JPS6250663A - 検知可能な信号が集中する区域を有する多区域分析試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 本発明は、液状試験媒体中の分析対象物の測定に有用な
多区域分析素子に関する。特に、本発明は、分析対象物
の検出可能な結合相手を含み、該液状試験媒体と接触す
ると検知可能な信号を与える多層イムノアッセイ試験具
に関する。

（先行技術の説明） 多区域分析素子又は試験具は、従来から提案されて来て
おり、液状試験媒体中の分析対象物を測定するための、
抗体又は抗原の特定の分析対象物に対する結合能力に依
存する、例えばイムノアッセイ等の結合試験法に応用さ
れてきた。そのような測定法には、分析対象物又はその
抗体の標識体等の標識試薬が、抗原−抗体反応に関与し
てその遊離種と結合種とを形成し、それによりそのよう
な種のうちの一つの標識試薬の量を液状試験媒体中の分
析対象物の量に関係づけることができるようにしたイム
ノアッセイが含まれる。原則として、そのような試験法
は、試験を完全に行うために該遊離種と結合種が分離さ
れなければならないために、不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ）イムノアッセイと呼ばれる。

必要な分離工程を独自に遂行し液状試験媒体を施した後
にさらなる操作を必要としない多区域、特に、多層分析
素子は、今や公知である。−・般に、そのような試験具
は、イムノアッセイを実行するための、そして、一体化
された必要な分離工程を達成するための、必要な試薬を
有する複数の層を具備する。そのような試験具には、さ
らに検出層を具備し、そこから結合又は遊１種中の標識
試薬によって生み出される信号が検知され測定されるも
のが幾つかある。そのような試験具によって提供される
検知可能な信号は、通常、色の変化、蛍光等の光学的な
性質のものである。あるいは、検出は、例えば、電位差
測定又は電流測定の技術を用いた電気化学的測定により
達成することができる。

例えば、そのような多層イムノアッセイ用分析素子は、
欧州特許公Ｍ第９７．９５２号及び西独国特許公開公報
（ＤＥ−Ｏ５）第３３　２９　７２８号に記載されてお
り、そこには、固定化された抗抗原抗体等の結合相手の
固定化体と検知可能な物質によって標識された抗原とを
組み込んである。液状試験媒体をそのような試験具に施
すと、試験媒体からの抗原は、固定化抗体との結合に関
して、試験具に組み込まれた標識抗原と競合する。標識
抗原の遊離種が固定化区域から離れて移動すると、遊離
種からの結合種の分離が起きる。

同様に、欧州特許公報筒５１，１８３号及び６６．６４
８号には、そのような試験具が開示されているが、それ
らにおいては液状試験媒体中の抗原又は抗体の測定が、
抗原（又は抗体）と抗原（又は抗体）の標識体との、固
定化抗体（又は抗原）のような、その結合相手の固定化
体に対する競合的結合に依存している。

米国特許第４，２５８，００１号に記載されているもの
などのような他の多層イムノアッセイ試験具も提案され
ており、それらは多数の有機高分子粒子によって形成さ
れた微粒子の３次元格子から成る１以上の層を具備して
いる。該粒子は、相互に連関した空所を形成し、これに
よって、高分子量分析対象物が中を通って移送されると
されている。必要とされているのではないが、抗原又は
抗体等の相互に作用する組成物を、そのような相互に作
用する組成物が共有結合しうる連結又は結合部位を該粒
子上に設けることにより、粒子上に固定化することがで
きるということが提案されている。

そのような試験具の他の例が、米国特許第４．４４６．
２３２号に記載されており、これは、酵素標識抗体上の
一定数の認識部位に対する分析対象物の結合部及び遊離
種間の競合という原理に基づいている。試験試料中の分
析対象物の測定は、該分析対象物の試験具の一区域での
酵素標識抗体との結合に依存しており、その分析対象物
は次に該試験具の別の区域に入り、そこで分析対象物に
結合した酵素連結抗体の酵素活性が検出される。それら
の区域の一つは、さらに結合し固定化された分析対象物
を含み、それが、試験試料からの分析対象物と、酵素標
識抗体との結合に関して競合、し、試験試料からの分析
対象物に結合しない酵素標識抗体があればそれと結合し
固定化する。

しかしながら、そのような試験具に特有な不都合は、逆
向きの流体移行の結果、下部の検出層内に移行した反応
生成物が、上部の層内に移行して還り、化学的妨害及び
試験反応の低下をもたらすということである。この不都
合を克服するために、反応生成物を局在化するか又は他
の仕方でそのような逆向きの流体移行を防止しようとす
る分析試験具が提案されている。

例えば欧州特許公報第５１，１８３号及び第６６．６４
８号は、親木性高分子量物質からなる検出可能な反応生
成物を捕集するための層を提案している。欧州特許公報
第６６．６４８号は、さらに、検出層内に検出可能な反
応生成物と強い相互作用を有する媒染剤を含有せしめ、
そこに検出可能な反応生成物を捕集することを提案して
いる。そのような媒染剤には、陽イオン性重合体、陰イ
オン性重合体及び第四級塩が含まれる。

同様に、米国特許第４，１４４，３０６号及び４．０４
２，３３５号には、検出可能な極用の媒染剤を包含せし
めた登録層を具備し、検出可能な種をそこに捕集し、そ
れにより該登録層から検出可能な種が拡散し又は移行す
ることを妨げるようにした多層分析素子が開示されてい
る。

そのような試験具の変形例が、米国特許第４．４５９．
３５８号に開示されており、そこには、＠開（ｓｐｒｅ
ａｄｉｎｇ）層、拡散可能な、標識抗体を包含した反応
層、及び、ラテックス粒子等の抗体を非特異的に結合し
、固定化しあるいは「媒染する」ようにした材料を包含
せしめた登録層から成る多層素子が記載されている。液
状試験媒体を試験具に施すと、試験媒体からの分析対象
物が反応層中で標識抗体と会合し、そこで免疫反応によ
る沈降物を生ずる。分析対象物と結合しない標識抗体の
いかなるものも、登録層中に拡散し、そしてそこでそこ
に含まれる媒染剤によって固定化される。

しかしながら、媒染剤の使用は、媒染剤の非特異的結合
の結果、検出可能な反応生成物の生成又は放出に必要な
反応を妨害することがある。そのような妨害は、試験具
の感受性を低下せしめるのみならず、検出及び測定の両
方を信頼のおけないものとすることがある。

登録層内における媒染剤の不都合な点を克服せんとして
、登録層以外の層内に媒染剤を用いて、さもなければ検
出可能な反応生成物を検出不可能とするであろう生成し
た検出可能な反応生成物の登録層又は検出層以外の層内
への移行を防ぐようにした他の分析素子が提案されてい
る。そのような試験具は、米国特許第４，１６６．０９
３号に開示されており、そこには、多層分析素子の放射
線遮断層及び試薬層間に挟んだ種移行防止層が具備され
ている。検出可能種移行防止層は、分析対象物に対して
透過性であり、試薬層内に生成した染料等の、いかなる
検出可能な種であれその有意義な部分が、さらに放射線
遮断層中に移行、することを防止する。そのような検出
可能種移行防止層は、試薬層内に生成した特定の検出可
能部用の媒染剤から成る。しかしながら、そのような防
止層は、依然として、分析対象物の存在によって開始さ
れた反応を妨害し、検出可能種の生成又は放出を妨害又
は実質的に抑制することがあるという媒染剤の欠点を有
する。

多層分析試験具申における逆向きの流体移行という問題
を克服するさらにもう一つの試みが、国際公開第ＷＯ８
４１０２１９３号に開示されており、多孔質の又は微細
孔質の支持部材上に、酵素標識抗分析対象物抗体に結合
した分析対象物から成る免疫複合体を捕集することを特
徴とする色原性支持体イムノアッセイを開示している。

該支持体は、標識成分が支持体材料中の信号発生試薬と
反応して発生する色信号を集中するように機能する０色
信号の集中は、反応生成物が支持体に共有結合する結果
であり、逆向きの流体移行の問題は、単一の層を設ける
ことにより克服される。

しかし、該イムノアッセイは、信号を支持体上に局在化
し集中するためには、幾つかの湿層及び洗浄工程を必要
とする。該イムノアッセイは、色信号生成に必要な反応
が起きる単一層一支持体を設けることにより逆向きの流
体移行を克服するが、依然として、多層分析素子の場合
は必要とされない、長時間の湿層及び洗浄段階が必要で
あるという欠点をなお有する。

したがって、特異的結合試験法に伴う特異的結合反応を
妨害することなく、化学標識基と相互作用性のその検出
試薬間の相互作用による検出可能な反応生成物を集中す
る多区域、又は多層試験具を提供することにより、上記
の不都合を克服することが本発明の目的の一つである。

本発明のもう一つの目的は、多区域又は多層試験具にお
いて、反応生成物がさらに移行を起こさない終点をその
うちに有する特異的結合試験法を提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は、高感度の検知限界を
手供するために、化学基及び相互作用性のその検出試薬
間の相互作用による検出可能な反応生成物によって発生
する信号を増幅することである。

［発明の要約］ 本発明は、分析対象物、標識試薬、固定化試薬及び標識
試薬用の固定化相互作用性検出試薬間の相互作用に基づ
く液状試験媒体からの分析対象物の測定のための多区域
試験具を提供する。

本発明は、その主要な利点を、標識試薬の使用に負って
いるが、この標識試薬は、該試薬と相互作用性の検出試
薬との相互作用の結果と′して検出可能な反応生成物の
形で検知可能な信号を出し、そして、検出区域内に固定
化され得るのである。

従来技術の試験具の場合のように別個で移行可能な検出
可能生成物を生じることがなく、検出可能な反応生成物
の固定化及び集中は、高度に特異的な化学相互作用の結
果である。この試験具は、流体が流れるような接触状態
の、（１）使用されるイムノアッセイ図式に応じて、分
析対象物若しくはその結合類縁体の固定化体、又は分析
対象物の結合相手の固定化体である固定化試薬を包含せ
しめた試薬区域、び（２）標識試薬に対して相互作用性
の検出試薬の固定化体を包含せしめた検出区域から成る
。標識試薬は、検出区域の固定化相互作用性検出試薬と
相互に作用すると検出可能な生成物を生じる検知可能な
化学的性質を有する化学基で標識されている、分析対象
物の結合相手の形態、又は、分析対象物若しくはその結
合類縁体の形態である。

試薬域内の固体化試薬、及び標識試薬は、存在する分析
対象物の量に応じて互いに結合する特異的結合相手を構
成するように選択される。標識試薬が、分析対象物又は
その類縁体の標識体である時は、固定化試薬は、分析対
象物の結合相手の固定化体であり、分析対象物と標識試
薬は、固定化試薬との結合に関して競合することになる
。標識試薬が分析対象物の結合相手の標識体である時は
、固定化試薬は、分析対象物又はその類縁体の固定化体
であり、分析対象物に結合しない標識試薬が固定化試薬
に結合することより固定化されることになる。標識分析
対象物又は標識結合相手のいずれが関係していようとも
、標識試薬の一部は、存在する分析対象物の量に応じて
、固定化試薬と結合することがないか又は結合しないま
まである。

上記の結果得られた、自由に試薬区域の内外に移行する
ことができるままであるか又は移行することができるよ
うになった標識試薬は、次に検出区域に入り、そこで、
検出区域の固定化相互作用性検出試薬と相互に作用し、
それにより、検出可能な反応生成物を生じる。好ましく
は、得られた反応生成物は、固定化され、それにより、
検出区域から試薬区域内に移行して上がることが防止さ
れる。反応生成物は、固定化相互作用性検出試薬の残基
を構成要素とすることにより、又は、放出されているが
不溶性の生成物となることにより、それ自身の性質で固
定化されることができ、あるいは１反応生成物が可溶体
として生成する場合は、反応生成物に対して結合親和力
を有する固定化試薬によって固定化することができる。

反応生成物は、検出区域において、測定されかつ試験媒
体中の分析対象物の量に関係づけられる検知可能な信号
を提供する。

［好ましい態様の説明］ 本発明の多区域試験具は、区域化された又は層化された
試験片又は試験具における特異的結合試験法を提供する
。この試験法は、試験具に施されるか又は試験具内に包
含された標識試薬を、固定化試薬に結合又は固定化する
ことによって試薬区域に保持されるものと、検出区域に
自由に移行するものとに分けることに依存している。検
出区域に移行する標識試薬は、自由に固定化相互作用性
検出試薬と相互作用を起こしその結果検出区域内に検出
可能な反応生成物を生じる。本発明は、検出区域に生じ
る検出可能な反応生成物を集中せしめる有利な手段を提
供し、それにより発生した信号を増幅する。

以下の記載を簡単にするために、今や１本発明の試験具
は、主として成層構造から成るものとして記載する。他
の種類の区域が同様の結果を達成することができるとい
うことは理解されるであろう、また、標識試薬は、分析
対象物の結合相手の標識体であるように選択され、固定
化試薬は分析対象物の固定化体であるように選択される
（固定化分析対象物は、当該技術において理解されるよ
うに、分析対象物の類縁体の固定化体によって代替する
ことが可能である）。

特に、本発明の試験具は、少くとも一つの試薬層と検出
層から成り、以下により詳細に説明するように、さらに
第２の試薬層を具備することができる。試薬層には、試
験媒体と接触して可溶化され得ない又は他の仕方で試薬
層から除去されることの不可能な分析対象物の固体化体
から成る固定化試薬を包含せしめである。検出層には、
標識試薬に対して相互作用性の検出試薬の固定化体を包
含せしめてあり、この相互作用性検出試薬は、同様に、
可溶化されたり又は他の仕方で検出層から除去されるこ
とが不可能である。第２の試薬層が用いられる場合は、
第１の試薬層には、試験媒体が施された時に試験媒体に
よって可溶化される標識試薬を包含せしめてあり、第２
の試薬層には、分析対象物の固定化体を包含せしめであ
る。

本発明の教示によると、試験具を構成する層は、互いに
流体接触（ｆｌｕｉｄ　ｃｏｎｔａｃｔ）　（流体が流
通するような接触状態）下にあり、これにより。

互いに関連している試験具の層は、流体をこれらの層内
及び層間に拡散させることができるようになることは注
目されねばならない。そのような流体接触は、試験具の
層間を液体試料、例えば、抗原、ハプテン及び／又は抗
体等の少くとも幾つかの成分が通過できるようにするが
、流体が流通するような接触状態の層間の接触界面に沿
って均一であることが好ましい、したがって、液状試験
媒体と標識試薬を試薬層に施すと、液状試験媒体と標識
試薬は、試薬層内に拡散浸透し、試薬層を通って、検出
層に拡散浸透することができる。

第１及び第２の試薬層が設けられている場合は、液状試
験媒体は、同様に、第１の試薬層内に拡散浸透しそれを
通り抜けることができ、それにより、そこに包含されて
いる標識試薬が可溶化され、液状試験媒体と標識試薬は
さらに第２の試薬層内に拡散浸透し、そして検出層内に
拡散浸透する。

一度液状試験媒体及び標識試薬が上記のように試薬層に
施され試薬層に浸透すると、検出対象である分析対象物
が液状試験媒体中に存在する場合には、存在する分析対
象物の実質的に全てが標識試薬と直接流体接触し特異的
に結合する。試薬層と検出層間の流動性の結果、生じた
分析対象物−（標識試薬）複合体は、試薬層内を、試薬
層外へ、そして検出層内へと、自由に移行することがで
きる。以下により詳細に説明するように、標識試薬は分
析対象物の標識試薬への結合用に唯一の使用可能な結合
部位を提供することが好ましい。

その結果、一度そのような結合部位が分析対象物によっ
て占められると、分析対象物−（標識試薬）複合体は、
試薬層に包含されている固定化分析対象物によって固定
化されることなく自由に。

試薬層内を、そして試薬層外へ移行することができる。

同様に、第１及び第２の試薬層が設けられている場合は
、液状試験媒体を第１の試薬層に施すと、標識試薬、が
可溶化され、存在する分析対象物の実質上全てが、標識
試薬と直接流体接触し特異的に結合する。生じた分析対
象物−（標識試薬）複合体は、第１の試薬層内及び第１
の試薬層外へ移行し、更に、第２の試薬層を通って、そ
して検出層内へ移行することができる。試験媒体からの
分析対象物と結合しない標識試薬のいかなるものも、試
薬層内の固定化分析対象物に結合し固定化されるか、又
は、第１及び第２の試薬層が設けられている場合は、第
２の試薬層内で固定化される。

一度分析対象物−（標識試薬）複合体が検出層内に移行
すると、複合体の標識試薬は、検出層内の固定化相互作
用性検出試薬と相互に作用し。

それにより、両者間の相互作用の結果として反応生成物
を生じる。以下により詳細に説明するように、反応生成
物は、標識試薬の性質により、それ自体で、検知可能な
信号を出すことができ、あるいは、検知可能な信号を生
じるためにさらに他の物質との相互作用を生ずることが
できる。本発明の好ましい実施例では、生じた反応生成
物は。

検出層からの逆向きの移行を防止するために検出層内に
固定化されるということは注目されねばならない。従っ
て、検出層内への反応生成物の局在化、好ましくは固定
化により、試験媒体中の分析対象物の量と精確に相関づ
けられる検出可能な反応生成物の正確で感度のよい検出
測定が可能となる。

（標識試薬及び検出システム） 本発明の標識試薬は、検知可能な化学的若しくは相互作
用的性質を有する化学基によって標識された、測定中の
分析対象物の結合相手、又はその分析対象物若しくはそ
の結合類縁体から成る。

化学基は、適当な相互作用性検出試薬と相互に作用する
前には、検出可能な生成物を生じることなく、また、他
の仕方で検知可能な信号を出すことがないということは
注目されねばならない、従って、標識試薬の化学基及び
相互作用性検出試薬の性質は、必然的に、検知可能な信
号を出す反応生成物を生じる相互作用の性質に依存し、
その検知可能な信号が試験媒体中の分析対象物の量に関
係づけられるのである。

本発明の教示によれば、検出層には、液状の試薬媒体若
しくは他の液状試薬と接触して可溶化するか又は他の仕
方で検出層から除去されることの不可能な、標識試薬に
対して相互作用性の検出試薬の固定化体を包含せしめで
ある。検出層内の相互作用性検出試薬の固定化によって
、試薬層内に固定化された未反応の標識試薬と相互作用
を起こす結果となる相互作用性検出試薬の試薬層内への
移行が防止される。そのような相互作用は、さもなけれ
ば、干渉性及び非特異性信号を生じるであろう、一度、
上記のように、適当な結合反応が開始したら、検出層内
に移行する分析対象物−（標識試薬）複合体は、検出層
内に固定化された相互作用性検出試薬と直接流体接触す
る。従って、標識試薬の化学基と相互作用性検出試薬間
の完全な相互作用は検出層内においてのみ可能である。

なお、化学基と相互作用性検出試薬間の相互作用は、標
識試薬と相互作用性検出試薬の性質に応じて、それ自体
で検知可能な信号を提供するか、あるいは、検知可能な
信号を提供するのにもう一つの物質又は他の物質をさら
に要する反応生成物の生成をもたらす６反応生成物は、
標識試薬と相互作用性検出試薬の固定化の結果、それ自
体で固定化されるか、あるいは、反応生成物に対して結
合親和力を有する検出層内の固定化結合剤に固定化する
ことができる可溶体として生成せしめることも可能であ
るということは注目されねばならない。そのような固定
化結合剤は、前記のように反応生成物がそれ自体で検知
可能な信号を提供しない場合は、反応生成物と相互に作
用した時に検知可能な信号を生じるのに必要な固定化物
質であってもよい。

一般に、検知可能な化学的性質を有する化学基は、上記
のように、それ自体の反応性に基づいて検知されるか、
又は、検知可能な信号を提供する他の物質との相互作用
に基づいて検知される化学基である。そのような化学基
はイムノアッセイの分野で充分に開発されており、イム
ノアッセイで用いられるそのような基の大部分が、本発
明の標識試薬に応用可能である。

例えば代表的な基には、酵素的に活性な基、例えば、酵
素（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　　（１９７６）　２２　
：１２３２、米国再発行特許第３１，００６号及び英国
特許第２，０１９；３０８号参照）、酵素基質（英国特
許明細書簡１，５４８，７４１号参照）、酵素補欠分子
団、補酵素（米国特許第４．１２０，７９７号及び第４
，２３８，５６５号参照）、酵素補助因子、酵素阻害剤
及び活性化因子、化学発光体類、化学触媒、金属触媒、
酵素チャネリングのメンバー（ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　
ｅｎｚｙｍｅｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）　、蛍光団−消化
剤、又はエネルギー伝達対（米国特許第３，９９６，３
４５号：第４．１７４，３８４号；第４，１９９，５５
９号、及び第４，２３３，４０２号参照）、並びに、ビ
オチン、キレート化剤、又はハプテン等の特異的に結合
可能な配位子等がある０例えば補助因子で標識された種
は、標識がそれにとっての補助因子である酵素及びその
酵素の一つの基質又は複数の基質を添加することにより
検出することができる。また、ハプテン、又は他の特異
的に結合可能な配位子（例えば、ビオチン）で標識され
た種は、そのハプテンの抗体、又は検出可能な分子を付
し即ち標識化した配位子と結合するタンパク質（例えば
、アビジン）を、添加することによって検出することが
できる。そのような検出可能な分子は、測定可能な物理
的性質（例えば、蛍光性又は吸光性（ａｂｓｏｒｂａｎ
ｃｅ）　）を有する何らかの分子であることができる。

そのような代表的な化学基は、互いに相互作用性を有し
、それにより、本発明の相互作用性検出試薬としてそれ
を用いることも可能となるということは注目されねばな
らない０例えば、標識試薬の標識がウンベリフェロンガ
ラクトース等の酵素基質である場合は、固定化検出試薬
は、β−ガラクトシダーゼ等の上記基質を加水分解する
ことができる酵素である。同様に、標識がニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド等の酵素補助因子である場合
は、固定化検出試薬は乳酸塩デヒドロゲナーゼ等の酵素
である。他の代表的な基には、フラビンアデニンジヌク
レオチド等の酵素補欠分子団、及びアポグルコースオキ
シダーゼ等のアポ酵素；並びに、メトトレキセート等の
酵素阻害剤、及びジヒドロフオレートリダクターゼ等の
酵素阻害剤により阻害される酵素がある。また、ハプテ
ン又は他の特異的に結合可能な配位子（例えば、ビオチ
ン）で標識された種は、該ハプテンに対する抗体、又は
、検出可能な分子を付し即ち、標識化した該配位子と結
合するタンパク質（例えば、アビジン）で検出すること
ができる。そのような検出可能な分子は、測定可能な物
性（例えば、蛍光性又は吸光性）を有する何らかの分子
であることができる。

さらに、標識試薬中の検知可能な化学基は、内部的に消
光された多数の蛍光体が付着せしめられているポリマー
残基であってもよい、検出層内の固定化相互作用性検出
試薬は、該蛍光体−ポリマー残基と相互に作用して、消
光されていない蛍光体分子を分離し放出する酵素である
ことができる。

上記のように、標識試薬と相互作用性検出試薬間の相互
作用によって生じる反応生成物は、（１）それ自体で検
知可能な信号を提供する−か、又は、（２）検知可能な
信号を提供するのに、さらに他の物質との相互作用を必
要とすることができる０例えば、ＦＡＤ標識抗体と固定
化アポ酵素検出試薬の相互作用は、活性酵素を生じ、こ
れがグルコースと反応して過酸化水素を生じる。後者の
生成物は、ペルオキシダーゼとテトラメチルベンジジン
等の色原体を用いる連結酵素反応（ｃｏｕｐｌｅｄ　ｅ
ｎｚｙｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）中で測定することがで
きる。

また、生じる反応生成物は、標識試薬及び相互作用性検
出試薬の性質に応じて、不溶体であってもよく可溶体で
あってもよい、いずれの場合にも、検知可能な信号は、
それ自体のものであってもよく、また、上記のごとくさ
らに他の物質との相互作用を必要としてもよい、しかし
１反応生成物が可溶体として生じる場合は、反応生成物
が検出層から試薬層内へ逆移行するのを防止するために
、検出層内に反応生成物に対して結合親和力を有する固
定化結合剤を包含せしめることが好ましい。例えば、生
じた酵素生成物が、陰イオン性発色団である場合には、
該生成物は、陰イ尤ン交換樹脂をマトリックス中に包含
せしめることにより固定化せしめることができる。ある
いはまた、基質は、発色団に付着せしめられ酵素標識と
の反応によって露出せめしられる誘導合成された糖類を
含んでいてもよい。対応する固定化レクチンをマトリッ
クス内に、あるいは、隣接する結合層温に包含せしめる
と、反応生成物のそこへの結合固定化がもたらされる。

しかし、ある場合には、標識試薬と相互作用性検出試薬
間の相互作用によって不溶性の反応生成物の生成がもた
らされることが好ましいことがある０例えば、酵素、ア
ルカリフォスファターゼに対するナフトールＡｓ−Ｂ１
リン酸塩、又は、酵素β−ガラクトシダーゼに対するナ
フトールＡｓ−Ｂ１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の
、不溶性生成物を生じる多くの酵素基質が使用可能であ
る。

検知可能な信号は、反射、透過又は蛍光測光法等によっ
て最終的な光学的信号を検知するための好適な装置を備
えた区域に、該試験具を通すことにより測定することが
好ましい。そのような試験具においては、例えば、試験
具エレメントの上に及び／又はその中に光等のエネルギ
ー源が向けられる。光は、次に、反射性支持体が使用さ
れている場合は、該エレメントから反射して検出手段に
還り、放射線透過性即ち透明な支持体が使用されている
透過光検出の場合には、該エレメントを通過して検出器
に達する。所望ならば、蛍光分光測光又はルミネセンス
測定の従来技術を用いることもできる。電気活性物質が
、標識として使用される技術においては、電流（ａ■ｐ
ｏ■ｅｔｒｉｃ）又は電位差検出装置を用いて測定を達
成することができる。

（多層分析エレメント） さて１図面を参照すると、第１１ｆｆｌ（ＦＩＧ。

１）は、互いに流体接触している少くとも一つの試薬層
と検出層から成る本発明による多層試験具の一実施態様
を示したものである。上記のように、試薬層には、分析
対象物の固定化体（「トＡｎＪで示す）が包含せしめら
れており、検出層には、標識試薬の化学基標識に対する
相互作用性検出試薬の固定化体（「ト試薬」で示す）が
包含せしめられている。

分析対象物を含有する液状試験媒体と標識試薬の両方を
試薬層に施すと、試験媒体と標識試薬は試薬層中に拡散
し、それにより、試薬層内の固定化分析対象物と流体接
触せしめられる。この実施態様においては、標識試薬と
試験媒体は、独立に又は混合物として一緒に施すことが
できるが、固定化分析対象物との結合に関して標識試薬
と試験媒体からの分析対象物との間の等しい競合を与え
るので後者が好ましい、したがって、液状試験媒体中に
存在する分析対象物のいかなるものも、標識試薬の分析
対象物に対する結合相手と結合し、それにより生じた複
合体は自由に、試薬層内を移行し、また試薬層外そして
検出層内へと移行することができる。試験媒体からの分
析対象物と結合しない過剰の標識試薬のいかなるものも
、標識試薬の分析対象物の結合相手により試薬層中の固
定化分析対象物と結合し、検出層内への移行が防止され
る。

あるいはまた、当該技術において公知であるように、標
識試薬は、液状試験媒体とともに添加することによるに
せよ、以下により詳細に説明するように別個の試薬層中
に包含せしめることによるにせよ、別個の成分として加
えるよりもむしろ。

試薬層内の固定化試薬にあらかじめ結合させておくこと
ができる。結合は、可逆的であるので、分析対象物の存
在は、そのような結合のあるものを置き換えて標識試薬
の検知可能な量を放出させる。

本発明の教示によれば、分析対象物に対する結合相手は
、分析対象物に対する唯一の特異的結合部位を有するこ
とが好ましい。そのような結合相手は１分析対象物に対
して調製され、モノクローナル抗体から精製、又は誘導
された、抗体の一価のフラグメントであることが好まし
い。

そのような−価の抗体フラグメントは、パパイン等のタ
ンパク質分解酵素を用いて正常な全ＩｇＧ抗体を消化し
て、当該技術において一般にＦａｂフラグメントと呼ば
れている抗体フラグメントを製造することにより、調製
することができる。あるいはまた、そのようなモノクロ
ーナル抗体フラグメントは、ペプシン等のタンパク質分
解酵素で正常な全ＩｇＧ抗体を消化し、次に化学的に還
元して当該技術において一般にＦａｂ’フラグメントと
呼ばれている抗体フラグメントを製造することによって
も調製することができる。

しかしながら、他の結合相手も使用することができるが
、勿論、測定される分析対象物に唯一の特異的で使用可
能な結合又は認識部位を有するものが好ましい、そのよ
うな他の結合相手には、全抗体ハイブリッド、レセプタ
ー分子等が含まれる０例えば、幾つかの操作により得ら
れる全抗体ハイブリッドを用いることができる。そのよ
うなハイブリッドは、分泌性骨髄腫（ミエローマ）細胞
と問題の抗体を分泌する牌臓細胞との交雑により製造さ
れるモノクローナル細胞系統から生体内において調製す
ることができる。得られた細胞系統は、問題の特異性を
有する一つの結合サブユニットと骨髄腫細胞系統によっ
て規定される特異性を有する第二のサブユニットから成
るハイブリッド分子を自然に製造することができる。そ
のような抗体は、当該技術において知られている通常の
タンパク質精製技術によって、最初の骨髄腫抗体又は牌
臓細胞の同種の二量体から分離することができる。また
、ハイブリッドは、尿素（８モル濃度）とジチオトレイ
トール等の還元剤の添加等による適当な変性条件下、抗
分析対象物抗体を第２の抗体と共に混合し１次に変性因
子を除去して抗体ハイブリッドの再構成を可能ならしめ
ることにより化学的に形成することができる。従って、
再構成された試料の一部は、該第２の担体抗体用の結合
部位を有するハイブリッドを含有し、これをさらに、当
該技術において知られている通常のタンパク質精製技術
により精製することができる。

したがって、一度試験媒体からの分析対象物が標識試薬
のその一価の結合相手、例えば、分析対象物に対する抗
体の一価の抗体フラグメント、と結合すると、標識試薬
上の固定化分析対象物に対する結合部位が、使用不能と
なる結果、試薬層中の固定化分析対象物による得られた
複合体の非特異的固定化が防止される０分析対象物−（
標識試薬）複合体が検出層内へ移行すると、標識試薬は
、固定化相互作用性検出試薬と相互に作用する０分析対
象物−（標識試薬）複合体と固定化試薬の相互作用によ
り１反応生成物が検出層に集中又は局在化せしめられ、
それにより生じる信号が目視により又は適当な器具を用
いて検知測定される。

以下により詳細に説明するように、反射層及び放射阻止
剤の場合を除き、本発明の種々の区域又は層及び支持体
は、大部分の場合放射線透過性である。そのような区域
又は層及び支持体は、可視光、蛍光又はルミネセンス放
射、放射能性放射線等を効果的に通過させる。特定の放
射線透過性材料は、該材料が包含せしめられるべき要素
とともに用いるために選択された特定の放射線に依って
選択される。したがって、第１図に示した試験具の検出
層内での検知可能な信号の生成により、検出層に向けら
れるか又は試薬層に向けられた適当な器具を用いて信号
を検知することが可能となる。試薬層内の標識試薬は、
検出層内の相互作用性検出試薬とのいかなる相互作用も
起こさないために検知可能な信号を示すことがないので
、試薬層からそして試薬層を通して、検出層内に生じた
検知可能な信号を検知する際に、試薬層からの妨害信号
がないということに注目しなければならない。

反応生成物によって発生した信号の試薬層からの又は検
出層からの検知は、例えば分光光度計、反射率計、蛍光
計、又は発光光度計（Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）等の適
当な機器を用いて達成することができる。例えば、検知
が蛍光の吸光度に基づいている時は、そのような機器か
らのエネルギー源は、試薬層に、あるいはそれを通過す
るように向けられるか、又は検出層にあるいはそれを通
過するように向けられる。他方、検出がルミネセンスに
基づく場合は、エネルギー源の必要なしにそのようなル
ミネセンスを検知する適当な機器が利用される。

さて、図面の第２図を参照すると、第１図の試験具と同
様の試験具が示しである。この態様においては、試験具
はさらに第１の試薬層と第２の試薬層間に位置せしめら
れた第２の試薬層を具備している。この追加の試薬層に
よって、標識試薬の試験媒体可溶体をその中に包含せし
めることが可能になり、このため、第１図に示された試
験具の場合等のように、液状試験媒体と標識試薬を、試
験具に施す前にあらかじめ混合したり、それぞれ独立に
施したりする必要がなくなる。特に、第１の試薬層には
、試験媒体可溶性の標識試薬（「標識試薬」で示す）を
包含せしめてあり、これは、該層内に拡散する試験媒体
と流体接触すると可溶化される。第２の試薬層には、分
析対象物の固定化体（ｒ）−ＡｎＪで示す）を包含せし
めてあり、そして、検出層には、上記のように相互作用
性検出試薬の固定化体（「ト試薬」で示す）を包含せし
めである。

液状試験媒体を第１の試薬層に施すと、液状試験媒体は
第１の試薬層内に拡散し試験媒体からの分析対象物のい
かなるものをもその中の標識試薬と直接流体接触させ、
一方、同時に、標識試薬を可溶化する。かくして、試験
媒体からのいかなる分析対象物も、標識試薬の結合相手
と結合し、それにより生じた分析対象物−（標識試薬）
複合体が、第１の試薬層内を移行し、また第１の試薬層
外、そして第２の試薬層内へと移行する。第１の試薬層
内の未結合の標識試薬即ち過剰の標識試薬のいかなるも
のも、また、第１の試薬層内を移行し、また第１の試薬
層外、そして第２の試薬層内へと移行するであろうとい
うことは注目され粋ばならない、標識試薬の分析対象物
に対する１価の結合相手の結合部位は、試験媒体からの
分析対象物との結合によりふさがっているので１分析対
象物−（標識試薬）複合体は、固定化されることなく第
２の試薬層内を移行して第２の試薬層外、更に検出層内
へと移行することができる。一度、検出層内に入ると、
標識試薬は、そこに包含せしめられた固定化相互作用性
検出試薬と相互に作用し、上記のように反応生成物を生
じる。しかし、第２の試薬層内のいかなる未結合標識試
薬も第２の試薬層内の固定化分析対象物に対して使用可
能な結合部位を有しているので、該標識試薬は、それに
結合して固定化されさらに検出層内に移行することを妨
げられる。検出層内に反応生成物によって生じた信号は
、次に、上記のように、検知され、測定され、試験媒体
からの分析対象物の量に関係づけられる。

本発明の多層試験具の種々の層は、自身が支持体であっ
てもよいが、そのような層を支持部材上にコーティング
するか、さもなければその上に位置せしめることが好ま
しい。支持部材は、光又は他のエネルギーに対して不透
明、反射性、又は透明であることができる。様々な層に
対して選択される支持部材は、意図された信号検知の態
様と両立可能なものであろう０例えば、試験具の化学反
応により、気体検知電極によって検出される気体状生成
物が発生する場合は、支持体は、そのような電極と流体
接触する液体浸透性の層である。好ましい支持部材の一
つは、約２００ｎｍ〜約９００ｎｍの間の領域内の波長
の電磁放射線を通すことの可能な憑物な支持体材料であ
る。支持体は、勿論、２００〜９００ｎｍの全領域にわ
たって透過性である必要はないが、分析結果の支持体越
しの蛍光測定による検出にとっては、支持体はより広い
領域にわたって透過性であること、あるいは、検出用に
用いられる蛍光物質の励起スペクトル及び発光スペクル
で透過性であることが望ましい。また、狭い波長帯の広
がりで透過性で、透過率を隣接する波長に縮小した支持
体を有することが望ましい、このことは、例えば、支持
体に適当な吸収特性を有する１以上の着色剤を含浸せし
めるか又は被覆することによって達成することができる
。

一般に、検知可能な信号が生じると、信号は、反射、透
過、蛍光又はルミネセンス分光測光法用の適当な機器で
測定する。従って、適切な支持部材の選択は、検出の方
法、すなわち、透過法又は反射法によって決まる。

放射線透過性又透明な支持部材は、光等のエネルギーの
ビームがそこを通過することを可能にする。該エネルギ
ーのビームは、次に放射線遮蔽層等から反射して、機器
の検知用構成部分に還る。

二酸化チタン、硫酸バリウム又は酸化亜鉛等の反射性顔
料をこの目的に使用することができる。

反射率や他の性質を高めるために、プラッシュポリマー
を、独立に又は反射性顔料を包含せしめて、用いること
もできる。そのような放射線遮蔽層及び遮蔽剤は、当該
技術において公知であり、米国特許第４，０４２，３３
５号及び第４．２５５，３８４号に記載のものが含まれ
る。

不透明な又は反射性の支持体が利用される場合は、エネ
ルギーのビームは、試験具の種々な層を通過して反射性
の層によって反射し、機器の検知用構成部分に至るよう
に方向づけられる。

例えば、第３図（ＦＩＧ、３）には、第１及び第２の試
薬層と、検出層とを支持部材上に取り付けるか又は他の
仕方で位置せしめた多層試験具を示しである。第１の試
薬層には、測定される分析対象物に対して結合親和力を
有し、かつあらかじめ酵素で標識した。即ち、検知可能
な化学特性を有する。上記のような試験媒体に可溶なモ
ノクローナル抗体の一価の抗体フラグメント（ｒＦａｂ
−酵素」で示す）を包含せしめである。第２の試薬層に
は、上記のように、試験媒体からの分析対象物と結合し
ていないいかなる標識試薬とも結合してそれを固定化す
る分析対象物の固定化体（「トＡｎＪで示す）を包含せ
しめである。検出層は、該酵素の基質の固定化体（「ト
基質」で示す）を包含せしめてあり、分析対象物−（標
識試薬）複合体は固定化基質と相互作用を起こし、それ
により反応生成物を生じる。前記のように、反応生成物
は検知可能な種として生成せしめることができるが、検
知可能な信号を提供するのに指示薬等の追加の物質との
相互作用をさらに要するものとして生成せしめることも
できる。

後者の場合、そのような指示薬の固定化体を包含せしめ
て、それにより生じた信号を、検出層内に局在化させる
ことが好ましい。

本発明の多層試験具とともに使用されている支持部材は
、反射性即ち放射線−不透明であるか、又は、透明即ち
放射線−透過性であってもよいということは注目されね
ばならない０例えば、反射性支持部材が使用されている
場合、所望の酵素−基質反応を測定するには、エネルギ
ーのビームを第１及び第２の試薬層並びに検出層をそれ
ぞれ通過するように方向づけ、そのビームは次に反射性
の支持部材により反射して機器の検出手段に還ってくる
０種々の層を通過し、支持部材によって反射するビーム
の性質は、検出層内の検知可能な反応生成物の量により
影響され、ビームにおける検知可能な変化が試験媒体中
の分析対象物の量に関係づけられる。

逆に、エネルギー源が通過できる放射線−透過性の、即
ち、透明な支持部材は、該ビームが放射線−遮蔽層又は
試薬等から反射し機器の検知用構成部分に還る。従って
、そのような透明な支持部材が本発明の多層試験具とと
もに使用されている場合は、何よりもまず、そのような
放射線遮蔽層又は遮蔽剤を試験具に包含せしめること、
好ましくは、遮蔽層を第２の試薬層と検出層の間に、又
は、遮蔽剤を第２の試薬層に包含せしめることが必要で
ある。そのような試験具においては、所望の酵素−基質
反応を測定するために、エネルギー源が透明な支持部材
を通過して検出層内に至るように向けられ、それにより
エネルギー源は放射線遮蔽層又は遮蔽剤により反射され
て検出層及び支持部材を通って還り１機器の検知手段に
至る。透明な支持部材と放射線−遮蔽層又は遮蔽剤を有
するそのような試験具の使用は、液状試験媒体に、該媒
体が全血である場合の赤血球等の、着色物質が含まれる
場合に特に望ましく、そのような場合、放射線−遮蔽物
質又は遮蔽層は、炉別され検出層より上の層にとどまる
赤血球の呈色による干渉を防止する。

本発明の多層分析試験具の種々の層は、上記の層及び配
置に限定されるものではないことは注目すべきである。

多層試験具と共に用い、そのような試験具の性能を高め
及び／又は調節する追加の層は、開示されており当該技
術において公知である０例えば、第１の試薬層のすぐ上
にそれに隣接して位置せしめられる展開（ｓｐｒｅａｄ
ｉｎｇ）区域又は層を具備せしめてよい、展着層は、施
した液状試験試料を測定し、下にある第１の試薬層に等
しく分布せしめる。そのような展着区域又は層は、当該
技術において公知であり、米国特許第３．９９２，１５
８号及び第４，４２７，６３２号に記載されているもの
等がある。

試験具は、また１種々の層の間に、接着性の又は下塗り
の層として機能して１層間の接着を容易にし、さらに、
層の固体支持部材への接着を容易にする中間区域又は層
を具備することができる。

中間の区域又は層は、例えば１分析対象物の中のめるも
のの検出をさまたげる妨害物質を除くための試薬を含有
するものを用いてもよく、あるいはまた、生成物検出時
の妨害を防ぐために試験具の区域又は層を隠蔽する放射
線遮蔽区域又は層であってもよい。全血中の赤血球など
の試験試料中にある種々の妨害物質の存在を隠蔽するそ
のような放射線遮蔽層を用いることもできる。

多層試験具に包含せしめられている種々の試薬が、その
種々の層を通って拡散する速度を調節するタイミング区
域又は層を設けることが好ましい時もある。そのような
タイミング区域又は層は、試験具申の試薬の時期尚早の
相互作用を防ぐことにより、培養時間及び反応連鎖を調
節し、あるいは、試験具の製造を容易にするために、試
験具申に包含せしめられる。

本発明の試験具は、試薬区域、検出区域、及び同様のも
のを、特にクロマトグラフィー分析に適合した配置に組
み立てた多区域試験具であってもよい、そのような試験
具は、液状試験媒体中に浸漬される吸収性区域を具備し
、その場合、該試験媒体は上向きに拡散して種々の区域
に入る。

その様な多区域試験具の区域は、液状試験媒体中に浸漬
されるか又は短時間浸漬されるのに適合したプラスチッ
ク性の支持部材上に取り付けられた試薬パッドの形をし
ている０区域を形成する試薬パッドは、支持部材上に端
部から端部へという縦の関係で位置せしめられ、それら
の端部は互いに流体接触（流体が流れるような接触状態
）下にある。特に１．このような試薬パッドは、それぞ
れをその上に位置せしめた、最下層の液状試験媒体吸収
性パッド又は区域、第１及び第２の試薬パッド又は区域
と、第２の試薬区域上に位置せしめた検出パッド又は区
域を具備する。

上記の試薬及び検出区域には、既に説明した多層試験具
の種々の試薬を包含せしめてあり、それらの機能と同様
の機能を遂行することは注目すべきである。しかし、こ
の態様においては、液状試験媒体の試料を試験具に施す
代わりに、多区域試験具の最下層の吸収性パッドが液状
試験媒体中に浸漬される。このようにし、吸収性パッド
は第１の試薬区域、第２の試薬区域及び検出区域にそれ
ぞれ試験媒体を吸収し拡散せしめる燈芯どして機能する
。米国特許第４．３０１，１３９号及び第４．３６１，
５３７号に記載され、展開液（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ　ｆ
ｌｕｉｄ）を使用する配置の試験具も、本発明に適合さ
せることができる。上記のように、第１の試薬区域に拡
散する試験媒体からの分析対象物は、そこに包含せしめ
られた標識試薬に結合し、それにより形成された複合体
は移行を続けて、第２の試薬層を通って、検出層中に至
り、そこで、分析対象物−（標識試薬）複合体が該層中
に固定化されている相互作用性検出試薬と相互に作用し
て、それにより反応生成物を生じ、これがさらに検出測
定される。同様に、試験媒体からの分析対象物に結合し
ていない第１の試薬区域中の標識試薬はいずれも、第２
の試薬層中に移行し、そこで、そこに包含せしめられた
分析対象物の固定化体により固定化される。

本発明の教示によれば、本明細書中に説明された種々の
層は、液状試料の少くとも幾つかの成分、例えば抗原、
ハプテン及び／又は抗体に対して透過性の多孔性マトリ
ックスからなることが好ましいが、そのような透過性は
１通常、多孔性、膨潤能又はその他の特性により生じる
ものである。マトリックス材としては、セルロース、紙
、羊毛、フェルト、織物等の多種の多孔性、繊維性材料
等をあげることができ、天然又は合成の材料のいずれで
もよい、そのような材料は、例えば、米国特許第３，８
０２，８４２号、第３．８０９，６０５号、第３，８９
７，２１４号及び第３，９８７，２１４号に記載されて
いる。

多孔性であるが非繊維性である他の材料としては、米国
特許第３，５５２，９２９号において言及されているも
の等のような微孔性ポリマー等があげられる。

本発明の多層試験具の種々の層のマトリックス形成材料
は、ゼラチン、アガロース等の浸透性の材料であること
が好ましい、そのような材料は、紙又は織物等の繊維性
で多孔性の材料の場合そうであるような毛管流によるよ
りも、むしろ拡散によって液体を通過せめる。上に説明
した多孔性で繊維性の材料を用いることは可能であるが
、ゼラチン、アガロース等が、光又は他の電磁放射線を
通過せしめる能力のみならず、液体に対する均一な浸透
性の故に、特に好ましい０分析される液状試験媒体がわ
かれば、当業者には、適切な材料の選択は容易に理解で
きる。

本発明の試験具申の分析対象物の固定化のために当該技
術において公知の種々の方法を用いることができ、ある
いは、試験具中への固定化を容易にするために該分析対
象物の誘導体又は適当な類縁体を調製することができる
。共有結合によって分析対象物又はその類縁体を固定化
するのが好ましいが、イオン交換又は吸着等の非共有的
会合を利用する他の手段も使用することができる０分析
対象物の固定化は、例えば、紙のセルロース等の試験具
の担体マトリックス中に、あるいは、薄膜状のゼラチン
又はアガロース中に直接包含せしめることにより達成す
ることができる。あるいはまた、分析対象物類縁体は、
ポリマー担体に結合せしめ、それを次に試験具のマトリ
ックス中に包含せしめることが可能であるが、該ポリマ
ーは結合用及び検出用の居間での有意な拡散を防止する
に足る大きさである。例えばゼラチンにおいては、分子
量ｉｏ、ｏｏｏより大きなポリマーが示すゼラチンマト
リックスへの拡散は無視することができる。同様に、ア
ガロースにおいては、分子１２００万以上のポリマーは
、マトリックス中に拡散することを抑制される０分析対
象物は、また、ポリスチレンマイクロビーズ等の非常に
小さい粒子に直接又はポリマー骨格を通じて結合せしめ
、これを次に試験具のマトリックス内に包含せしめるこ
ともできる。そのような粒子は、ある粒径の範囲で容易
に入手可能であり、ポリスチレン、微品質セルロース、
架橋デキストラン及び架橋アガロース、イオン交換樹脂
等がある。それらの物質を担体上に結合するのに、広範
囲の化学技術を用いることができる。例えば、水溶性カ
ルボジイミドを用いて遊離カルボキシル基を活性化し、
次に種々のアミン化合物を始めとする求核試薬と反応さ
せることができる；アミド残基又はビーズをヒドラジン
との反応によりヒドラジドに変換し、これをさらにグル
タルアルデヒド、１゜５−ジフルオロニトロベンゼン、
４，４′−ジフルオロ−３，３′−ジニトロフェニルス
ルホン、２．４−ジクロロ−６−カルボキシメチル−ア
ミノー５−トリアジン、ジメチルアジビイミゾイト、ジ
メチルスベリイミデート等の２官能試薬と反応させ、次
に、問題の分析対象物又は類縁体と結合したアミン又は
他の求核試薬と反応させることができる；ヒドラジドを
硝酸との反応によりジアゾ化反応によってアジド基に変
換することができる；ヒドラジドを無水コハク酸と反応
させ、スペーサー結合基（ｓｐａｃｅｒ　ａｒ＋ｗ）を
有するカルボキシル化基を包含せしめることができ；脂
肪族アミン又は粒子も、スルフヒドリル誘導体に高い特
異性を示すマレインイミド基等の多様な特異性を有する
官能基をアミンに結合させる複素２官能架橋剤の使用を
始めとして、ヒドラジド化学で用いられるものと類似の
２官能試薬と反応させることができる；水酸基は、臭化
シアン、塩化トシル、カルボニルジイミダゾール、又は
ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートにより活性化する
ことができる；ポリスチレン等の粒子をニトロ化し。

該ニトロ基を芳香族アミンに還元し、そして、該芳香族
基を問題の求核性分析対象物／類縁体との反応の荊にジ
アゾ化することができる。ニトロセルロース、ジアゾベ
ンゾキシメチル（ＤＭＢ）紙、誘導体合成によるナイロ
ンメツシュ、又は臭化シアン、ｐ−ニトロフェニルクロ
ロホルメート、又はカルボキシルジイミダゾールを用い
て活性化した紙を求核試薬又は反応性ポリマーに結合さ
れた試薬に結合するのに利用することができる。

適切な結合試薬を試薬層に固定化された材料に直接結合
する代わりとして、特異的な結合相手を利用して、分析
の実行中にその場で必要な固定化を得ることもできる。

固定化されるべき材料、即ち、分析対象物若しくは類縁
体又は結合相手は、別個の結合物質に対する結合部位を
有するか、又は有するように変成せしめることができ、
今度は、この物質を試薬域で固定化せしめることができ
る。該固定化され得る材料は、かくして、試験具中のい
かなる好便な位置にも位置せしめることができ、分析の
実行とともに、適切な固定化をもたらす、検出区域内で
標識試薬を固定化する上記の結合性相互作用を用いても
よい、同様に。

分析対象物の固定化のための上記の方法は、一般に種々
の検出試薬又はその誘導体の固定化のも応用できる。

本発明の試験具は、上記のように、隣接する層の間の流
体接触を可能にするように組み合わせた複数の試薬層を
用いている。その種々な層は。

次々に上に重なるコーティングを形成するための皮膜形
成剤を用いて製造することができ、あるいはまたフィル
ター紙又はグラスファイバー又は織物状ポエステル等の
繊維性試薬マトリックスの暦を重ねることにより製造す
ることができる。

あるいは、・隣接した区域を、上記のごとく、各反応区
域の端部が直接流体接触した状態で各区域を支持部材に
取り付けたクロマトグラフィ一方式に配置せしめること
ができる。

紙の複数の層は、例えば、周囲を囲むプラスチックの枠
、あるいは代わりに液状の透過性メツシュスクリーンを
並置して、あるいは水溶性接着剤を層間に包含せしめる
ことにより保持することができる。多層フィルムの流延
は、ドクターブレード、押出コーター、マイヤー棒、パ
ドルコーター又はグラビヤコーターの使用を始めとする
、フィルム流延のための当該技術における多くの技法に
より達成することができる。あるいは、複数の連続した
層をカスケードコーターを用いて流延することもできる
。上記の方法により形成されたフィルム状の層は、試薬
を含有し、一定期間培養される織物状又はメツシュ状の
材料を用いてオーバーレイすることができる。

（分析対象物） 本分析法は、使用可能な結合相手が存在するいかなる分
析対象物の検出にも適用可能である。

通常、分析対象物は、結合相手が存在し、生物学的シス
テムにおいて生産可能な若しくは合成可能なペプチド、
ポリペプチド、タンパク買、炭水化物、糖タンパク質、
ステロイド、核酸又は他の有機分子である０分析対象物
は、官能基で表現して、通常、抗原及びその抗体；ハプ
テン及びその抗体；相補的ポリヌクレオチド連鎖；並び
にホルモン、ビタミン、中間代謝物及び薬剤とそれらの
結合相手からなる群から選択される。

通常、分析対象物は、抗体又は抗原ポリペプチド若しく
はタンパク質等の、通常約１，０００〜約１０，０００
，０００の分子量を有する免疫学的に活性なポリペプチ
ド又はタンパク質、あるいは１分子量約１００以上、そ
して通常約１．５００未満を有するハプテンである。

代表的ポリペプチド分析対象物は、アンギオテンシンエ
及び■、Ｃ−ペプチド、オキシトシン、バンプレシン、
ニューロフィシン、ガストリン、セクレチン、ブラジキ
ニン並びにグルカゴンである。

代表的なタンパク質分析対象物には、プロタミン、ムコ
タンパク賀、糖タンパク質、グロブリン、アルブミン、
硬タンパク質、リンタンパク質、ヒストン、リポタンパ
ク質、色素タンパク質、及び核タンパク質の類がある。

特異性のタンパク質の例は、プレアルブミン、α１−リ
ポタンパク質、ヒト血清アルブミン、αｔ　−Ｈ糖タン
パク質、αｌ−抗トリズシン、α１−糖タンパク質、ト
ランスコルチン、チロキシン結合グロブリン、ハプトグ
ロビン、ヘモグロビン、ミオグロブリン、セルロプラス
ミン、α２−マクログロブリン、β−リポタンパク質、
エリスロポエチン、トランスフェリン、ヘモベキシン、
フィブリノーゲン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ。

ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等並びにそれらのフラグメン
ト、例えばＦｃ及びＦａｂ、補体因子、プロラクチン、
血液凝固因子、例えば、フィブリノーゲン、トロンビン
等、インシュリン、メラノトロピン、ソマトトロピン、
チロトロピン。

卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ゴナドトロピン
、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、内因子、ト
ランスコバラミン、血清酵素。

例えば、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、クロリ
ンエステラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ、グルタミン酸−ビルピン酸トランスアミナ
ーゼ、及びウロベプシン、エンドルフィン、エンクファ
リン、プロタミン、組織抗原、細菌抗原、並びに肝炎に
関連した抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｏＡｇ及びＨ
Ｂ９Ａｇ）等のウィルス抗原がある。

代表的なハプテン分析対象物としては、医薬品、中間代
謝物、ホルモン、ビタミン、毒素、及び類似の有機化合
物等がある。ハプテンホルモンとしてはチロキシン、及
びトリイオドチロニン等がある。ビタミンとしては、ビ
タミンＡ、Ｂ、例えばＢ１２、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸
並びにチアミン等がある。医薬品としては、アミノグリ
コシド、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン。

アミカシン、シソマイシン、カナマイシン及びネチルマ
イシン、ペニシリン、テトラサイクリン、テラマイシン
、クロロマイセチン、並びにアクチノマイセチン；ヌク
レオシド及びヌクレオチド、例えば、アデノシンニリン
酸（ＡＤＰ）、アデノシンニリン酸（ＡＴＰ）、フラビ
ンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、及びそのリン酸塩誘導体
（ＮＡＤＰ）、チミジン、グアノシン、アデノシン；プ
ロスタグランジン；ステロイド、例えば、エストリオー
ル及びエストラジオール等のエストロゲン、ステロゲン
、アンドロゲン、ジゴキシン、ジギトキシン、副腎皮質
ステロイド；フェノバルビタール、フェニトイン、プリ
ミドン、エトサクシミド、カルバマゼピン、パルプロエ
イト（マａｌｐｒｏａｔｅ）、テオフィリン、カフェイ
ン、プロプラノール、プロ力インアミド、キニジン、ア
ミトリブチリン、フルチゾール、デシプラミン、ジンピ
ラミド、ドキセピン、ドキンルビシン、ノルトリブチリ
ン、メトトレキセート、イミプラミン、リドカイン、プ
ロ力インアミド、Ｎ−アセチルプロ力インアミド、アン
フェタミン類、カテコールアミン、並びに坑ヒスタミン
薬等がある。

毒素としては、アセチルニー２トキシン、アルファトキ
シン、コレラトキシン、シトリコン、サイトカラシン類
、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｉ（Ｔ−２）キシン
等がある。

（液状試験媒体） 測定される分析対象物を含有する液状試験媒体は、自然
に存在する又は人工的に合成される液体で分析対象物を
含有すると思われるものであってよく、通常生物学的液
体又はその希釈物である。

分析対象物が測定される生物学的液体には、血清、全血
、血漿、尿、唾液、羊水及び脳を髄液等がある。

実」１１」 酵素標識抗体の製造 抗ジゴキシン抗体（〜６ｍｇ／−）を含有する腹水症液
を０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液中で５倍に希釈しくｐＨ
３、５）、ｌ　：　５０　（ｗ／ｙ）のペプシン／抗体
溶液で３７℃で４８時間温雪量た。アミコン（Ａｍｉｃ
ｏｎ）　Ｐ　Ｍ　３０膜〔米国、マサチューセッツ州、
ダンバースのアミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃａｒｐ、）
製〕で、限外か過により〜５−に濃縮後、試料をセファ
クリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−３００〔米国、
ニューシャーシー州、ビスキャットアウェイの）７）レ
マシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）製〕、カラ
ム（２，４Ｘ９０ｃ■）上でゲル濾過し、１０ｍＭのリ
ン酸ナトリウムと０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７
、２）で平衡せしめ、上記抗体のＦ（ａｂ’）２フラグ
メントを単離した。該抗体を１０ｍＭのジチオトレイト
ールを用いて還元し、該タンパク質ピーク示す画分をＰ
−６０Ｇポリアクリルアミドゲル樹脂［米国、カリフォ
ルニア州、リッチモンドのバイオ−ラド社（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　Ｇｏ、）製］上で脱塩した直後、活性β−ガラク
トシダーゼと反応させた後、プールした。該β−ガラク
トシダーゼ（ＩＸ型：米国、ミズーリ州、セントルイス
のシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｇｏ、）製〕を５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、
４に対して透析した。

１０ｍｇ／−の溶液を、複素２官能架橋剤のスクシニミ
ジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−力ルポキシレートと室温で２時間反応させ、この物質
をＰ−６ＤＧカラム（ｔｘｓ。

ｃＩｌｌ）に通した。活性β−ガラクトシダーゼを抗体
とｌ：３の比で混合し、４℃で２００時間反応せた。こ
の物質は、アミ：Ｉ　７　（Ａｍｉｃｏｎ）　ＰＭ　３
０ＷＮでの限外濾過により約１０倍に濃縮した。濃縮物
をＡＣＡ２２樹脂〔米国、メリーランド州、ガイセルズ
ブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のＬＫＢインスツ
ルメンツ社（Ｌ　Ｋ　Ｂ　　ＩｎｓｔｒＩＩｍｅｎｔｓ
、　Ｉｎｃ、）製〕（１，５Ｘ１１０ｃｍ）に通し、遊
離抗体フラグメント（Ｆａｂ）とＦａｂ及びβ−ガラク
トシダーゼの高級置換オリゴマーとからＦａｂ−β−ガ
ラクトシダーゼを分離した。酵素／抗体画分をプールし
、固定化ウアバインを含有する調和性カラムに通した。

固定化ウアバインカラムを調製するには、ウアバインを
スミス等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、９　：　３３１−３３７　
（１９７０））によって開示された方法と同様にして牛
血清アルブミンに結合した。

ウアバイン−ＢＳＡは、既に開示された方法（Ｗｉｌｓ
ｏｎ、　Ｎ、及びＮａｋａｎｅ、　Ｐ、　Ｊ、　ｏｆ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２，１７１−１８１　、（１９７Ｂ
））により、過ヨウ素酸塩酸化の後に、セファデクス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２５（米国、ニューシャー
シー州、ビスキャット７ウエイのファルマシア社（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）製〕に結合した。Ｆａｂ−
β−ガラクトシダーゼ含有試料を親和性樹脂のカラム（
Ｉ　Ｘ　１０ｃ■）に通した。遊離β−ガラクトシダー
ゼをカラムから溶出し、次いで、２０ｍＭウアバインを
含有する溶離溶液を溶出して、抗体−酵素複合体をカラ
ムから溶離した。５力ラム容量部で洗い出してプールし
た。プール液を２−に濃縮し、食塩リン酸緩衝液（５０
ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、
ｐＨ７，４）を１０回取り替えて、２０時間透析した。

実ｆｌヱ 固定化分析対象物層の製造 ホワットマン（Ｗｈａｔｉｔａｎ）　３１−　Ｅ　Ｔ　
（米国。

ニューシャーシー州、クリプトンのホワットマン社（Ｗ
ｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、）　）紙を活性化し次にパラ−
ニトロフェニルクロロホルメート（ＮＰＣＦ）を用いて
誘導体を合成した０紙シートを蒸留水に１５分間浸漬し
、その水を次に傾瀉し、紙をアセトンを次々に６容量部
用いてすすぎ、遊離水を除去した。その紙を次に、アセ
トン中のＮＰＣＦ１０％の溶液中に浸漬し、６時間湿層
し、次いで未反応ＮＰＣＦをアセトンで連続してすすい
で除去した。すすぎ液は、ＩＮのＮａＯＨ１００ル皇を
そのすすぎ液３００ＩＬ９．に加えて、ホルメートの存
在を試験した。すすぎは、アセトンを３容量部用いて検
知可能な黄色がなくなるまで続行し、１文の蒸留水で水
洗し、次にアセトン１０〇−容積×５で洗浄し、溶剤を
空気乾燥により除去した。

実」０１１ 固定化基質層の製造 ホワット−Ｆ　７　（Ｗｈａｔｍａｎ）　３１−　Ｅ　
Ｔ紙（３，７ｇ）をアセ゛トン１０〇−中の１，１′−
カルボニルジイミダゾール２ｇと共に室温で時々撹拌し
ながら１時間湿層した。この紙をアセトン２００−容積
×３を用いて洗浄し、５０℃で約１０分（即ち、それと
わかるアセトンの臭いがなくなるまで）乾燥し、シリカ
ゲル乾燥剤を用いて４℃で次に用いるまで貯蔵した。こ
の紙を、次に、活性のアミン、β−ガラクトシル−ウン
ベリフェロン−アミノヘキシル（米国特許第４．２５９
，２３３号参照）を含有するβ−ガラクトシダーゼ基質
と反応させた。その基質試薬５０薦ｇをＤＭＳ　Ｏ２０
−中に溶解し、Ｉｇの活性紙に加えた。１５分後、２０
ｗＪのインプロパツールを加え、時々撹拌しながら室温
で６時間反応を続行した。溶剤を傾瀉し１紙をインプロ
パツール１００−容ｆｉＸ　３で洗浄した。２−のエタ
ノールアミンを含有するインプロパツールの７リコート
（２００ａ／）を加え、室温で３０分間反応させ、次い
でイソプロパツール２００−で３回洗浄した。この紙を
イソプロパツール２０〇−中に室温で一晩放置した。翌
日、溶剤を傾瀉し、残存する溶剤を５０℃で１５分間乾
燥することによって除去した。

支嵐１」 酵素−抗体複合体層 ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　５４紙を０，６Ｍの
リン酸ナトリム緩衝液、ｐＨ７，４中の抗ジゴキシンＦ
ａｂ−β−ガラクトシダーゼ１０５ｇ／＠ｌを含有する
溶液に短時間浸漬し５４０℃で２０分間乾燥した。

実Ｊ１１１ 多層試験具の組立て 上記の３つの試薬エレメントから、複合細片試験具を組
み立てた。基質層を両面接着テープ〔米国、ミネソタ州
、セントボールのスリーエム社（３Ｍ　　Ｃｏｍｐａｎ
７）製〕上に薄層状に重ね、幅ｌＣ層、長さ１２．７ｃ
ｍの長いリボン状に裁断した。

この材料を１次に、幅８．３ｃｍ、長さ１２．７ｃ＋ａ
の透明なポリスチレン支持体〔米国、ミシガン州、ミツ
ドランドのダウケミカル社（ｎｏｗＣｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、）製〕の一方の表面に、ソノ端部の長手沿いに層
状に重ねた。１〜２ｍ■細片の両面接着テープを基質層
の後側の端部沿いに貼着し、固定化分析対象物類縁体を
含有する試薬層の１ｃｍ幅のリボンをその両面接着テー
プの細片で基質層の上に取り付けた。上記の方法を繰り
返して酵素−抗体複合体を含有する試薬紙のリボンを取
り付けた。得られた多層試験具を種々の暦をその端部に
合わせて取り付けた輻５騰■×長さ８．３ｃ＋ｓの試薬
片に切断した。

夾焦１Ｊ 試験具の操作 正常ヒト血清の試料をジゴキシンを混合して５ｎＭにし
た。０．２〜５．０ｎＭの範囲の濃度のジゴキシンを正
常ヒト血清を用いて貯蔵試薬を希釈して調製した。試料
の７リコート（８０ＩＬｌ）　　を試験具に施して試験
を開始した。試験具を反射率光度計中に載置し、これに
よって試薬パッドの底部を、該パッドの法線に対して４
５゜で取り付けられた光学繊維束からの白色光で照射し
た０反射光を、該光を４０５ｎ層干渉フィルター〔米国
、マサチューセッツ州、ハドソンのグイトリックオプテ
ィクス社（ｎｉｔｒｉｃ　０ｐｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）製
〕と関連検知エレクトロニクス機器に運ぶ、該パッドに
対して垂直に取り付けられた光学繊維束により検知した
０時間の経過とともに、反射率の変化を追跡し、施した
ジゴキシンの濃度と関連づけた。

【図面の簡単な説明】

ｗ４１図（ＦＩＧ、ｌ）は１本発明により構成された試
薬層及び検出層を有する多層分析試験具の断面図である
。 第２図（ＦＩＧ、２）は１本発明により構成された二つ
の試薬層及び検出層を有する多層試験具の断面図である
。 第３図（ＦＩＧ、３）は、本発明により構成された二つ
の試薬層、検出層及び支持体を有する多層試験具の断面
図である。 標鐵叡薬ろ　　δＡｎ（を祈月象物） ６Ａｎ（分析対象物） δＡｎ（分析対象物）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ｉ）分析対象物、及び該分析対象物若しくはその
   結合類縁体の標識体又は固定化体と、（ｉｉ）それぞれ
   、該分析対象物の結合相手の固定化体又は標識体との間
   の結合を伴い；該分析対象物、その類縁体又は結合相手
   の標識体が、検出用組成物と相互に作用して検知可能な
   信号を生じる検出可能な化学基からなる標識試薬である
   、液状試験媒体中の分析対象物の特異的結合試験法によ
   る測定のための多区域分析試験具であって；液体が流れ
   るような接触状態で、 （１）該分析対象物、その類縁体又は結合相手の固定化
   体を包含した固体の多孔性マトリックスからなる試薬区
   域と、 （２）検出区域内に移行する標識試薬を受容し測定する
   ための、該検出用組成物の少くと も一つの成分の固定化体を包含した固体の多孔性マトリ
   ックスからなる検出区域 からなることを特徴とする多区域分析試験具。 ２）検出区域に固定化された検出用成分が、標識試薬と
   の化学反応に関与して、検知可能な信号を出す生成物を
   生成する特許請求の範囲第１項記載の多区域分析試験具
   。 ３）標識試薬中の検出可能な化学基が酵素的に活性な基
   である特許請求の範囲第２項記載の多区域分析試験具。 ４）標識試薬中の検出可能な化学基が（ｉ）酵素である
   か、又は（ｉｉ）そのような酵素の基質又は補助因子で
   あり、固定化された検出用成分がその他方である特許請
   求の範囲第３項記載の多区域分析試験具。 ５）標識試薬中の検出可能な化学基が酵素であり、固定
   化された検出用成分がその基質である特許請求の範囲第
   ４項記載の多区域分析試験具。 ６）基質が色原性である特許請求の範囲第５項記載の多
   区域分析試験具。 ７）基質が蛍光原性である特許請求の範囲第５項記載の
   多区域分析試験具。 ８）基質が化学ルミネセンス性である特許請求の範囲第
   ５項記載の多区域分析試験具。 ９）標識試薬中の検出可能な化学基が、内部的に消光さ
   れた多数の蛍光体を結合せしめたポリマー残基であり、
   固定化された検出用成分が蛍光体−ポリマー残基に作用
   して分解し、消光されていない蛍光体分子を放出させる
   酵素である特許請求の範囲第４項記載の多区域分析試験
   具。 １０）固定化された検出用成分が標識試薬と化学反応を
   起こし、検知可能な信号を出す固定化生成物を生成する
   特許請求の範囲第２項記載の多区域分析試験具。 １１）検出可能な生成物が不溶性である特許請求の範囲
   第２項記載の多区域分析試験具。 １２）検出可能な生成物が可溶性であり、検出区域がそ
   のような可溶性生成物に対する固定化剤をさらに包含す
   る特許請求の範囲第２項記載の多区域分析試験具。 １３）標識試薬中の検出可能な化学基が蛍光体からなり
   、検出区域に固定化された検出用成分が標識試薬の蛍光
   に対する消光剤である特許請求の範囲第１項記載の多区
   域分析試験具。 １４）標識試薬中の検出可能な化学基が多数の蛍光体を
   有するポリマー残基である特許請求の範囲第１３項記載
   の多区域分析試験具。 １５）検出用成分が、検出区域に包含されたマトリック
   スに共有結合せしめられることによって検出区域に固定
   化されている特許請求の範囲第１項記載の多区域分析試
   験具。 １６）検出用成分が、マトリックス中に分散した高分子
   量の高分子物質に結合せしめられることによって検出区
   域に固定化されている特許請求の範囲第１項記載の多区
   域分析試験具。 １７）分析対象物の結合相手が抗体又はそのフラグメン
   トである特許請求の範囲第１項記載の多区域分析試験具
   。 １８）試薬区域及び検出区域が、流体が流通するような
   接触状態の層状である特許請求の範囲第１項記載の多区
   域分析試験具。 １９）標識試薬の試験媒体可溶体を包含した固体の多孔
   性マトリックスからなる試薬層をさらに具備する特許請
   求の範囲第１８項記載の多区域分析試験具。 ２０）検出層の、試薬層とは反対の側に位置せしめた支
   持部材をさらに具備する特許請求の範囲第１８項記載の
   多区域分析試験具。 ２１）固体の多孔性クロマトグラフ要素からなり、試薬
   区域及び検出区域がそのような要素の個別の区分である
   特許請求の範囲第１項記載の多区域分析試験具。 ２２）分析対象物を含有する水性媒体と接触して検知可
   能な光学的信号を生じる、水性液状媒体中の分析対象物
   測定用の多層イムノアッセイ試験具であって、流体が流
   通するような接触状態の、以下の順序の、 （ｉ）該分析対象物に対する抗体又はそのフラグメント
   と、酵素基質に作用してそれを検知 可能な光学的信号を出す生成物に変える酵素とからなる
   標識試薬の水可溶体を包含した固体の多孔性マトリック
   スからなる第１の試薬層、 （ｉｉ）該分析対象物又はその結合類縁体の固定化体を
   包含した固体の多孔性マトリックスからなる第２の試薬
   層、 （ｉｉｉ）検出層中に移行する標識試薬を受容し、測定
   するための、該酵素基質の固定化体を包含した固体の多
   孔性マトリックスからなる検出層、並びに、 （ｉｖ）固体の非多孔性基板からなる支持部材からなる
   多層イムノアッセイ試験具。 ２３）基質が色原性である特許請求の範囲第２２項記載
   の多層イムノアッセイ試験具。 ２４）基質が蛍光原性である特許請求の範囲第２２項記
   載の多層イムノアッセイ試験具。 ２５）基質が化学ルミネセンス性である特許請求の範囲
   第２２項記載の多層イムノアッセイ試験具。 ２６）抗体フラグメントがモノクローナル抗体から誘導
   される特許請求の範囲第２２項記載の多層イムノアッセ
   イ試験具。 ２７）検出用成分が、検出区域に包含されたマトックス
   に共有結合せしめられることによって検出区域に固定化
   されている特許請求の範囲第２２項記載の多層イムノア
   ッセイ試験具。 ２８）検出用成分が、該マトリックス中に分散した高分
   子量の高分子物質に結合されることによって検出区域に
   固定化されている特許請求の範囲第２２項記載の多層イ
   ムノアッセイ試験具。 ２８）該第１の試薬層、第２の試薬層及び検出層が検知
   可能な光学的信号に対して透過性であり、該支持エレメ
   ントがそのような信号に対して不透明である特許請求の
   範囲第２２項記載の多層イムノアッセイ試験具。