JPH0414959B2

JPH0414959B2 -

Info

Publication number: JPH0414959B2
Application number: JP32457287A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sakurai; Joji Takahashi
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 1992-03-16
Also published as: JPH01165380A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、固定化微生物の製造法に関するもの
である。〔従来の技術〕固定化微生物およびそれを用いた有用物質の生
産方法は、将来の主要技術として注目され、精力
的に研究が行われ、すでに応用または実用段階に
まで進展している事例もある。しかしながら、使
用する微生物によつてまだ満足できる固定化法が
確立されていないのが現状である。このような微生物の一例として糸状菌を挙げる
ことができ、該微生物の固定化法としては、高分
子ゲルを用いて固定化する方法が一般に採用され
ていた。上記固定化法は、微生物を固定化する方
法としては最も汎用されている方法であるにもか
かわらず、該方法で糸状菌を固定化した場合に
は、高分子ゲル内部への通気性および培養液また
は反基質質液の拡散性などの点で問題を生じ、必
ずしも満足できる方法とはなりえなかつた。高分子ゲルを用いた固定化法以外に網目状布帛
または繊維状物質を担体として使用する方法も報
告されている（たとえば、特開昭61−15687号公
報、特開昭61−149085号公報など参照）。〔発明が解決しようとする問題点〕網目状布帛または繊維状物質を担体として用い
る方法は、高分子ゲルを用いた固定化法の欠点を
解決できる優れた方法であるが、固定化法として
振盪培養、通気撹拌培養などの液相中で固定化処
理を採用しており、菌体がペレツト状になり、
担体への固定化がスムーズに進行しない、微生
物の担体への結合が弱く、担体から微生物が容易
に剥離してしまう、等の欠点を有していた。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、糸状菌の固定化法に関し種々研
究を重ねた結果、従来液相中で行われていた担体
への微生物の固定化操作を気相中で行うことによ
り、担体からの菌体の脱離のない強固でかつ高活
性な固定化微生物が得られることを発見し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、菌体が糸状を呈する微生
物を多孔性担体に接種し、該微生物を生育させる
ことにより固定化微生物を製造する方法におい
て、該微生物の生育を気相中で行うことを特徴と
する固定化微生物の製造法に関するものである。以下、本発明を詳細に説明する。本発明方法で使用可能な微生物としては、菌体
が糸状を呈する微生物であればよく、その種類に
関係なくすべて好適に用いることができる。具体
的にそれらの微生物を例示すれば、ムコール
（Mucor）属、リゾプス（Rhizopus）属などの接
合菌類、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペ
ニシリウム（Penicillium）属、アウレオバジデ
イウム（Aureobasidium）属、ボトリテイス
（Botrytis）属、フザリウム（Fusarium）属、ト
リコデルマ（Trichoderma）属などの不完全菌
類、モナスカス（Monascus）属、サイトア
（Saitoa）属、ユーロチユウム（Eurotium）属、
ユーペニリシウム（Eupenicillium）属、エミリ
セロシス（Emericellopsis）属などの子のう菌
類、アクチノマイセス（Actinomyces）属、ス
トレプトマイセス（Streptomyces）属などの放
線菌類およびフアボラス（Favolus）属、フエリ
ナス（Phellinus）属などの担子菌類を例示する
ことができる。これらの微生物を固定化するための担体として
は、微生物の菌糸が十分に伸長できる1μｍ〜10
mm程度の孔を有し、微生物を培養成分を保持でき
る能力をを有する多孔性担体でればよく、その形
状、構造、材質などには限定されない。たとえば、担体の材質としては、ナイロン、ポ
リエステル、レーヨン、ビニロン、アクリル、ポ
リプロピレン、ポリウレタン、ポリビニールアル
コールなどの合成由来のもの、紙、木綿、麻、
絹、綿などの天然由来のもののいずれであつても
よい。担体の構造としては、上記材質の繊維を規則的
または不規則的に二次元的または三次元的に編み
あげたもの、または化学的もしくは物理的手段に
て一部分を結合させたもののいずれであつてもよ
い。また、担体の材質として合成由来のものを使
用する場合には、発泡状の構造を有していてもよ
い。このような発泡体は、たとえばポリオキシエ
チレン構造を有するポリオール（たとえば、ポリ
エチレングリコールなど）とポリイソシアネート
（たとえばジフエニルメタンジイソシアネートな
ど）を反応させることにより容易に調製すること
ができる。担体の形状としては、平面状、丸状、円柱状、
円錐状、筒状、多面体状などの形に成形したも
の、あるいは一定の形の整形しないものであつて
もよい。また、担体のの物理的強度を高め、形状
を一定に保持するため、これらの担体を金属もし
くは硬質ポリマーなどのネツト、棒、リング、糸
などの補強材で補強してもよい。このような担体を具体的に示せば、編布、不織
布、瀘紙、発泡体などそれらの補強物を例示する
ことができる。不織布についてさらに具体的に説明すれば、乾
式不織布、湿式不織布のいずれも好適に用いるこ
とができ、乾式不織布は接着剤型不織布、機械結
合型不織布、紡糸型不織布のいずれのものも好適
に用いることができる。これら不織布は、種々市
販されており、適宜に選択すればよい。担体への微生物の固定化処理は、使用した微生
物が資化可能な成分を含有する培養液を担体に含
浸させ、これに微生物を接種して気相中で１時間
〜30日間培養するか、または培養液に微生物を懸
濁し、この懸濁液を担体に含浸させてこれを気相
中で１時間〜30日間培養することにより実施する
ことができる。ここで「気相中」とは、気体の雰囲気中に保持
し、常に気体と微生物との接触が密接に行える条
件下のことを意味し、「気体」とは、空気、高濃
度酸素含有気体、純酸素などの酸素を含有するも
のもしくは必要に応じてこれにに二酸化炭素およ
び窒素を適当濃度含有せしめたものを意味し、こ
れらの気体は、強制的に撹拌または通気させる状
態であつてよい。また、「含浸させる」とは担体
の空隙に培養液、微生物懸濁液などの溶液を保持
させることを意味する。担体に含浸させる培養液は特に制限されず、使
用した微生物の生育に繁用されている炭素源（グ
ルコース、グリセリン、デキストリン、脂肪酸な
ど）、窒素源（ペプトン、酵母エキス、コーンス
テイーク・リカー、カゼインなど）、アミノ酸類、
ビタミン類、無機塩類などを一種以上含有するも
のであればよい。担体に接種または培養液に懸濁させる微生物
は、胞子または生育初期の微生物のいずれであつ
てもよく、微生物の使用濃度は、１×10⁵〜１×
10⁹個／mlが好適である。気相中での生育条件は、使用する微生物が良好
に生育する通常の温度、湿度、PHなどの各条件を
適宜選定すればよく、具体的には温度０〜70℃、
気体中の相対湿度60％以上、PH２〜11の条件より
適宜選定できる。また、微生物の固定化処理は、無菌箱等で区切
られた培養容器内で無菌的に行つてもよい。〔発明の効果〕本発明の方法は、担体への微生物の固定化操作
を気相中で行うため、固定化処理が極めて簡便で
あるとともに担体へ微生物が強固に結合した高活
性の固定化微生物を得ることができる。そして、
本発明方法で得られた固定化微生物は、物質変換
反応、物質生産反応などの応用反応中で担体から
微生物が剥離せず、長時間高活性を維持するた
め、極めて有用なものである。〔実施例〕以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説
明する。実施例１関西フエルト製ニユーフアインフエルト（9.4
cm×８cm）を円筒形にして、内側をステンレス製
金網で補強し、担体とした。グルコース（３％）、酵母エキス（0.9％）、マ
ルトエキストラクト（デイフコ社製）（0.9％）、
ペプトン（1.5％）を含有する培養液（PH6.0）中
に、アスペルギルス・ニガー
（Aspergillusneger）IAM2094の胞子を懸濁し、
胞子濃度10⁶〜10⁷個／ml程度の胞子懸濁液を調製
し、上記担体をこの懸濁液中に十分に浸した後、
引き上げて、ガラス製円筒管（直径５cm、長さ30
cm）中に直立させ、綿栓をして30℃、36〜48時間
静置培養し、固定化微生物を得た（以下、気相生
育固定化微生物と称する）。比較のため、実施例１と同様に処理して胞子懸
濁液をしみ込ませた担体を上記のガラス製円筒管
に入れ、これにグルコース（１％）、酵母エキス
（0.3％）、マルトエキストラクト（0.3％）、ペプ
トン（0.5％）を含有する培養液（PH6.0）200ml
を加えて、円筒管底部に取り付けたガラスボール
フイルターより空気を通気させながら、30℃、36
時間液相中で培養し、固定化微生物を得た（以
下、液相生育固定化微生物と称する。）。上記各固定化微生物をそれぞれを殺菌水１を
200mlずつ用いて５回にわけて洗浄し、以下に述
べるグルコン酸生産反応に供した。また菌体量測
定用に上述と同様にして固定化微生物を調製し、
乾燥菌体総重量を測定したところ、気相生育（空
気中）のもので約340mg、液相生育で約440mgの菌
体が担体に固定化されていた。次に、気相生育および液相生育の各固定化微生
物を用いて、グルコン酸生産を実施した。グルコン酸生産用反応液（PH6.0）としてはグ
ルコース（10％）、硫酸マグネシウム（0.015％）、
リン酸二水素カリウム（0.02％）、リン酸水素二
ナトリウム（0.04％）を含有するものを用いた。
グルコン酸生成反応は、固定化微生物と反応液
200mlをガラス管（直径５cm、長さ30cm）中に入
れ、ガラスボールフイルターより純酸素を底部か
ら通気して、溶存酸素濃度、30ppm、反応温度、
30℃、反応PH、PH7.6の条件下にて行つた。反応
中のPH変動は、６規定の水酸化ナトリウムを中和
剤として使用したPHコントローラーにより行つ
た。反応中適時、反応液を採取し、残存グルコー
ス量をネルソン−ソモジ法で、生成グルコン酸量
をカラムとしてMCI−TEL−CKO8S（三菱化成
工業(株)製）を用いた高速液体クロマトグラフイー
法（溶出剤：１％リン酸溶液、検出：210nｍの
吸光度）にて測定し、グルコースがほぼ消費され
つくしたところで反応液すべて抜き取り、新たに
グルコン酸生産用反応液を200ml加えて、引き続
き繰り返し反応を行つた。気相生育（空気中）および液相生育の各固定化
微生物によるグルコン酸生産における反応時間、
収率、グルコン酸生産速度値を第１表および第２
表に示し、それぞれの場合の繰り返し使用による
グルコン酸生産速度の変化を第１図に示す。第１回目の反応は、反応開始直後のため不安定
であるが、繰り返し使用の２回目以降ではつねに
気相生育固定化微生物の方が、液相生育固定化微
生物より、グルコン酸生産速度値が高かつた。ま
た、液相生育固定化微生物では、繰り返しによる
生産速度の低下が大きく、繰り返し使用10回目に
おいて、当初の速度の40％以下になつてしまい、
その後も低下し続けたのに対して、気相生育固定
化微生物では10回目以後もほとんど速度の低下は
なく、反応開始当初の生産速度の70％程度の速度
を保持した。また、気相生育固定化微生物では、
繰り返し使用中においても、担体からの菌体の剥
離はほとんど認められなかつた。以上のように、気相生育固定化微生物は液相生
育固定化微生物と比較して、担体との結合力、グ
ルコン酸生産における生産速度およびその安定性
の点において極めてすぐれており、のべ反応時間
680時間余りの長期間にわたり、安定なグルコン
酸の生産が可能であつた。

【表】

【表】実施例２担体として関西フエルト製ニユーフアインフエ
ルト（9.4cm×８cm）を円筒形にしたものに加え
て、その外側に同じニユーフアインフエルト
（15.7cm×9.6cm）を円筒形にしたものを置き、二
重にして、担体表面積を内側の担体のみの場合の
３倍にしたものを使用し、実施例１と同様に処理
し、担体にアスペルギルス・ニガーIAM2094の
胞子懸濁液を含浸させた。これを実施例１と同様にガラス製円筒管に直立
させ、ガラス製円筒管ごと密閉容器に入れ、容器
中の空気をすべて純酸素に置換し、純酸素中で30
℃、48時間静置培養し、微生物を担体上に増殖さ
て、固定化微生物を得た。純酸素中で生育させた
固定化微生物の乾燥菌体重量は、9.4cm×８cmの
担体当り、約225mgであつた。この固定化微生物とグルコース（10％）、硫酸
マグネシウム（0.015％）、リン酸二水素カリウム
（0.02％）、リン酸水素二ナトリウム（0.04％）を
含有する反応液（PH6.0）600mlを用いて、グルコ
ン酸の生産反応を行つた。グルコン酸生産反応
は、加圧可能なステンレス製反応器（内径6.9cm、
高さ27cm）を用いて、純酸素で５Kg／cm²（ゲージ
圧）に加圧し、反応器底部のガラスボールフイル
ターより純酸素を通気して、溶存酸素濃度
150ppm、反応温度30℃、反応PH６に保持し、以
下実施例１と同様に、グルコン酸生産反応を繰り
返し実施した。反応時間、収率、グルコン酸生産速度の結果を
第３表および第２図に示した。第３表および第２図より、繰り返し１、２回目
では反応開始直後のため、不安定であつたが、３
回目以降ではグルコン酸生産速度は3.2〔ｇ／ｇ
cell.h〕以上と高い値を示し、繰り返し使用12回
目以降においても、生産速度はほとんど変化する
ことなく、およそ３〔ｇ／ｇcell.h〕と実施例１に
示した常圧反応の場合の約３倍の値を保ち続ける
ことが可能であつた。この高い値は、繰り返し20
回を越えても変わらなかつた。以上のように、純酸素中で菌糸を生育させて得
た固定化微生物は、高溶存酸素濃度下におけるグ
ルコン酸生産反応において、その生産速度および
安定性において格段すぐれた効果が得られること
が明らかとなつた。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は、液相生育固定化微生物（●−●）ま
たは気相生育固定化微生物（○−○）を用いて、
グルコン酸生産反応を行つた時の、固定化微生物
の繰り返し使用によるグルコン酸の生産速度の変
化を示したものである。第２図は、高溶存酸素濃度下でグルコン酸生産
反応を行つた時の、固定化微生物の繰り返し使用
によるグルコン酸生産速度の変化を示したもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

１菌体が糸状を呈する微生物を多孔性担体に接
種し、該微生物を生育させることにより固定化微
生物を製造する方法において、該微生物の生育を
気相中で行うことを特徴とする固定化微生物の製
造法。