JPH04141088A - 大腸菌ｄｎａポリメラーゼ２及びその製法 - Google Patents
大腸菌ｄｎａポリメラーゼ２及びその製法Info
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- JPH04141088A JPH04141088A JP2263125A JP26312590A JPH04141088A JP H04141088 A JPH04141088 A JP H04141088A JP 2263125 A JP2263125 A JP 2263125A JP 26312590 A JP26312590 A JP 26312590A JP H04141088 A JPH04141088 A JP H04141088A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は基礎分子生物学、遺伝子工学研究用試薬として
有用な酵素である大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■及びその
製法に関する。
有用な酵素である大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■及びその
製法に関する。
今まで遺伝子工学研究用試薬として一般に利用されてい
るＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ’Ａポリメラー
ゼ１１その改変型であるフレノウ断片、Ｔ４ファージ由
来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７フアージ由来ＤＮＡポリメ
ラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ等がある。これらの酵素はその有する性質に応
じて特定のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法な
どにそれぞれ利用されている。
るＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ’Ａポリメラー
ゼ１１その改変型であるフレノウ断片、Ｔ４ファージ由
来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７フアージ由来ＤＮＡポリメ
ラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ等がある。これらの酵素はその有する性質に応
じて特定のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法な
どにそれぞれ利用されている。
一方、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■はその遺伝学的、生
化学的研究により、本酵素の遺伝情報を担うｐｏｌ Ｂ
遺伝子の発現が紫外線や化学変異原物質などで誘導され
ること、また、塩基部分が損傷を受けたＤ Ｎ Ａ 鎮
を鋳型としたときも試験管内ＤＮＡ合成能を有すること
などが明らかとなり、本酵素が大腸菌における突然変異
形成機構に関与する可能性が考えられ、この重要な自然
現象解明のための分子遺伝学的基礎研究用試薬として、
またその特異的なりＮＡ合成能から遺伝子工学的試薬と
しても有用な用途が期待されている。
化学的研究により、本酵素の遺伝情報を担うｐｏｌ Ｂ
遺伝子の発現が紫外線や化学変異原物質などで誘導され
ること、また、塩基部分が損傷を受けたＤ Ｎ Ａ 鎮
を鋳型としたときも試験管内ＤＮＡ合成能を有すること
などが明らかとなり、本酵素が大腸菌における突然変異
形成機構に関与する可能性が考えられ、この重要な自然
現象解明のための分子遺伝学的基礎研究用試薬として、
またその特異的なりＮＡ合成能から遺伝子工学的試薬と
しても有用な用途が期待されている。
従来知られている大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の製造方
法としては、野生型大腸菌から精製するモーゼス（Ｍｏ
ｓｅｓ）の方法があり、当該方法は、メンツズ イン
エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）第２９巻、第１３〜１６頁（１９７４＞に
記載されている。
法としては、野生型大腸菌から精製するモーゼス（Ｍｏ
ｓｅｓ）の方法があり、当該方法は、メンツズ イン
エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）第２９巻、第１３〜１６頁（１９７４＞に
記載されている。
しかしながら、モーゼスの方法により得られる大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩの含量は少なく、また操作も煩雑
であり、該酵素を大量に得ることは困難である。一方、
大腸菌ＤＮＡポリメラーセ［の遺伝子構造やアミノ酸配
列については不明であり、これら遺伝子の単離及び当該
遺伝子をベクターに結合して、遺伝子工学的に発現させ
る方法についても、いまだ明らかにされていない。
ＮＡポリメラーゼＩＩの含量は少なく、また操作も煩雑
であり、該酵素を大量に得ることは困難である。一方、
大腸菌ＤＮＡポリメラーセ［の遺伝子構造やアミノ酸配
列については不明であり、これら遺伝子の単離及び当該
遺伝子をベクターに結合して、遺伝子工学的に発現させ
る方法についても、いまだ明らかにされていない。
本発明の目的は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの工業
的製造に適した大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製、
及びそれを用いた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの製造
方法を提供することにある。
的製造に適した大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製、
及びそれを用いた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの製造
方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は第１図で表
されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＨに関する。
されるアミノ酸配列を有していることを特徴とする大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＨに関する。
また、本発明の第２の発明は第１の発明の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩをコードする塩基配列に関する。
ポリメラーゼＩＩをコードする塩基配列に関する。
更に、本発明の第３の発明は本発明の第１の発明の大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼ■の製造方法に関する発明であて
、該ポリメラーゼＩＩをコードするＤＮＡを含有させた
組換え体プラスミドを導入させた形質転換体を培養し、
該培養物より本発明の第１の発明の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩを採取することを特徴とする。
菌ＤＮＡポリメラーゼ■の製造方法に関する発明であて
、該ポリメラーゼＩＩをコードするＤＮＡを含有させた
組換え体プラスミドを導入させた形質転換体を培養し、
該培養物より本発明の第１の発明の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩを採取することを特徴とする。
以下、本発明を具体的に説明する。
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子は大
腸菌遺伝子地図上２分の位置（ｐａｌ Ｂ）に存在する
。この大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝
子をプラスミドベクターにクローニングする方法として
は、例えば、大腸菌遺伝子地図上の２分の位置に存在す
るｄｉｎ ＡプロモーターＤＮＡをプローブとして、大
腸菌遺伝子ライブラリーからｐｏｌ Ｂを含む遺伝子領
域を選択すれば良い。なおｄｉｎ Ａは大腸菌が紫外線
等で損傷を受け、その修復時（ＳＯ３機構）において誘
導のかかる遺伝子として知られている〔プロシーディン
グズ オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエ
ンシーズ オブザ Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ８口ＳＡ、）、 第７７巻
、第２８１９〜２８２３頁（１９８０）］。
腸菌遺伝子地図上２分の位置（ｐａｌ Ｂ）に存在する
。この大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝
子をプラスミドベクターにクローニングする方法として
は、例えば、大腸菌遺伝子地図上の２分の位置に存在す
るｄｉｎ ＡプロモーターＤＮＡをプローブとして、大
腸菌遺伝子ライブラリーからｐｏｌ Ｂを含む遺伝子領
域を選択すれば良い。なおｄｉｎ Ａは大腸菌が紫外線
等で損傷を受け、その修復時（ＳＯ３機構）において誘
導のかかる遺伝子として知られている〔プロシーディン
グズ オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエ
ンシーズ オブザ Ｕ Ｓ Ａ （Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ８口ＳＡ、）、 第７７巻
、第２８１９〜２８２３頁（１９８０）］。
選択した遺伝子領域をプラスミドベクターに組込み、次
いで該プラスミドで微生物を形質転換し、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩを効率よく発現する形質転換体を創製
すればよい。
いで該プラスミドで微生物を形質転換し、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＩを効率よく発現する形質転換体を創製
すればよい。
本発明に係る形質転換体及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■は次に例示する工程により得ることができる。
■は次に例示する工程により得ることができる。
（１）ＤＮＡ供与体として大腸菌から染色体ＤＮＡを抽
出し制限酵素で切断してλフアージベクターと接続した
大腸菌遺伝子バンクを用いる。
出し制限酵素で切断してλフアージベクターと接続した
大腸菌遺伝子バンクを用いる。
（２） （１）のバンクよりｄｉｎ ＡプロモーターＤ
ＮＡ断片と相同な配列を含むλフアージＤＮＡを、ｄｉ
ｎ Ａプロモーター断片をプローブとして選択する。
ＮＡ断片と相同な配列を含むλフアージＤＮＡを、ｄｉ
ｎ Ａプロモーター断片をプローブとして選択する。
（３） （２）で得られたファージよりＤＮＡを抽出
し、適当な制限酵素で切断して目的とするＤＮＡ断片を
回収する。
し、適当な制限酵素で切断して目的とするＤＮＡ断片を
回収する。
（４） プラスミドベクターを制限酵素で開裂し、こ
の開裂部位に、（３〕で得たＤＮＡ断片を結合させる。
の開裂部位に、（３〕で得たＤＮＡ断片を結合させる。
（５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入し
、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。
、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。
（６） （５）で得た形質転換体を培養し、培養菌体
より大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩを生産する。
より大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩを生産する。
上記ＤＮＡ供与体である大腸菌遺伝子バンクとしては、
既知の領域のＤＮＡ断片を含むλファージの集団である
不凍らの作製したライブラリーを用いることができる。
既知の領域のＤＮＡ断片を含むλファージの集団である
不凍らの作製したライブラリーを用いることができる。
該ライブラリーの詳細はセル（Ｃｅｌｌ） 、第５０巻
、第４９５〜５０８頁（１９８７）に記載されている。
、第４９５〜５０８頁（１９８７）に記載されている。
また、このライブラリーに限らず、大腸菌野生株に１２
（ＡＴＣＣｅ ２３７１６）あるいはその変異株
、例えばＣ６００（エール大学ジェネティク・ストック
・センター）のいずれから抽出してもよく、抽出、精製
、制限酵素による切断反応等は公知の方法を用いること
ができる。
（ＡＴＣＣｅ ２３７１６）あるいはその変異株
、例えばＣ６００（エール大学ジェネティク・ストック
・センター）のいずれから抽出してもよく、抽出、精製
、制限酵素による切断反応等は公知の方法を用いること
ができる。
ｄｉｎ ＡプロモーターＤＮＡ断片と相同な配列を含む
λファージを選択する方法は、ライブラリーのλフアー
ジ溶液をナイロン膜にスポットし、３２ｐでラベルした
ｄｉｎ Ａプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をプロー
ブとしてハイブリダイズするクローンを選び出せばよい
。ｄｉｎ Ａプロモーターを含むＤＮＡ断片はジャーナ
ル 才ブ モレキュラー バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１
６０巻、第４４５〜４５７頁（１９８２）に記載の方法
で調製し、用いればよい。ハイブリダイゼーションによ
る選択の方法自体は公知の方法、例えば１９８２年、コ
ールド スプリング ノ１−バー ラボラトリ−発行、
Ｔ、 ７ ＝アスティス（Ｔ、 Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）
ほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリ
−７−’−ユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ。
λファージを選択する方法は、ライブラリーのλフアー
ジ溶液をナイロン膜にスポットし、３２ｐでラベルした
ｄｉｎ Ａプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をプロー
ブとしてハイブリダイズするクローンを選び出せばよい
。ｄｉｎ Ａプロモーターを含むＤＮＡ断片はジャーナ
ル 才ブ モレキュラー バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１
６０巻、第４４５〜４５７頁（１９８２）に記載の方法
で調製し、用いればよい。ハイブリダイゼーションによ
る選択の方法自体は公知の方法、例えば１９８２年、コ
ールド スプリング ノ１−バー ラボラトリ−発行、
Ｔ、 ７ ＝アスティス（Ｔ、 Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）
ほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリ
−７−’−ユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ。
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第３０９頁
に記載の方法を用いることができる。
に記載の方法を用いることができる。
ｄｉｎ ＡプロモーターＤＮＡと相同な配列のＤＮＡを
含むλフアージクローンを選び出し、そのＤＮＡを制限
酵素処理し、上記と同様のプローブを用いてサザンハイ
ブリダイゼーションを行い、ｄｉｎ ＡプロモーターＤ
ＮＡと相同の配列を有するＤＮＡ断片を選択することが
できる。
含むλフアージクローンを選び出し、そのＤＮＡを制限
酵素処理し、上記と同様のプローブを用いてサザンハイ
ブリダイゼーションを行い、ｄｉｎ ＡプロモーターＤ
ＮＡと相同の配列を有するＤＮＡ断片を選択することが
できる。
ｄｉｎ ＡプロモーターＤＮＡと相同の配列を有するＤ
ＮＡ領域は、ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ切断により生じ
る５、３ｋｂのＤＮＡ断片中に存在する。
ＮＡ領域は、ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ切断により生じ
る５、３ｋｂのＤＮＡ断片中に存在する。
次に、このＤＮＡ断片をプラスミドベクターに組込む。
プラスミドベクターとしては、公知のものが使用でき、
例えばｐｔｌｃ １８．１９などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
例えばｐｔｌｃ １８．１９などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
例えばｐｔｌｃ １８をＢａｍＨＩ 、 巳ｃｏＲＩ
で２重切断し、上記ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ ＤＮＡ
断片を組込ませる。その手段自体は公知の方法によるも
のであり、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いた酵素反応で組込ま
せればよい。
で２重切断し、上記ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ ＤＮＡ
断片を組込ませる。その手段自体は公知の方法によるも
のであり、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いた酵素反応で組込ま
せればよい。
次いで、ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ切断々片を組込んだ
プラスミドを宿主大腸菌に導入させるが、宿主大腸菌と
しては、形質転換能を有するものであれば、野生株、変
異株のいずれも使用できる。用いるベクターにより用い
る宿主を適宜変えることも可能である。導入の手段自体
は公知の方法、例えば前記モレキュラー クローニング
、ア ラボラトリ−マニュアル、第２５０頁（１９８２
）を用いることができる。
プラスミドを宿主大腸菌に導入させるが、宿主大腸菌と
しては、形質転換能を有するものであれば、野生株、変
異株のいずれも使用できる。用いるベクターにより用い
る宿主を適宜変えることも可能である。導入の手段自体
は公知の方法、例えば前記モレキュラー クローニング
、ア ラボラトリ−マニュアル、第２５０頁（１９８２
）を用いることができる。
このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入させ、プ
ラスミドベクターの特性、例えばｐ［ＩＣｌ３の場合、
アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することによ
り、クローン化することができる。
ラスミドベクターの特性、例えばｐ［ＩＣｌ３の場合、
アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することによ
り、クローン化することができる。
クローン化されたＤＮＡの解析は、公知の方法を用いて
行うことができる。すなわち、多数得られる形質転換株
よりプラスミドを調製し、適当な制限酵素で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により分析し、目的のＤＮＡ断片
が挿入されているクローンを選択すればよい。
行うことができる。すなわち、多数得られる形質転換株
よりプラスミドを調製し、適当な制限酵素で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動により分析し、目的のＤＮＡ断片
が挿入されているクローンを選択すればよい。
以上のうよにして、目的の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■
遺伝子を含むＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ断片が挿入され
たプラスミドｐＬＩｃ １８を調製することができ、該
プラスミドをｐＴ）Ｉ １００と命名した。
遺伝子を含むＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ断片が挿入され
たプラスミドｐＬＩｃ １８を調製することができ、該
プラスミドをｐＴ）Ｉ １００と命名した。
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩに対するｐａｌ Ａ遺伝子
が高温感受性になっている宿主大腸菌ＭＭ３８６にｐＴ
Ｉ（１００を導入し、該大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが
産生されない３７℃におして培養された該大腸菌の粗抽
出液のＤＮＡポリメラーゼ活性は、ｐＨ［’ １ Ｂだ
けを導入した宿主菌に比べて２０倍の活性を示すこと、
このＤＮＡポリメラーゼ活性はＮ−エチルマレイミドに
対して感受性であることから、ｐＴＨ１００に大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩを産生ずる遺伝子情報（ｐｏ］
Ｂ）が存在し、それが実際に発現していることを確認し
た。ｐ’ｒＨ１００上のＢａｍＨＩ［ＥＣＯＲＩ断片に
ついて全塩基配列を解析し、その全塩基配列を決定した
。
が高温感受性になっている宿主大腸菌ＭＭ３８６にｐＴ
Ｉ（１００を導入し、該大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩが
産生されない３７℃におして培養された該大腸菌の粗抽
出液のＤＮＡポリメラーゼ活性は、ｐＨ［’ １ Ｂだ
けを導入した宿主菌に比べて２０倍の活性を示すこと、
このＤＮＡポリメラーゼ活性はＮ−エチルマレイミドに
対して感受性であることから、ｐＴＨ１００に大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩを産生ずる遺伝子情報（ｐｏ］
Ｂ）が存在し、それが実際に発現していることを確認し
た。ｐ’ｒＨ１００上のＢａｍＨＩ［ＥＣＯＲＩ断片に
ついて全塩基配列を解析し、その全塩基配列を決定した
。
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＨを著量発現させるために、
ｐＴ）Ｉ １００を宿主大腸菌（例えばＨＢｌ ０１）
に形質転換した。ｐＴＨ１００で形質転換された大腸菌
ＨＢＩＯＩは、Ｂｓｃｈｅｒ ｉｃｈ １ａｃｏｌｉ
ＨＢ １０１／ｐＴＨ１００と表示し、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１７０１号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ’−１１７０１）としで寄託されている。ｐ
ＴＩｌ ｌ ００を保有する大腸菌を培養し、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩを大量に発現させた培養菌体より
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の採取を行った。培養菌体
より、前出モーゼスらの文献記載の方法に従って精製及
び活性測定を行った。
ｐＴ）Ｉ １００を宿主大腸菌（例えばＨＢｌ ０１）
に形質転換した。ｐＴＨ１００で形質転換された大腸菌
ＨＢＩＯＩは、Ｂｓｃｈｅｒ ｉｃｈ １ａｃｏｌｉ
ＨＢ １０１／ｐＴＨ１００と表示し、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１７０１号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ’−１１７０１）としで寄託されている。ｐ
ＴＩｌ ｌ ００を保有する大腸菌を培養し、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩを大量に発現させた培養菌体より
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の採取を行った。培養菌体
より、前出モーゼスらの文献記載の方法に従って精製及
び活性測定を行った。
得られた大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■は、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で９−万ダルトンの分子量
を示すクローン化ＤＮＡ由来の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ■である。精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、そ
のＮ末端のアミノ酸配列を決定した。その配列を表１に
示す。
アクリルアミドゲル電気泳動で９−万ダルトンの分子量
を示すクローン化ＤＮＡ由来の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ■である。精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、そ
のＮ末端のアミノ酸配列を決定した。その配列を表１に
示す。
表１
Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−このアミノ酸配列より、第１図のＤＮＡ
配列中の塩基番号１２３５〜３５８３の駐訳可能領域を
、ｐｏｌＢ、すなわち大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの
構造遺伝子と決定し、該ＤＮＡポリメラーゼ■の全アミ
ノ酸配列を明らかにした。
ｅｕ−Ｔｈｒ−このアミノ酸配列より、第１図のＤＮＡ
配列中の塩基番号１２３５〜３５８３の駐訳可能領域を
、ｐｏｌＢ、すなわち大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの
構造遺伝子と決定し、該ＤＮＡポリメラーゼ■の全アミ
ノ酸配列を明らかにした。
そのアミノ酸配列を第１図に示す。すなわち第１図は、
ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片の全塩基配列、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩの塩基配列、及びその塩基配列が
コードする大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩのアミノ酸配
列を示す。
ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ断片の全塩基配列、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩＩの塩基配列、及びその塩基配列が
コードする大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩのアミノ酸配
列を示す。
なお、第１図中、Ｎ末端に記載のＮｅｔは、該ＤＮＡポ
リメラーゼ■発現の際に切離される。
リメラーゼ■発現の際に切離される。
以上のように、本発明により、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩＩの性状が明らかとなり、工業的な製造が可能とな
った。
ゼＩＩの性状が明らかとなり、工業的な製造が可能とな
った。
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
実施例１
（１）ｄｉｎＡプロモーター領域を含むλフアージクロ
ーンの選択 不凍らの作製した大腸菌整列クローンライブラリーのど
のクローンにｄｉｎ Ａプロモーターを含むかを調べる
ため、染色体地図上２分付近を含むλフアージクローン
１３種をナイロン製膜にスポットし、０．５Ｎ水酸化ナ
トリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で変性させたＩ
ＭＦリス＋１ｃＩ １．５Ｍ塩化ｔ ） ＩＪ ラム
（ｐ）１７．０）溶液で中和した後紫外線照射でファー
ジＤＮＡを膜上に固定した。
ーンの選択 不凍らの作製した大腸菌整列クローンライブラリーのど
のクローンにｄｉｎ Ａプロモーターを含むかを調べる
ため、染色体地図上２分付近を含むλフアージクローン
１３種をナイロン製膜にスポットし、０．５Ｎ水酸化ナ
トリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で変性させたＩ
ＭＦリス＋１ｃＩ １．５Ｍ塩化ｔ ） ＩＪ ラム
（ｐ）１７．０）溶液で中和した後紫外線照射でファー
ジＤＮＡを膜上に固定した。
プラスミドｐＧＷ ５１０よりｄｉｎ ＡブローＴ−一
ター領域を含むＢａｍＨｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ切断２．８
ｋｂ長の断片を切り出し、ランダムプライミング法によ
り放射性標識してプローブに用いた。ハイブリダイセ−
’／ ヨ：／ Ｌｔ ６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ１１％ＳＤＳ
、５×デンハーツ溶液、１００μｇ／ｍｉ２子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中で６０℃、２時間行ツタ。１ｘＳＳＣ。
ター領域を含むＢａｍＨｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ切断２．８
ｋｂ長の断片を切り出し、ランダムプライミング法によ
り放射性標識してプローブに用いた。ハイブリダイセ−
’／ ヨ：／ Ｌｔ ６ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ１１％ＳＤＳ
、５×デンハーツ溶液、１００μｇ／ｍｉ２子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中で６０℃、２時間行ツタ。１ｘＳＳＣ。
０、１％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、Ｘ線フィル
ムに感光し、オートラジオダラムをとった。その結果、
クローン５Ｈ５に強いシグナルが現れ、８Ｄ２に弱いシ
グナルが現れた。
ムに感光し、オートラジオダラムをとった。その結果、
クローン５Ｈ５に強いシグナルが現れ、８Ｄ２に弱いシ
グナルが現れた。
（２） λクローン５Ｈ５からｃｌｉｎΔプロモータ
ー領域を含むＤＮＡ断片の単離 λクローン５Ｈ５からＤＮＡを調製し、制限酵素切断後
、サインプロット法を行った。ハイブリダイゼーション
の条件は（１〕と同様である。
ー領域を含むＤＮＡ断片の単離 λクローン５Ｈ５からＤＮＡを調製し、制限酵素切断後
、サインプロット法を行った。ハイブリダイゼーション
の条件は（１〕と同様である。
オートラジオグラフィーの結果、ＢａｍＨＩ −Ｂｃ。
Ｒ１の５．３ｋｂ長の断片がプローブとハイブリダイズ
した。そこで、この断片をｐｔｌｃ１８プラスミドベク
ターにクローニングした。ｐ［Ｉｃ １８の１μｇをＢ
ａｍＨＩ 、 ＢｃｏＲＩで同時に処理しく３７℃、
１時間）、続いてアルカリホスファターゼ処理を行った
（６５℃、３０分）。フェノール処理後、エタノール沈
殿によって線状化ベクターを回収した。
した。そこで、この断片をｐｔｌｃ１８プラスミドベク
ターにクローニングした。ｐ［Ｉｃ １８の１μｇをＢ
ａｍＨＩ 、 ＢｃｏＲＩで同時に処理しく３７℃、
１時間）、続いてアルカリホスファターゼ処理を行った
（６５℃、３０分）。フェノール処理後、エタノール沈
殿によって線状化ベクターを回収した。
次に、λ５ Ｈ５ＤＮＡを同様にＢａｍＨＩ −Ｅｃｏ
ＲＩで処理し、アガロースゲル電気泳動により分離して
ゲル断片より回収した。
ＲＩで処理し、アガロースゲル電気泳動により分離して
ゲル断片より回収した。
線状化ｐＵｃ １８の０．１μｇとλ５Ｈ５ＢａｍＨＴ
−ＥｃｏＲＩ断片０．２ μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ１
００ユニットを用いてリガーゼ緩衝液〔６６ｍＭ）
リスＨＣＩ （ｐＨ７，６） ６ ６ ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ Ａ
ＴＰ：）２０μβ中、１６℃、４時間反応させ結合させ
た。
−ＥｃｏＲＩ断片０．２ μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ１
００ユニットを用いてリガーゼ緩衝液〔６６ｍＭ）
リスＨＣＩ （ｐＨ７，６） ６ ６ ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ Ａ
ＴＰ：）２０μβ中、１６℃、４時間反応させ結合させ
た。
結合させたＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０３に導入し、アンピ
シリン１００μｇ／ｍｌ’を含むし寒天培地（トリプト
ン１０ｇ／Ｉ！、酵母エキス５呂／Ｒ，食塩５ｇ／１ｐ
Ｈ７，２、寒天１５ｇ／ｉ’）に塗布した。得られた形
質転換体より、プラスミドを調製し、このプラスミドＤ
ＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ 、 ＢｃｏＲＩで切断後
、アガロースゲル電気泳動を行って組込まれたＤＮＡ断
片のサイズを確認した。
シリン１００μｇ／ｍｌ’を含むし寒天培地（トリプト
ン１０ｇ／Ｉ！、酵母エキス５呂／Ｒ，食塩５ｇ／１ｐ
Ｈ７，２、寒天１５ｇ／ｉ’）に塗布した。得られた形
質転換体より、プラスミドを調製し、このプラスミドＤ
ＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ 、 ＢｃｏＲＩで切断後
、アガロースゲル電気泳動を行って組込まれたＤＮＡ断
片のサイズを確認した。
（３）組換え体粗抽出液の調製
得られた組換えプラスミドをｐＴｔｌ １００と命名し
、次に該プラスミドを、大腸菌ＭＭ３８６（ｐａｌ Ａ
高温感受件）を導入し、得られた形質転換体より粗抽出
液を調製した。まず、培養液１０−から集菌し、５０ｍ
Ｍ ）リスＨＣＩ（ｐｔｆ ８．０ ）２５％スクロー
ス溶液で洗浄した。同じ溶液に再溶解した後、同量のリ
シス溶液［：５０ｍＭ）’ＪスＨＣＩ （ｐＨ７，５
） ２５％スクロース、６０ｍＭスペルミジン・−
塩酸、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１２ｍＭ ＤＴＴＩ
を加え、４℃で４５分間静置した。更に、５％（ｗ／ｖ
）ブリジ（Ｂｒｉｊｉ）５８を２０μｍ加え３７℃で５
分間静置した後、遠心（３００００Ｘｇ、３０分）によ
り上清をとり粗抽出液とした。
、次に該プラスミドを、大腸菌ＭＭ３８６（ｐａｌ Ａ
高温感受件）を導入し、得られた形質転換体より粗抽出
液を調製した。まず、培養液１０−から集菌し、５０ｍ
Ｍ ）リスＨＣＩ（ｐｔｆ ８．０ ）２５％スクロー
ス溶液で洗浄した。同じ溶液に再溶解した後、同量のリ
シス溶液［：５０ｍＭ）’ＪスＨＣＩ （ｐＨ７，５
） ２５％スクロース、６０ｍＭスペルミジン・−
塩酸、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１２ｍＭ ＤＴＴＩ
を加え、４℃で４５分間静置した。更に、５％（ｗ／ｖ
）ブリジ（Ｂｒｉｊｉ）５８を２０μｍ加え３７℃で５
分間静置した後、遠心（３００００Ｘｇ、３０分）によ
り上清をとり粗抽出液とした。
（４）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定
反応溶液として３０ｍＭヘペスーＫＯ）Ｉ （ｐＨ７
，６）８ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭグルタミン
酸カリウム、５ｍＭ ＤＴＴ、３３ μＭｄＡＴＰ。
，６）８ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭグルタミン
酸カリウム、５ｍＭ ＤＴＴ、３３ μＭｄＡＴＰ。
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、３．３μＭ〔α”Ｐ］ＴＴＰ、２
５ｍＭ活性化サケＤＮＡを用意し、この溶液４０μｌに
対し、粗抽出液５μｌを加えて、３７℃、３０分反応さ
せた。２０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えて反応を停
止させた後、１０μｌをＤＥ８１紙（ワットマン社）に
スポットし、１０％トリクロロ酢酸で洗浄して、合成鎮
に取込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。
５ｍＭ活性化サケＤＮＡを用意し、この溶液４０μｌに
対し、粗抽出液５μｌを加えて、３７℃、３０分反応さ
せた。２０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えて反応を停
止させた後、１０μｌをＤＥ８１紙（ワットマン社）に
スポットし、１０％トリクロロ酢酸で洗浄して、合成鎮
に取込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。
その結果、ｐＴＨ１００を導入した菌体から４００ ｐ
ｍｏｌＴＴＰ／ｍｇ、またｐＵｃ１８だけの場合、２０
ｐｍｏｌＴ Ｔ Ｐ ／ ｍｇとなり、ｐＴＨ１００
の導入によるＤＮＡポリメラーゼ活性の増加が見られた
。
ｍｏｌＴＴＰ／ｍｇ、またｐＵｃ１８だけの場合、２０
ｐｍｏｌＴ Ｔ Ｐ ／ ｍｇとなり、ｐＴＨ１００
の導入によるＤＮＡポリメラーゼ活性の増加が見られた
。
（５） ｐＴＦＩ １００の構造解析ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を有するポリペプチドを産生ずる遺伝情報を担
うＤＮＡがｐＴ）Ｉ １００上に存在することから、組
込まれたＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ断片の構造解析を行
った。
ーゼ活性を有するポリペプチドを産生ずる遺伝情報を担
うＤＮＡがｐＴ）Ｉ １００上に存在することから、組
込まれたＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲＩ断片の構造解析を行
った。
次いで大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子を検索するた
めに、既に本発明者らによって精製された大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■のＮ末端アミノ酸分析をマッダイラ（Ｍ
ａｔｓｕｄａｉｒａ）の方法〔ザ ジャーナル 才ブ
バイオロジカル ケミ ス ト リ −（Ｔｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２６２巻、第１００３５頁（１９
８７）〕で行った。すなわち精製タンパクをＳＤＳゲル
電気泳動に供した後、ＰＶＤＦメンプランに移し、コマ
ジ−ブルー（ＣＢＢ）により染色し、７％酢酸アンモニ
ウムメタノールで脱色した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■タンパクの部分を切り取り、アミノ酸シークエンサー
に供しエドマン分解により、表１のＮ末端アミノ酸配列
を決定した。
めに、既に本発明者らによって精製された大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■のＮ末端アミノ酸分析をマッダイラ（Ｍ
ａｔｓｕｄａｉｒａ）の方法〔ザ ジャーナル 才ブ
バイオロジカル ケミ ス ト リ −（Ｔｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２６２巻、第１００３５頁（１９
８７）〕で行った。すなわち精製タンパクをＳＤＳゲル
電気泳動に供した後、ＰＶＤＦメンプランに移し、コマ
ジ−ブルー（ＣＢＢ）により染色し、７％酢酸アンモニ
ウムメタノールで脱色した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■タンパクの部分を切り取り、アミノ酸シークエンサー
に供しエドマン分解により、表１のＮ末端アミノ酸配列
を決定した。
その結果、ＢａｍＨＩ −ＢｃｏＲｒ上の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■遺伝子の構造、及び該ＤＮＡポリメラー
ゼ■の全アミノ酸配列を決定した（第１図） 実施例２ プラスミドｐＴ）ｌ １００を導入した大腸菌による大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの生産実施例１で作成した
プラスミドｐＴＨ１００を大腸菌ＨＢＩＯＩに導入し、
形質転換体を得、該形質転換体をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１／ｐＴＨ１００と命名し
た。
ポリメラーゼ■遺伝子の構造、及び該ＤＮＡポリメラー
ゼ■の全アミノ酸配列を決定した（第１図） 実施例２ プラスミドｐＴ）ｌ １００を導入した大腸菌による大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩの生産実施例１で作成した
プラスミドｐＴＨ１００を大腸菌ＨＢＩＯＩに導入し、
形質転換体を得、該形質転換体をＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１／ｐＴＨ１００と命名し
た。
次に、上記大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７０１） ヲ
１００μｓ／ｄのアンピシリンを含む２０−のし培地に
接種し、３７℃で一夜前培養した。これを５００ｍｆの
Ｌ培地を含む２１容のフラスコ４本に５−ずつ移し、更
に８時間３７℃で振とう培養（１２Ｏｒｐｍ）した後集
菌し、６ｇの菌体を得、次に該菌体を凍結融解し、以後
低温下で各操作を行った。菌体を５０ｍＭ）ＩＪスＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５） １０％スクロース、０．１
Ｍ塩化−）−）！Ｊウム、１５ｍＭスペルミジン３ｍｆ
に懸濁し、０．２■／ｍｌ！になるようにリゾチームを
加えて４℃で１時間静置した。トリトンＸ−１００（ロ
ーム アンド ハース社）を１％（Ｖ／Ｖ）になるよう
に加え、３７℃で４分振とうした後、遠心（２３０００
ｘｇ、１時間）で上清を得、画分１とした。
１００μｓ／ｄのアンピシリンを含む２０−のし培地に
接種し、３７℃で一夜前培養した。これを５００ｍｆの
Ｌ培地を含む２１容のフラスコ４本に５−ずつ移し、更
に８時間３７℃で振とう培養（１２Ｏｒｐｍ）した後集
菌し、６ｇの菌体を得、次に該菌体を凍結融解し、以後
低温下で各操作を行った。菌体を５０ｍＭ）ＩＪスＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５） １０％スクロース、０．１
Ｍ塩化−）−）！Ｊウム、１５ｍＭスペルミジン３ｍｆ
に懸濁し、０．２■／ｍｌ！になるようにリゾチームを
加えて４℃で１時間静置した。トリトンＸ−１００（ロ
ーム アンド ハース社）を１％（Ｖ／Ｖ）になるよう
に加え、３７℃で４分振とうした後、遠心（２３０００
ｘｇ、１時間）で上清を得、画分１とした。
画分１に０．２２６ｇ／耐量の硫酸アンモニウムを加え
、氷中１時間かくはんした後、２３０００×ｇで４０分
遠心し沈殿を得た。
、氷中１時間かくはんした後、２３０００×ｇで４０分
遠心し沈殿を得た。
この沈殿を２０−のＰＣ緩衝液［５０ｍＭ）リスＨＣＩ
（ｐＨ７，５） ３０％グリセロール、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴＩ 、２５０１Ｍ塩化ナト
リウムに溶解し、４１の同じ溶液で一晩透析した。
（ｐＨ７，５） ３０％グリセロール、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴＩ 、２５０１Ｍ塩化ナト
リウムに溶解し、４１の同じ溶液で一晩透析した。
これをあらかじめ同じ溶液で平衡化したＰ−セルロース
カラム４０−に添加し、５０ｍＭから４００ｍＭまでの
ＮａＣ１の直線濃度勾配により展開した。
カラム４０−に添加し、５０ｍＭから４００ｍＭまでの
ＮａＣ１の直線濃度勾配により展開した。
溶出液を分画し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を調べた。活
性測定には標準反応液として６７ｍＭリン酸カリウム（
ｐＨ７，４） ６．７ ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０μＭ活性化ＤＮＡ
、３３μＭ ｄＡＴＰ。
性測定には標準反応液として６７ｍＭリン酸カリウム（
ｐＨ７，４） ６．７ ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０μＭ活性化ＤＮＡ
、３３μＭ ｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、１６ ｎＭ ［３Ｈ）
ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して分画サン
プル５μｌを加え、３７℃、１０分反応させた後、５０
＋ｎＭピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１−加えて
反応を停止させた。水中で５分間静置した後、全量をグ
ラスフィルター上に移し吸引ろ過した。１０％ＴＣＡで
数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、フィルタ
ーを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフィル
ター上の放射活性を測定した。一方これらの両分を、５
ＰＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、タンパ
クのバンドを調べた。
ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して分画サン
プル５μｌを加え、３７℃、１０分反応させた後、５０
＋ｎＭピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１−加えて
反応を停止させた。水中で５分間静置した後、全量をグ
ラスフィルター上に移し吸引ろ過した。１０％ＴＣＡで
数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、フィルタ
ーを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフィル
ター上の放射活性を測定した。一方これらの両分を、５
ＰＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、タンパ
クのバンドを調べた。
その結果、発現された大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■は分
子量約９万ダルトンで、そのＤＮＡポリメラーゼ活性は
３００ｍＭ〜３２ ＯｍＭ ＮａＣ１画分に溶出され
ていた。Ｐ−セルロースカラムで精製した活性画分では
、本酵素は粗抽出液から約３０００倍に精製され、比活
性も約５０００Ｕ／ ｍｇと、これまでに報告されてい
る大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■標品の２５倍の高純度を
示し、大量の酵素を純度よく調製することができた。
子量約９万ダルトンで、そのＤＮＡポリメラーゼ活性は
３００ｍＭ〜３２ ＯｍＭ ＮａＣ１画分に溶出され
ていた。Ｐ−セルロースカラムで精製した活性画分では
、本酵素は粗抽出液から約３０００倍に精製され、比活
性も約５０００Ｕ／ ｍｇと、これまでに報告されてい
る大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■標品の２５倍の高純度を
示し、大量の酵素を純度よく調製することができた。
以上詳細に説明したように、本発明により既存のＤＮＡ
ポリメラーゼと異なった性質を示す大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩの工業的製造に適した新規な大腸菌、及びそ
れを用いたＤＮＡポリメラーゼ■の製造法が提供された
。
ポリメラーゼと異なった性質を示す大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩの工業的製造に適した新規な大腸菌、及びそ
れを用いたＤＮＡポリメラーゼ■の製造法が提供された
。
第１図は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の全塩基配列及び該ＤＮＡポリメラーゼＩＩの
アミノ酸配列を示す図である。
ＮＡ断片の全塩基配列及び該ＤＮＡポリメラーゼＩＩの
アミノ酸配列を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、図面の第１図で表されるアミノ酸配列を有している
ことを特徴とする大腸菌ＤＮＡポリメラーゼII。 ２、請求項１記載の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIをコー
ドする塩基配列。 ３、請求項１記載の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIをコー
ドするＤＮＡを含有させた組換え体プラスミドを導入さ
せた形質転換体を培養し、該培養物より請求項１記載の
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIを採取することを特徴とす
る請求項１記載の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIIの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2263125A JPH04141088A (ja) | 1990-10-02 | 1990-10-02 | 大腸菌ｄｎａポリメラーゼ２及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2263125A JPH04141088A (ja) | 1990-10-02 | 1990-10-02 | 大腸菌ｄｎａポリメラーゼ２及びその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04141088A true JPH04141088A (ja) | 1992-05-14 |
Family
ID=17385169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2263125A Pending JPH04141088A (ja) | 1990-10-02 | 1990-10-02 | 大腸菌ｄｎａポリメラーゼ２及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04141088A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999025240A1 (en) | 1997-11-14 | 1999-05-27 | Citizen Watch Co., Ltd. | Radiation thermometer |
-
1990
- 1990-10-02 JP JP2263125A patent/JPH04141088A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999025240A1 (en) | 1997-11-14 | 1999-05-27 | Citizen Watch Co., Ltd. | Radiation thermometer |
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