JPH0414748B2

JPH0414748B2 -

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Publication number: JPH0414748B2
Application number: JP60206693A
Authority: JP
Inventors: Senya Inoe; Akira Ono
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 1985-09-20
Filing date: 1985-09-20
Publication date: 1992-03-13
Also published as: JPS6267451A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な性状を有するヒドロキシアパ
タイト、Ca₅（PO₄）₃OH、から成るクロマトグラ
フイー用充填剤に関するものである。更に詳しく
は、本発明は、微小球形をしたヒドロキシアパタ
イト粒子から成るクロマトグラフイー充填剤を提
供するものである。本発明に係るクロマトグラフ
イー充填剤は、機械的強度が大きく、耐久性、再
現性に優れた、特にカラムクロマトグラフイー用
充填剤として好適な微小球形のヒドロキシアパタ
イトよりなるものであつて、産業上の利用性の極
めて大なるものである。

近時、化学物質や生化学物質の分離・精製に
は、高速液体クロマトグラフイーや電気泳動装置
が多く、用いられ、なかでも、高速液体クロマト
グラフイーは、吸着能力のある物質を充填したカ
ラムに、分離対象材料を通すだけで足りるという
取扱いの容易さから広く利用されている。そし
て、これまでそのような用途に用いられる充填剤
の材料としては、シリカやアルミナの使用がその
主流となつていた。ところが、これらの既存のイ
オン交換型や分子ふるい型などの充填剤を用いた
高速液体クロマトグラフイーによつては、大きな
分子量の生体高分子の分離には限界があり、およ
そ10の５乗ダルトン以上の高分子量のたんぱく質
などの分離精製は不可能とされている。また、一
方、近時、バイオテクノロジーの進展に伴い、こ
うした分離限界の壁を破る技術手段の開発が強く
望まれている。

ところで、最近ヒドロキシアパタイトを充填し
たカラムが市販されるようになり、従来不可能で
あつた10の５乗ダルトン以上の生体高分子の分
離・精製が可能となつたことから、たんぱく質、
核酸、酵素などの分離・精製を必要とするバイオ
テクノロジーの工業化に応えるものとして注目を
あびている。

しかしながら、従来技術によるヒドロキシアパ
タイト充填剤は、機械的強度が小さく、微粉化し
易く、また、充填特性やクロマト特性の再現生が
悪く、耐久性に乏しく寿命が短かいため高価なも
のとなるなどの種々の難点があるため、生体高分
子の分離・精製について優れた特性を有するにも
かかわらず、広く使用されるには至らず、その難
点の解消が切望されている。

すなわち、これまでのヒドロキシアパタイト
は、テイゼリウス法〔A.Tiselius，S.Hjerte´n
and O¨.Levin，Arch.Biochem.Biophys.，65，
132−155（1956）〕をはじめ、溶液中からイオンの
直接的反応によつてヒドロキシアパタイトの沈殿
を生ぜしめる、いわゆる湿式合成法と呼せられる
方法により製造されるものであるため、Ca／Ｐ
比のコントロールが難かしく、リン酸分が充分に
抜けきらないため、強アルカリ、有機溶剤に弱い
という欠点があり、また、充填剤粒子としての形
状は、壊れ易い板状結晶や微小結晶の集合体から
成り、機械的強度が小さいため、高圧を作用させ
ての充填時や測定操作時に微粉化し易いという欠
点が有つた。更に、板状や柱状の微結晶の集合体
から成る粒子であるために、充填時における流動
性が悪く、しかも上述の如く、その機械的強度が
小さいため、高圧を作用させて充填剤粒子を密に
詰め、充填粒子間間隙を均一にすることは極めて
困難であつた。また、充填の済んだカラムの充填
状態を変化させないよう、その取扱いについて
も、格別の注意を払う必要があるなど、実用上多
くの難点が存在した。

高速液体クロマトグラフイー用充填剤は、その
粒径を極度に微小化する必要がある。すなわち、
液体中における物質の拡散係数は、気体のそれに
比べて著しく小さいから、液体クロマトグラフイ
ーにおける分配の非平衡の影響を小さくするに
は、移動相中の物質移動距離を充分に小さくする
必要がある。このため、液体クロマトグラフイー
の分析の高速化のためには、ガスクロマトグラフ
イーの場合に比較して、粒子径の極めて小さな充
填剤が必要となる。最近では、各種充填剤の開発
が進み、その性能向上と共に微粒子化がますます
進み、３から5μm程度の粒子径のものも実用化さ
れるようになつてきた。

ヒドロキシアパタイトに関しても、粒子の微小
化はある程度実現されてきているが、上述の如
く、従来技術によるヒドロキシアパタイト粒子
は、機械的強度が小さく微粉化し易すい欠点を有
し、しかも、その微小粉体は板状や柱状の微結晶
の集合体から成るため、充填剤として用いる場合
に、粒子形状が不ぞろいとなることは避けられな
かつた。

充填剤の粒子径の微小化に加えて、充填剤粒子
の形状を球形にすることは、充填操作を容易にす
るという実用上の利点であるのみならず、クロマ
トグラムのピークの広がりの原因の１つである充
填粒子間間隙のばらつきを減少することが出来、
クロマト特性を向上させる上からも極めて重要な
ことである。しかしながら従来技術によるヒドロ
キシアパタイト充填剤の球形化については、これ
まで、技術的に造粒が容易な100μm程度の大きさ
の球状の成形粒子の製造がなされているのみで、
高速液体クロマトグラフイー用として好適な数
μm〜10数μm程度の極めて微小な球形のヒドロキ
シアパタイトの製造に関しては、強く実現が望ま
れているにもかかわらず、その技術的困難さか
ら、今日まで、実現されていなかつた。

本発明者らは、先に、新規なヒドロキシアパタ
イトの製造法として水まはた水と相溶性の有機溶
媒を、それぞれ、単独で溶媒として用いるか、あ
るいは水と相溶性の有機溶媒と水との混合溶媒を
溶媒として用い、その使用した溶媒に対し可溶性
のカルシウム化合物と、リン化合物とを加えて混
合して原料溶液を調製し、その原料溶液を火炎中
または加熱帯域中に噴霧し、熱分解反応を生ぜし
めることにより微小球形のヒドロキシアパタイト
を生成せしめる方法を提供し、また、その際の製
造条件を選択することにより、何らの成形操作を
加えることなく、直接に、サブミクロン〜数10ミ
クロンの球形を有するヒドロキシアパタイト粒子
を製造できることを見い出した（特願昭59−
265270号〔特開昭61−146704号〕、特願昭60−
38655号〔特開昭61−201612号〕参照）。本発明者
らは、さらに、その後の研究により、こうして得
られた球形粒子がクロマトグラフイー用充填剤の
粒子の形状として最も望ましい形であるばかりで
なく、そのクロマト特性においても、極めて優れ
た特性を有することを見い出した。すなわち、こ
の新規な性状を有するヒドロキシアパタイト粒子
は、従来技術では不可能であつた数μm程度の球
形粒子を、何らの成形操作を加えることなく直接
に製造し得るという利点のみならず、Ca／Ｐ比
のコントロールが容易であるという製法によるも
のであるため、生成したヒドロキシアパタイト球
形粒子は、科学的安定性に優れ、機械的強度が極
めて大きく耐久性に優れる等、充填剤として具備
すべき多くの優れた特性を有することが見い出さ
れた。本発明は、かかる知見に基づいてなされた
ものである。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明においては、上述の本発明者らの方法に
より製造される数μ〜数10μmのヒドロキシアパ
タイト球形粒子をそのまま、あるいは更に粒度を
そろえるために分級を行つてからカラム充填剤と
して用いるものである。

上記のヒドロキシアパタイトは粒子形状が球形
であるために、充填時の流動性が良く、角ばつた
粒子の充填時に生じ易いブリツジ現象を起こすこ
ともなく、通常の操作手順に基づいた充填操作を
実施するだけで均一に充填されたカラムを容易に
製造することができる。またさらに、粒子径のそ
ろつた、形の整つた球形粒子を充填する場合に
は、充填操作が一層容易であるだけでなく、均一
に充填されたヒドロキシアパタイト粒子によつて
形成される粒子間間隙も、極めて均一なものとな
るから、渦流によつてカラム軸方向への溶質の流
れの線速度に差を生じさせてカラムの分離能低下
の原因の一つとなる充填粒子間間隙のばらつきを
解消することができるという特長を有する。

粒径の微小化と粒径の均一化は従来技術により
製造されるヒドロキシアパタイト充填剤について
も、ある程度実現されるようになり、また、カラ
ムへの充填に関しても、充填粒子間間隙のばらつ
きを少なくするための細心の工夫がなされている
がそうした努力にもかかわらず、従来技術により
製造されるヒドロキシアパタイト充填剤は、その
粒子形状が板状や柱状の微結晶の集合体などの
種々の形を有し、しかも機械的強度が小さいため
に、均一な充填を実現できる充分な圧力を作用さ
せて粒子間間隙のばらつきを完全に除去すること
はできなかつた。

よく知られているように、カラムクロマトグラ
フイーの分離能を低下させる因子として、(1)拡
散、(2)非平衡、(3)渦流の三つの原因がある。これ
らは全て、溶質のバンドの広がりを増大させる効
果があり、従つて、理論段の高さを増大させてし
まう効果がある。(1)は、カラム軸方向への溶質の
拡散であるが、現在では高圧で安定に送液し得る
ポンプが実用化されているので、溶質の拡散を無
視できる範囲の高い流速でクロマト分離を行うこ
とにより、実際上(1)の影響は解消することが可能
である。(2)は、カラムの各部分で必ずしも平衡が
成立していない場合に生じる効果であり、充填剤
の粒径が大きい程著しい。また(3)は、充填剤が流
れをさえぎるように位置しているために渦流が起
こり、溶質のカラム軸方向の線速度に差を生ずる
効果である。この現象は、粒子径が大きい程、ま
た粒子形が不ぞろいであつたり、充填のされ方が
一様でないと、その効果は大きくなる。よく知ら
れた上記の理論の帰結として、理論段の高さを減
少させて、カラムの分離能を高めるためには、で
きるだけ細かい粒子の充填剤を用いることであ
り、また粒子はできるだけ均一にそろつたものを
一様に充填することが重要であることがわかる。
このことから、本発明において用いられる微小球
形のヒドロキシアパタイトが、従来より望まれて
いる充填剤の特性を満たすものであることは明ら
かであろう。

また、前述の方法により製造される微小球形ヒ
ドロキシアパタイトは、例えば、500Kg／cm²の充
填圧を作用させても、密に詰まつた粒子が破壊す
ることもなく、極めて大きな機械的強度を有する
ので、充填操作や充填の終了したカラムの取扱い
が極めて容易になるという、実用上重要な長所を
有するものである。カラムクロマト法において分
離能を高めるためには、前述の如く、充填剤の粒
径を極度に小さくすることによつて実現される
が、その反面、微小粒子の充填によつて、カラム
内での粒子間間隙もせまくなり、従つて、流速を
著しく低下させる結果を招くことになる。実際に
は、この点を解決するために、カラムに高圧を作
用させて流速を大きくする方法が用いられている
が、この場合、充填剤に相当な圧力が加えられる
ことになる。

それ故、用いる充填剤粒子の機械的強度が小さ
い場合には、充填時や測定時に充填された粒子が
破壊され微粉化して、それがカラムの目詰まりを
引き起こし、カラムの寿命を短かくする原因とな
る。これまでのヒドロキシアパタイトが板状や微
小結晶の集合体から成り、壊れ易いなどという欠
点を有するのに比し、本発明の充填剤は、極めて
大きな機械的強度を有する粒子よりなるものであ
るため、この点についての課題は、一挙に解決す
ることができる。

さらに、また、数μm〜数10μmの極度に小さな
粒子から成る充填剤を、再現性良く、容易にカラ
ムに充填できるか否かは、充填剤が備えるべき特
性として、実用上極めて重要な事柄である。しか
しながら、従来技術によるヒドロキシアパタイト
充填剤は、その粒子形状が板状や微小結晶の集合
体など種々な形から成る粒子であるために、流動
性が悪く、均一な充填を行うことは容易ではな
く、格別の工夫を必要とした。それ故、より大き
な口径の大型カラムへの均一な充填を行うこと
は、粒子の機械的強度が小さいことと、粒子間間
隙のばらつきを押えるための技術上の問題とによ
つて、更に困難さを増し、充填作業の容易性につ
いては望むべくもなかつた。

しかるに、本発明に使用する微小球形のヒドロ
キシアパタイトは、整つた球形を有するために、
充填時の流動性が良く、また大きな機械的強度を
有するから、容易に再現性の高い充填操作を行う
ことができる。しかも、カラム径の小さな分析用
カラムの充填のみならす、カラム径の大きな分取
用カラムの製造の際も、充填粒子の破壊や充填の
不均一化の心配をすることなく、容易に充填操作
を行うことができるという利点がある。

また、更に、本発明に使用されるヒドロキシア
パタイトは、上述の如く機械的強度の大きな球形
粒子であるばかりでなく、Ca／Ｐ比を容易にコ
ントロールすることができるために、化学的安定
性に優れ、有機溶剤や強アルカリに強く使用中に
微粉化したりすることがない。このように、物理
的にも化学的にも極めて安定したヒドロキシアパ
タイトを用いるものであるため、充填の再現性も
高く、従つて保持時間や保持容量など、クロマト
特性の再現性が高く、繰り返し使用に耐える耐久
性の高いカラムを提供することができる。このこ
とは寿命の長いヒドロキシアパタイトカラムの提
供を可能とし、カラムの使用に関するコストを大
きく引き下げる効果があり、実用上の意義は極め
て大きい。

次に本発明に使用する微小球形のヒドロキシア
パタイトの製造方法につき具体的に説明する。ま
ず、出発原料として、水または水と相溶性の有機
溶媒を各々単独で溶媒として用い、あるいはま
た、水と相溶性の有機溶媒と水との混合溶媒を溶
媒として用い、それらの各溶媒に対し、可溶性の
カルシウム化合物及びリン化合物を加えて混合
し、全体を溶解して原料溶液を調製する。この際
の溶液調製のための原料の混合の順序は、必ずし
も上述の順序に特定されるものではなく、沈殿を
生じないような順序で相互に混合しさえすればよ
い。また、上記の原料溶液に関しては、カルシウ
ム化合物やリン化合物及び溶媒の組み合わせによ
つては、均一な溶液を調製するのが困難であつた
り、あるいは一度調製した溶液が、時間の経過と
共に濁りを生じたりする場合があるが、場合によ
り、酸を加えることによりこれらの問題点は解決
される。また、リン化合物として有機化合物を用
いる場合に、場合により、アンモニア水を溶液に
加えておくと、副生成物や遊離CaOの生成を抑
え、ヒドロキシアパタイトの生成率を向上させる
効果がある。このように、必要に応じて、溶液に
は酸やアンモニア水を加えることができる。混合
のための時間は、選択した原料によつて異なる
が、全原料が溶解し、均一な組成の溶液になるま
で充分に攪拌を行なう。次いで、このようにして
調製して得られた溶液を、加圧ノズルや回転円板
などにより公地の噴霧方法によりガスバーナーな
どの火災中に噴霧し、あるいはガス炉、電気炉、
高温のガスなどにより原料溶液が熱分解を起こす
温度域の所望の温度に予め加熱された加熱帯域中
に噴霧する。溶媒として、水に対して相溶性であ
る可燃性有機溶媒または、水に対して相溶性の可
燃性有機溶媒と水との混合溶媒を溶媒として用い
る場合には、可燃性有機溶媒自体の燃焼による燃
焼熱も熱分解反応に必要な熱源として利用するこ
とができる。また、水に対して相溶性の有機溶媒
と水との混合溶媒中の有機溶媒を燃焼させずに混
合溶媒の蒸発を促進させるために用いる場合や、
水を単独で溶媒として用いる場合には、上述の如
きガス炉などの熱の供給源を必要とする。あるい
は、有機溶媒の燃焼熱と、ガス炉などによる加熱
源の両方を併用することもできる。なお、水に対
して相溶性の有機溶媒を単独で溶媒として用いる
場合でも、原料化合物の組合せによつては、原料
化合物中の残留水分や結晶水などのために、結果
として反応系が水と有機溶媒との混合溶媒を用い
た系になることもあるが、これらのいずれの場合
であつても、沈殿を生じないで原料溶液が調製で
きるものであれば、この方法における溶媒として
使用することができる。

この方法において使用されるカルシウム化合物
及びリン化合物としては、Ca（NO₃）₂・4H₂Ｏ，
Ca（CH₃COO）₂・H₂Ｏ，CaCl₂・2H₂Ｏ，
CaBr₂・2H₂Ｏ，CaHPO₄・2H₂Ｏ，NH₄H₂PO₄，
NH₄H₂PO₃，NH₄H₂PO₂，H₃PO₄，H₃PO₃，H₃
PO₂，（CH₃Ｏ）₃Ｐ，（C₂H₅Ｏ）₃Ｐ，〔（CH₃）₂
CHO〕₃Ｐ，〔CH₃（CH₂）₃Ｏ〕₃Ｐ，（C₆H₅）₃Ｐ，
（C₂H₅Ｏ）₂POH，（C₆H₅）₃PO等が挙げられる。
また、有機溶媒としては、メタノール、エタノー
ル、イソプロパノールなどのアルコール類やアセ
トンを使用するのが好適であるが、これらに特に
限定されるものではなく、混合によつて、沈殿を
生じない均一な溶液を調製し得る原料の組合せで
あればいずれでもよい。また、そのために、必要
に応じて加える酸としては、硝酸や塩酸は好適な
ものである。

上述の方法による噴霧熱分解反応により生成す
る粉体は、原料化合物の種類や組合せ、噴霧熱分
解条件を選ぶことにより、サブミクロンの粒子が
密にあるいは粗く集合して互いに固着・焼結し
て、全体としては中空球状の微小粉体や内まで詰
まつた微小球形粉体あるいは、球状粉体が破壊さ
れて種々な形状の粉体となつた状態のものなど、
いろいろに変えることが出来る。このうち、本発
明のクロマトグラフイー用充填剤としては、中空
であると否とを問わず、形の整つた球形粒子であ
れば好適に使用することができる。

また、前記の噴霧熱分解反応によつて生成した
粉体を更に空気、水蒸気を加えた空気、不活性雰
囲気などの種々の雰囲気中で、ヒドロキシアパタ
イトが分解せずに安定に存在し得る温度範囲の所
望の温度で加熱処理することにより、結晶化度や
焼結度合を促進させ更に機械的強度を増大させる
ことができる。

なお、必要に応じ前記の如くして、生成した微
小球形のヒドロキシアパタイトの粒径を更に一様
にそろえるために種々の公知の方法により分級す
ることができる。

以下に、本発明の実施例を掲げ、本発明を具体
的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に
より特定されるものではない。

実施例１１微小球径ヒドロキシアパタイトの製造カルシウムとリンの原子比（Ca／Ｐ）が1.67と
なるようにCa（NO₃）₂・4H₂ＯとH₃PO₄とをメタ
ノールに溶解して、溶質全体の濃度が2mol／
となるように溶液を調製し、更にこの溶液１に
対して、HNO₃25mlを加えて均一な溶液を作製し
た。次いで、この溶液を、二流体噴霧ノズルを用
いて、毎分８ml（噴霧空気圧＝0.7Kg／cm²）の割
合でガスバーナーによる火炎中に噴霧して熱分解
反応を生ぜしめ、生成した粉体をサイクロンで捕
集した。この粉体をＸ線回折分析した結果、ヒド
ロキシアパタイトであり、また、電子顕微鏡
（SEM）観察から、0.1〜0.5ミクロンの粒子が密
に固着・焼結して、全体としておよそ１〜37μm
の球形粒子となつた粉体を含む粉体であることが
分つた。この生成粉体を空気分級機により分級
し、５〜15μmの粒度の、形の整つた球形のヒド
ロキシアパタイトのみを取り出した。

２充填における加圧テスト１で得られたヒドロキシアパタイト粒子を、純
水に分散し、内径４mm、長さ250mmの高速液体ク
ロマトグラフイー用ステンレスカラムを用いて、
スラリー充填法により、100〜500Kg／cm²まで種々
に加圧圧力を変えて充填テストを行つた。加圧テ
スト後、充填カラムを分解し、充填されたヒドロ
キシアパタイトをSEMで観察したが、500Kg／cm²
の高圧を作用させた後でも、粒子の変形や破壊は
認められなかつた。そこで、充填カラムを分解し
て回収したヒドロキシアパタイト粒子を再び上記
方法と同じ操作で充填テストを実施したところ１
回目と同じ充填を行うことができ、更に、そのカ
ラムを分解して、SEM観察を行つたヒドロキシ
アパタイト粒子に、変形や破壊などの変化は認め
られなかつた。

３カラムクロマトグラフイー１に記載した方法により製造したヒドロキシア
パタイトの球形粒子を、NaH₂PO₄水溶液（1/10
Ｍ）に分散し、スラリー充填法により内径４mm、
長さ150mmのステンレスカラムに充填した。（充填
圧＝170Kg／cm²）。

このカラムを用いて、リニアグラジエント法
（グラジエント＝3.49×10^-2Ｍ／ml）により、PH
6.8燐酸ソーダ緩衝液を用いて、卵白リゾチーム
の測定を行つた。液流量を0.5〜2.0ml／min（内径
１cmのカラムに換算して3.13〜12.5ml／min）ま
で種々に変えた時の測定圧は、19Kg／cm²（0.5
ml／minの場合）から81Kg／cm²（2.0ml／minの場
合）まで変化したが、各条件下で各々安定に測定
することができ、カラムの目詰まりなどのトラブ
ルは、全く生じなかつた。これにより、本発明の
充填剤が、80Kg／cm²程度の高圧でのクロマトグラ
フイーに適するものであることがわかる。また、
このことは、本発明の充填剤がリゾチームのよう
に粘性の低いたんぱく質溶液に対して用いる場
合、カラム内径１cmに換算した流量として10ml／
min以上の高流速で溶液が流せるという、従来の
カラムに比較して、優れた特徴を有するものであ
ることを示すものである。

実施例２実施例１の１により製造したヒドロキシアパタ
イト粒子を、800℃で２時間、大気中で加熱処理
した。得られた粒子を分析した結果、結晶成長に
伴い、ヒドロキシアパタイトのＸ線回折強度が増
大したが分解は全く認められず、またSEM観察
でも球形粒子の形状破壊は認められなかつた。次
いで、この加熱処理したヒドロキシアパタイト粒
子を、実施例１の３の充填操作と同じ方法によ
り、内形４mm、長さ150mmのステンレスカラムに
充填した。

このカラムを用いて、卵白リゾチームとチトク
ロームＣの測定を順不同に実施し、卵白リゾチー
ムについては総計30回、チトクロームＣについて
は総計20回、全体では50回の繰り返し使用テスト
を行つて、カラムの目詰りの有無や保持時間の再
現性の度合いを調べた。測定は、いずれもPH6.8
燐酸ソーダ緩衝液を用いたリニアグラジエント法
（グラジエント＝3.49×10^-2Ｍ／ml）で、流量は
0.5ml／minとした。測定時の圧力は20〜23Kg／
cm²であつた。テストの最後までカラムの目詰りを
生ずることもなく、極めて良好なクロマトグラム
が得られた。また、再現性については、この測定
における卵白リゾチームの保持時間の変動を調べ
たが、測定を通じて、その最小値と最大値は、そ
れぞれ、22.05分及び22.37分であつた。この測定
は、保持時間の繰り返し精度や保持時間の再現精
度について、測定データを統計処理して求める程
の厳密なテスト内容を意図したものではないが、
通常、液体クロマトグラフイーの取扱説明書等に
記載されている再現性の評価の目安である２％以
内に納まつており、この測定に用いたカラムが高
い再現性を有していることがわかる。繰り返して
テストを行つた後、カラムを分解し、ヒドロキシ
アパタイト球形粒子のSEM観察を行つたが、粒
子の変形や破壊などの異常は認められなかつた。

実施例３カルシウムとリンの原子比が1.67となるよう
に、Ca（NO₃）₂・4H₂Ｏ及びH₃PO₄を２−メトキ
シエタノールに溶解して、溶質全体の濃度が
1.0mol／となるように溶液を調製した。この
溶液を使用し、実施例１の１で用いた噴霧熱分解
法と同じ方法で噴霧熱分解を行ない、１〜6μmの
球形ヒドロキシアパタイト粒子と、微小結晶の集
合体から成るヒドロキシアパタイトの塊状粉体と
が混合した状態の生成物を得た。この生成物を空
気分級機により、分級し、３〜6μmの球形ヒドロ
キシアパタイトのみを取り出した。この分級によ
り得た球形ヒドロキシアパタイト粒子をスラリー
充填法により400Kg／cm²でステンレスカラム（内
径４mm、長さ100mm）に充填し、実施例２と同様
の方法により、充填剤としての評価テストを行つ
た。この実施例において得たヒドロキシアパタイ
ト充填剤は、その機械的強度、耐久性、再現性な
どにおいて実施例２におけると同様に良好な結果
が得られた。

実施例４６Ｎ HNO₃450mlにCa（CH₃COO）₂・H₂
O220.25ｇを溶解した溶液と、メタノール300ml
にH₃PO₄（含量85.6％）85.85ｇを溶解した溶液と
を混合して均一な溶液を調製した。この溶液を、
実施例１の１で用いたのと同じ方法で噴霧熱分解
を行ない、およそ１〜25μmの大きさの球状のヒ
ドロキシアパタイトを得た。この生成物を空気分
級機により分級し、５〜15μmの粒度のヒドロキ
シアパタイト粒子を取出して、600℃で２時間加
熱処理した後、実施例３と同様にして、カラム充
填と液体クロマトグラフイー評価テストを行つ
た。

この実施例により得られたヒドロキシアパタイ
トの粒子の形状は、実施例３で得られた粒子程整
つた球形にはなつておらず、幾分、形が歪んだ
り、凹凸がある球状粒子が含まれていたが、その
クロマト特性に関しては、実施例３と同様の結果
が得られた。

実施例５カルシウムとリンの原子比が1.67となるよう
に、Ca（NO₃）₂・4H₂Ｏ及び（C₂H₅Ｏ）₃Ｐをエタ
ノールに溶解して溶質全体の濃度が1mol／と
なるように溶液を調製し、更にこの溶液500mlに
対して、アンモニア水（濃度28％）を34ml加えて
混合し、均一な溶液とした。次いで、この溶液を
使用して、実施例１の１で用いたのと同じ方法で
噴霧熱分解を行い、およそ１〜8μmの大きさの球
形ヒドロキシアパタイトから成る生成物を得た。
この生成物を800℃で１時間、加熱処理をした後、
実施例１の３で用いた方法と同じスラリー充填法
により、500Kg／cm²の充填圧を作用させて内径４
mm、長さ50mmのステンレスカラムに充填した。

このカラムを用いて、リニアグラジエント法
（グラジエント＝3.49×10^-2Ｍ／ml）により、PH
6.8燐酸ソーダ緩衝液を用いて、液流量＝0.5ml／
minの条件でチトクロームＣの測定を行つた。こ
の測定時のクロマトグラムを第１図に示した。チ
トクロームＣには、それが包含する鉄原子に酸化
状態のものと還元状態のものとの少なくとも２種
類の分子種があることから、第１図で明瞭に分離
された２つのピークは、これらの分子種（左側の
ピークが酸化型分子、右側のピークが還元型分子
による）によると推定され、この実施例のカラム
が高い分離度を有するものであることがわかる。

実施例６カルシウムとリンの原子比が1.67となるよう
に、Ca（NO₃）₂・4H₂ＯとH₃PO₃をメタノールに
溶解して、溶質全体の濃度が0.5mol／となる
ように溶液を調製した。次いで、この溶液を実施
例１の１で用いたのと同じ方法で噴霧熱分解を行
い、およそ１〜9μmの大きさの球形ヒドロキシア
パタイトから成る生成物を得た。この生成物を
600℃で２時間加熱処理した後、実施例５と同様
の方法で50mmカラムに充填した。このカラムを用
いて実施例５と同じ方法でチトクロームＣの測定
を行つたが、実施例５と同様の高い分離度を示し
た。

実施例７カルシウムとリンの原子比が1.67となるよう
に、Ca（NO₃）₂・4H₂Ｏと（CH₃Ｏ）₃Ｐをメタノ
ールに溶解して、溶質全体の濃度が1mol／と
なるように溶液を調製し、更にこの溶液１に対
してアンモニア水（濃度28％）を68ml加えて混合
し、均一な溶液とした。次いで、この溶液を使用
して、実施例１の１で用いたのと同じ方法で噴霧
熱分解を行い、およそ0.5〜5μmの大きさの球形
ヒドロキシアパタイトから成る生成物を得た。こ
の生成物を空気分級機により分級し、1μm以下の
粒子を除去した後、実施例１の３で用いた方法と
同じスラリー充填法により、500Kg／cm²の充填圧
を作用させて、内径４mm、長さ30mmのスタンレス
カラムに充填した。

このカラムを用いて、実施例５と同じ条件でリ
ゾチームの測定を行つたが、この実施例で得たヒ
ドロキシアパタイト充填剤は、その機械的強度、
再現性など実施例２と同様に、良好なクロマト特
性を有していることがわかつた。

実施例８リン化合物として（C₂H₅Ｏ）₂POHを、有機溶
媒として、エタノールを用いた他は、実施例７と
同様の方法により、溶質全体の濃度が0.5mol／
である溶液を調製し、噴霧熱分解を行つて、お
よそ0.5〜3μmの大きさの球形ヒドロキシアパタ
イトから成る生成物を得た。この生成物の分級、
充填、測定は共に実施例７と同様に行つた。その
結果、実施例７同様の良好なクロマト特性が得ら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１実施例（実施例６）によ
り得られた本発明のクロマトグラフイー用充填剤
を用いて行つたチトクロームＣのクロマトグラフ
を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１水または水と相溶性の有機溶媒を、それぞ
れ、単独で溶媒として用いるか、あるいは水と相
溶性の有機溶媒と水との混合溶媒を溶媒として用
い、その使用した溶媒に対し可溶性のカルシウム
化合物とリン化合物とを、加えて混合して原料溶
液を調製し、その原料溶液を火炎中または加熱帯
域中に噴霧することにより、熱分解反応により生
成せしめた微小球形のヒドロキシアパタイトから
成るクロマトグラフイー用充填剤。２水または水と相溶性の有機溶媒を、それぞ
れ、単独で溶媒として用いるか、あるいは水と相
溶性の有機溶媒と水との混合溶媒を溶媒として用
い、その使用した溶媒に対し可溶性のカルシウム
化合物とリン化合物とを加えて混合して、原料溶
液を調製し、その原料溶液を火炎中または加熱帯
域中に噴霧することにより熱分解反応により生成
せしめた微小球形のヒドロキシアパタイトを更に
加熱処理して得られるヒドロキシアパタイト粒子
から成るクロマトグラフイー用充填剤。