JPH04148696A

JPH04148696A - 亜硫酸の測定方法

Info

Publication number: JPH04148696A
Application number: JP27186090A
Authority: JP
Inventors: Yoshibumi Amano; 天野　義文; Hideo Shioda; 塩田　日出夫; Kazuo Nakamura; 和夫中村; Hiroshi Kurosawa; 黒沢　尋; Takeshi Sato; 猛佐藤; Hirofumi Akano; 裕文赤野; Kichiya Kawamura; 川村　吉也
Original assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Current assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1990-10-09
Publication date: 1992-05-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、亜硫酸及びその化合物の測定方法並びに測定
装置に関する。さらに詳しくは亜硫酸、亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸水素ナトリウム、結晶亜硫酸ナトリウム、無
水亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、無水亜硫酸
、メタ重亜硫酸カリウム、等の亜硫酸塩類、及びアルデ
ヒド、ケトン、糖類等と結合した結合型亜硫酸などの亜
硫酸化合物の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

亜硫酸及びその化合物は食品の加工処理を行う際に食品
添加物として食品の漂白、酸化防止及び保存等の目的で
広く使用されている。しかし一方で亜硫酸化合物はアレ
ルギーの原因物質となるなどその濃度によっては人体に
悪影響を及ぼす可能性もあり、食品衛生法においてもそ
の使用基準が食品ごとに規制されている。従って、亜硫
酸及びその塩類の使用にあたっては、添加量、含有量に
十分な注意を払う必要がある。現在、これら亜硫酸及び
その化合物の測定方法としてはモニア・ウィリアムス法
、蒸留・ヨウ素滴定法、蒸留・比色法（以上、社団法人
日本食品衛生協会刊　食品衛生検査指針Ｉ　　１９７３
頁４０４−４０８）　、又はランキン法（Ｂ、Ｃ，Ｒａ
ｎｋｉｎｅ；Ａｕ５ｔ、Ｗｉｎｅ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　５
ｐｉｒｉｔ　Ｒａｖ、。

８０、１４　（１９６２））等が一般的に用いられてい
るが、これらの方法はいずれも蒸留操作が必要であり、
熟練を要すると共に多量の試料を必要とし、操作が煩雑
で分析所要時間も長い。また、この蒸留操作においては
亜硫酸が反応系外に揮散したり反応装置内に残留するな
どして亜硫酸の回収率が低下する問題がある。又、にわ
とり肝臓由来の亜硫酸酸化酵素を用いる方法（Ｈ，０，
Ｂｅｕｔ　ｌｅｒ　；Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　。

１５、１５７　（１９８４））も実用化されているが、
色素やアスコルビン酸の共存による亜硫酸定量の妨害や
、酵素自体の安定性に難点がある。さらに、イオンクロ
マト法（Ｈ，Ｊ、Ｋｉｍ、　Ｙ、に、にｉｍ；Ｊ、Ｆｏ
ｏｄ　Ｓｃｉ、、　５１゜１３６０　（１９８６））ガ
スクロマド法（浜野等；食衛誌。

１９、５６　（１９７８））ポーラログラフイー法（Ｗ
、　Ｈｏ　ｌａｋ。

Ｊ、５ｐｅｅｃｈｉｏ；Ｊ、Ａｓ５ｏｃ、Ｏｆｆ、Ａｎ
ａｌ、Ｃｈｅｍ、、　７２．４７６（１９８９））等の
分析機器を使用した例もあげられるが、前記した共存物
質の妨害を完全に排除することはできず、また装置が高
価である等、問題があった。微生物を使用するものとし
ては、チオバチルス属に属する菌株を用いて亜硫酸を測
定する方法が明らかにされている（Ｋ、Ｎａｋａｍｕｒ
ａ、　Ｙ、Ａｍａｎｏ。

０、Ｎａｋａｙａｍａ；Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　３１゜３５１　（１９
８９））。この方法は、亜硫酸に対する特異性が高（測
定精度に優れ、操作が簡便で且つ菌体の酵素の指定性も
良好で実用１優れた性質を示すが、測定できるのは遊離
型亜硫酸のみであり、食品分析において必要な総亜硫酸
量（遊離型亜硫酸量と結合型亜硫酸量の合計）を測定す
ることができないという問題点があった。

一方、チオバチルス・チオオキシダンスの生産する亜硫
酸脱水素酵素に関してはＰｌａｎｔ　＆　Ｃｅ１ｌＰｈ
ｙｓｉｏｌ、、　８．７２５（１９６８）及びＰｌａｎ
ｔ　＆　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｉｌ、　７０！　（１９７０）等にその記載があるが、
いずれも該酵素の反応機構を解明しようとしたものであ
り、これを用いて亜硫酸量を測定しようという試みはな
されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上記亜硫酸の測定方法における問題点を解決
するためになされたものであり、試料中の総亜硫酸の測
定に関して、簡便に、定量精度が高く、安定性に優れた
定量方法を与えることも目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の第１の測定方法は、チオバチルス・チオオキシ
ダンスに属する微生物の産生する亜硫酸脱水素酵素活性
を含有する酵素活性含有物（以下、［亜硫酸脱水素酵素
活性含有物Ｊとい−５−）を使用して遊離型亜硫酸を硫
酸に酸化する反応を利用して亜硫酸含量を測定する方法
において、試料中の総亜硫酸のうち結合型亜硫酸を系外
に取り出すことなく酸性下処理及び／又はアルカリ性下
処理することにより、試料中の亜硫酸を全て遊離型亜硫
酸にして総亜硫酸含量を測定することを特徴とする亜硫
酸の測定方法である。

本発明の第２の測定方法は、チオバチルス・チオオキシ
ダンスに属する微生物の産生ずる亜硫酸脱水素酵素活性
含有物を使用して遊離型亜硫酸を硫酸に酸化する反応を
利用して亜硫酸含量を測定する方法において、試料中の
結合型亜硫酸を酸性下処理及び／又はアルカリ性下処理
することなく試料中の遊離型亜硫酸含量を測定し、その
測定値を前記第１の測定方法により求めた試料中の総亜
硫酸含量から減じて得られる値を結合型亜硫酸含量とす
ることを特徴とする結合型亜硫酸の測定方法である。

本発明の第１及び第２の測定方法においては、好ましく
は、該酵素が遊離型亜硫酸を硫酸に酸化する過程で消費
する酸素量を検出するか、または、該酵素が遊離型亜硫
酸を硫酸に酸化することによって生ずるｐＨの変化、も
しくは、該酵素が遊離型亜硫酸を硫酸に酸化する過程で
放出される水素イオン量を検出する。

次に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明に用いられる亜硫酸脱水素活性含有物を産生ずる
微生物はかかる微生物としては亜硫酸酸化能を存するチ
オバチルス・チオオキシダンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）に属する微生物であれ
ばいずれでもよいが、例えば、チオバチルス・チオオキ
シダンスＩＦＯ１３７２４、チオバチルス・チオオキシ
ダンスＪＣＭ３８６６、ＪＣＭ３８６７、ＪＣＭ３８６
８、チオバチルス、チオオキシダンスＡＴＣＣ１９７０
３、ＡＴＣＣ２１８３５、チオバチルス・チオオキシダ
ンス１１７７３　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１１９）等が挙
げられる。

本発明者らは菌体の生育速度が速く、亜硫酸酸化能の高
い菌株を広く検索した結果、旧松尾鉱山の土壌からチオ
バチルス属に属するｌ菌株を分離した。本菌株は生育速
度が速く、亜硫酸酸化能に優れ、かつ非常に安定性に優
れる等の実用的な性質を有していた。

本菌株の菌学的性質を次に記載する。

Ａ、形態学的特徴（１）細胞の形及び大きさ：桿菌で大きさは０．４〜０
．８μｍＸ０．９〜２．２μｍ（２）細胞の多形成：なしく３）運動性：有り、単極鞭毛（４）ダラム染色性：陰性（５）抗酸性：有りＢ、培養的性質（１）肉汁寒天、肉汁液体、肉汁ゼラチンせん刺、リド
マスミルク培養には生育せず。

（２）チオバチルス培地（ＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇｕｅ
　ｏｆ　ＢＡＣＴＥＲＩＡ　＆　ＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨ
ＡＧＥＳ　１７ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９８９）及
び、Ｔｈ１ｏｓｕｌｐｈａｔｅ寒天Ｎ（Ｌ２培地（根井
外喜男編　微生物の保存法：東京大学出版会（１９７７
））で生育する。

生育は遅く、透明、淡黄色の微小コロニーを形成する。

Ｃ１生理学的性質（１）硝酸塩の還元　　　ニー（２）脱窒反応（３）ＭＲテスト（４）ＶＰテスト（５）インドールの作成（６）硫化水素の作成（７）てんぶんの加水分解（８）クエン酸の利用（９）無機窒素源の利用　：＋Ｃ０）色素の生成　　　　：± ０υウレアーゼ０２オキシダーゼ　　　：＋０３カタラーゼ０４生育の範囲　　　　：ｐＨ１〜６の範囲で生育。

生育温度はｌＯ℃〜３７℃。

０！１９酸素に対する態度　：絶対好気性αｆ１９０−
Ｆテスト　　　：被酸化的り、下記の糖類からの酸及び
ガスの生成酸　　ガス（１）Ｌ−アラビノース（２）Ｄ−キシロース（３）Ｄ−グルコース（４）Ｄ−マンノース（５）Ｄ−フラクトース（６）Ｄ−ガラクトース（７）麦芽糖（８）蔗　糖（９）乳　糖　　　　　　　− α０）トレハロース（ＩＩ）Ｄ−ソルビット０２Ｄ−マンニット α３イノジツト（１４１グリセリン α９でんぷんＥ、その他の生理学的性質（１）イオウの酸化　　　：十（２）鉄イオンの酸化（３）チオ硫酸の酸化　　：＋（４）無機栄養性　　　　：絶対化学無機栄養（５）硫
酸塩の生成　　　：＋Ｆ、化学分類学的性質（１）　Ｄ　Ｎ　ＡのＧＣ含量　：５１モル％（２）ユ
ビキノン系　　　：ユビキノンＱ−８（３）菌体脂肪酸
組成　　：３−ヒドロキシテトラデカノン酸を含む。

以上の菌学的性質をもとに、本菌株の分類学上の地位を
パージエイズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー　第３巻（１９８９）（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ　３　（１９８９
））の記載と比較し求めたところ、チオバチルス・チオ
オキシダンスに属する新菌株であると同定し、チオバチ
ルス・チオオキシダンス１１７７３と命名した。なお、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　
ＢＰ−３１１９として国際寄託されている。

上記のチオバチルス・チオオキシダンスに属する微生物
の培養は、イオウを含有するシルバーマン９に培地（Ｓ
　ｉ　ｌｖｅｒｍａｎ、　Ｍ、　Ｐ、ら：　Ｊ、　Ｂａ
ＣｔｅｒｉＯｌ、　。

７７、６４２　（１９５９））、チオバチルス培地（Ａ
ＴＣＣＣａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ＢＡＣＴＥＲＩＡ　
＆　ＢＡＣＴＢＲＩＯＰＨＡＧＥＳ　１７ｔｈ　ｅｄｉ
ｔ−ｉｏｎ、　１９８９）、Ｔｈ１ｏｓｕｌｐｈａｔｅ
寒天Ｎ（Ｌ　２培地（根井外喜男編　微生物の保存法二
東京大学出版会（１９７７））などで行うことができる
がこれらを適宜改変した培地でもできる。

培養温度は、１０°Ｃ〜３７°Ｃが適しているが、さら
に望ましくは、２５°Ｃ〜３３°Ｃである。培養時間の
ｐＨは１〜６が適しており、さらに望ましくは、ｐＨ３
〜５である。培養期間は、望ましくは２日間〜Ｉ４日間
、さらに望ましくは３日間〜１０日間である。

培養は液体培養、固体培養いずれでも良いが、好気的に
行う必要がある。

本発明に用いる亜硫酸脱水素酵素活性含有物は、例えば
、チオバチルス・チオオキシダンスに属する微生物の培
養菌体を、好ましくは超音波破砕処理により、破砕後、
遠心分離して沈澱を除去し、得られた上溝液を超遠心分
離することにより得ることができる。

亜硫酸脱水素酵素活性含有物を用いる方法としては、例
えば、酸素電極の先端部分をガス透過性膜（ミリボア社
製ＴｙｐｅＨＷＡＰＯ２５００）で覆い、膜と電極の間
に亜硫酸脱水素酵素活性含有物を乾燥重量５ｇ／ｉとな
るようにＯ，１Ｍクエン酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ５，０）に懸濁した液を２００．ｃｚｊ７人れた
亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化酸素電極を作成して
用いると亜硫酸脱水素酵素活性含有物の溶出がなく、酵
素活性の安定性も高く再現性のよい結果が得られる。

また、亜硫酸脱水素酵素活性含有物が遊離亜硫酸を硫酸
に酸化する原理は、葡萄酒技術研究会講演要旨集（第２
号）（大野：　１９８８）に記載があるが、遊離状の亜
硫酸がシトクロムＣ（Ｆｅ”）とＨＪの存在下で亜硫酸
脱水素酵素の作用により硫酸となる。

一方、この反応で生成したシトクロムＣ（Ｆｅ”つとＨ
ｌは酸素存在下でシトクロムＣ酸化酵素の作用により再
びシトクロムＣ（Ｆｅ”）と８２０に酸化される。

以上の一連の反応は、第１図に示す通りである。

この原理によれば試料中の遊離状態にある亜硫酸はすべ
て測定できるが、一般にアルデヒド、ケトン、糖類など
で結合している結合型の亜硫酸は測定できない。

しかし、試料をｐＨ１〜３、望ましくはｐＨ１，５〜３
に調整し、７０°Ｃ〜１１０°Ｃ１望ましくは７５〜１
０５℃の条件下に２分〜２５分、望ましくは５分〜２０
分間の酸性下処理を行うか、または、試料をｐＨＩ。

〜１４、望ましくはｐＨ１１〜１３に調整し、１５℃〜
７０℃、望ましくは２０℃〜５０°Ｃの条件したに２分
〜２０分間、望ましくは５分〜１５分間のアルカリ性下
処理を施すことにより遊離させることができる。従って
、試料にこれらの処理を施し、結合型亜硫酸を遊離型亜
硫酸とした後に上記原理により測定すれば試料中の総亜
硫酸量を測定することができる。

また、上記酸性下処理及び／又はアルカリ性下処理は系
外に取り出すことなく装置の系内で行い、その後、同一
の系内に保ったまま遊離亜硫酸として微生物で測定する
ことにより従来法のように揮散、残留などによる回収率
の低下を招くことなく総亜硫酸量を測定することができ
る。さらに、上記測定において試料を酸性下処理及び／
又はアルカリ性下処理することなく遊離型亜硫酸のみを
測定した値を総亜硫酸の測定値から減することにより結
合型亜硫酸のみの値も正確に求めることができる。

本発明で使用する亜硫酸脱水素酵素活性含有物が亜硫酸
を硫酸に酸化する前記の原理において、試料中の遊離型
亜硫酸の量と酸化に伴い消費される酸素の量及び水素イ
オンの放出量は高い相関関係にあり、従ってこれらの量
を通常用いられる酸素電極又はｐＨ電極で変化量を電位
差として検出するか、又は亜硫酸が硫酸に変化すること
により生ずる溶液のｐＨ変化をｐＨ電極で検出すること
によって、もとの試料中の遊離型亜硫酸量を検定するこ
とができる。

第２図は、本発明に係わる酸性下処理方法を用いた測定
装置の回路図の例を図示したものである。

この測定装置は、試料注入器ｌと、試料緩衝液とを切り
替えるための切り替えバルブ２と、試料及び緩衝液を混
合し加熱処理するための加熱槽５と、該加熱槽５に試料
及び緩衝液を送るためのポンプ４と、加熱槽５で加熱処
理された試料を冷却するための冷却槽６と、亜硫酸脱水
素酵素活性含有物固定化酸素電極又はｐＨ電極を装着し
た反応槽７と、該反応槽７を一定温度に保つための恒温
槽８と、電流電圧変換器１０と、ｍＶメーター１１と、
コンピューター１２と、ＣＲＴ１３と、プリンター１４
とからなるものである。試料注入器ｌより一定量の試料
を導入したポンプ４で加熱槽５に送る。緩衝液３は切り
替えバルブ２を操作して加熱槽５に送る。加熱槽５で混
合し加熱処理された試料は、冷却槽６に入り、冷却され
る。次に恒温槽８で一定温度に保たれた反応槽７に送り
亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化酸素電極又はｐＨ電
極９で電位の変化を測定する。測定した信号は電流電圧
変換器１０、ｍＶメーター１１を経てコンピューター１
２に取り込み演算処理してＣＲＴ　（デイスプレィ）１
３及びプリンター１４に出力される。また、これらの一
連の操作はコンピューターにプログラムすることにより
自動制御できる。

第３図は、アルカリ性下処理方法を用いた測定装置の回
路図の例を図示したものである。

この測定装置は、試料注入器１５と、試料とアルカリ液
とを切り替えるための切り替えバルブ１６と、試料及び
アルカリ液を混合しアルカリ処理するための加熱槽１９
と、該加熱槽１９に試料及びアルカリ液を送るためのポ
ンプ１８と、加熱槽１９でアルカリ処理された試料を冷
却するための冷却槽２０と、該冷却槽２０から送られた
試料及び酸緩衝液を混合するための混合器２１と、該混
合器２１に酸緩衝液を送るためのポンプ２３と、亜硫酸
脱水素酵素活性含有物固定化酸素電極又はｐＨ電極を装
着した反応槽２５と、該反応槽２５を一定温度に保つた
めの恒温槽２４と、電流電圧変化器２７と、ｍＶメータ
ー２８と、コンピューター２９と、ＣＲＴ３０と、プリ
ンター３１とからなるものである。試料注入器１５より
導入した試料は、ポンプ１８で加熱槽１９に入り、次に
切り替えバルブ１６を操作しアルカリ液１７を加熱槽１
９に入れる。ここでアルカリ処理した試料は、冷却槽２
゜で冷却した後、混合器２１に送り、そこに酸緩衝液２
２をポンプ２３を用いて加え混合する。混合された試料
は、恒温槽２４で一定温度に保たれた反応槽２５に送り
亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化酸素電極又はｐＨ電
極２６で電位の変化を測定する。測定した信号は電流電
圧変換器２７、ｍＶメーター２８を経てコンピューター
２９に取り込み演算処理したＣＲＴ３０及びプリンター
３１に出力される。また、これらの一連の操作はコンピ
ューターにプログラムすることにより自動制御できる。

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳しく那明するが
、本発明はこれに限定されるものではｔｉい。

〔実施例〕

り微生物の培養方法チオバチルス・チオオキシダンス１１７７３　（ＦＥＢ
ＢＰ−３１１９）を下記の組成を含む滅菌した培地５０
ｍ＋の入った２００ｒｎＩ容三角フラスコに接種し、３
０°Ｃにて４日間振盪培養を行った。この培養液２−を
世じ培地１００−を入れた３００ｍ１容エーレンマイヤ
ーフラスコに無菌的に接種し、３０°Ｃにて１０日間振
徳培養を行った。培養終了後、培養液を東洋濾紙＄Ｎα
５Ｃ濾紙を用いて濾過し、イオウ粉末を除去した。得ら
れた濾液中の菌体量は０．２ｇ乾燥菌体／ｌ培養液であ
った。

培地組成イオウ粉末　　　　　　　　１．０％に２ＨＰ０４０．０５％Ｃａ（ＮＯｓ）ｔ　”　４ＨｚＯ０，００１％（ＮＨ４
）ＩＳＯ４０，３％ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０１
％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％ｐＨ６，５蒸留水にイオウ粉末を除いた上記の成分を混合し、ｐＨ
６，５に調整した後、減菌して、別に減菌したイオウ粉
末を無菌的に混合する。

２）亜硫酸脱水素酵素活性含有物の調製実施例１で得ら
れた培養菌体を蒸留水で洗浄した後、２０ｋＨｚ　、６
０分の超音波破砕処理（ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｃ　Ｐ
ｏｗｅｒ社製５ＯＮＩＦＩＲＥ使用）を行い、破砕物を
１５０００Ｘｇ、　３０分間遠心分離して沈澱を除き、
得られた上清液をさらに１４４０００Ｘ　ｇ　、　６０
分間超遠心分離することにより亜硫酸脱水素酵素活性画
分を沈澱として集め、亜硫酸脱水素酵素活性含有物とし
た。なお、該酵素活性は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏ−１ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、　３１．３５１（１９８９）に記載された中村らの
方法に従い、亜硫酸ナトリウムを基質として、酸素電極
を用いた酸素消費速度（Ｒａｎｋ　Ｂｒｏｔｈ、　Ｃｏ
、製酸素吸収計使用）で測定した。

その結果、亜硫酸脱水素酵素活性は細胞膜画分に局在し
ていた。得られた亜硫酸脱水素酵素活性含有物の性質を
以下に記載する。

Ａ９作用亜硫酸を酸化する。

Ｂ、基質特異性亜硫酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、次
亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウムを酸化する。

チオ硫酸ナトリウム、硫化ナトリウム、テトラチオン酸
ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウ
ムは酸化しない。

なお、チオバチルス・チオオキシダンス１１７７３（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−３１１９）の完全菌体（ホールセル）を
使用すると、上記基質特異性記載の化合物のうち亜硫酸
、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、次亜硫酸
水素ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウムを酸化するが、
さらに、少なくともチオ硫酸ナトリウムが酸化される。

従って、亜硫酸脱水素酵素活性含有物を使用すると亜硫
酸化合物のみを選択的に測定できるという特性を有して
いる。

Ｃ１至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲ｐＨ５，０〜８．０の間で安定に作用し、至適作用ｐＨ
は７．０付近にある（第４図及び第５図参照）。

なお、安定性は各ｐＨで４°Ｃ，３日間保存したときの
残存活性を亜硫酸ナトリウムを基質とした酸素消費速度
で測定した。

Ｄ３作用温度範囲２０℃〜５０℃の範囲で安定に作用し、至適作用温度は
３５℃である（第６図及び第７図参照）。なお、安定性
は各温度で２４時間保存したときの残存活性を亜硫酸ナ
トリウムを基質とした酸素消費速度で測定した。

Ｅ、阻害１　ｍＭ　ＫＣＮ、　１ｍＭアンチマイシンＡ、　　１
　ｍＭ　ＮａＮ。

で亜硫酸酸化活性は阻害される。

Ｆ、基質親和定数亜硫酸ナトリウムに対するＫｍ値は２．５７ｍＭである
（第８図参照）。

３）ｐＨ電極を用いた亜硫酸量の測定実施例２で得られた亜硫酸脱水素酵素活性含有物を１０
ｍｇ　（乾燥重量）／ｄｌとなるように、１０ｐｐｍ〜
４０ｐｐｍに調製した亜硫酸ナトリウム溶液に添加し、
酸素電極のかわりにｐＨ電極を用いて溶液のｐＨ変化を
測定したところ、溶液の亜硫酸ナトリウム濃度とｐＨ変
化量の間には高い相関関係が見られた（第１Ｏ図参照）
。

４）亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化酸素電極を用い
た亜硫酸量の測定酸素電極（電気化学計器製）３２の先端部分をガス透過
性膜（ミリボア社製ＴｙｐｅＨＷＡＰＯ２５００）　３
３テ覆い、膜と電極の間に実施例２で得られた亜硫酸脱
水素酵素活性含有物を乾燥重量５ｇ／ｚとなるように、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５
，０）ニ懸濁した液２００μｆをバッファー槽３４に入
れて亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化電極を作成した
（第１１図参照）。

以上の結果に示されるごとく、チオバチルス・チオオキ
シダンス１１７７３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１１９）の生
産する亜硫酸脱水素酵素活性含有物を用いることにより
亜硫酸量を測定できた。

この酵素活性含有物固定化酸素電極を第２図に示した酸
性下処理方式の測定装置に装着し、１０ｐｐｍ〜４０ｐ
ｐｍに調製した亜硫酸ナトリウム標準液の測定を行った
。各試料を注入した際の固定化酸素電極での電流減少値
を測定した結果、第１３図に示すように亜硫酸ナトリウ
ム濃度と電流減少量には高い相関が見られる。

５）結合型亜硫酸の測定条件グルタルアルデヒド亜硫酸結合物と標準物質として酸性
下処理条件を検討した結果を第１表、同様にアルカリ性
下処理条件を検討した結果を第２表に示す。

（本頁以下余白）第２表酸性下処理の処理条件試料ニゲルタルアルデヒド亜硫酸結合物３０■／１（９０°Ｃ９１０分間処理）（ｐＨ２，０゜１０分間処理）（ｐＨ２，０゜９０℃処理）第３表アルカリ性下処理の処理条件試料ニゲルタルアルデヒド亜硫酸結合物３０■／１（３０℃。

１０分間処理）（ｐＨ１２゜１０分間処理）（ｐＨ１２゜３０℃処理）以上の結果より酸性下処理においては、ｐＨ１〜３、望
ましくはｐＨ１，５〜３の条件下、７０°Ｃ〜１１０℃
、望ましくは７５℃〜１０５℃で２分〜２５分、？まし
くは５分〜２０分処理すれば良く、アルカリ性下処理に
おいては、ｐＨ１０〜１４、望ましくはｐＨ１１〜１３
の条件下、１５°Ｃ〜７０℃、望ましくは２０°Ｃ〜５
０℃で２分〜２０分、望ましくは５〜１５分処理すれば
良いことがわかった。

６）ｐＨ電極での標準物質の測定側測定装置（第２図、第３図）の反応槽にｐＨ電極を装着
し、１ｍＭのクエン酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に実施例１で得た亜硫酸脱水素酵素活性含有
物を乾燥重量として１ｇ／ｌの濃度となるように懸濁し
て反応槽にいれて平衡化しておきそこに、Ｏ〜１１００
ｐｐとなるように亜硫酸ナトリウムを注入した。各亜硫
酸ナトリウム濃度下で３０’Ｃ２０分間反応した結果、
反応前後のｐＨの低下と亜硫酸ナトリウム濃度の間には
高い相関関係が認められた。その結果を第１３図に示す
。

７）結合型亜硫酸の酸性下処理とアルカリ性下処理の測
定例実施例６で用いた亜硫酸脱水素酵素活性含有物固定化酸
素電極を第２図及び第３図の装置に装着して、グルタル
アルデヒド亜硫醸結合物の水溶液を試料として測定した
。その結果を第３表及び第４表に示す。同時に、同じ試
料についてランキン法を用いて測定した結果を第５表に
示す。

第３表　酸性下処理による結合型亜硫酸の測定例試料　
：　グルタルアルデヒド亜硫酸結合物処理条件：　　１
）Ｈ２，０，７０°Ｃ，５分間（本頁以下余白）第４表　アルカリ性下処理による結合型亜硫酸ｑ測定例試料　：　グルタルアルデヒド亜硫酸結合物処理条件：
　　ｐＨ１２，２５°Ｃ，５分間第５表　ランキン法を
用いた測定例試料　：　グルタルアルデヒド亜硫酸結合物測定：衛生
試験法、注解１９９０（日本薬学会編、金原出版）頁４７５記載の方法による以上の結果のとおり本装置により結合型亜硫酸が精度よ
く、迅速に測定できた。また回収率においてもランキン
法と比べて高い値が得られた。

８）アルカリ性下処理装置を用いた食品での測定例と従
来法との比較市販ワインを試料として第３図に示すアルカリ性下処理
装置を用いて全亜硫酸量及び赤ワインの遊離亜硫酸量を
測定し、ランキン法での測定値と比較した結果を第６表
及び第７表に示す。

第６表　市販ワインの分析（１）試料：白ワイン処理ニアルカリ性下処理（１）ＨＩ３．３０°Ｃ，５分間）両側室とも６回の測定平均値である。

第７表　市販ワインの分析（２）試料：赤ワイン処理：遊離型亜硫酸は試料をアルカリ性下処理せず測定
した。

結合型亜硫酸はアルカリ性処理（ｐＨ１２，３０℃、５分間）両側室とも６回の測定平均値である。

〔発明の効果〕

本発明は、試料中の亜硫酸及びその化合物の含量を簡便
に定量精度が高く測定する方法を与えるものであり、且
つ安定性にも優れ実用的な測定方法として使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、亜硫酸脱水素酵素活性含有物が遊離亜硫酸を
硫酸に酸化する機構を示す図である。第２図及び第３図
は、それぞれ酸性下処理方法及びアルカリ性下処理方法
を用いた測定装置を示す図である。第４図及び第５図は
、それぞれ亜硫酸脱水素酵素活性含有物の至適ｐＨ及び
ｐＨ安定性についての試験結果を示す図である。第６図
及び第７図は、それぞれ亜硫酸脱水素酵素活性含有物の
至適温度及び熱安定性についての試験結果を示す図であ
る。第８図は、亜硫酸脱水素酵素活性含有物の基質親和
性についての試験結果を示す図である。第９図は、亜硫
酸ナトリウム濃度と酸素消費速度の関係を示す図である
。第１０図は、亜硫酸ナトリウム濃度とｐＨ変化量の関
係を示す図である。第１１図は、亜硫酸脱水素酵素活性含有物を固定化した
酸素電極を示す図である。第１２図は、亜硫酸ナトリウ
ム濃度と電流減少量の関係を示す図である。第１３図は
、亜硫酸ナトリウム濃度とｐＨ変化量の関係を示す図で
ある。第図第４図度（＠Ｃ）第６図度じＣ）第７図第８図亜硫酸ナトリウム濃度（ｐｐｍ）第９図亜硫酸ナトリウム濃度（ｐｐｍ）第１０図弔図亜硫酸ナトリウム濃度（ｐｐｍ）第図亜硫酸ナトリウム濃度（ｐｐｍ）手続補正書（方式）％式％事件の表示平成２年特許願第２７１８６０号発明の名称亜硫酸の測定方法補正をする者事件との関係　　　特許出願人住　所　　愛知県半田市中村町２丁目６番地名称　株式
会社中埜酢店代表者　　中　埜　又左工門代　　理　　人住　所　　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号６゜補正の対象（１１願書の出願人代理人の印（２）図面　（第１１図）７、補正の内容（１）別紙の通り（２）別紙の通り

Claims

【特許請求の範囲】１、チオバチルス・チオオキシダンスに属する微生物の
産生する亜硫酸脱水素酵素活性を含有する酵素活性含有
物を使用して遊離型亜硫酸を硫酸に酸化する反応を利用
して亜硫酸含量を測定する方法において、試料中の総亜
硫酸のうち結合型亜硫酸を系外に取り出すことなく酸性
下処理及び／又はアルカリ性下処理することにより、試
料中の亜硫酸を全て遊離型亜硫酸にして総亜硫酸含量を
測定することを特徴とする亜硫酸の測定方法。２、チオバチルス・チオオキシダンスに属する微生物の
産生する亜硫酸脱水素酵素活性を含有する酵素活性含有
物を使用して遊離型亜硫酸を硫酸に酸化する反応を利用
して亜硫酸含量を測定する方法において、試料中の結合
型亜硫酸を酸性下処理及び／又はアルカリ性下処理する
ことなく試料中の遊離型亜硫酸含量を測定し、その測定
値を請求項１記載の方法により求めた試料中の総亜硫酸
含量から減じて得られる値を結合型亜硫酸含量とするこ
とを特徴とする結合型亜硫酸の測定方法。３、請求項１又は２記載のチオバチルス・チオオキシダ
ンスに属する微生物の産生する亜硫酸脱水素酵素活性を
含有する酵素活性含有物を使用して亜硫酸含量を測定す
る方法において、該酵素が遊離型亜硫酸を硫酸に酸化す
る過程で消費する酸素量を検出するか、又は、該酵素が
遊離型亜硫酸を硫酸に酸化することによって生ずるｐＨ
の変化、もしくは、該酵素が遊離型亜硫酸を硫酸に酸化
する過程で放出される水素イオン量を検出することを特
徴とする亜硫酸の測定方法。４、チオバチルス・チオオキシダンスが新菌株チオバチ
ルス・チオオキシダンス１１７７３（ＦＥＲＭＢＰ−３
１１９）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の測
定方法。