JPH0413698A - 生理活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はキモトリブシン阻害作用等を示す生理活性ペプ
チドに関するものである。

［従来の技術］ 微生物、各種臓器或は培養基等よりペプチド結合を有す
る種々の物質を分離・精製する場合、或は微生物を培養
してタンパク質等を作らせる場合、更に生体に対して各
種生理活性ペプチドを作用させる場合等において、プロ
テアーゼが存在することによってタンパク質の収率が低
下したり、或は目的タンパク質が全く得られなかったり
といったことはしばしば経験するところである。そこで
このような場合には温度を上げる・下げる、或は塩を加
える等の手段によってプロテアーゼ活性を抑制したり、
若しくは失活させるというようなことが行なわれている
。しかしこれらの方法ではプロテアーゼと同様にペプチ
ド結合を有するタンパク質である目的物質も何らかの影
響を受ることは避けられず、例えば微生物にタンパク質
を作らせる場合などでは微生物の生育が阻害されること
も多い。

［発明が解決しようとする課題］ 上記の問題を解決するにはプロテアーゼだけに働く阻害
剤、即ちプロテアーゼインヒビターを利用することが考
えられる ［ｆＪ題を解決するための手段］ 本発明の生理活性ペプチドは次に示す理化学的特性を有
するものであることに要旨がある。

分子量：　ＳＤＳ電気泳動による測定で約７．９００Ｈ
ＰＬＣによる測定で約８，５００ 等電点：　７．ｏ。

生理活性：キモトリブシン阻害活性を有する［作用及び
実施例］ 本発明の生理活性物質は先側大字家蚕遺伝子資源センタ
ーが系統保存している家蚕Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉｋ０
３の血漿より精製することができたもので、次のような
理化学的物性により特定することがで籾る。

１）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法
による測定で約７，９００゜ＨＰＬＣによる゛測定で約
ａ、ｓｏｏ　。

２）等電点：　７．００ ３）Ｎ末端からの２０アミノ酸の推定１次構造：＾５ｐ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−生理活性：キモトリブシン阻害活性を示す。

（カゼインを基質に用いてＫ　ｉ　＝０．１７ＭＭ） 更に実施例において示す様に優れた熱安定性及びｐＨ安
定性も有している。また生理活性においてもキモトリブ
シン阻害活性以外の生理活性も有することが期待されて
いる。

本発明の生理活性ペプチド（以下Ｃｌ−２と略す）は家
蚕血漿を原料とし、常法により精製して得ることができ
る。例えば、硫安塩析後、ＤＥＡＥ或はＣＭ−イオン交
換クロマトグラフィー及びキモトリブシンを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーを組み合せることによっ
て高純度に精製できる。更にアミノ酸のＮ−末端からの
一次構造が決定されたので、遺伝子を取り出すこと（単
離すること）が出来るようになり遺伝子組み換え技術を
応用して大量生産することも可能である。

以下、実施例に基づいて具体的に説明する。

実施例１ く精製方法〉 見■ 貼」互υ−μｘｒｉ　ｋ０３の幼虫５齢３日に血漿を採
取し、遠心分離によって血液細胞を取り除いたもの。

延支皇亙 上記家蚕血漿２０ａ＋１に硫酸アンモニウムを加え３０
〜７０％飽和で沈澱した沈澱物を遠心分離した。得られ
た沈澱物に少量の０．０５Ｍ　）−リスー塩酸ｉｌ街液
（ｐＨａ　、ａ）を加え溶解させた後、同Ｍ街液に対し
て透析した。

イオン　換カラムクロマトグラフィー 前記トリス−塩酸緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ａ５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製
）（２×４０ｃｍ）に、硫安分画によって得た活性画分
を通し、同Ｉｌ街液で洗浄し、非吸着（又は素通り）画
分にＣｌ−２の活性画分を得た。溶出パターンを第１図
に示す、活性画分を合わせて濃縮した後、０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウム１！衝液（ｐ）１７．４）で透析し、遠
心分離により上清を得た。

アフィニティーカラムクロマトグラフィー前記リン酸ナ
トリウム緩衝液で平衡化させたキモトリブシン結合５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カ
ラム（１ｘｌＯｃｍ）に前記上清を通し、同ｉＩ街液で
洗浄した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（）ＩＣＩで
ｐＨ，０に調整、　Ｏ，ＳＭ　ＮａＣ１及び４ＭＵｒｅ
ａ含有）で溶出し、精製Ｃｌ−２を得た。溶出パターン
を第２図に示す。

第１表に各精製段階での体積、総タンパク質量、比活性
、総キモトリブシン阻害活性及び回収率を示す、尚、キ
モトリブシン阻害活性の測定、Ｃｌ−２であることを確
認するための電気泳動及び活性染色は下記の方法で行っ
た。

く実験方法〉 キモトリブシン阻害活性の測 Ｋｕｎｉｔｚらの方法（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、
３０，２９１−３１０゜１９４７）　に基づいて行なっ
た。

試料溶液０．１　ｍｌを０．２２ｍ１のキモトリブシン
溶液（２００ｐｏｏｌｅ）に加え３７℃で１０分間イン
キュベージ日ンした後、あらかじめ緩衝液に溶解したＨ
ａｗ＋ｍａｒｓｔｅｎカゼインを、終濃度で３０　ｍｇ
／ｍｌになるように加えた。この時の反応液量は０．３
２ｍ１とした。３７℃で１０分間反応させた後、トリク
ロロ酢酸を最終で５％になるように加え、反応を停止し
、反応液を遠心分離した後、上清の２８０ｎｍにおける
吸光度（Ａ２♂０）を測定した。試料溶液を加えないも
のについても同様の測定を行ない、試料溶液を加えない
もののＡ　２ａ、をＡ１加えたもののＡ２６６をＢとし
た場合、阻害活性は（Ａ−Ｂ）／ＡＸ１００で表わさ汎
る。即ち、上述した反応条件で４０　ｐｍｏｌｅのキモ
トリブシンを５０％阻害する活性量をキモトリブシンイ
ンヒビタ−１単位（ｕ）　　とした。

アクリルアミドゲル　　株 Ｄａｖｉｓ、Ｂ、Ｊ、ａｎｄ　０ｒｎｓｔｅｉｎ、Ｌ、
らの方法（＾ｎｎ。

Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃ１．１２１．Ａｒｔ　２，３２
１−３４９，４０４−４２７．１９６４）に準じて行な
った。

活性染色 Ｌｌｒｉｅｌ　とＢｅｒｇｅｓの方法（Ｎａｔｕｒｅ　
２１８，５７Ｂ−５８０゜１９６８）により実施した。

この方法ではキモトリブシンの活性を示す部位が染色さ
れるので、染色されない部位、すなわちキモトリブシン
インヒビターの存在する部位は活性染色されずに白く抜
けることから、キモトリブシンインヒビターの存在部位
が明らかとなる。

第 表 第１表に示したように、原料より約５％の回収率で、比
活性が約４０７倍に精製された。尚、精製品の比活性は
１１，０７０ｕ／ａ＋ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。

実施例２ く理化学的性質〉 実施例１で得た精製品を用いて次の分析及び試験を行な
った。

１土１ １）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測
定 Ｌａｅｏ＋ｍ１ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２７；６８
０，１９７０　）により１２．５％ｇｅｌｓＤｓ電気泳
動を行なった結果を第３図に示す、還元状態での分子量
が約７，９００であることがわかった。

２）ＨＰＬＣ（非還元状態）による測定ＴＳＫｇａｌ　
ｌ＋３０００　ＳＷ　［東ソー■製、カラム（８×３０
０＋ｍ）］を用いて来施した結果を第４図に示す。非還
元状態（自然な状態）での分子量が約８．５００である
ことがわかった。

以上の結果よりＣｌ−２は単量体であると推定される。

蔓亙羞 ＾ｍｐｈｏｌｉｎｅ　　（ファルマシア社製）（２％ｖ
１ｖ　）を用いた６、４％ポリアクリルアミドゲルによ
るｐＨ３，５−１０のｐＨ勾配を持つ等電点ゲル電気泳
動を行ない（３００Ｖ、５ｈｒ）　、活性染色により泳
動位置を求めた。一方間様に泳動した別のゲルを５ｍｍ
ずつスライスしてｐＨを測定し、泳動位置からキモトリ
ブシンインヒビターの等電点を求めた。結果を第５図に
示す１等電点は７．０であることがわかフた。

Ｎ末端からの２０アミノ酸の１次槽 エドマン分解により１次構造を決定した。まず、アミノ
アシド　シークエンサー８９０　Ｍ／Ｅ（ベックマン社
製）を使用してフェニルチオヒダントイン（ｐＴＨ）；
！導体を得、該諺導体をＯＤＳカラム（４，６Ｘ　２５
０ｗｌ１１）　　［東ソー■製、１２０Ｔ］を用いたＨ
ＰＬＣにより同定し、Ｎ末端側２０残基のアミノ酸の１
次構造を決定した。

推定される１次構造は下記の通りであった。

Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ− 二ｌム鼠量亙 Ｍｏｏｒｅ　ａｎｄ　５ｔａｉｎらの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｑ；８１９．１９６
３）に準じて行なった。即ち、精製された試料に０．０
５％メルカプトエタノールを含むＦ　ｅ　ｆｒｅｅの６
Ｎ−ＨＣＩを加え、１１０℃で２４時間加水分解した後
、アミノ酸自動分析計［日立■製、アミノアシドアナラ
イザー型６５５Ａ］を用いて構成アミノ酸比を求めた。

ＨＰＬＣによる分子量の測定結果をもとに各アミノ酸数
を推定した。結果を第２表に示す。

第２表より明らかなようにＮｅｔと旧Ｓを含有しないと
いう特徴を有している。

第 表 １）ＨＰＬＣにより測定された分子量（８，５００）か
ら推定したアミノ酸個数 ［キモトリブシンに対する阻害活性］ キモトリブシン（２００ｐｍｏｌｅ）に種々の量のＣｌ
−２を加え３７℃で１０分間インキエベーションした後
、カゼインを基質に用いてキモトリブシン活性を測定し
た。測定結果を目ｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プ
ロットにして第６図に示す０図より求められたＣｌ−２
のＫｉ値は０．７７μＭであった。

［キモトリブシンに対する１００％阻害比］キモトリブ
シン（２００ｐｍｏｌｅ）に種々の量のＣｌ−２を加え
３７℃で１０分間インキエベーションした後、カゼイン
を基質に用いてキモトリブシン活性を測定した。第７図
に阻害されたキモトリブシン量とＣｌ−２の量の関係を
示す、実験に使用したキそトリプシン（牛膵臓由来、Ｅ
Ｃ３４，２１，，１）の分子量が２５．２００であるの
で、ＨＰＬＣにより推定された分子量８，５００のＣｌ
−２のキモトリブシンに対する１００％阻害比【Ｉ／Ｅ
ｌはモル比で２．２４：１である。

１里亘１ 種々のプロテアーゼにＣｌ−２を反応させた後のプロテ
アーゼの残存活性を測定した。尚夫々のプロテアーゼの
使用量及び活性測定法は下記第３表の通りである。

第　　　３　　　表 果 表 結果を第４表に示す。

Ｃｌ−２はキモトリブシンに対して阻害活性を示し、他
のプロテアーゼに対しては殆んど阻害活性を示さなかワ
た。

ＬＪＪ○【性 ｐＨ２〜１２で室温に２４時間放置した後、キモトリブ
シンインヒビター活性がどのように変化するかを調べた
結果を第８図に示す。尚、本反応に用いたｍ衝）夜は、
ｐＨ２〜３はグリシン−塩酸緩衝液を、ｐＨ４〜５は酢
酸！！衝液を、ｐＨ６〜７はリン酸緩衝液を、ｐＨ６〜
９はトリス−塩酸Ｍｍｔｌｔを、ｐＨ１０〜１１はグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液を、ｐＨ１２はグリコー
ル−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。

図より、安定性が最も悪いと考えられるｐＨ２付近にお
いてもなお７５％の阻害活性を維持しており、この生理
活性ペプチドが優れたｐＨ安定性を示すことがわかる。

糺支定豆 本生理活性ペプチドをリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶
解し、種々の温度で１０分間加熱処理した後の残存活性
を調べた。結果を第８図に示す１図より、９０℃で１０
分間処理を行なってもなお７５％のキモトリブシン阻害
活性が維持されており、本生理活性ペプチドが優れた耐
熱性を有していることがわかる。

５ｈｉｆｆ反応（Ｚａｃｃｈａｒｉａｓ、Ｒ，Ｊ、、Ｍ
ｏｒｉｓｓｏｎ、Ｊ、Ｈ。

ａｎｄ　Ｗｏｏｄｌｏｃｋ、Ｊ、Ｊ、、Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、３１，１４８．１９６９）が陰性であり
、またＣｌ−２を電気泳動後、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔで膜に移し、蛍光標識フレチン［Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｉｎ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ベクター社製）］
と反応させても蛍光バンドが無かった（陰性であった）
ことから、本生理活性ペプチドに１１８１の結合はない
と考えられる。

［発明の効果］ 本発明のキモトリブシン阻害活性を有する生理活性ペプ
チドは上記のように優れたｐＨ安定性及び熱安定性を有
しており、その活性を種々の分野に応用できる。例えば
ペプチド結合を有する物質の生産及び精製の際に加える
と収量を上げることができ、ペプチド結合を有する生理
活性物質と共存させることにより生理活性物質を経口投
与することができる可能性がある他、種々の分野に応用
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーの溶出パタ
ーン、第２図はアフィニティカラムクロマトグラフィー
の溶出パターン、第３図はＳＤＳ電気泳動による分子量
測定結果を示す図、第４図はＨＰＬＣによる分子量測定
結果を示す図、第５図は等電点電気泳動の結果を示すグ
ラフ、第６図はＣｌ−２のカゼインを基質に用いた時の
キモトリブシンの阻害活性を表わすグラフ、第７図は、
キモトリブシンＩＭに対するＣｌ−２の阻害モル比［１
／Ｅ］を表わすグラフ、第８図はＣｌ−２のｐＨ安定性
を示すグラフ、第９図はＣｌ−２の熱安定性を示すグラ
フである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 　次に示す理化学的特性を有するものであることを特徴
   とする生理活性ペプチド。 分子量：ＳＤＳ電気泳動による測定で約７，９００ＨＰ
   ＬＣによる測定で約８，５００ 等電点：７．００ 生理活性：キモトリブシン阻害活性を有する