JPH0414295B2 - - Google Patents

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JPH0414295B2
JPH0414295B2 JP58167695A JP16769583A JPH0414295B2 JP H0414295 B2 JPH0414295 B2 JP H0414295B2 JP 58167695 A JP58167695 A JP 58167695A JP 16769583 A JP16769583 A JP 16769583A JP H0414295 B2 JPH0414295 B2 JP H0414295B2
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JP
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layer
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tissue section
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Oonsutain Renado
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MAUNTO SAINAI SUKUURU OBU MEDEISHIN OBU ZA SHITEI UNIV OBU NYUUYOOKU
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MAUNTO SAINAI SUKUURU OBU MEDEISHIN OBU ZA SHITEI UNIV OBU NYUUYOOKU
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組織染色およびマウント前の、テー
プに支持された、特にこわれやすい組織試料の薄
切片の取扱い方法に関し、さらに詳しくは、前記
工程のために顕微鏡用スライド上に前記切片を確
実、安全に移行およびマウントするに際しこれを
迅速、簡単とするための方法に関する。
種々の顕微鏡的研究のために、動物および植物
組織の非常に薄い切片が各種のミクロトームで切
断されて調製される。組織を生のまま切断するこ
とも可能であるが、生の組織の多くはその柔軟性
のため、ゆがみのない薄い切片に切断することが
非常に困難である。しばしば組織を凍結ミクロト
ーム上でまたは低温恒温装置内で０℃（32〓）以
下の温度で切断する場合があり、組織内の凍結水
の硬さのため２〜３マイクロメートルもの薄い切
片を比較的容易につくることができる。これらの
凍結切片は脆く砕け易いためそれ以後の取扱いお
よび処理が困難である。組織切片の作成を簡単に
するため、すぐれた切断性を有し、高品質で取扱
いの比較的容易な組織切片を生ずる、支持された
組織のブロツクを製造する一群の方法が開発され
ている。このような方法には、典型的には次の操
作が含まれる：(1)組織細胞を構成する天然ポリマ
ーを不溶化しこれを硬化させる溶液中での組織の
固定、(2)一連の、水と混合し得る溶媒（例えばア
ルコール）、次でパラフインまたはプラスチツク
モノマーと混合し得る溶媒（例えばトルエンまた
はリシレン）による組織の脱水、(3)溶融パラフイ
ンまたはモノマー溶液による組織への浸透、およ
び(4)パラフインの凝固またはモノマーの重合によ
る固体ポリマーの形成による包埋。『Staining
Methods（組織染色法）』（J.F.A McManus お
よびR.W.Mowry著、P.B.Hoeber社、ニユーヨ
ーク、1960年）および『Techniques for
Electron Microscopy （電子顕微鏡技法）』（D.
Kay編、Blackwell Sci.Publ.社、オツクスフオ
ード、イギリス）第166〜212頁参照。
しかし時には切片作成がやはり困難な試料があ
る。切片を組織から切断する場合に切片の一部が
ばらばらになつて切片から脱落したり、ミクロト
ームから取去る場合に切片から落ちたりし易い。
このような切断の難しい切片の切断および取扱
を容易とするための方法を記載した次の文献を参
考として引用する： １ A.Palmgren〔ネイチヤー（Nature）、第174
巻、第46頁（1954年）〕は非常に大形で硬い、
または脆い試料切断用の補助材として感圧接着
テープを使用することを述べている。接着テー
プの一片を、ミクロトーム内に支持された、凍
結またはパラフインブロツク内に包埋された試
料の表面に貼る。切断された切片はこれにより
貼つたテープで支持される。このようにして調
製した、硬くて脆く砕け易い組織の圧縮されて
いない切片の品質は、同じ組織のブロツクから
の常法による切片よりはるかにすぐれたものと
することができる。しかしPalmgrenによれば、
前記切片をテープ上にあるまゝで処理したり、
スライドガラス上に転位したり（それ以後常法
によつて処理し得るようにするため）するに
は、手の込んだ、時間がかゝりまた不便な手法
が必要で、これにより切片が損傷を受ける恐れ
もある。
２ W.E.Beckel〔ネイチヤー、第184巻、第1584
頁（1959年）〕は前記Palmgren記載の方法にお
いて商品名スコツチ（Scotch）No.810の酢酸セ
ルロース下地の接着テープの使用について述べ
ている。テープに載せた切片は、湿つた常法で
アルブミンを塗布したスライドガラス上に切片
側を下にして当てる。充分乾燥後（少くとも２
〜３時間を要する）、接着剤の下地、接着剤層
およびパラフインをすべてテトラヒドロフラン
に30分間溶解すると切片のみがスライドガラス
に接着して残り以後常法によつて処理すること
ができる。別の方法として、クロロホルムで２
分間、次でキシレンで30分間の処理も接着剤下
地、接着剤層およびパラフインの溶解に使用す
ることができる。Beckelはまた、アルブミン
のフイルムと、セロイジン（celloidin）の安息
香酸メチルまたはエチルアルコール２パーセン
ト溶液を使用して切片とスライドガラスとを接
合し、次いでクロロホルムで１分間、キシレン
で10分間処理して処理を完了する『より迅速な
方法』を記述している。
３ D.S.GowersおよびR.E.Miller〔ネイチヤー、
第190巻、第425頁（1961年）〕はBeckelの方法
を追試したが、入手し得るスコツチNo.810テー
プでは接着剤を溶解することができず、それに
代る入手し得る最良のテープ〔商品名 タツク
（Tuck）No.200〕を使用した場合、溶媒中で切
片を損傷せずにテープを安全に除去するには１
〜10時間を要することを見いだした。
４ R.P.WedeenおよびH.I.Jernow〔Am.J.
Physiol.，第214巻、第776頁（1968年）は接着
テープで支持した凍結切片をオートラジオグラ
フ（写真）用プレートに付着させるのにシアノ
アクリレート（イーストマン910“スーパーグル
ー”）（Eastman 910 “superglue”）を使用し
た。シアノアクリレートは最初液体であるが、
絞り出して薄膜にすると重合固化する。シアノ
アクリレートポリマーはキシレンその他の処理
溶媒に可溶でありこのため切片は離れて浮いて
しまうので、通常の染色操作には有用でない。
本発明は、少くとも部分的に、接着テープに支
持された組織切片を迅速で便利な方法により、永
久的結合によつて顕微鏡用スライドにマウントす
る方法であつて、その結合材料はかゝる試料に対
して以後加えられる処理工程のいずれにも影響さ
れずまたそれらを妨害せず、またその後の完全処
理試料の顕微鏡観察を妨害しないようなものであ
る方法に関する。
テープに載せた組織切片試料の処理の時間を短
縮しこれを簡単化するという従来得られなかつた
利点を獲得するため、本発明により、可撓性の感
圧接着テープの一片上に支持された組織試料を、
さらに重合可能な感圧接着剤の皮膜を接触面上に
被覆した顕微鏡用スライドと接触させる方法が提
供される。切片作成の補助手段として、前記試料
に可撓性テープを貼る技法は、例えば前記の、そ
れぞれPalmgren、Beckel、Gowersらおよび
Wedeenらの分献に記載されている。試料切片を
重合性の層に接触させた後その層を１〜３分間で
重合させ、テープを支持テープの下地および（ま
たは）支持テープ接着剤層を弱める溶媒中に浸漬
すると、これらは洗い去られまたははがれ落ちて
１分間以内に組織試料が完全に露出する。重合性
の層およびその切片への結合は硬化後は、不溶性
のテープ下地を切片に損傷を与えずにはく離し、
その後試料を顕微鏡用スライド上に強固に支持す
るに十分な強度を有する。
重合性の層はさらに、以下の性質をもつ硬化性
成分のみを含有するという特徴を有している。す
なわち、前記硬化性成分は、それぞれの硬化前お
よび硬化中の拡散係数が充分に小さく、従つて硬
化過程中の試料内への成分の拡散が最小となり、
また粘度が充分に大きく、従つて指圧を加えた場
合の試料中への流入が最小、すなわち30分間で１
マイクロメートル以下であるという特徴を有して
いる。しかし硬化すると、前記の層は顕微鏡用ス
ライドと試料切片との間に確実な結合を形成し、
支持された切片の以後の処理の際の取扱いを容易
にする。切片内への拡散および流入が最小である
ので組織切片の内部構造は実質的に全部が、次の
処理を受けやすい状態のまゝである。また、重合
後の結合層は前記の処理により何等影響を受けな
い。
重要なこととして、重合した層は未染色の組織
の屈折率（例えば約1.53ないし1.57）に合つた、
また処理終了後に試料を封入しその上にカバーグ
ラスを付するのに通常使用するマウント用媒体に
合つた屈折率を有する。通常、試料はその特定の
成分を際立たせるため処理の間に染色する。完成
した顕微鏡用スライドの各種の成分それぞれの屈
折率が実質的に同じであるので、後に組織を顕微
鏡で検鏡する場合に像を悪化させるような光学的
干渉は生じない。
従つて本発明は、感圧重合性層によつて組織を
顕微鏡用スライドに確実に付着させ、この層の硬
化性成分は重合前および重合中に極めて僅かしか
試料中に浸透せず、かつ重合後は試料の屈折率に
合つた屈折率を有し、支持された組織を後に化学
的または物理的に処理する場合、これら処理の影
響を受けずまたこれらに影響もしないものである
方法を提供する。
第１図に示すように、パラフイン１０によつて
囲まれ浸透された組織薄切片９を感圧接着剤層１
４により可撓性テープまたは基体１２の表面上に
支持しこれに付着させる。切片９は層１４に付着
させたスペーサ１３の窓または開口部内に位置し
ている。1982年３月４日出願の米国特許出願第
06／354，837号明細書に記載の如く、スペーサ１
３はミクロトームによる薄切片９の切断を容易に
する。
第２図において、顕微鏡用スライド１６が図示
され、これはその上面に感圧接着剤層１８を支持
している。層１８は熱硬化性の重合性材料か光重
合性材料のいずれかから成ることができる。好ま
しくは層１８は、例えば320nｍ〜390nｍ範囲の
波長の紫外線に露光することにより光重合可能で
ある。第２図はまた、試料９と層１８が並置され
るようテープ１２を倒置した状態を示す。次に試
料と層１８とを接触させる。軽い圧力を、例えば
手で、加えることが好ましい。またこの圧力は、
試料９と層１８との間の接触を円滑にするため、
試料に沿つて漸次に加えることもできる。
層１８は好ましくは次の特徴を有するように形
成される： １ 重合前は試料９に接着する充分な粘着性を有
する。
２ 試料９とスライド１６との間に永久的結合を
形成するよう、重合性である。
３ 層１８の重合前に組織切片９内に30分間で１
マイクロメーターも拡散する程度散係数の大き
な硬化性成分を含有いない。もしこのような成
分が相当量拡散したとすれば、硬化後これによ
つて、以後の処理における試料切片９全体への
処理試薬の浸透が妨げられるであろうことは明
かである。
４ 試料切片９との接触の際、またなでつけ操作
において圧力を加えている間に切片９の細孔内
に流入しないよう、十分に大きな粘度を有する
こと。もし切片内に相当量が流入すれば、これ
もまた硬化後、それ以降の処理の妨げになるで
あろう。
５ 硬化後は、試料切片９が以後の処理中に遭遇
する試薬のすべてに不溶性、非膨潤性である。
６ 未染色組織の屈折率および、試料９を顕微鏡
用スライド上に封入するのに通常使用されるマ
ウント用媒体の屈折率と合つた屈折率例えば約
1.53ないし1.57を有する。
７ 硬化後は、試料切片９の底面およびスライド
１６の対向面の両方に強固に結合するのに有効
である。
従つて、試料９を層１８に接触させなでつけた
後、得られた積層体２０は3A図に示す通り、光
源２１からの紫外線に、層１８を完全に重合させ
るに充分な時間、典型的には３分間、露光する。
光源２１は４ワツト（またはそれ以上）のブラツ
クライトけい光ランプ（けい光体のピーク光出力
350nｍのもの）でよい。この時点で、層１８お
よびテープ１２上の接着剤層１４（これは重合し
ない）は間にはさまれた試料９に強固に接着す
る。
第３Ｂ図に示すように、積層体２０を次にビー
カー２４内に入れた溶媒溶液２２、例えばキシレ
ン中に浸漬する。この浸漬はテープ１２上の層１
４を迅速に軟化させる役をし、積層体２０がビー
カー２４内に浸漬している間に試料９上からテー
プ１２を手で静かにはがせるようにする。露出し
た層１４およびパラフイン１０はテープ１２がは
ぎ取られる際に、またはその後１分間以内に、溶
解する。試料切片９はこれで完全に露出する。層
１４が溶解してしまうと、残りの積層体にはいつ
でも以後の処理を行なうことができ、試料切片９
はスライド１６の表面に強固に結合している。ま
た、溶媒溶液２２は、前述のように基体１２をは
がす必要を無くするため基体１２と接着剤層１４
の両方を溶解し得るように選択してもよいことは
明かである。
好ましくは、スライド１６上の層１８は非常に
高分子量の反応性オリゴマー（典型的には、それ
ぞれが２個の末端アクリルまたはメタクリル基を
有するもの）の混合物から成る。高分子量によ
り、高粘度と抵拡散係数とが確保される。分子量
が高過ぎると粘着性が不十分である。アクリル基
またはメタクリル基の存在によつて、オリゴマー
はラジカル重合により架橋して高度に不溶性のポ
リマーとなる。
典型的には、混合物は硬化後の屈折率が1.560
より大きい一つのオリゴマー（例えば、屈折率を
大きくするためにビスフエノールＡまたはその他
の高度に芳香族性の残基を多くしたエポキシ−ア
クリレートオリゴマー）および硬化後の屈折率が
1.530より小さい別のオリゴマー（例えばウレタ
ンアクリレートオリゴマー）から構成される。硬
化した樹脂は両方ともキシレン、アルコールおよ
び水に対して非常に高い耐性を有してなければな
らない。これらを適当な比率で混合することによ
り、層１８を重合した場合その硬化後の屈折率を
所望の任意の、1.530ないし1.560の値とすること
ができる。
当業者が反応性オリゴマーおよび（または）ポ
リマーと他の開始剤および溶媒のその他の組合せ
を配合して、前記の方法における各条件を満たす
ことができることは明らかである。しかし、層１
８の形成に適当な組成物の詳細な記述について
は、本願と同一日付で出願した、出願人および発
明者同一の別出願の明細書の記載を参照された
い。
層１８の屈折率と、試料切片９ならびにスライ
ド１６上に試料を封入するのに使用されるマウン
ト用媒体の両者の屈折率との調和は極めて重要で
ある。これらの屈折率が正しく調和されていない
と、層１８の硬化した上面の表面欠陥のすべて、
例えばさきに除去した接着剤層１４またはパラフ
イン１０上の肌理によつて残つた表面欠陥が顕微
鏡検鏡の際に、目を混乱される、位相差による強
度差の細い模様として観察されるであろう。従つ
てこれらの屈折率を正しく調和させると非常に高
品質に仕上つた顕微鏡用スライドが得られる。試
料９封入用のマウント用媒体は好ましくは1.55付
近の屈折率を、硬化後の層１８は1.545ないし
1.555の屈折率を有する。
テープ１２をほく離した後、露出した試料切片
９は慣用の組織学的技法により、貯蔵および永久
封入のために処理することができる。この処理の
間、試料欠片９はすでに重合した層１８によりス
ライド１６に強固に永久的に結合し、層１８は前
記技法による処理に影響を与えることも影響され
ることもない。前記封入操作は、例えば前記
McManusおよびMowryの著者に詳細に記載され
ているようにして手動で行なうことができる。別
の方法として、それぞれ個別のスライド１６上に
支持した多数の組織試料切片９を自動式に、例え
ばテクニコンインスツルメンツ社（Technicon
Instruments Corporation、Tarrytown、New
YorK）販売のオートテクニコン
（AUTOTECHNICON）システムに明確に示し
記載されているように、またその技術報文
（Technical Publication）No.TA1−0225−10
（1977年６月）、３−10ないし３−13ページに記載
さているようにして処理することができる。
第４図は、直ちに顕微鏡観察できるよう完全に
マウントした試料切片を示す。第４Ａ図は常法で
マウントした試料切片９を示す。この試料はマウ
ント用媒体２６で覆われ、カバーグラス２８が前
記媒体および試料上に存在している。
一方、第４Ｂ図は米国特許第4120991号明細書
に開示された技法による、紫外線硬化性マウント
用媒体２７内への試料９の封入を示す。図に示さ
れる通り、カバーグラスは無く、代りにマウント
用媒体２７の上面が光学的に平坦となるよう形成
されている。
本方法の目的に対しては、切片を捕捉するのに
使用する接着テープは少なくとも溶媒例えばキシ
レンに可溶性の接着剤層を有しなければならな
い。先に引用したWedeenおよびJernowが使用し
たようなシリコーンゴム接着剤が凍結切片に対し
適当であり、ペルマセル（Permacel）No.925のよ
うな接着テープがパラフイン切片作成に適当であ
る。
組織試料の薄切片を顕微鏡用スライド上に移行
する方法のいくつかの形式について記述したがこ
の方法には、本発明の原理から逸脱することなく
その細部に種々の変更を加え得ることは明らかで
あろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は可撓性テープまたは基体の表面上に支
持された状態の組織薄切片を示す斜視図である。
第２図は顕微鏡用スライドとこれに並置した第１
図の基体とを示す斜視図である。第３Ａ図は、基
体と顕微鏡用スライドとの間に組織薄切片が積層
されるように両者を重ね合せたところを示す斜視
図である。第３Ｂ図は組織切片を顕微鏡用スライ
ド上にそれ以後の処理のために露出させるため、
スライド上から基体を取り除くところを示す断面
図である。第４Ａ図は顕微鏡用スライド上に組織
薄切片をカバーグラスと共にマウントした最終的
な状態を示す断面図である。第４Ｂ図は顕微鏡用
スライド上にカバーグラスなしで組織薄切片をマ
ウントした最終的な状態を示す断面図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 第一の感圧接着剤層によつて基体上に支持さ
    れた組織試料の薄切片を、第二の感圧接着剤層に
    よつて一つの面の少くとも一部を被覆された顕微
    鏡用スライド上へ、前記基体から移行しマウント
    する方法であつて、 前記第二の層としてのみ、重合性の感圧接着剤
    の層を使い、ただしこの重合性感圧接着剤は重合
    前の拡散係数が前記組織試料への拡散を実質的に
    防ぐのに充分に低くまた重合前の粘度が前記組織
    試料への流入を実質的に防ぐのに充分に高いもの
    とし、 前記支持された組織切片と前記第二の層とを接
    触させて、前記基体、前記第一の層、前記組織切
    片、前記第二の層および前記顕微鏡用スライドか
    ら成る積層体を形成し、 前記第二の層を重合し、 前記第一層を溶解するが重合した前記第二層は
    溶解しない溶液中に前記積層体を浸漬して、前記
    基体と前記第一層との前記組織切片上からの除去
    を容易なものとし、次で 前記基体と前記第一層とを除去して、前記顕微
    鏡用スライド上に支持された前記組織切片を露出
    させることから成る、前記組織試料薄切片の移行
    マウント方法。 ２ 前記顕微鏡用スライド上に支持された前記組
    織切片に、該組織試料を直ちに顕微鏡検鏡し得る
    状態となるよう染色しマウントする処理を行な
    う、前項１に記載の方法。 ３ 前記除去工程が、前記基体と前記第一層とを
    前記溶媒中に実質的に完全に溶解する工程から成
    る、前項１に記載の方法。 ４ 前記基体が可撓性であり、そして前記除去工
    程が前記組織切片上から前記基体をはく離し前記
    第一層を溶解し去る工程から成る、前項１に記載
    の方法。 ５ 前記重合工程が前記第二層を熱硬化する工程
    から成る、前項１に記載の方法。 ６ 前記重合工程が前記第二層を光重合する工程
    から成る、前項１に記載の方法。 ７ 前記第二層の重合の前に前記積層体に圧力を
    加えて前記組織切片の前記第二層への接着を確実
    なものとする、前項１に記載の方法。 ８ 前記組織切片を前記第一層上になでつけて両
    者間の均一で完全な接触を確保する、前項７に記
    載の方法。 ９ 前記第二層の屈折率を前記組織切片の屈折率
    と合わせる、前項１に記載の方法。 １０ 前記第二層を重合後約1.53ないし1.57の屈
    折率を有するように形成する、前項９に記載の方
    法。 １１ 前記第二層を、前記処理工程によつて影響
    を受けないように形成する、前項２に記載の方
    法。 １２ 前記第二層を、前記処理工程中に不活性で
    あるように形成する、前項２に記載の方法。
JP58167695A 1982-09-13 1983-09-13 組織試料薄切片の移行マウント方法 Granted JPS59116531A (ja)

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US417307 1982-09-13
US06/417,307 US4545831A (en) 1982-09-13 1982-09-13 Method for transferring a thin tissue section

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JPS59116531A JPS59116531A (ja) 1984-07-05
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EP (1) EP0103477B1 (ja)
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