’Ａ ＴＦＡ＊溶液と０．１チＴＦＡ
アセトニトリル溶液５０１５０混合物 流速：３−７分 検知器：ウォーターズ４４Ｌ２１４ｎｍ上記工程で得ら
れた凍結乾燥物を上記溶媒１１１Ｌｔに浴解し、カラム
に注入し几。活性阻害剤を含む大きなピークは保持時間
的６６．５分で溶出した。
このピークを染め、凍結乾燥した。
上に得られた物質の縄ＫをＢＤＢ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって測定し几。銀染色ゲルに分子量約
５７，０００±３．０００の単一のバンドのみを示し友
。等電点電気泳動により等電点は約４．６±０．３であ
つ几。
ゲル電気泳動によって測定し几。銀染色ゲルに分子量約
５７，０００±３．０００の単一のバンドのみを示し友
。等電点電気泳動により等電点は約４．６±０．３であ
つ几。
例１１
ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ４ＣＲＬ １５５４ ）
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションか
ら継代数５で凍結して得られ丸。細胞を解凍し、非必須
アミノ酸と１０％ウシ胎仔含有を含むイーグルの最少必
須培地２０ｐＨを加えた７５α２フラスコに播いた。こ
の細胞は７日間で来賓状態に生前した。次に細胞を１＝
５の割合に分解し、１ｏｔｓウシ胎仔血清含有イーグル
最少必須培地２０ｄを含む７５工２組織培養フラス３中
に播””ｒｔ ｏ Ｂ日間培養し友のち、メジウムを除
去し、細胞を６回２、ンクの平衡塩類溶液で洗浄し友。
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションか
ら継代数５で凍結して得られ丸。細胞を解凍し、非必須
アミノ酸と１０％ウシ胎仔含有を含むイーグルの最少必
須培地２０ｐＨを加えた７５α２フラスコに播いた。こ
の細胞は７日間で来賓状態に生前した。次に細胞を１＝
５の割合に分解し、１ｏｔｓウシ胎仔血清含有イーグル
最少必須培地２０ｄを含む７５工２組織培養フラス３中
に播””ｒｔ ｏ Ｂ日間培養し友のち、メジウムを除
去し、細胞を６回２、ンクの平衡塩類溶液で洗浄し友。
ついで九細胞を、血清を含まないイーグル最少必須培地
１〇−１中で４８時間培責し友。メジウムｔ″取り出し
、血管新生の阻！４を試験し九ところ、ＲＰＬＩ！細肥
調整メジウムについて述べたと同じ基準で阻害作用を示
し九〇 上述のようにして調製されたヒト線維芽細胞調整メジウ
ム’（ｉ−８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付し迄。ゲルをＳ染色して、分子量５７．０００±３．
０００の種が同定され几。このバンドはヒト網膜色素上
皮細胞からの精製阻害剤と全く同じ位置に移動し次。
１〇−１中で４８時間培責し友。メジウムｔ″取り出し
、血管新生の阻！４を試験し九ところ、ＲＰＬＩ！細肥
調整メジウムについて述べたと同じ基準で阻害作用を示
し九〇 上述のようにして調製されたヒト線維芽細胞調整メジウ
ム’（ｉ−８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付し迄。ゲルをＳ染色して、分子量５７．０００±３．
０００の種が同定され几。このバンドはヒト網膜色素上
皮細胞からの精製阻害剤と全く同じ位置に移動し次。
例１２
よる精製
精製血・ｇ新生阻害剤に対する抗体を慣用方法を用いて
ウサギに産生させ友。ウサギに最初、完全フロインドア
ジュバント中３００μｇの阻害剤を注射し九。さらに完
全フロインドアシュパント中１００〜３００μｇを隔月
ごとに注射し九。ウサギから球皿し、抗体の存在を二重
拡散法で調べ友。
ウサギに産生させ友。ウサギに最初、完全フロインドア
ジュバント中３００μｇの阻害剤を注射し九。さらに完
全フロインドアシュパント中１００〜３００μｇを隔月
ごとに注射し九。ウサギから球皿し、抗体の存在を二重
拡散法で調べ友。
ついで６６％飽和硫酸アンモニウムによって沈殿させて
、ウサギ血清から抗体を部分精製し尺。
、ウサギ血清から抗体を部分精製し尺。
このウサギ抗体は、前述の阻害剤の精製のための免疫吸
着アフィニティークロマトグラフィー法に使用できる。
着アフィニティークロマトグラフィー法に使用できる。
抗体を吸着剤たと゛えばシアノデンデロミド活性化アガ
ロースにカップリングさせる。
ロースにカップリングさせる。
ついで阻害剤を含む祖サンプルを、固定化抗体と阻害剤
が完全に接触するような遅い速度でカラムに通す。カラ
ムを負荷緩衝液で洗浄する。次にカラムｔ−溶出して、
抗体から阻害剤を除去する。阻害剤は−２〜３で安定で
あるので、カラムからの阻害剤の除去はＰ＆′ｉをこの
レベルに低下させることによって行うのが好ましいが、
界面活性剤や他の緩衝液を用いる他の方法も使用できる
。阻害剤の純度は５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル′１
気泳動によって試験する。
が完全に接触するような遅い速度でカラムに通す。カラ
ムを負荷緩衝液で洗浄する。次にカラムｔ−溶出して、
抗体から阻害剤を除去する。阻害剤は−２〜３で安定で
あるので、カラムからの阻害剤の除去はＰ＆′ｉをこの
レベルに低下させることによって行うのが好ましいが、
界面活性剤や他の緩衝液を用いる他の方法も使用できる
。阻害剤の純度は５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル′１
気泳動によって試験する。
以上述べｍ本発明の方法および生成物には多くの修飾お
よび改変が可能なことは、本技術分野の熟練者に自明の
とおりである。本発明はこれらの修飾および改変が特許
請求の範囲およびその均等物に含まれる眠りに２いて、
本発明の範囲内に包含さｎるものである。
よび改変が可能なことは、本技術分野の熟練者に自明の
とおりである。本発明はこれらの修飾および改変が特許
請求の範囲およびその均等物に含まれる眠りに２いて、
本発明の範囲内に包含さｎるものである。
Claims (67)
- （１）網膜色素上皮細胞を培養して培養メジウム中に血
管新生阻害剤を産生させ、この血管新生阻害剤を培養メ
ジウムから回収する工程からなる血管新生阻害剤の製造
方法 - （２）網膜色素上皮細胞は、タペタムを欠く動物の眼か
ら得られる特許請求の範囲第１項記載の製造方法 - （３）動物の眼はヒトの眼である特許請求の範囲第２項
記載の製造方法 - （４）動物の眼はブタの眼である特許請求の範囲第２項
記載の製造方法 - （５）網膜色素上皮細胞を集め、この細胞から血管新生
阻害剤を抽出する工程からなる血管新生阻害剤の製造方
法 - （６）網膜色素上皮細胞は、タペタムを欠く動物の眼か
ら得られる特許請求の範囲第５項記載の製造方法 - （７）動物の眼はヒトの眼である特許請求の範囲第６項
記載の製造方法 - （８）動物の眼はブタの眼である特許請求の範囲第６項
記載の製造方法 - （９）ヒト線維芽細胞を培養し、培養メジウム中に血管
新生阻害剤を産生させ、この血管新生阻害剤を培養メジ
ウムから回収する工程からなる血管新生阻害剤の製造方
法 - （１０）ヒト線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である特許請
求の範囲第９項記載の製造方法 - （１１）皮膚線維芽細胞はＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５５４号
と命名された細胞系の特性を有する特許請求の範囲第１
０項記載の製造方法 - （１２）ヒト線維芽細胞を集め、この細胞から血管新生
阻害剤を抽出する工程からなる血管新生阻害剤の製造方
法 - （１３）血管新生阻害剤を精製する付加工程からなる特
許請求の範囲第１項、第２項、第５項、第６項、第９項
、第１０項または第１２項のいずれかに記載の製造方法 - （１４）血管新生阻害剤の回収前に細胞を過集密まで生
育させる特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
項、第９項または第１０項のいずれかに記載の製造方法 - （１５）細胞が過集密を達成したのち、細胞を洗浄して
ウシ胎仔血清を除去し、血清を含まないメジウムを加え
、回収前に細胞を血清を含まないメジウム中で生育させ
る特許請求の範囲第１４項記載の製造方法 - （１６）血管新生阻害剤の回収前に細胞を亜集密まで生
育させる特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
項、第９項または第１０項のいずれかに記載の製造方法 - （１７）血管新生阻害剤の回収前に細胞を約１０〜１１
日間生育させる特許請求の範囲第１項、第２項、第３項
、第４項、第９項または第１０項のいずれかに記載の製
造方法 - （１８）精製のための付加工程は、分子をその物理的お
よび化学的特性に応じて設計された特定の順序での一連
の操作からなり、その操作は透析、遠心分離、逆相高速
液体クロマトグラフィー、ゲル透過高速液体クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフイニテ
イークロマトグラフイー、免疫吸着アフイニテイークロ
マトグラフイー、等電点電気泳動、電気泳動、ゲルろ過
および沈殿からなる群より選ばれる特許請求の範囲第１
３項記載の製造方法 - （１９）各操作ののちその操作で得られたそれぞれのフ
ラクションについて血管新生阻害能を試験し、その阻害
能を有するフラクションを一連の操作の次の操作に付す
特許請求の範囲第１８項記載の製造方法 - （２０）血管新生阻害能を有するフラクションを、血管
新生阻害能を有する唯一のフラクションが残り、この残
つたフラクションをポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付すと単一のバンドのみを示すようになるまで、一連の
精製操作に付す特許請求の範囲第１９項記載の製造方法 - （２１）精製のための付加工程は血管新生阻害剤をその
疎水性および分子量に基づいて望ましくない物質と分離
する工程である特許請求の範囲第１３項記載の製造方法 - （２２）網膜色素上皮細胞を培養してメジウム中に血管
新生阻害剤を産生させ、このメジウムを細胞から分離し
、このメジウムを疎水的相互作用クロマトグラフィーで
ほぼ精製する各工程からなる特許請求の範囲第１項記載
の製造方法 - （２３）網膜色素上皮細胞は、タペタムを欠く動物の眼
から得られる特許請求の範囲第２２項記載の製造方法。 - （２４）動物の眼はヒトの眼である特許請求の範囲第２
３項記載の製造方法 - （２５）動物の眼はブタの眼である特許請求の範囲第２
３項記載の製造方法 - （２６）ヒト線維芽細胞を培養してメジウム中に血管新
生阻害剤を産生させ、このメジウムを細胞から分離し、
このメジウムを疎水的相互作用クロマトグラフィーでほ
ぼ精製する各工程からなる特許請求の範囲第９項記載の
製造方法 - （２７）ヒト線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である特許請
求の範囲第２６項記載の製造方法 - （２８）ほぼ精製した阻害剤をサイズ排除クロマトグラ
フィーに付してさらに精製する付加工程を加えた特許請
求の範囲第２３項から第２７項までのいずれかに記載の
製造方法 - （２９）メジウムを細胞から分離したのちの任意の段階
に酸透析を採用する特許請求の範囲第２８項記載の製造
方法 - （３０）メジウムを細胞から分離したのち、阻害剤を疎
水的相互作用クロマトグラフィーでほぼ精製する工程の
前に酸透析を採用する特許請求の範囲第２９項に記載の
製造方法 - （３１）細胞を過集密まで生育させ、メジウムには過集
密を達成するまで血清を含有させ、この時点で細胞を洗
浄して血清を除去し、血清を含まない血清を加え、分離
はそれから少なくとも２４時間後に行う特許請求の範囲
第２４項または第２６項のいずれかに記載の製造方法 - （３２）ヒト網膜色素上皮細胞を血清含有培養メジウム
中で過集密まで生育させ、メジウムを細胞から除去し、
細胞に血清を含まないメジウムを加えて細胞の生育を継
続させ、細胞からメジウムを分離し、分離したメジウム
を酸透析に付して透析液を生成させ、透析液中の阻害剤
を逆相高速液体クロマトグラフィーでほぼ精製し、この
ほぼ精製された阻害剤をゲル浸透高速液体クロマトグラ
フィーによつてさらに精製する特許請求の範囲第１項記
載の製造方法 - （３３）ヒト線維芽細胞を血清含有培養メジウム中で過
集密まで生育させ、メジウムを細胞から除去し、細胞に
血清を含まないメジウムを加えて細胞の生育を継続させ
、細胞からメジウムを分離し、分離したメジウムを酸透
析に付して透析液を生成させ、透析液中の阻害剤を逆相
高速液体クロマトグラフィーでほぼ精製し、このほぼ精
製された阻害剤をゲル浸透高速液体クロマトグラフィー
によつてさらに精練する特許請求の範囲第９項記載の製
造方法。 - （３４）ヒト線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である特許請
求の範囲第３３項記載の製造方法 - （３５）血管新生阻害剤を産生しかつ培養メジウム中で
生育して血管新生阻害剤を含有する培養メジウムを産生
できる細胞を培養し、メジウムを細胞から分離し、この
メジウムを血管新生阻害剤に対する固定化抗体と接触さ
せてメジウム中の血管新生阻害剤を固定化抗体に結合さ
せ、結合した阻害剤が除かれたメジウムを除去し、血管
新生阻害剤を固定化抗体から分離する各工程からなる血
管新生阻害剤の製造方法 - （３６）分離工程は、阻害剤−抗体複合体の環境のｐＨ
を約２〜３に低下させ、阻害剤を固定化抗体から溶出す
ることからなる特許請求の範囲第３５項記載の製造方法 - （３７）抗体はポリクロナール抗体である特許請求の範
囲第３５項記載の製造方法 - （３８）抗体はモノクロナール抗体である特許請求の範
囲第３５項記載の製造方法 - （３９）特許請求の範囲第１３項の方法によつて製造さ
れた精練血管新生阻害剤 - （４０）特許請求の範囲第２３項から第２７項までのい
ずれかに記載の方法で製造された精練血管新生阻害剤 - （４１）特許請求の範囲第２８項の方法によつて製造さ
れた精練血管新生阻害剤 - （４２）特許請求の範囲第３２項、第３３項、第３５項
または第３６項のいずれかに記載の方法で製造された精
製血管新生阻害剤 - （４３）精製血管新生阻害剤
- （４４）精製血管新生阻害剤は培養可能な細胞から回収
されている特許請求の範囲第４３項記載の血管新生阻害
剤 - （４５）培養可能な細胞は培養可能なヒト細胞である特
許請求の範囲第４４項記載の血管新生阻害剤 - （４６）ヒト細胞は網膜色素上皮細胞である特許請求の
範囲第４５項記載の血管新生阻害剤 - （４７）ヒト細胞は線維芽細胞である特許請求の範囲第
４５項記載の血管新生阻害剤 - （４８）線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である特許請求の
範囲第４７項記載の血管新生阻害剤 - （４９）血管新生阻害剤はタペタムを欠く動物の眼の網
膜色素上皮細胞から回収される特許請求の範囲第４３項
記載の血管新生阻害剤 - （５０）酸性環境において安定な精製血管新生阻害剤
- （５１）酸性環境のｐＨは約２〜３である特許請求の範
囲第５０項記載の血管新生阻害剤 - （５２）分子量約５７，０００±３，０００、等電点約
４．６±０．３である精製血管新生阻害剤 - （５３）ｐＨ約２〜３の環境で安定な特許請求の範囲第
５２項記載の血管新生阻害剤 - （５４）血管新生阻害活性を有する少なくとも１個の活
性部位をもつ精製ポリペプチドからなる血管新生阻害剤 - （５５）ポリペプチドはヒト網膜色素上皮細胞から回収
される天然の血管新生阻害剤に対しホモロジーを示す特
許請求の範囲第５４項記載の血管新生阻害剤 - （５６）少なくとも１個の活性部位は、ヒト網膜色素上
皮細胞から回収される天然の血管新生阻害剤と生物学的
に同等な方式で機能する特許請求の範囲第５４項記載の
血管新生阻害剤 - （５７）少なくとも１個の活性部位は、ヒト網膜色素上
皮細胞から回収される天然の血管新生阻害剤における相
当部位から、阻害活性が増大したポリペプチドを形成す
るように改変された特許請求の範囲第５５項記載の血管
新生阻害剤 - （５８）血管の新生がある役割を果しているヒトおよび
動物の疾患を、精製血管新生阻害剤の有効量を担体と混
合して投与することによつて治療する方法 - （５９）疾患は、糖尿病性網膜症、老人性黄斑部変性、
慢性関節リウマチ、充実性腫瘍、創傷治癒時の過剰瘢痕
形成からなる群より選ばれる特許請求の範囲第５８項記
載の方法 - （６０）投与方法は静脈内、局所、眼内、結膜下、筋肉
内、包膜下および直接注射からなる群より選ばれる特許
請求の範囲第５８項記載の方法 - （６１）血管新生阻害剤はタペタムを欠く動物の眼の網
膜色素上皮細胞に由来する特許請求の範囲第５８項また
は第６０項のいずれかに記載の方法 - （６２）血管新生阻害剤はヒト線維芽細胞に由来する特
許請求の範囲第５８項または第６０項のいずれかに記載
の方法 - （６３）血管新生阻害剤は静脈内注射される特許請求の
範囲第５８項記載の方法 - （６４）特許請求の範囲第４３項、第４４項、第５２項
または第５４項のいずれかに記載の血管新生阻害剤の治
療有効量を医薬的に許容される担体と混合してなる医薬
組成物 - （６５）眼内投与に適した特許請求の範囲第６４項記載
の医薬組成物 - （６６）局所投与に適した特許請求の範囲第６４項記載
の医薬組成物 - （６７）点眼剤としての使用に適した特許請求の範囲第
６４項記載の医薬組成物
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