JPH04148686A - 形質転換体およびペプチド前駆体タンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用して、複数のペプチ
ドを含むペプチド前駆体を得る上で有用なプラスミド、
形質転換株およびペプチド前駆体タンパク質の製造方法
に関する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］現在、生
理活性を有する数多くのペプチドホルモンが知られ、ま
たその医薬品又は試薬としてのニーズが高まっている。

近年、組換えＤＮＡ技術を用いて、ペプチドを微生物に
より生産させることが可能となりつつある。この組換え
ＤＮＡ技術では、通常、ペプチドをコードする遺伝子と
、他のタンパク質をコードする遺伝子とを連結したペプ
チド前駆体遺伝子を、宿主である大腸菌内で発現させ、
生成したペプチド前駆体に酵素又は薬剤を作用させて、
目的ペプチドを切り出している。

しかしながら、大腸菌を宿主としてペプチド前駆体を製
造する場合には、次のような問題がある。

（１）大腸菌を宿主として使用する場合には、エンドト
キシンを生産するので、生産物からエンドトキシンを除
去しなければならない。

（２）大腸菌菌体内に生産したペプチド前駆体は、通常
、イ＞　クルー　’、；　＝ｓ　ンホティ（Ｉｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）と称される不溶性の塊となる場合
が多く、このインクルージヨンボディからペプチド前駆
体を回収するには、尿素などの可溶化剤で可溶化させる
工程が必要である。ペプチド前駆体からペプチドを酵素
的作用などにより切り出す場合、特に前記可溶化が重要
である。しかしながら、この工程はかなり煩雑であり、
しかも可溶化効率が低い。例えば、大腸菌により牛成長
ホルモンを生産させ、生成したインクルージヨンボディ
を、尿素を用いて可溶化させると、可溶化率が１０％で
あり、残りはインクルージヨンボディを形成したままで
あることが報告されている［５ｃｈｏｎｅｒ、　Ｒ，Ｇ
、、　ａｔ　ａｌ、。

１’３１０／ＴｌＥＣｌｌＮ０Ｉ、ＯＧＹ、　３．１５
１−１５４　（１９８５）］。

（３）菌体内でペプチド前駆体を生産させると、菌体破
砕物から目的とするペプチド前駆体を精製する必要があ
る。この場合、大腸菌菌体中に存在する多種類の宿主由
来のタンパク質から目的とするペプチド前駆体を分離す
るためには、多くの精製工程を必要とする。

一方、菌体外にペプチド前駆体を分泌生産させる場合に
は、菌体内で生産させる場合よりも、宿主由来の夾雑タ
ンパク質が少ないため、目的とするペプチド前駆体の製
造に有利である。そこて、分泌タンパク質を多量に分泌
する性質を有し、病原性がなく、酵素、アミノ酸などの
工業的生産に広く利用されてきたバチルス属細菌を宿主
として、ペプチド前駆体を菌体外に分泌生産させること
が検討されている。特にバチルス属細菌の中でもバチル
ス・ズブチリスは、遺伝学的、生化学的な知見が多い。

また、その分泌能を利用し、バチルス・ズブチリスを宿
主として、多くの異種遺伝子産物を分泌生産させること
が報告されている。例えば、バチルス・ズブチリスのα
−アミラーゼ遺伝子を利用したマウス−β−インターフ
ェロンの分泌［Ｙａｍａｎｃ、　Ｋ、　ｃｌ　ａｌ、＋
　Ｉｎ　Ｊ、　Ａ、　ｌ１ｏｃｈ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｓａ
ｌｌｏｗ（ｃｄ、）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　ｏｒ　　ｍ１ｃｒｏｂａｌａｌｄｌｒｒｅｒ
ｃｎＬｉａｔｉｏｎ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，１１７−１２３（１９８５）
］、バチルス・アミロリキファシエンスのα−アミラー
ゼ遺伝子を利用した、スタフィロコッカス・アウレウス
ノブロチインＡの分泌［５Ｌｅｐｈｅｎ　Ｒ，Ｆａｈｎ
ｅｓＬｏｃｋ、　ｃｌ　ａｔ、、＾ｐｐＨｃｄ　ａｎｄ
’ＥｎｖｌｒｏｎｍｃｎＬａｌ　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏ
ｇｙ、　Ｆｅｂ、　３７９−３８４　（１９８７）］、
ズブチリシン遺伝子を利用した、大腸菌のβ−ラクタマ
ーゼの分泌［５ｕｉ−１，ａｓ　Ｖａｎｇ、、　ａｔ　
ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｒａｃｔｃｒｌｏｌ
ｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１８ｇ、　Ｎｏ、　２．　ＮＯＶ
、　＋００５−１００９　（１９８６）］および］ヒト
ーα−インターフェロの分泌［Ｐａ１ｖａ、　　　１．
　　ａｔ　　ａｔ、、　　Ｇｅｎｅ、　　２２．　２２
９−２３５　　＜１９１１３ン］などが報告されている
。これらの報告に見られるように、バチルス・ズブチリ
スを宿主として、成る種の原核生物由来のタンパク質は
効率よく分泌生産される。例えば、スタフィロコッカス
・アウレウスのプロティンへの場合には、約１　ｇ／ｊ
の分泌生産が認められる。

しかしながら、真核生物由来のマウス−β−インターフ
ェロンやヒト−α−インターフェロンの分泌の場合には
、その分泌生産量は僅かである。

例えば、ヒト−α−インターフェロンの場合には、その
分泌生産量が５００μｇ／ｊ程度である。

また、アミノ酸数の少ないペプチド若しくはその前駆体
の分泌生産に関して、バチルス・ズブチリスのズブチリ
シン遺伝子を用いた２５アミノ酸カラなる心房性利尿ホ
ルモン［ｈｕｍａｎ　ａｅｒｉａｌ　ｎａＬｒｌｕｒａ
ｔｌｃ　　α−ｒａｃＬｏｒ（ｈＡＮＦ）　］の分泌生
産が報告されている［１．Ｉｎ−Ｐａ　Ｗａｎｇ、、　
ａｔ　ａｌ、＋　Ｇｅｎｅ、　６９．３９−４７　（１
９８８）］。しかしながら、この場合にも、分泌生産量
が５００μｇ／Ｊ程度と低い。この主な原因として、ペ
プチドの分泌阻害および枯草菌が分泌するプロテアーゼ
による分解が考えられる。

これらのことは、バチルス・ズブチリスを宿主とする場
合には、真核生物由来のタンパク質又はペプチドなどを
菌体外に分泌生産させることが容易でないことを意味す
る。また、分泌生産されたタンパク質、ペプチド分子の
一部、若しくは全てのＣ−末端側が、宿主由来のプロテ
アーゼにより分解する可能性がある。従って、バチルス
・ズブチリスなどの微生物により、完全なアミノ酸配列
を有するペプチドを分泌生産させることは困難である。

本発明の目的は、真核生物由来のペプチドであっても、
完全なアミノ酸配列を有するペプチドを菌体外に効率よ
く多量に分泌生産する上で有用なプラスミド、及びこの
プラスミドで形質転換された形質転換株を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、完全なアミノ酸配列を有するペプ
チドをペプチド前駆体として効率よく多量に得ることが
できるペプチド前駆体タンパク質の製造方法を提供する
ことにある。

【発明の構成］ 本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意検討の結
果、宿主微生物により菌体外に分泌されるタンパク質を
コードする遺伝子に、ペプチドをコードする遺伝子を複
数連結した遺伝子断片と、ベクターＤＮＡとを連結し、
得られたプラスミドにより宿主微生物を形質転換する場
合には、形質転換株の培養により、完全なアミノ酸配列
を有する複数のペプチドを含むペプチド前駆体タンパク
質が菌体外に効率よく多量に生産することを見いだし、
本発明を完成した。すなわち、本発明は、宿主微生物に
より菌体外に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子
に、ペプチドをコードする遺伝子が複数連結した遺伝子
断片と、ベクターＤＮＡとが連結しているプラスミドを
提供する。

また、本発明は、前記プラスミドにより宿主微生物が形
質転換されている形質転換株を提供する。

さらに、本発明は、前記形質転換株を培養し、複数のペ
プチドを含むペプチド前駆体タンパク質を菌体外に分泌
させるペプチド前駆体タンパク質の製造方法を提供する
。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のプラスミドは、宿主微生物により菌体外に分泌
されるタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。前
記タンパク質は、キャリアーとして機能し、宿主微生物
により菌体外に分泌されるタンパク質であればよい。好
ましいタンパク質は、バチルス（Ｂａｃｌ　Ｉ　Ｉｕｓ
）属細菌、特にバチルス・ズブチリス（１）ａｃｉｌｌ
ｕｓ　　５ｕｂＬＩＩｉｓ）により分泌されルタンパク
質である。バチルス・ズブチリスは、安全性が高く、菌
体外にタンパク質を多量に分泌する。

バチルス属細菌が菌体外に分泌するタンパク質には、バ
チルス属細菌が本来分泌するタンパク質、例えば、α−
アミラーゼ、中性又はアルカリ性プロテアーゼ、ベニシ
リナーゼ、セルラーゼなどに限らず、異種生物のタンパ
ク質、例えば、黄色ブドウ状球菌［スタフィロコッカス
・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）　］由来のプロティンＡなども含まれる。好ま
しいタンパク質には、前記プロティンＡが含まれる。

以下、プロティンＡについて説明する。

プロティンＡは、遺伝子の発現に関与するプロモーター
領域とリポソーム結合部位とを有している。プロモータ
ー領域は、例えば、黄色ブドウ状球菌８３２５−４株［
ウーレンら、Ｊ、　ｎ１ｏ１．　Ｃｈｅ１、＋　２５９
．１６９５　（１９８４）コに由来し、−１３１〜−１
２０番口のヘアピン構造と−１５１〜−１３８番口のパ
リンドローム配列とを有するプロモーターであってもよ
いが、好ましいプロモーター領域は、本出願人が特開昭
８３−２４５６７７号公報において提案した塩基配列で
表される領域である。このプロモーター領域は、−３０
０〜−１番目の配列に対応し、その特徴は、前記黄色ブ
ドウ状球菌８３２５−４株に由来するプロモーター領域
と異なり、前記ヘアピン構造及びパリンドローム配列が
存在しない点にある。

プロモーター領域の下流（１〜１０８番目の塩基配列）
には、分泌に関与するＳ領域をコードする遺伝子が存在
し、この分泌シグナル領域の下流（１０９〜１５２４番
目の塩基配列）には構造遺伝子が存在する。プロティン
Ａの構造遺伝子は、Ｅ　（１０９〜２７６番目の塩基配
列）　、Ｄ　（２７７〜４５９番目の塩基配列）、Ａ（
４６０〜６３３番目の塩基配列）　、Ｂ　（６３４〜８
０７番目の塩基配列）　、Ｃ（８０８〜９８１番目の塩
基配列）、およびＸ　（９８２〜１５２４番目の塩基配
列）からなる６つのユニットで構成され、Ｎ末端から、
上記の順序に結合している。また、１５２５〜１５５２
番目の塩基配列はノンコーディング部分であり、１５２
５〜１５２７番目には終始コドンＴＡＡが存在する。Ｅ
領域は、プロティンＡのＮ末端に存在するユニットであ
り、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）との結合能力が比較的
小さい。Ｄ、Ａ。

Ｂ１及びＣ領域は、それぞれＩｇＧのＦｃ部分との強い
結合能力を有し、Ｘ領域は、プロティン八分子を黄色ブ
ドウ状球菌の細胞壁に結合させる機能を有するユニット
である。

このように、プロティンＡは、ＩｇＧのＦｃ領域と特異
的に結合する５つの繰返し領域と、細胞壁と結合する領
域とを有している。このことを利用して、Ｆｃ領域と特
異的に結合する領域の後に、目的とするペプチドを連結
し、融合タンパク質として発現させた後、アフィニティ
ークロマトグラフィーで簡＋１ｔに精製することができ
る。従って、タンパク質をコードする遺伝子は、前記プ
ロティンＡ中のＩｇＧのＦｃ部分に対して結合能を有す
る領域、特に、プロティンＡの成熟タンパク質中の４４
°０番目のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構
造遺伝子中の４４０番口のアミノ酸（シグナルペプチド
を除いて）であるＡｓｐまでの領域が好ましい。また、
タンパク質は、プロティンＡの成熟タンパク質中の１８
７番口のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造
遺伝子中の１８７番口のアミノ酸（シグナルペプチドを
除いて）であるＬｅｕまての領域が好ましい。

また、前記のように、黄色ブドウ状球菌のプロティンＡ
には、遺伝子の発現に関与するプロモーター　リポソー
ム結合部位、分泌シグナル及びタンパク質をコードする
領域が含まれている。従って、プロティンＡを導入した
プラスミドは、分泌発現能を有し、タンパク質をコード
する領域の後に、ペプチドをコードする遺伝子を連結す
ると、タンパク質とペプチド前駆体とからなるペプチド
前駆体タンパク質を分泌発現する。

なお、タンパク質の大きさは、キャリアーとして機能す
る限り、タンパク質分子全体であってもよく、その一部
であってもよい。

また、前記タンパク質をコードする遺伝子は、生物由来
であってもよく、化学合成したものであってもよい。前
記遺伝子は、前記タンパク質の大きさに対応して、タン
パク質全体をコードしていてもよく、その一部をコード
していてもよい。

本発明のプラスミドの特徴は、前記タンパク質をコード
する遺伝子に、目的ペプチドをコードする遺伝子が複数
連結したタンデム型遺伝子を含んでいる点にある。

ペプチドは、天然のアミノ酸で構成される限り特に限定
されない。ペプチドの具体例としては、例えば、バソア
クティブ・インテステイナル・ポリペプチド［Ｖａｓｏ
ａｃｔｌｖｃ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｏ１ｙｐｅｐ
ＬＩｄｅ（ＶＩＰ）］、心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ）
、インスリン、ガストリン、各種オピオイドペプチド、
上皮細胞成長因子、エンドセリン、サブスタンスＰ１カ
ルシトニン、インスリン様成長因子ｉ。

■、ガラニン、モチリン、バソプレッシンなどの生理活
性ペプチド、ヒルジン、ニグリンＣ１分泌性白血球由来
プロテアーゼインヒビターなどの阻害剤などが挙げられ
る。また、ペプチドには、ヒトアルブミン、血液凝固因
子、リンフ才力イン、神経細胞成長因子、肝細胞再生因
子などの各種の分化誘導因子、成長因子などのタンパク
質もふくまれる。

好ましいペプチドには、ＶＩＰが含まれ、このＶＩＰは
２８個のアミノ酸残基からなり、血管拡張作用や血流増
加作用などの薬理作用を有する［５ｃｉｅｎｃｅ　１８
９．１２１７　（１９７０）］　、　Ｖ　Ｉ　Ｐは、下
記のアミノ酸配列で表される。

１１−＋１１ｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｔ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾ｒ
ｇ−１，ａｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｃｔ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−３ｅｒ−ｌ　１ｅ−１，ｅｕ−Ａｓｎ−０１１このア
ミノ酸配列で表されるＶＩＰは、１７番目のアミノ酸が
Ｌｅｕではな（Ｍ　ｅ　ｔである点で、先行技術文献［
特開平１−２９８９９８号公報および１Ｅｕｒ。

」、ｎ１ｏｃｈｅ＊、　１７８．３４３−３５０　（１
９Ｈ）］に記載のＶＩＰと異なる。

マタ、ＶＩＰは、Ｃ末端にｃｔｙ−ｘ（式中、Ｘは、Ｏ
ｌｌ、　Ｌｙｓ−０１１、＾ｒｇ−０１１、ＬＦＳ−Ａ
ｒｇ−０１１、またはＡｒｇ−Ｌｙｓ−０１１を示す）
が付加したＶＩＰ前駆体として使用するのが好ましい。

複数のペプチドをコードする遺伝子は、生物から抽出し
てもよく、化学合成してもよい。なお、同種のペプチド
を連続した配列で、複数コードするような遺伝子は、一
般に知られていない。従って、複数個のペプチドをコー
ドする遺伝子として、化学合成した遺伝子を複数用いる
のが好ましい。

また、複数のペプチドは、同種の複数のペプチドで構成
されていてもよく、異種の複数のペプチドで構成されて
いてもよい。

前記タンパク質をコードする遺伝子に連結される、ペプ
チドをコードする遺伝子の数は、２以上であればよいが
、通常、２〜２０程度である。

前記ペプチドをコードする複数の遺伝子間には、酵素的
又は化学的に切断可能なスペーサー配列（アミノ酸配列
）が存在するのが好ましい。前記切断可能なスペーサー
配列を利用して、ペプチド前駆体からペプチド又はペプ
チドを含む断片を容品に切り出し、分離することができ
る。なお、ペプチドを単離する際に、切断のためのスペ
ーサー配列が必要でない場合には、スペーサー配列を複
数の遺伝子間に介在させる必要はない。

化学的に切断可能なスペーサー配列としては、例えば、
臭化シアンにより切断されるＭｅｔ［Ｃ末端側が切断さ
れる。Ｄ、　Ｖ、　Ｇｏｃｄｄｅｌ、　ｏｔ　ａｌ、、
　Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ｕ
ｓ＾７６、１０６−１１０　（１９７９）］］ＢＮＦＳ
−スカトールＳｋａｔｏｌ）やＮ−りｏｏスクシンイミ
ド（ＮＣ５）により切断されるＴｒｐ［Ｃ末端側が切断
される。Ｙ、　５ａｌｔｏ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｌｏｃｈｅｓ、　　１０１．１２３−１３４　（１９
８７）］　、７０％ギ酸などの酸により切断されるＡｓ
ｐ−Ｐｒｏ　［Ａｓｐ−Ｐｒｏ間が切断される。旧ｏｃ
ｈｃｍ、　ｌ’３ｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｓｍｕｎ、、　４０．１１７３　（１９
７０）　］　、ヒドロキシアミンにより切断されるＡｓ
ｎ−Ｇｌｙ　［Ａｓｎ−ｃｔｙ間が切断される］などが
挙げられる。

酵素的に切断可能なスペーサー配列には、例えば、トリ
プシン、エンドプロテイナーゼなどのトリプシン様酵素
により切断されるＡｒｇ、Ｌｙｇ［Ａｒｇ、ＬｙｓのＣ
末端側が切断される。　Ｊ、　５ｈｌｎｅ、　ａｔ　ａ
ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８５．４５６−４６１　（
１９８０）］、リジルエンドペプチダーゼ、エンドブロ
テイナーゼＬｙｓ−Ｃなどにより切断されるＬｙｓ（Ｌ
ｙＳのＣ末端側が切断される。特開昭８１−２７５２２
２号公報）、ｖ８プロテアーゼなどの酸性アミノ酸に特
異的な酵素により切断されるＧｌｕ、Ａｓｐ（Ｇｌｕ、
ＡｓｐのＣ末端側が切断される。特公表昭６０−５０１
８９１号公報）、血液凝固因子Ｘａにより切断される夏
１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｃ末端側が切断される
。特開昭６１−１３５５９１号公報）、トロンビン（Ｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ）により切断されるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇなと（Ｃ末端側が切断される。特開昭８２−１３５
５００号公報）、カリクレイン（Ｋａｌｌｌｋｒａｌｎ
）により切断されるＰｈｅ−Ａｒｇ　［Ｃ末端側が切断
される。特開昭６２−２４８４８９１１号公報］、プロ
リルエンドペプチダーゼにより切断されるＰｒｏ［（末
端側が切断される。　ＢＩｏｃｈｏ＊１ｓｔｒｙ、　１
６、２９４２　（１９７７）　）　、ウロキナーゼ（ｕ
ｒｏｋｌｎａｓｏ）により切断されるＧｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ　（Ｃ末端側が切断される。特開平２−１００６
８５号公報）などが含まれる。

さらに、酵素的に切断可能なスペーサー配列には、ジペ
プチドＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ。

Ａｒｇ−Ｌｙｓｂ　Ｌｙｓ−Ｌｙｓが含まれる。これら
のアミノ酸間を特異的に加水分解するプロテアーゼとし
ては、大腸菌（Ｐ、５ｃｈｏｒｌｃｈｌａ　　ｃｏｌ＋
）由来のＯｍｐＴプロテアーゼ［プロテアーゼ■。

Ｋ、　　Ｓｕｇｌｓｏｔｏ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　
Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、１７０．　５６２５−５
６３２　（１９８ｇ）］　、サルモネラ・ティフィムリ
ウム（Ｓａｌ＋ｇｏｎａｌｌａ　　Ｌｙｐ旧ｍｕｒｉｕ
ｎ　）由来のＥ　−Ｐｒｏｔｃｉｎ　　［Ｊ、　Ｇｒｏ
ｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｊ、　Ｄｕｎｎ、　Ｊ、　
ｎａｃＬｃｒｌｏｌ、　１７１．２９０Ｂ−２９０５（
１９８９）］　、鎮痛ペプチドの生合成に関与するプロ
テアーゼ［Ｗ、　Ｄｅｎｓｅｒ　ａｎｄ　Ｋ。

Ｂｒａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　ｒ３１ｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１３８、３５［１−３
８２（１９８Ｂ）］などが挙げられる。

前記スペーサー配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇの
Ｎ末端側を特異的に加水分解するプロテアーゼとしては
、例えば、ソマトスフチンの成熟に関′ｊするプロテア
ーゼ［Ｐ、　Ｇｌｕｓｃｈａｎｋｏｒ、　ｃｌ　ａ、、
　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｃ＋ｎ、２６２．９６１５−
９６２０　（１９８７）］などが挙げられる。

さらに、スペーサー配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａ　
ｒ　ｇのＣ末端側を特異的に加水分解するプロテアーゼ
としては、例えば、ＩＲＣＭ−セリンプロテアーゼ（Ｓ
ｅｒｉｎｅ　ＰｒｏＬｃａｓｃ）　１　　［Ｊ、＾、　
Ｃｒｏｗｌｉｓｈ、　ｃｌ　ａｌ、、　Ｊ、　＋３ｉｏ
１．　Ｃｈｃｍ、２６１．１０８５０−１０８５８　（
１９８［ｉ）］　、］ＰＯＭＣ−コンバーティングエン
ザイムｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）　　［Ｙ
、　Ｐ、　１．ｏｈ、　ａｔ　ａｌ、。

Ｊ、　ｌ１ｉｏ１．　Ｃｈａｓ、　２６０．７１９４−
７２０５　（１９８５）］　、酵母サッカ０フイセス属
［Ｓａｃｃｈａｒｏｇ＋ｙｃｃｓ、　Ｋ、　Ｍｌｚｕｎ
ｏ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏａｈｃｔｉ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒｃｓ、　Ｃｏｓｍｕｎ。

１４４、８０７−８１４　（１９８７）］　、］フライ
ベロマイセス属Ｋｌｕｙｖｃｒｏｍｙｃｃｓ）　、スポ
ロポロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｓｙｃｃｓ）　
、フ（Ｏバジジウム属（ＦｉｌｏｂａｓｉｄｆＵＩ）　
、ハンゼヌラ属（ｌｌａｎｓｃｎｕｌａ）　、イサチェ
ンキア属（ｌｓｓａＬｃｈｃｎｋｌａ）　、ピキア属（
Ｐｉｃｈｉａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐ
ｏｒｉｄｉｕｉ）　、サツカロミコプシス属（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｇ＋ｙｃｏｐｓｉｓ）由来のプロテアーゼ（特
開平１−１９１６８３号公報、特開平２−４９５８５号
公？！りなどが挙げられる。

これらのスペーサー配列の中で、前記酵母由来の塩基性
アミノ酸残基対特異的プロテアーゼによりＣ末端側を特
異的に加水分解できるＬｙｓ−ＡｒｇＳＡｒｇ−Ａｒｇ
、又はＰｒｏ−Ａｒｇが好ましい。

ペプチド前駆体を分泌させるために遺伝子が組込まれる
ベクターＤＮＡは、宿主微生物により複製可能なりＮＡ
であればよいが、バチルス属細菌で複製可能なプラスミ
ドのＤＮＡであるのが好ましい。ベクターとしては、菌
体外にタンパク質を分泌する宿主に応じて、慣用のベク
ター、例えば、スタフィロコッカス属由来のプラスミド
ｐＵＢ１１０、ｐｃ１９４、ｐＢＤ６４、ｐＥ１９４、
ｐＳＡＯ５０１、ｐＴ１２７およびこれらの誘導体が挙
げられる。好ましいベクターＤＮＡは、プラスミドｐＵ
Ｂ１１０のＤＮＡである。これらのプラスミドを有する
バチルス−ズブチリスは、いずれもオハイオ大学バチル
スストックセンター（住所：　４８４．　Ｖａｓｔ　１
２ｔｈ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｃｏｌｕｇｕｓ　０ｈａｉｏ
、　４３２１０　Ｕ、Ｓ、＾）から人手できる。

本発明のプラスミドは、通常の連結技術、例えば制限酵
素を用いて切断したＤＮＡとベクターＤＮＡとをリガー
ゼを用いて連結する制限酵素法、リンカ−法などにより
構築できる。すなわち、前記タンパク質をコードする遺
伝子と、ペプチドをコードする複数の遺伝子とが連結し
た遺伝子断片に、発現のための制御部位であるプロモー
ターリポソーム結合部位及び分泌シグナルを結合し、ｔ
ｉｌられたＤＮＡ断片を、ベクターＤＮＡに結合するこ
とにより、プラスミドを構築できる。なお、プロモータ
ー　リポソーム結合部位、分泌シグナル及びタンパク質
をコードする領域を含む前記プロティンＡなどを用いる
場合には、プロモーターリポソーム結合部位、分泌シグ
ナル及びタンパク質をコードする遺伝子を、ベクターに
導入する必要はない。

複数のペプチドをコードする遺伝子の構築、各遺伝子断
片の連結には、慣用の遺伝子操作法が利用できる。その
際、大腸菌の宿主ベクターなどを利用することもできる
。例えば、タンデム型造転子の構築をＶＩＰを例にとっ
て説明すると、次の通りである。複数のＶＩＰをコード
する遺伝子の構築には、ＶＩＰ遺伝子の５′側に、制限
酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列であるＧＡＣＮ
ＮＮＧＴＣが存在することを利用できる。前記制限酵素
Ｔｔｈｌｌｌ　１による切断片は、突出末端であるが対
称構造を有していないので、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌに
よる切断部位を利用して、ペプチドをコードする複数の
遺伝子を目的の方向に導入する切断点として極めて有用
である。すなわち、挿入するＶＩＰ遺伝子として、５′
側に制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断部位を有し、３′側
に前記制限酵素の切断部位を有しない遺伝子を合成する
。

一方、ＶＩＰ遺伝子が導入されたプラスミドを制限酵素
Ｔｔｈｌ　１１１て切断すると共に、５′側のリン酸残
基をアルカリホスファターゼにより除去し、前記挿入す
るＶＩＰ遺伝子をＤＮＡリガーゼにより連結する。得ら
れたベクターにより大腸菌を形質転換すると共に、形質
転換株を培養し、２つのＶＩＰ遺伝子が導入されたプラ
スミドを調製する。上記操作を繰返し行なうことにより
、このＴｔｈｌｌｌｌ切断部位を利用して、理論的には
、何回でも、ＶＩＰ造伝子のタンデム化が可能であり、
複数のＶＩＰ造伝子が連結されたプラスミドを調製でき
る。

なお、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌが認識する切断部位を、
他のペプチドをコードする遺伝子の５′側に付加し、前
記と同様にして順次連結することにより、他のペプチド
をコードする遺伝子をタンデム化できる。

本発明の形質転換株は、前記プラスミドを宿主微生物に
移入し、宿主微生物を形質転換することにより得られる
。宿主微生物は、菌体外にタンノくり質を分泌する限り
特に制限されないが、ノくチルス属細菌、特に、遺伝学
、生化学的な知見が多く蓄積され、かつ安全性の高いバ
チルス・ズブチリスであるのが好ましい。さらに、バチ
ルス・ズブチリスの中で、菌体外へのプロテアーゼ生産
性を突然変異などの手法により低下させた菌株が好まし
い。このような菌株を前記プラスミドにより形質転換す
る場合には、宿主に由来するプロテアーゼによる分解を
著しく抑制でき、ペプチド前駆体を効率よく多量に得る
ことができる。

プロテアーゼ生産性の低い枯草菌としては、例えば、（
１）バチルス・ズブチリス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５
ｕｂＬｌｌｉｓ）　Ｄ　Ｂ　１０４株［Ｊ、　ｒｌａｃ
ｔｃｒｉｏｌ、、　１６０；　４４２−４４４．　（１
９８４）　］及びバチルス・ズブチリス１０４）ＩＬ株
［１１１ｏｃｈｅｓ、旧ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍ５ｕｎ、、　１２８、６０１−６０６．　（１９８５
）］　　；　（２）本出願人が特開昭６４−３７２８４
号公報において提案したバチルス・ズブチリスＤＹ−１
６株（微工研菌寄第９４８８号）；（３）アルカリプロ
テアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプ
ロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、ｓ
　ｐ　ｏＯＡΔ６７７変異逍伝子を導入した菌株などが
挙げられる。特に好ましい菌株は上記（３）に属する菌
株であり、このような菌株には、例えば、特願平１−２
８１４４０号において、本発明者らが提案したように、
バチルス・ズブチリス１０４ＨＬ株にｓｐｏ　Ｏ＾△６
７７変異遺伝子を導入したバチルス・ズブチリス５ＰＯ
ＩＩ株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・ズブ
チリスＤＹ＝１６林にｓ　ｐ　ｏＯＡΔ６７７斐異迫伝
子を導入したバチルス・ズブチリス５ＰＬ１４株（微工
研菌寄第１０９１１８号）などが含まれる。

前記プラスミドによる宿主微生物の形質転換は、慣用の
方法、例えば、チャン（Ｃｈａｎｇ）らのプロトプラス
ト化法［Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｍｏ
１．　Ｇｏｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１６ｇ、　ｌｌｌ−
＋１５　（１９７９）］などを利用して行なうことがで
きる。

さらに、本発明の製造方法においては、前記形質転換株
を培徨し、菌体外に、複数のペプチドを含むペプチド前
駆体タンパク質を分泌させる。形質転換株の培養は、ペ
プチド前駆体が分泌発現可能である限り、慣用の液体培
養に準じて行なうことができる。すなわち、形質転換株
の培養は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素
源、増殖因子成分などを含む成体培地で、振盪培養又は
通気撹拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨ
は、例えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養
に採用される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、
好ましくは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の
条件で行なうことができる。より具体的には、例えば、
５００　ｍｌのヒダ付き３角フラスコに１００ｍ１のＭ
ｏｄｌｕｓ　　Ａ培地［５ｔｏｐｈｏｎ　Ｒ，Ｐａｈｎ
ｅｓｔｏｃｋ、　ｏｔ　ａｌ、、＾ｐｐｌｉｅｄ　ａｎ
ｄ　Ｅｎｖｌｒｏｒｖｏｎｔａｌ　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ
ｏｇｙ、　Ｆｅｂ、　３７９−３８４　（１９８７）〕
を入れ、前記形質転換株を植菌し、３７℃で１５時間程
度培養することにより、複数のペプチドを含むペプチド
前駆体タンパク質を菌体外に多量に分泌させることがで
きる。

培養上清を、分離精製手段、例えばアフィニティークロ
マトグラフィーに供することにより、培養液からペプチ
ド前駆体タンパク質を分離精製し、回収できる。回収し
たペプチド前駆体タンパク質に含まれるペプチドは、分
解されることなく、完全なアミノ酸配列を有している。

目的とするペプチドは、ペプチド前駆体タンパク質のス
ペーサー配列を化学的又は酵素的作用により切断するこ
とにより得ることができる。スペーサー配列を切断する
場合には、スペーサー配列のＣ末端側を切断するのが好
ましい。特に、酵母由来の塩基性アミノ酸残基対特異的
プロテアーゼによりスペーサー配列のＣ末端側を特異的
に加水分解するのが好ましい。なお、上記プロテアーゼ
は、スペーサー配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ配
列を切断しないこと、酵母起源であるため大量に調製す
ることが比較的容易であること、般に安全性が高いこと
などの理由から、特に好ましい。

プロテアーゼが、スペーサー配列を特異的に認識し、か
つスペーサー配列のＣ末端を特異的に加水分解する場合
にはｔ１貫独で使用できる。

また、（ａ）プロテアーゼが、スペーサー配列を特異的
に認識し、かつスペーサー配列のＮ末端又はスペーサー
配列間を特異的に加水分解する場合には、（ｂ）スペー
サー配列のＮ末端から塩基性アミノ酸を遊離するアミノ
ペプチダーゼ及び／又はＣ末端から塩基性アミノ酸を遊
離するカルボキシペプチダーゼと組合せて、前記融合蛋
白質を処理することにより、ペプチドを得ることができ
る。

塩基性アミノ酸を特異的に認識し、スペーサー配列のＣ
末端側又はＮ末端側から塩基性アミノ酸をＲＭするカル
ボキシペプチダーゼ又はアミノペプチダーゼは、このよ
うな特λ性を有する酵素であれば、その起源を問わず使
用可能である。カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチ
ダーゼとしては、例えば、カルボキシペプチダーゼＢ　
（Ｅ、　Ｃ，３，４，１７，２）、カルボキシペプチダ
ーゼＥ（エンケファリン・コンペルターゼ）、カルボキ
シペプチダーゼＮ　（Ｅ、　Ｃ，！１．４．１７．３）
、ｙｓａａ　［サッカｔｆｆ？イセス・セレビジアエ由
来のにＥｘｌ遺伝子産物；　Ａ、　Ｄｍｏｃｈｏｖｓｋ
ａ、　ａｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１１．５０．５７３−５８
４　（１９８７）］、アミノペプチダーゼＢ　（Ｅ、　
Ｃ，３，４，１１，ｌｌ）などが挙げられる。

得られたペプチドの分子量は、慣用の方法、例えば、ア
ガロースゲル電気泳動法、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法などにより７１ＦＪ定でき、ペプチドの
同定は、そのアミノ酸配列を解析することにより行なう
ことができる。

【発明の効果］ 本発明のプラスミド、および該プラスミドで形質転換さ
れた形質転換株は、真核生物由来のペプチドであっても
、完全なアミノ酸配列を有するペプチドを効率よく多量
に分泌生産する。

本発明の製造方法では、完全なアミノ酸配列を有するペ
プチドをペプチド前駆体として効率よく多量に１１１る
ことかできる。

［実施例］ 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。なお、実施例で用いた酵素は、いずれも盲酒造■製の
酵素であり、それらの仕様に記載されている条件で反応
を行った。

実施例１ （１）プラスミドｐ　ＭＤ　２　Ｄ　（１）構築バチル
ス・ズブチリスを宿主とし、スタフィロコッカス・アウ
レウスのプロティンＡ遺伝子を発現し、項五上清中にプ
ロティンＡを分泌生産するプラスミドｐＭＤ２００の構
築図を第１図に示す。

プロティンＡ遺伝子を含むプラスミドｐＤＣＰ２４１１
（特開昭８３−２４５６７７号公報参照）は、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの１間株からクロニッグしたプ
ロティンＡ遺伝子を、大腸菌で複製可能なプラスミドｐ
Ｕｃ１１ｇに連結したプラスミドである。ｐＤｃＰ２４
１１の取得法、およびｐＤＣＰ２４１１に含まれるプロ
ティンＡ遺伝子の全塩基配列は、前記特開昭８３−２４
５８７７号公報に詳細に記載されている。

このプラスミドを含む大腸菌形質転換株から、アルカリ
法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌｅｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、、　ｌ、　３３　（１９
＋１９）］によりｐＤＣＰ２４１１を調製した。

ｐＤｃＰ２４１１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩと
て切断し、生成したプロティンＡ遺伝子を含む約１．９
ｋｂのＤＮＡ断片（以下、プロティンＡ遺伝子断片とい
う）をアガロースゲル電気泳動法を用いて分離した後、
電気溶出法を用いて溶出し、精製した［Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、　ａｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｌ
ｎｇ、　８．２８　（１９８９）］　、前記プロティン
Ａ造遺伝断片は、プロティンＡ遺伝子のプロモーターリ
ポソーム結合部位、分泌のためのシグナル配列、および
プロティンへの構造遺伝子を含んでいる。

次いで、ベクターとなるｐＵＢｌｌｏを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩとで切断し、生じた約３．７Ｋｂｋｂ
のＤＮＡ断片（以下、ｐＵＢ１１０ベクター造伝子断片
という）を、上記と同様にして、アガロースゲル電気泳
動法を用いて分離した後、電気溶出法を用いて溶出し、
精製した。

プロティンＡ遺伝子断片と、ｐＵＢ１］０ベクター遺伝
子断片とを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プ
ラスミドｐＭＤ２００を構築した。

（２）　Ｖ　Ｉ　Ｐをコードする遺伝子を含むプラスミ
ドの構築 ＶＩＰ遺伝子を構築するため、ＶＩＰのアミノ酸配列に
従って、対応する遺伝子コドンを枯草菌のコドン使用都
度に合せ、下記の８Ｆｉ類の遺伝子を、ＡＢＩ４３０Ａ
　　ＤＮＡ合成装置で作製した。

５　’　−ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡ
ＡＧＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣ＾＾ＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣ
ＡＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＧ−３゜−ＣＴＣＡＧＣＴＧ
ＣＡＧＴ＾＾ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＴ＾＾Ａ
ＡＡＴＧＴ＾＾ＧＴＣＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧ５゜ ５−ＣＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＴ＾＾ＣＴＡＣＡＣＧ
ＣＧＴＴＴＡ＾ＧＡＡＡＧＣＡ＾＾ＴＧＧＣＴＧＴＧ−
３３−ＴＣＡＧ＾＾ＧＴＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＣ
ＧＣ＾＾＾ＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣ−５’ ５°−＾ＡＡＡ＾＾ＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＣ
ＴＴＡＡＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧＡ
ＡＧＣＡＧＧ−３゜３−ＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＴ＾
＾＾ＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＧ＾＾ＴＴＧＣＣＧＡＴＴＡ
ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴ−５゜５’−ＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣ
ＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧ
−３゜３°−ＣＧＴＣＣＡＡＣＧＡにＧＴＡＴＧＧＡＣ
ＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡ＾ＡＣ＾ＧＴＣＧＴＡＧＧＡＣ
ＴＡＣＡＡＣＣＴＡＧＧＣ−５”Ｔｓ−ＤＮＡキナーゼ
を用いて、それぞれの合成りＮＡの５′末端にリン酸を
付加した。また、プラスミドｐＵｃ１９を制限酵素Ｘｂ
ａｌとｓｐｈ！とで切断し、ＤＮＡリガーゼにより、５
′末端にリン酸を付加したそれぞれの合成りＮＡを、ｐ
ＵｃＩＱのＸｂａ　ｌ−３ｐｈ　１間に挿入し、ＶＩ　
Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｙ遺伝子を含むプラスミドｐＭＤ３２１ａ
を構築した。第２図にプラスミドｐＭＤ３２１ａの構築
図を示す。

得られたｐＭＤ３２１ａにおける合成遺伝子部分の塩基
配列およびアミノ酸配列を以下に示す。

■シｃｏＲＩ　５ａｃｌ　　Ｋｐｎｌ　５ｓａｌＢａ−
旧ＸｂａｌＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ
ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＰｈｃＧＩｕｌ、ｅｕ（ｉｌ
ｙＴｈｒＡｒｇＧｌｙＳｃｒＳａｒＡｒｇＩＩ　ｌ　ｃ
　Ｉ　ｌ＾ａｔｌｌ　　　　　　　　　　　　　　　６
０ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧ＾＾ＧＧ＾＾Ｇ＾＾ＴＧ
ＡＣＡＡＶａｌＡｓｐＶａｌＩｌａＧｌｕＧｌｙＡｒｇ
ＭｅＬＴｈｒｌｌｃａ ７ｔｈｌｌｌｌ ＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＧＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＰｈｅＴｈｒＰｈｃ＾ｒｇｌｌｌｓＳｏ
ｒＡｓｐＡｌａＶａｌＰｈｅプロティンＣ−ＯＶＩＰ ＾ＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧＣＧＴＴＴＡＡＧ＾＾
＾ＧＣＴｈｒＡｓｐＡｓｎＴｙｒＴｈｒ＾ｒｇＬｅｕ＾
ｒｇＬｙｓＧＩｎ１’：ｃｏＲＩ ＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡ＾＾＾ＡＴＡＴＴＴＧＡＡ
ＴＴＣＴＡＴＴＭｅｔＡＩａＶａｌＬｙｓＬｙｓＴｙｒ
ＬｅｕＡｓｎＳｅｒｌｌｅＢｇｌｌｌ　　　　　　１８
０ ＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴ＾＾丁＾ＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧ
＾＾Ｇ１、ｃｕＡｓｎＧｌｙＨＨＨ ＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴ
ＴＴＡＴＴＴＧＢａａ＋Ｈ１ ｐｈ１ ＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡ
ＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴ
ＴＡＣＣＣＡこの合成遺伝子部分は、ｖｒｐ−ｃｒｙを
コードする塩基配列の前に存在する、血液凝固因子Ｘａ
の認識配列１１ｅＧ１ｕＧ１ｙＡｒｇ、ＢｒＣＮにより
切断されるＭｅｔ、およびプロティンＣの認識配列Ｔｈ
ｒｌ　１ｅＰｈｅＴｈｒＰｈｅＡｒｇをコードする遺伝
子より構築されている。

また、Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｖ遺伝子の下流には、２つ
の終始コドン（ＴＡＡＴＡＧ）の後に、枯草菌のズブチ
リシンのターミネータ−ＣＭ、　ｌ１ｏｎｊｏ、　ａｔ
　ａｌ、、Ｊ、　ＲｉｏｔｃｃｈｎｏＩｏｇｙ、　２．
７５−８５　（１９８５）］が存在する。

（３）５分子のＶＩＰをコードする遺伝子を含むプラス
ミドの構築 ５分子のＶＩＰをコードする遺伝子（以下、タンデム型
ＶＩＰ遺伝子という）を含むプラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　３
２１　Ｒ５ａの構築図を第３図に示す。

ｐＭＤ３２１ａのＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　１　ｙ遺伝子の５′
側には、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列で
あるＧＡＣＧＣＡＧＴＣが存在する。一方、第３図に示
されるように、挿入するＶＩＰ遺伝子の５′側にＴｔｈ
ｌｌｌｌ切断部位を残し、３′側が切断不能な遺伝子を
合成した。

また、タンデム化したＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　ｙを切断し
て回収するため、塩基性残基対特異的プロテアーゼ（特
開昭平成２−４９５８５号公報）による切断の認識配列
であるＬｙｓ−Ａｒｇに対応する遺伝子を導入し、第３
図に示すように、タンデム化のためのＶＩＰ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ道伝遺伝合成した。

次いで、ｐＭＤ３２１ａをＴｔｈｌｌｌｌで完全に切断
し、アルカリホスファターゼにより、この５′側のリン
酸基を除去した。そして、作製したタンデム化のための
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＡｒｇ遺伝子と混合し、ＤＮＡ
リガーゼにより連結した後、大腸菌１Ｍ１０９株を形質
転換した。

得られたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミド
遺伝子を調製し、目的通りＶＩＰ−Ｇｌｙ遺伝子が２個
タンデムに連結されたプラスミドｐＭＤ３２１Ｒ２ａを
構築した。

得られたｐＭＤ３２１Ｒ２ａは、２個のタンデムに繋っ
たＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｙ遺伝子の５′領域付近に７ｔ
ｈｌ　１１１による切断点を唯−有している。

そして、ｐ　Ｍ　Ｄ　３２１　Ｒ２ａをＴ　ｔ　ｈ　１
１．１１て切断し、アルカリホスファターゼにより５′
領域を脱リン酸化した後、タンデム化のためのＶＩＰ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ造伝了と混合し、ＤＮＡリガー
ゼにより連結した後、大腸菌１Ｍ１０９株を形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性形質転換株からプラスミ
ドを調製し、目的の遺伝子が３個タンデムに導入された
プラスミドｐＭＤ３２１Ｒ３ａを得た。同様の操作をさ
らに繰返し、５個のＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｙ遺伝子が、
Ｌｙｓ−Ａｒｇを介して、タンデムに連結されたｐＭＤ
３２１Ｒ５ａを作製した。

（４）プラスミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築バチルス・ズ
ブチリスを宿主とし、５分子のＶＩＰを含むペプチド前
駆体（以下、ペプチド前駆体という）を分泌するプラス
ミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築を第４図に示す。

前記プラスミドｐＭＤ２００を制限酵素Ｐｓｔ■で切断
した後、ＤＮＡブランチングキット（ＢｌｕｎＬｉｎｇ
　Ｋｉｔ）を用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素ｓ
ｐｈ　Ｉで切断し、約５．５Ｋｂの断片をアガロースゲ
ル電気泳動法により精製し、タンデム型ＶＩＰ遺伝子を
組込むためのベクターとした。

ベクターに組込むタンデム型ＶＩＰ遺伝了は、前記プラ
スミドｐＭＤ３２１Ｒ５ａを制限酵素Ｋｐ　ｎ　１．で
切断した後、ＤＮＡブランチングキットを用いて末端を
平滑化し、さらに制限酵素５ｐｈＩで切断し、約０．５
Ｋｂの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
精製することにより取得した。このＤＮＡ断片は、血液
凝固因子Ｘａ、及びプロティンＣの認識するアミノ酸配
列をコドする遺伝子の下流に、タンデム型ＶＩＰ遺伝子
が連結した構造を有している。また、各ＶＩＰ遺伝子の
Ｃ末端には、ＶＩＰをアミド化するため、Ｇｕｙをコー
ドする遺伝子を連結している。さらに、Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ
　Ｉ　Ｙをコードする遺伝子の間には、ペプチド前駆体
タンパク質からＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｆを切断して回収
するため、塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの一
種であるＰＢＲ５−プロテアーゼの認識配列Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇをコードする遺伝子が挿入されている。

次いで、ベクターＤＮＡとタンデム型ＶＩＰ遺伝子断ハ
とをＴ４リガーゼを用いて連結し、ペプチド前駆体タン
パク質分泌プラスミドｐＭＤ５００Ｒ５を構築した。こ
のｐＭＤ５００Ｒ５は、バチルス・ズブチリスを宿主と
し、プロティンＡの１位から４０２位、スペーサーとし
て血液凝同因子Ｘａ及びプロティンＣの認識配列に相当
するアミノ酸配列を含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−３ｅｒ　−５
ｅｒ　−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ａ５ｐ−Ｖａ　１−１１ｅ
　−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｔｈｅ−ＩＩｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇｓ　「１的ペプチド
としてＶＩＰの生合成前駆体Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　１　ｙを
、Ｌｙｓ−Ａｒｇを介して、５分子結合した構造を有す
るプラスミドである。

（５）バチルス・ズブチリスを宿主としたペプチド前駆
体の生産 チャン（Ｃｈ、ａｎｇ）らの方法［Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、
、　ａｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１．　Ｇｃｎ、　Ｇａｎｃｔ、、　１６１１．　ｌ
ｌｌ−１１５（１９７９＞］に従って、ｐＭＤ５００Ｒ
５によりバチルス・ズブチリス５ＰＬ１４　（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−１０９８８）を形質転換した。得られた形質転
換株バチルス・ズブチリス５ＰＬ１４　（ｐＭＤ５００
Ｒ５）（微工研菌寄第１１７４２号）により分泌される
ペプチド前駆体タンパク質中のＶＩＰ’Ｑを、次に示す
方法で測定した。

先ず、０．５Ｍコハク酸を含むメデアム（Ｍｃｄｆｕｌ
ｌ）Ａ培地１００ｍ１を用いて、５ＰＬ１４　（ｐＭＤ
５００Ｒ５）を３７℃で１６時間振盪培谷した。

培養停止後、濃度が１０ｍＭになるようにプロテアーゼ
阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオライド（
ＰＭＳＦ）　、ＥＤＴＡを添加し、温度４℃、１５００
０ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離し、菌体を除いた。

培養上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した後、２
ｍｌのＩｇＧ−セファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ゲ
ル（ファルマシア（株）製）を充填したカラムに、５　
ｍｌ容量のシリンジを用いて、得られた培養上清２ｍｌ
を注入し、ペプチド前駆体タンパクｉを精製した。カラ
ムを２０ｍ１のＴＳＴブアッファ−［５０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ７，６）　、１５０ｍＭのＮａＣｆＩ、０．
０５％のツイーン（Ｔｖｅａｎ）２０］て洗浄した後、
０．１Ｍ酢酸１０ｍ１（ｐＨ３，０）を用いてペプチド
前駆体タンパク質を溶出した。溶出液は、１／２イΔ量
の０．２ＭＱ炭酸アンモニウム溶液を用いて直ちに中和
した。得られたペプチド前駆体タンパク質溶出液を、限
外濾過（分子量カット１００００）のフィルターを用い
て濃縮した後、下記の条件で、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて分取した。

カラム　ＴＳＫゲルＩ’ｈａｎｙｌ　５ｐＰＶ−ＲＩ’
内径４．６ｉ＋ｍＸ７．５ａｎ 流速　　１．０ｍｌ／分 溶媒　　Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸Ｂ：０．０４
４％トリフルオロ酢酸／ ６０％アセトニトリル 傾斜　　１５，０〜３８％／４６分、２ｍｌ／％次いで
、ｖＩｐ−ｃｔｙの酵素免疫測定法による定量は、「酵
素免疫測定法」　（石川栄治他編集、医学書院）記載の
方法により行った。

先ず、ＶＩＰを用いてウサギを免疫し、抗ＶＩＰ血清を
得た。この抗ＶＩＰ血清より「酵素免疫測定法」の第８
３−９２頁記載のマレイミド−ヒンジ法に、にり抗ＶＩ
Ｐ−１ｇＧ、抗Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｆ（ａｂ’）ｚ、抗ＶＩＰ
−ペルオキシダーゼ標識−Ｆａｂ’　を調製した。

酵素免疫測定法によるＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｖの測定は
、以下の手順で行った。

ＥＬＩＳＡプレート（９６穴）に抗Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｆ（ａ
ｂ’）２を吸むさせ、１％牛血清アルブミンでブロッキ
ングした。このプレートに被試験液を添加したＶＩＰ−
Ｇｌｙを、同相に吸むした抗ＶＩＰ−Ｆ　（ａｂ’　）
２に結合させた後、洗浄し、更に抗ＶＩＰ−ペルオキシ
ダーゼ標識−Ｆａｂ２を添加し、同相に結合したＶ”Ｉ
Ｐ−Ｇｌｙをサンドイッチした。遊離の標識抗体を除去
した後、１０ｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ
）、０．０２５％過酸化水素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，０）を含む反応液を添加し、ペルオキ
シダーゼの反応により生成する色素を波長４９０ｎｍの
吸収で測定した。

標準物質として、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢ
Ｉ）社製のペプチド合成装置により固相合成し、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製し、アミノ酸組成
を確認したＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｙを用いた。

その結果、目的とするペプチド前駆体タンパク質が分泌
生産されており、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて、ＶＩＰｉ＋
１性を示したピークの波長２１４　ｎａの吸収からタン
パク質量を算出したところ、塩基配列から予想されるＶ
ＩＰ部分の分子量から、分泌されたペプチド前駆体タン
パク質に含まれるＶＩＰは、３．２ｍｇ／Ｊてあった。

実施例２ バチルス・ズブチリスを宿主としたペプチド前駆体の生
産 ｐＭＤ５００Ｒ５により、前記バチルス・ズブチリス５
ＰＬ１４を実施例と同様にして形質転換した。得られた
形質転換株ＳＰＬ１４（ｐＭＤ５００Ｒ５）により分泌
されるペプチド前駆体タンパク質を、以下のようにして
精製した。

先ず、０．５Ｍコハク酸を含む１旧ｕｇ　　Ａ培地４Ｊ
ヲＪＴＪＬ’テ、５ＰＬ１４　（ｐＭＤ５００Ｒ５）を
３７℃で１６時間浸透培養した。培養停止後、濃度を１
０ｍＭになるようにＰＭＳＦＳＥＤＴＡを添加し、４℃
、５０００ｒｐｍの条件で、３０分間遠心分離し、菌体
を除いた。得られた培養上清を０．２２μｍのフィルタ
ーで濾過した後、培養上清３．６１ｍ１を、３００ｍ１
のＩｇＧ−セファロースゲル（ファルマシア（株）製）
を充填したカラムに約６ｍ１／分の流速で注入し、ペプ
チド前駆体タンパク質を精製した。カラムを、実施例１
と同様な組成のＴＳＴブアッファ−２，８８１を用い、
流速４ｍ１７分の条件で洗浄した後、０．　１Ｍ酢酸（
ｐＨ３，０）を用いて、流速４ｍｌ／分の条件でペプチ
ド前駆体タンパク質を溶出した。この時溶出岐は、１７
２倍−の０．２Ｍｆｆ１炭酸アンモニウム溶液を用いて
直ちに中和した。得られたペプチド前躯体タンパク質溶
出液を、限外濾過（分子量カット１００００）のフィル
ターを用いて濃縮した後、ペプチド前駆体を以下の条件
で分取した。

カラム　Ｐｈｃｎｙｌ−５ＰｖＲＰ 内径２１．５＋ｉｍＸ１５ｃｍ 流速　　６ｍ１Ｚ分 溶媒　　Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸Ｂ：０．０４
４％トリフルオロ酢酸／ ６０％アセトニトリル 傾斜　　２７．５〜３０％１５（１分、１２０ｍ１／％ そして、分取した成分を凍結乾燥することにより、■的
とする分子ｍ６４０００のペプチド前駆体タンパク質を
得た。また、前記実施例１同様にして、波長２１４ｎｍ
の吸収がらタンパク質量を算出したところ、４）の培養
液から、約３７ｍｇのペプチド前駆体タンパク質が得ら
れた。

参考例１ ペプチド前駆体タンパク質からのＶ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　１ｙ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇの切り出し 分取したペプチド前駆体タンパク質１００μｇを、塩基
性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ（特開平２−４９
５８５号公報）０．１ｍＵ　［］Ｕは、３０℃、５０ｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７，０）、０．１％のルブロール
（Ｌｕｂｒｏｌ）ＰＸ、　０　、　５　ｍ　ＭのＣａＣ
ｊｌｚ中において、０．１ｍＭのＢｏｃ−ＧＩｎ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　（Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニ
ル基、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミドを示す
）と反応させる条件において、１分間に１μモルのＡＭ
Ｃ（７−アミノ−４−メチル−クマリン）を遊離する活
性とした］と、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，０）　
、１ｍＭのＣａＣ１）ｚ中て３７℃で反応させた。反応
時間６時間における反応液を逆相高速液体クロマトグラ
フィーを用いて分析し、出現した２つのピークを分取し
、プロテインシークエンサーを用いてそのアミノ酸配列
を解析したところ、Ｖ　Ｉ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　ＹＬ　ｙ　ｓ
　−Ａ　ｒ　ｇｓ及びＶＩＰ−Ｇｕｙと完全に一致した
。このことから、完全なアミノ酸配列を持つＶＩＰを含
むペプチド前駆体が、分泌生産されたことが判明した。

参考例２ ペプチド前駆体タンパク質からＶＩＰ−Ｇｌｙの切り出
し 分取したペプチド前駆体タンパク質１００μＫを、塩基
性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ（特開平２−４９
５８５）０　、　１　ｍ　Ｕ　（Ｉ　Ｕは、前記と同様
な活性を意味する）と、カルボキシペプチダーゼＢ（シ
グマ社製）１０ｍＵ　［ＩＵは、２５ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）中において、１ｍＭのＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ　（Ｂｚはベンジルオキシカルボニル基を示す）と２
５℃で反応させる条件下において、１分間に１μモルの
Ａｒｇを遊離する酵素活性とした］と、５０ｍＭのトリ
ス塩酸（ｐＨ７，０）　、１ｍＭのＣａＣｊ１２中で３
７℃で反応させた。反応時間６時間における反応液を逆
相高速液体クロマトグラフィーを用いて分析し、出現し
た２つのピークを逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分取し、プロテインシークエンサーを用いてそのアミ
ノ酸配列を解析したところ、ＶＩ　Ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｖと完
全に一致した。このことから、完全なアミノ酸配列を持
つＶＩＰを含むペプチド前駆体が、分泌生産されたこと
が判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＤ２００の横築図、第２図はプ
ラスミドｐＭＤ３２１ａの構築図、第３図はプラスミド
ｐ　Ｍ　Ｄ　３２１　Ｒ５ａの構築図、 第４図はプラスミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築図である。 特許出願人　　エム・デイ・リサーチ株式会社代　　理
　　人　　　弁理士　　鍬　　　■　　　充　　　生第 図 ｃｏＲＩ ｃｏＲＩ εｅｏＲＩ ａｍＨＩ ｃｏＲＩ ａｍＨＩ 第 図 キネ−ジョン ＸｂａＩ−５ｐｈＩ 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、宿主微生物により菌体外に分泌されるタンパク質を
   コードする遺伝子に、ペプチドをコードする遺伝子が複
   数連結した遺伝子断片と、ベクターＤＮＡとが連結して
   いるプラスミド。 ２、タンパク質が、バチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）
   属細菌により分泌されるタンパク質である請求項１記載
   のプラスミド。 ３、バチルス属細菌により分泌されるタンパク質が、ス
   タフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
   ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡである請求項２
   記載のプラスミド。 ４、ペプチドをコードする遺伝子が、バソアクティブ・
   インテスティナル・ポリペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖ
   ｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコ
   ードする塩基配列を含む請求項１記載のプラスミド。 ５、ベクターＤＮＡが、バチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ￥）属細菌で複製可能なプラスミドのＤＮＡである請求
   項１記載のプラスミド。 ６、バチルス属細菌で複製可能なプラスミドが、ｐＵＢ
   １１０である請求項５記載のプラスミド。 ７、請求項１記載のプラスミドにより、宿主微生物が形
   質転換されている形質転換株。 ８、宿主微生物が、バチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）
   属細菌である請求項１記載の形質転換株。 ９、宿主微生物が、バチルス・ズブチリス（￥Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ￥）である請求項８記載の形
   質転換株。 １０、形質転換株が、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰＬ−１４（ＰＭＤ５０
   ０Ｒ５）（微工研菌寄第１１７４２号）である請求項１
   記載の形質転換株。 １１、請求項１記載の形質転換株を培養し、複数のペプ
   チドを含むペプチド前駆体タンパク質を菌体外に分泌さ
   せるペプチド前駆体タンパク質の製造方法。