JPH04164254A - 免疫学的多層分析素子及び分析方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の特定成分を分析するだめの分析
素子に係り、特に生物学的流体試料中の特定成分を、こ
れと特異的に結合しうる物質と標識体との均一系競合反
応により測定する分析方法及び分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発かなされてきた
。その分析法は、主として免疫反応をその原理とするも
のである。上記原理を用いる測定法として、種々のもの
が開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫
測定法が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｖ）が、放射性ヨードで標識
した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシ
ュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識物質として、放射性同位元素以外のものが
種々開発されてきた。他の標識物質としては例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げられ
る。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ／
Ｆ分離と略記する）がある。

従来、免疫測定法におけるＢ／Ｆ分離の問題点を解決す
るために、種々の測定法が開発されてきた。

例えば、特開昭５１−４４６２９５号、同５５−２９９
７号、同５８−２１１６６２号、同５４−２０１３４号
、同５５−１０４８９６号、同５７−１５０６８１号等
に記載されている均一系免疫測定法がある。すなわち、
流体試料中の特定成分を、該特定成分と特異的に結合す
る物質と標識体を用いる均一系競合反応により測定する
方法であり、該標識体が特定成分と特異的に結合する物
質と結合すると、結合しなかった場合に対して検出可能
な変調応答を示すものであり、このような標識体を利用
することによりＢ／Ｆ分離の工程を省略することができ
る。

臨床検査の分野では、これら均一系免疫測定法による湿
式分析が行われている。しかし、比較的多量の水溶液中
で、試料溶液及び各試薬を混合して反応させるため、測
定結果の信頼性を得るためには、高度の熟練と経験が必
要であり、再現性も十分とはいえない。このような操作
上の問題点を解決すべく、また測定結果の精度、再現性
を高めるべく、各操作を自動化した測定装置も開発され
ているが、送液機構や試料の混入防止等の複雑な機構が
必要であり、非常に高価な装置となる。また、試薬の調
製や装置の調節、測定後の試薬、試料溶液の廃棄等に問
題があり、また試料溶液も多量に必要とし、採取、操作
上も熟練を要するものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、このような湿式分析に代り、簡単な操作で迅速に
測定できる乾式分析法が考案されている。

例えば、特開昭５７−１０３０５５号には、濾紙やガラ
ス繊維布に免疫反応試薬や発色試薬を順次含浸、乾燥さ
せた単層の分析要素が記載されている。これを用いるこ
とにより安価な測定装置で迅速に、流体試料中の特定成
分を分析できるが、濾紙のような粗な表面からの測定で
は多量の迷光やノイズの影響が避けられず、測定精度及
び再現性が十分とはいえない。

例えば試薬２層のうち一層だけを非繊維質多孔性反応層
とすると、操作その他の束縛からやむなく定ってしまう
測定にかかるまでの時間、例えば３．５〜７分では既に
最高感度が去っていることがあるし、また逆に層構成上
標識体高濃度値ではまだ感度が出ていないことがある。

また他の問題として酵素、抗体等の蛋白質類を有機溶媒
に接触させると変質、活性劣化を起すことがあり、また
微分散させる操作も煩雑である。

さらに、特開昭５８−１８１６７号に記載された分析多
層素子では、試料溶液として２５μａから２００μρと
いう多量の溶液を必要としている。このような多量の試
料溶液を分析素子に滴下して測定するためには、その量
に応じて多量の免疫反応試薬を分析素子に含有させなけ
ばならず、分析素子が高価なものとならざるを得ない。

また、例えば試料溶、液が血清や血漿である場合には多
量の採血が必要となり、採血時間、被採血者の対応事態
等に望ましくないものがある。

〔発明の目的〕

本発明は前述の従来技術の欠点を省み、本発明の目的は
、簡便な操作でしかも少量の試料溶液で、最高感度への
到達を測定時間に順応させ、精度および再現性に優れた
流体試料中の特定成分を定量する多層分析素子及び該多
層分析素子を用いた分析方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の骨子としては、流体試料中の特定成分を、該特
定成分または該特定成分の類縁体のいづれかと標識物質
が結合した標識体を適用して該特定成分および該標識体
の双方に特異的に結合しうる物質に対する均一系競合反
応によって、測定するために特定の多層分析素子を用い
ることであり、該多層分析素子は、該特定成分および該
標識体の双方に特異的に結合しうる物質を含有する親水
性高分子非多孔性反応層を有することを特徴とする多層
分析素子である。

本発明の多層分析素子に用いる均一系競合反応による測
定法は、従来公知の技術であり、例えば特開昭５５−２
９９７号に記載されている測定法が有利に利用できる。

本発明の多層分析素子において、親水性高分子非多孔性
反応層は、上記均一系競合反応を行わせる層であり、繊
維質多孔性展開層と分離して設けることにより均一系競
合反応を効率よく局在的に行わしめることができる。従
って、少量の試料溶液で、十分に反応でき、しかも高精
度に測定できることが可能となった。また、標識体を高
分子物質からなる非多孔性層に含有させることにより、
標識体と特定成分および標識体の双方に特異的に結合し
うる物質との反応を、任意に遅延させることが可能とな
り特定成分を高感度時間帯で捉えて測定することができ
る。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分とは、
その存在の有無又は、その流体試料中での量が検出され
、その特定成分に特異的に結合する物質が存在しうる物
質又は物質群である。すなわち、ポリペプチド、蛋白質
、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモ
ン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられ
る。好ましくは、分子量６，０００以下の低分子化合物
である。

具体的には、下記の物質、または物質群を挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（Ｇ　Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ　ｃＴ　Ｈ）、メラ
ニン刺激ホルモン（Ｍ　Ｓ　Ｈ）、バソプレッシン、オ
キシトシン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテン
シン■及び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン
、セロトニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ１）
、トリヨードサイロニン（Ｔ　３）、ガストリン、コル
チゾール、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲ
ン、プロゲステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドト
ロピン、胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子
（ＴＲＨ。

ＦＳＨ−ＲＨ，ＣＲＨ，ＬＨ−ＲＨ等）等〈ビタミン類
〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ５　ビタミンＢ２、ビ
タミンＢ６、ビタミンＢ１□、ビタミンＣ１ビタミンＤ
１　ビタミンＥ１ヒタミンに１葉酸等。

−９＝ く各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンソイルエクゴニン、コカイン、コテイン、テキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、カロイマイシン、クロラムフェニコール、ク
ロロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、セファ
ロスポリン、ポリミキシンＢ１テラマイシン、テトラザ
イクリン、ストレプトマイシン、ジフェニルヒダントイ
ン、エトスクシミド、フェノバルビクール、ブリミドン
、セコバルビクール、アセタミノフェン、アミトリブチ
リン、カルバマゼピン、ジゴキシン、ジンビラミド、リ
ドカイン、メソトレキセート、Ｎ−アセチルプロカイナ
ミド、フェニトイン、プロカイナミド、プログラ１０−
ル、テオフィリン、カナピノール、テトラヒドロカナピ
ノール、コリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン
、ブチロフェノン、カフェイン、クロロｌＯ− プロマシン、パルピッレート、アンフェタミン、カテコ
ールアミン、エピネフリン、グリセオフルビン、イミプ
ラミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、メゾロバメート、メ
タトン、ナルセイン、ノルトリブチリン、オキサゼパン
、パバベリン、プロスタグランジン、テグレトール、バ
ルプロン酸等Ｒびこれらの代謝産物。

〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、燐酸エステル類、チオホスフェ
ート類、及びこれらの代謝産物。

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結
合する物質としては、測定対象により抗体、抗原、レク
チン、プロティンＡなどが挙げられるが、該特定成分と
該結合物質の結合反応が抗原−抗体反応である場合が特
に好ましい。本発明で使用する抗体は、その由来を特に
限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、免
疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは
従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アン
モニウム沈殿法、セファデックスゲルによるゲル濾過法
、イオン交換セルロースクロマｌ−クラアイ法、電気泳
動法等（右田俊介編「免疫化学」中白書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）肺
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑腫細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、該
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。

また、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ各分各企
画いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理し
てＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ　’又はＦ（ａｂ’）２といっ
た活性抗体フラグメントにして使用してもよい。

更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組
合せて使用してもよい。

これらの抗体を非多孔性反応層に含有させるには、抗体
の特定成分と特異的に結合しうる能力を保持したまま含
有させる必要があり、例えば測定すべき特異的反応に関
与しない哺乳動物の正常血清蛋白質、アルブミン、ゼラ
チンおよびそれらの分解物等と混合後、凍結乾燥して、
含有させることができる。

本発明に適用しうる標識物質としては、例えば、補欠分
子族、補酵素などが挙げられるが、好ましくはフラビン
アデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌ
レオチド及びその還元体、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸及びその還元体、アデノシン燐酸、フラ
ビンモノヌクレオチドである。特に好ましくは、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（以後ＦＡＤと略記する）で
ある。

特定成分または特定成分の類縁体と、上記標識物質が結
合した標識体は、Ｄ、Ｌ、Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａ（２
，；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖ
ｏ（１５３，ｐ６５８−６６５　（１９８１）、Ｔ、Ｊ
、　Ｒｉｃｈａｒｄ　ａｔ　ａ（１，；　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｖｏｏ、２７　、　ｐ１４９９〜１５０４　（１９８１
）および特開昭５５−２９９６号、同５８−４６０７２
号等に記載された方法を用いて作成することができる。

本発明に適用しうる均一系免疫測定法の標識物質に起因
する信号を検出するために、補欠分子族や補酵素と組す
るアポ酵素をか必要である。アポ酵素としては、特開昭
５５−２９９７号、同５７−１０３０５５号等に記載さ
れたものが使用でき、例えばホロ酵素の形で記載すると
、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ
、リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸
デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ等を
挙げることができる。好ましくは、グルコースオキシダ
ーゼである。アポグルコースオキシダーゼの使用に際し
ては、酵素の安定化のために特開昭５７−１６６９８０
号に記載された抗グルコースオキシダーゼ抗体を使用す
ることが望ましい。

また、これら酵素の活性は、発色反応により比色定量す
ることが有利であり、例えばグルコースオキシダーゼを
例にして説明すると、グルコースヲＭ　’Ｊｔとして、
グルコースオキシダーゼにより生成する過酸化水素をペ
ルオキシダーゼを触媒として検出可能な色素を形成させ
て検出する方法が広く用いられている。

発色反応試薬としては、下記に示される化合物Ｉ４− を用いることができる。

０−ジアニンジン ０−およびｐ−トルイジン等のアニリン誘導体０−７エ
ニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジメチル−ｐ−フェニレン
ジアミン、ベンジジン、３．３’、５．５’−テトラメ
チルベンジジン等の芳香族ジアミン類カテコール、グア
ヤコール、オルシノール、ピロガロール等のフェノール
誘導体 サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のような芳香族
カルボン酸 ロイコマラカイトグリーン、ロイコフェノールフタレン
のようなロイコ染料 ４−アミノアンチピリンとフェノールまたはナフトール
誘導体との組合せ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンとＮ、Ｎ
’−ジメチルアニリンとの組合せｐ−アニシジンと８−
ヒドロキシキノリンとの組合セ ２．２′−アジノジ（３−エチル−６−スルホベンゾチ
アゾリン） ２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）　−４
，５＝ヒス（ｐ−ジメトキシアミノフェニル）イミダゾ
ール 等。

これら発色反応試薬は、水あるいは有機溶媒に溶解し容
易に検出層に含有させることができる。

また必要に応じて発色反応試薬および形成された色素の
安定化に特開昭５８−８７４６１号に記載されているよ
うなカルボキシル基を有するポリマーを含有させてもよ
い。

標識体に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光法
または、発光法で検出することができ、測定法としては
信号の経時的変化を測定するレート測定法または一定時
間後の信号を測定するエンドポイント測定法を用いるこ
とができる。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比
色法）では、紫外光、可視光、近赤外光を利用すること
ができ、例えば流体試料として血清および血漿を用いる
場合には、血清および血漿による吸光の影響を小さくす
るために緑色光、赤色光または、近赤外光を利用するの
が好ましい。

本発明による多層分析素子は、光透過性支持体の上に積
層して製造することが好ましく、本発明で使用しうる支
持体としては、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリカーボネートおよびポリビニルイミ
ダ（例えばポリスチレン）のような高分子化合物あるい
はガラスのような透明無機化合物等が挙げられる。

本発明に係る繊維質多孔性展開層は、流体試料溶液を展
開し反応層に均一に供給するだめの層であり、その素材
としては、例えば　　パルプ、粉末濾紙、綿、麻、綱、
羊毛、キチン、キトサン、セルロースエステル、ビスコ
ースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、ポリアミド（６
−ナイロン、６ローナイロン、６１０−ナイロンなど）
、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレートなど）、
ポリオレフィン（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガ
ラス。

石綿などの繊維、例えば植物性、動物性、鉱物性或は合
成、半合成、再生の繊維を用いることができ、更にこれ
らを混合して用いても良い。また吸水性の洋紙、和紙、
濾紙、プラッシュポリマー、あるいは前記の繊維類など
を単独あるいは混合して製造した織布、不織布、合成紙
などを用いることもできる。

本発明の非多孔性反応層は、均一系競合反応を行わせる
層であり、特定成分および標識体の双方に特異的に結合
しうる物質や前記アポ酵素等を含有している。

また、本発明による展開層や反応層には、必要に応して
免疫反応における非特異反応を排除する目的で測定すべ
き特異的反応に関与しない蛋白質を含有させることがで
きる。代表的な例としては、哺乳動物の正常血清蛋白質
、アルブミン、ゼラチンおよびそれらの分解物等が挙げ
られる。

本発明の標識体を含有する高分子物質からなる非多孔性
層の素材としては、成膜性を有する少なくとも１種の親
水性コロイドが用いられる。

親水性コロイドとしては、ゼラチン、フタル化ゼラヂン
等のゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポリアクリル
アミド、ポリアクリル酸すトリウム等の合成高分子、ヒ
ドロキシエチルセルロース、カルボキンメチルセルロー
スナトリウム塩等のセルロース誘導体の多糖類等或はア
ルギン酸ナトリウム等まで含まれる。そして好ましくは
ゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体が挙げ
られる。

これら親水性コロイドを塗布および／または製膜するこ
とにより、本発明に係る高分子物質からなる非多孔性層
を形成させることができる。標識体を含有させるには、
水、有機溶媒で溶解して容易に含有させることができる
。

さらに、本発明による多層分析素子では、高分子物質か
らなる非多孔性層が標識体に起因する信号を検出するた
めの前記発色試薬を含有させた検出層を設けてもよい。

勿論、標識体を含有する高分子物質からなる非多孔性層
に前記発色試薬を含有させることができる。

さらに本発明に係る検出層の高分子物質はその膜物性、
例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために一部を他
の水分散性高分子重合体、すなわち高分子ラテックスと
置換することができる。好ましい高分子ラテックスの例
としては、例えは特開昭５７−１１６２５８号、同５８
−９９７５２号記載のものが有用である。これらの高分
子ラテックスは、親水性コロイドバインダの最大７０％
を置換することが可能であるが、好ましくは約５０％以
下の置換である。

本発明に係る非多孔性層もしくは前記検出層には他の添
加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を
目的に応して添加することができる。

緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適
したｐＨするために含有される。用いることができる緩
衝剤としては日本化学金偏「化学便覧基礎編」（東京、
丸善（株）１９６６）ｐ１３１２〜１３２０、Ｎ。

Ｅ　、　Ｇｏｏｄ等；　バイオケミストリ（Ｂｅｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、　ｖ。

Ｑ　５．ｐ４６７（１９６６）、今村、斎藤；化学の領
域、　ｖｏ１２３０（２）、ｐ７９（１９７６）、Ｗ、
Ｊ、ファーギュソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）等、Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏ（２１０４，ｐ３００（１９
８０）等の文献に記載されているものをあげることがで
きる。具−２０＝ 体的な例としては、くえん酸塩、硼酸塩、燐酸塩、炭酸
塩、トリスバルビッール、グリシン、グツド緩衝剤等が
あげられる。これらの緩衝剤は必要に応じて検出層以外
の層に含有させてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含有され
、酸化防止剤などがある。また層中に含有させる標識体
の活性保持のために、固定化酵素、アフィニティクロマ
トグラフィの吸着体、固定化抗体、及び蛋白質や酵素等
の保存に用いられる保恒剤を含有される。その物質とし
ては、日本生化学金偏［生化学実験講座ｌ、蛋白質の化
学ＩＪ（東京化学同人（株）１９７６）ｐ６６〜６７、
実験と応用「アフィニティクロマトグラフィ」ｐ１６〜
１０４、特開昭６０−１４９９２７号等に記載されてい
るものがあげられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン、シクロデキストリン類、非還元糖類（シュクロ
ース、トレハロース）、ポリエチレングリコール、アミ
ノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。

ゼラチンやゼラチン誘導体のような親水性コロ＝２１− イドからなる高分子物質層には硬膜剤を添加することが
でき、硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質
を用いることができ、Ｔ　、　Ｈ、ジエイムス（Ｔ、Ｈ
，Ｊａｍｅｓ）編「ザ・セオリ・オブ・ザ・フォトグラ
フィックプロセスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　
ｔｈｅＰｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ）（
４ｔｈ）、ｐ７７−８７に記載されているものをあげる
ことができる。具体的な例としては、アルデヒド類、活
性オレフィン類、活性エステル類等があげられる。

標識体を含有した高分子物質からなる非多孔性層に硬膜
剤を添加することにより、該標識体の多孔性反応層への
溶出拡散を任意にコントロールすることができ、標識体
と特異的に結合しうる物質との反応を遅延させるのに有
用である。

界面活性剤として使用可能な代表的な界面活性剤の例と
しては、トライトン■Ｘ−１００（・−ム・ハース社製
：オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、サー
ファクタントＩＯＧ■（オリーン社製；ノニルフェノキ
シポリグリシドール）等の非イオン性界面活性剤および
イオン性界面活性剤かある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるか、粒状体の重量に対して２Ｑｗｔ％乃至０．
００５ｗｔ％好ましくは１５ｗｔ％乃至０．１ｗｔ％用
いることができる。更に別の方法として該粒子単位と液
体キャリアの超音波処理、物理的混合、および物理的攪
拌処理、ｐＨ調整かある。これらは前記の方法と組合せ
ることにより、さらに有用である。

その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、プ
ロ７カ試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応じ
て適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定のための検
出物質を、検出層に集中的に集めたり、検出物質か色素
の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさせる物
質であり、検出物質と強い相互作用を示すカチオン性ポ
リマー、アニオン性ポリマー及びこれらのポリマーのラ
テックスが用いられる。

本発明の多層分析素子は、さらに流体試料が血液（全血
）の場合に有用な血球分離層、必要に応じて設ける接着
層、保護層、タイミング層といった補助層を設けること
かできる。これらの層は、その機能に応して設けられる
へき位置が容易に決定できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが
、本発明かこれら実施例によって限定されるものではな
い。

ＦＡＤ標識テオフィリンおよびアポグルコースオキシダ
ーゼは、特開昭５８−４６０７２号および米国特許４．
２３８，５６５号に記載された方法に準じて作成した。

実施例１ ｌ−（１）　　モノクローナル抗テオフィリン抗体の作
成 無水エタノール２５０＋１１１２中に、６−クロル−１
，３−ジメチルウラシル５０ｇど６−アミノカプロン酸
３７ｇを加え、さらにトリエチルアミン２８ｇを加えて
加熱還流下２００時間反応せ、エタノールを溜去後、水
から再結晶して（５−カルボキシペンチル）イミノ基を
導入したウラシル誘導体を得た。この化合物３６ｇを水
１００ｍ１２に加えて懸濁し、これに水５０ｍａに溶解
した亜硝酸ナトリウム１４ｇを加え、５０°０で１時間
反応させ、冷却後濾取した。

この濾取物３２ｇをメタノール４００＋１１０に溶解し
、酸化白金を触媒として水素で還元した。触媒を濾別し
た後、さらに蟻酸メチルと反応させることによりホルム
アミド化したウラシル誘導体を得た。次に、この１８ｇ
ｅ　ｏ−ジクロルベンゼン１１２中に入れ、窒素雰囲気
下４時間加熱還流することにより、９−（５−カルボキ
シペンチル）−１，３−ジメチルキサンチンを得た。特
開昭５８−４６０７２号記載の方法に準じて、この化合
物をウシ血清アルブミンに結合させ、免疫原として用い
た。

約６週齢のＢａＱｂ／ｃマウス（雌）を上記免疫原で免
疫した。すなわち２００μｇの上記免疫原を完全７０イ
ンドアジユバントを用いてエマルジョンとし、マウスの
腹腔に注射した。２週間後、１５０μｇの免疫原を不完
全７０インドアジユバントを用いてエマルジョンとしマ
ウス腹腔に注射した。ざらに２週間後０．１５Ｍの食塩
水に溶解した１００μ９の免疫原をマウスの静脈に注射
した。その３日後牌臓を取り牌細胞を採取した。この牌
細胞（４Ｘ１．０″個）とアザグアニン耐性マウス骨髄
腫細胞Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３（１，２Ｘ　１０８
個）とを混合し、５０％ポリエチレングリコール４００
０（メルク社製）を用いて細胞融合した。融合細胞を９
６ウエルプレートに撒き１５％ウシ胎児血清、ペニシリ
ン（５０単位／ｍＱ）とストレプトマイシン（５０μｇ
／　ｍＬ）とを含むＨＡＴ培地（０，４μＭアミノズテ
リン、１６μＭチミジン、１００μＭヒポキサンチンを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地）で培養した。２日おきに
培地の半分を新しいＨＡＴ培地と交換し、２週間後各ウ
ェルの培地上清をＥＱｉｓａ法によりアッセイし、ポジ
ティブのものを限界希釈法により、クローニングを行い
、雑種細胞を得た。次にこの細胞を、マウス腹腔内にて
増殖させ、モノクローナル抗テオフィリン抗体を含むマ
ウス腹水を得た。

このマウス腹水３．２ｍＯを多層分析素子に用いた。

１−（２）　　抗グルコースオギシダーゼ抗体含有２６
一 アポグルコースオキシダーゼの調製 凍結乾燥したアポグルコースオキシダーゼ２５ｍｇに、
グルコースオキシダーゼをヤギに免疫して得られた抗グ
ルコースオキシダーゼ抗体４ｍ（ｌを加え多層分析素子
に用いた。

１−（３）　　テオフィリン測定用分析素子の作成厚さ
１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレー
トフィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗布、
乾燥させ検出層を形成させた。（乾燥後の膜厚は２２μ
ｍであった。） 塗布液（１） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　４．０ｇトライトンＸ
−］、００（ローム・ハース社Ｍ）２．０ｇ 抗テオフィリン抗体　　　　　　　３．２ｍｆｆ抗グル
コースオキシダーゼ抗体含有 アポグルコースオキシターゼ　　４．０ｍｍグルコース
（東京化成社製）　　　　６００ｍ１＋ペルオキシダー
ゼ（ベーリンガ社製） ７００Ｕ １．２−ビス（ビニルスルホニル）エタン７ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　２１．０ｇ次にこの検
出層の上に下記の組成の塗布液（２）を塗布乾燥させＦ
ＡＤ標識テオフィリンを含有するゼラチンバインダから
なる非多孔性層を形成させた。（乾燥後の膜厚は１０μ
ｍであった。）塗布液（２） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　２．０ｇドライド７　
Ｘ−１００１，０ｇ ＦＡＤ標識テオフィリン（ＪＯＯｕｇ／ｍ（ｌ水溶液）
６００μα １．２−ビス（ビニルスルホニル）エタン４ｍ９ １．５Ｍ　＜えん酸−燐酸水素 二カリウム緩衝液（ｐＨ５，０）　　　　３．６ｇ３．
３　’、５．５　’−テトラメチルベンジジン５ｍｇ ガントレッッＥＳ−２２５（ＧＡ　Ｆ社製）１．８ｇ ＝２８− 蒸留水　　　　　　　　　　　　　２８．０ｇ次に、こ
の層の上に接着層として下記の組成の塗布液（３）を塗
布、乾燥した。

塗布液（３） Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル 共重合体（重量費２：８）　　　　　　１．０ｇブタノ
ール　　　　　　　　　　　　　３８．０ｇさらに、こ
の接着層の上に下記の組成の塗布液（４）を塗布、乾燥
させ、繊維質多孔性展開層を形成させた。（乾燥後の膜
厚は２８０μｍであった。）塗布液（４） トライトンｘ−１００（ローム・ハース社製）９．１ｇ スチレン−グリシジルメタクリレート 共重合体（９：　Ｉ）　　　　　　　　　２３．０ｇ濾
紙原材料用繊維Ｄ （東洋痘紙社製）　　　　　　　　　　９０．０ｇキシ
レン　　　　　　　　　　　　　　２８０ｇこのように
して塗布した試料を、ｌ−５ｃｍＸ　１．５ｃｍの大き
さに裁断して中心に直径３ｍｍの孔をあけたプラスチッ
クマウント（２，５ｃｍＸ　３．Ｏｃｍ）に封入し分析
素子−１とした。

比較例（１） （１）−（１）　モノクローナル抗テオフィリン抗体の
作成 １−（１）と同様にして得られたマウス腹水０゜８ｍＱ
に更にウシ血清アルブミン２００ｍｇを加えて凍結乾燥
し、多層分析素子に用いた。

（１）−（２）　　アポグルコースオキシダーゼの調製 １−（２）と同様にして得られた抗グルコースオキシダ
ーゼ抗体５ｍｆｆにウシ血清アルブミン２５０ｍｇを加
えて凍結乾燥し多層分析素子に用いた。

（１）　＝（３）　　テオフィリン測定用分析素子の作
成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に、下記の組成の塗布液（５）を塗
布、乾燥させ標識体および発色試薬を含有する非多孔性
層を形成させた。（乾燥後の膜厚は２５μｍであった。

） 塗布液（５） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　４．５ｇトライト
ンＸ−１００（ローム・ハース＆Ｈ）０．５ｇ グルコース（東京化成社製）　　　　　５４０ｍｇ３．
３’、　５．５’−テトラメチルベンジジン（同化化学
研究所製）　　　　　　　　９０ｍｇガントレッツＥＳ
−２２５（ＧＡＦ社製）　　　　　１．６ｇペルオキシ
ダーゼ（ベーリンガ社製） ０００Ｕ ＦＡＤ標識テオフィリン（１００μｇ７ｍｆｌ水溶液）
１２０ｐ（１ １，５Ｍ＜えん酸−燐酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ１．２−ビ
ス（ビニルスルホニル）エタン０ｍｙ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　４６．０ｇ次に、
この層の上に前記（１）−（１）および（１）−（２）
で調製したウシ血清アルブミンを含む抗テオフィリン抗
体及びアポグルコースオキシダーゼを均一に分散した下
記の組成の塗布液（６）を塗布、乾燥させ、非繊維質多
孔性反応層を形成させた（乾燥後の膜厚は１５０μｍで
あった）。

塗布液（６） トライトンＸ４００　　　　　　　　　　０．４ｇ抗テ
オフィリン抗体（凍結乾燥品）　　２００ｍｐ抗グルコ
ースオキシダーゼ抗体含有アポグルコースオキシダーゼ
（凍結乾燥品）　　３８０ｍｇポリビニルピロリドン（
和光紬薬社製）１．８ｇ アビセル（旭化成社製）　　　　　　　１１．０ｇブタ
ノール　　　　　　　　　　　　３４．０ｇさらに、こ
の多孔性反応層の上に下記の組成の塗布液（７）を塗布
、乾燥させ、繊維質多孔性展開層を形成させた。（乾燥
後の膜厚は２００μｍであっＩこ。） 塗布液（７） ）　ライ）　７Ｘ−’１００　　’　　　　　　　　　
　１．８ｇポリビニルピロリドン　　　　　　　　１．
８μ濾紙原材料用繊維Ｄ（東洋濾紙社製） １８．０ｇ ブタノール　　　　　　　　　　　　６８．０ｇこのよ
うにして塗布した試料を、１．５ｃｍＸ　１．５ｃｍの
大きさに裁断して比較例の分析素子−（１）としｔこ。

（１）−（４）　　テオフィリンの測定５．３ｗｔ％ウ
シ血清アルブミンを含有する５ＱｍｌＪ　＜えん酸−燐
酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した５〜
２５μｇ１ｍα濃度のテオフィリン（アルドリッチ社製
）１０μｌを前記１（３）及び（１）−（３）で作成し
た分析素子−■および（１）に滴下し、３７°Ｃで密閉
状態でインキュベーションしながら３０秒ごとに７分間
支持体側から６５０ｎｍの反射濃度の測定を行い、１分
、４分及び７分における夫々の反射濃度（Ｄｒ）　；　
Ｄｒ＋、　Ｄｒ、間及びＤｒ、、　０１７間の濃度差（
△Ｄｒ）　；△１）ｒ（１−ｔ＋及び△ＤｒＬ４−＋、
表−１ 表−１で明かなように、△ＤＩ”（＋−ａｌにおいては
分析素子ｌ及び（１）間には測定結果に大差はないが、
実用的な測定時間４〜７分の測定には判然と差を生じ、
感度に換算すると３倍程度高くなっている。

実施例２〜８ 実施例１と同様の試薬を用い、非多孔性の上下試薬層の
２層積層を繊維質多孔性展開層で被覆した分析素子２〜
８を表−２に示す構成で作成したＬ尚参照の便に分析素
子−１の構成も同じ表示法で記載した。

表−２ （註）ａｐｏ−ＧＯＤ；抗グルコースオキシダーゼ抗体
含有アポグルコースオキシダーゼ、 ａｎｔｉ−Ｔｈｅｏ；抗テオフィリン抗体、ＦＡＤ−Ｔ
ｈｅｏ；ＦＡＤ標識テオフィリン、ＴＭＢＺ；３，３’
　、５．５’−テトラメチルベンジジンこれらの分析素
子を用い実施例１と同様の測定を行った結果、分析素子
−１とほぼ同の程度の結果かえられた。

〔発明の効果〕

少くとも１層よりなる試薬層を設は核層に親水性高分子
をバインダに用いることによって、外部的束縛によって
強いられる測定時間範囲の中に、反応の検出に最適の反
応度を収めることができ、検知濃度を高めることによっ
て検出感度を３倍に上げることができる。

また有機溶媒による酵素、抗体の蒙る障碍を退け、微分
散にも簡便な超音波分散で充分であり、凍結乾燥も不要
となる。従って試薬の活性が安定し再現性もよくなり、
競合反応を利用するには理想に近い多層分析素子及び分
析方法かえられる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分を、該特定成分または該特
   定成分の類縁体のいづれかと標識物質が結合した標識体
   と該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合しう
   る物質との均一系競合反応により分析する分析素子にお
   いて、該分析素子が該特定成分および該標識体の双方に
   特異的に結合しうる物質を含有する親水性高分子非多孔
   性反応層を有することを特徴とする免疫学的多層分析素
   子。
2. （２）前記標識物質が補欠分子族および補酵素からなる
   群より選ばれた物質である請求項１記載の免疫学的多層
   分析素子。
3. （３）前記標識物質が、フラビンアデニンジヌクレオチ
   ドである請求項１または請求項２記載の免疫学的多層分
   析素子。
4. （４）特定成分の分析に請求項１乃至請求項３のいずれ
   かに記載の免疫学的多層分析素子を用いて流体試料溶液
   を５μｌから２０μｌの範囲の量適用する免疫学的分析
   方法。