JPH04166082A

JPH04166082A - 動物の胚細胞融合方法及び装置

Info

Publication number: JPH04166082A
Application number: JP2291082A
Authority: JP
Inventors: Atsuo Uyama; 宇山　敦雄; Hideo Shioda; 塩田　英夫; Makoto Oishi; 良大石
Original assignee: Tokyo Rikakikai Co Ltd
Current assignee: Tokyo Rikakikai Co Ltd
Priority date: 1990-10-29
Filing date: 1990-10-29
Publication date: 1992-06-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、動物の胚細胞融合方法及び装置に関し、詳し
くは電気的な場により細胞融合を行う方法及び装置であ
って、特に羊や牛等の大型の産業動物において、核移植
によるクローニング、核移植によるキメラの作出、倍数
体の作成などを行うために動物の胚細胞を融合するのに
適した方法及び装置に関する。

〔従来の技術〕

動物の胚細胞を融合させることは、高価な産業動物を多
く作り出すために重要な技術であるが、核融合後の細胞
の分裂能、増殖能等の生物活性が良好で、発生率が高い
ことが要求されている。

従来の細胞融合は、融合させたい２種の細胞を含む懸濁
液中に一対の対向電極を設置し、泳動−一過的膜破壊−
細胞融合の３ステツプを行うことにより融合が進められ
る。この中で一過的膜破壊のステップは、約］■ぐＶの
ＤＣパルス電圧かがけられ、電解強度１０’〜］、０６
Ｖ／ｍ程度で行われている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしなから、動物の胚細胞なとのような大きな細胞の
場合は、５０Ｖ以上の電圧をかけると細胞自身が破壊し
てしまうため、従来がら各種の細胞融合装置か開発に取
り組まれている。また、これらの従来装置を用いた胚細
胞融合で生や羊等の大型の産業動物を得た例も報告され
ているが、その融合成功率は極めて低かった。

また、細胞融合技術で最も重要なことは、融合細胞の発
生率を高めることである。そのため、融合細胞の状態を
確認しなから良い状態の細胞を選んで融合させることが
要求される。

例えば一般の細胞融合では、「１的とする２種類の融合
細胞Ａ、Ｂから融合後、Ａ、　Ｂ細胞だけを得る必要か
ある。しかし従来の装置では、融合させたい２種類の細
胞を等量含む懸濁液を使用して融合さぜるゝため、細胞
は集団として扱われ、融合産物の由来か明らかでは無く
なってしまう。また、２種類の細胞Ａと細胞Ｂとの融合
操作においては、上記のことく多数の細胞が存在してい
るため、細胞Ａと細胞Ｂとの１対１のハイブリッＩ−Ａ
　Ｂか得られる確率と同じ確率で、同種間のハイブリッ
ドＡＡやＢＢである可能性もあり、さらに３個以」二融
合したもの（ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＡＢＢ等）や、全く融合
していないものも含まれている。このため、融合後にＡ
Ｂ融合した細胞だけをスクリーニングする必要かあるが
、このような細胞たけをスクリーニングするためには栄
養要求性や薬品耐性を利用して行わなければならず、非
常に面倒な操作であった。

一方、牛なとの大型動物の核移植胚の作成（クローニン
グ）の場合には、除核未受精卵の透明帯の切開部から側
法を注入するので、」二部のような問題は起きないが、
細胞を電気的に融合させる時には、融合細胞の融合面を
電極と平行にして行わなければならないので、従来は電
極間に交流を印加して、いわゆる交流アライメントを行
って融合面の向きを平行にするようにしていた。しかし
、この交流アライメントでは確実に融合面の平行度を出
すことか困難であり、従って融合率も低いものであった
。この融合面の向きの問題は、他の細胞融合の場合、例
えばマウスの場合でも同様である。

そこで本発明は、動物の胚細胞融合を効率よく行うこと
かできる胚細胞融合方法及び装置を提供することを目ｒ
自としている。

〔課題を解決するための手段〕

」二部した目的を達成するために、本発明の動物の胚細
胞融合方法は、一対の対向電極間に目的の融合細胞を挟
持し、前記電極間にパルス電圧を印加して細胞融合を行
うにあたり、前記一対の電極として、相対する電極面か
互いに平行で、かつその径が１．００　ｆｔ　ｍ以下の
電極を用いることを特徴としている。

また、本発明の動物の胚細胞融合装置は、目的の融合細
胞を挟持する一対の対向電極を備えた動物の胚細胞融合
装置であって、前記一対の電極が、相対する電極面、が
互いに平行で、かつその径を１００μｍ以下に形成した
ことを特徴としている。

〔実施例〕

以下、本発明を図面に示ず一実施例に基づいて、さらに
詳細に説明する。

図は本発明装置の一実施例を示すもので、第１図は正面
図、第２図は第１図の８部の拡大図である。

本発明の胚細胞融合装置１は、図に示すように先端か対
向した一対の対向電極２，２を（Ｈｆｔえたものであっ
て、該電極２の先端の電極面２ａを互いに平行に形成す
るとともに、その径Ｒを１００μｍ以下に形成したもの
である。

上記電極２は、例えばタングステンやステンレススチー
ルの直径］、　ｍｍ程度の線の一端を円錐状に形成し、
その下部側、即ちンヤーレ等の容器３の底面３ａに沿う
部分を容器底面３ａと平行になるように屈曲させるとと
もに、その電極面２ａが容器底面３ａに対して垂直にな
るように切り落とした形状に形成されている。従って、
電極２の先端に形成される面は、電極先端部の円錐の中
心線に対して僅かに傾斜した面となっている。また表面
には耐蝕性向上や導通性の向」二を目的とした被覆、例
えば金メツキを行うことが好ましい。

本発明においては、このような形状に電極面２ａを形成
し、かつ電極面２ａの大きさを、胚細胞の大きさに対応
した大きさ、即ち１００μｍ以下とし、画電極２，２間
に１」的とする細胞を挟持することが可能な大きさとす
る。これにより、１」的とする細胞、例えば細胞Ａと細
胞Ｂとを確実に、かつ容易に所定の向きて電極２，２間
に挟持することか可能となる。

尚、電極先端の電極面の径Ｒは、小さいほど好ましいが
、電極の製造上の問題などから、通電；５は５０〜１０
０μｍ程度か適当である。

また、」１記電極２を操作して該電極２，２間に１」的
の細胞を挟持させるためには、電極２をマイクロマニピ
ュレーターのホルダー４に装着し、電極部分を顕微鏡に
より目視しながらマイクロマニピュレーターを操作すれ
ば良い。

そして本発明方法では、」１記形状の対向電極２゜２間
に「ｉ的とする融合ｉｌｌ胞を挟持し、該電極間にパル
ス電圧を印加して細胞融合を行う。

上記融合操作における融合条件は、印加する電圧は３〜
５０Ｖ、時間は１０〜３００７．ｚ　ｓが適当てあり、
電解強度としては１０４〜５Ｘ１．０５Ｖ／ｍが得られ
る。即ち、従来に比べて低い電圧で、細胞融合に必要な
電解強度を得ることができるので、細胞を破壊すること
なく融合操作を行うことか可能となる。

また、上記融合操作を、前述のように顕微鏡でｌ」視し
ながらマイクロマニピュレーターを操作して行うことに
より、融合細胞の状態を確認しながら良い状態の細胞を
選んで融合させることか可能となり、材料（細胞）の損
失もなく、融合利料の組み合わせ、即ち融合産物の由来
を明らかにすることができる。また特殊なチャンバ等を
使用する必要かなく、シャーレ等の通′畠用いられる容
器を用いて融合操作を行うことが可能である。

さらに、前述のように顕微鏡で目視しながら一つずつ融
合操作を行うことにより、細胞の融合面と電極面との平
行度も確認でき、容易に調整できるので、確実に細胞融
合を行うことかてきる。

ここて、ＩＩ胞融合を行う手順を、牛の核移植胚の作成
例に従って説明する。

ます、過排卵処理−人工授精後数日１］に卵管／？１ｊ
流により１６〜３２細胞期の初期胚を回収するが、ある
いは層場て採取した卵巣より卵胞卵を採取し、体外成熟
培養１体外受精を行い、その後２〜４０間体外培養する
ことにより８〜］６細胞期胚を得る。このような胚の透
明帯の約３／４を顕微操作によって、切開し、マイクロ
ピペットを用いて制球を取り出す。取り出した制球は、
リン酸緩衝液中でピペッティングすることにより単一制
球に分離する（カリオプラストの作製）。

一方、過υ１卵処理−発情終了後数時間で卵管を／１ｌ
ｌｉ流してｕｊ卵卵子を回収するが、あるいは層場で採
取した卵巣より採取した卵胞卵を培養成熟させた後、ピ
ペッティングにより卵丘細胞を除去し、第１極体を放出
した卵子を体外成熟卵とする。このυＩ卵卵子あるいは
体外成熟卵の第１極体（＝１近の透明帯を、微細）１ラ
ス釧を用いて顕微操作により約］／４程度切開する。ザ
イトカランンＢ添加リン酸緩衝液中で１５分処理した後
、脱核用ピペットを透明帯の切開部より挿入し、第１極
体（＝１近より核を含む卵細胞質を約］／３吸引除去す
る（サイトプラストの作製）。

次に、上記除咳未受精卵をホールディングピペットで保
定するとともに、脱核用ピペットで申−制球（カリオブ
ラスト）を吸引し、そのピペットを除核未受精卵の透明
帯の切開部から挿入した後、制球をゆっくりと注入する
。続いて、この状態の細胞を電気融合用溶液（０，１ｍ
Ｍ　　Ｍｇ５Ｏａ　。

０．０５ｍＭ　　ＣａＣｌ２添加０．３ＭマンニＩ・−
ル液）中に移し、図に示すように、マイクロマニピュレ
ーターに装着した前記本発明装置の対向電極２，２の先
端の間に、制球と除核未受精卵との融合面か電極面２ａ
と平行になるように、即ち、電極２と細胞が一列になる
ようにして挟み込み保定する。このように保定した状態
で、所定のパルス電圧（直流の矩形波）をＬ−３える。

通電後たたち−１，０− に卵を２０％子牛血清添加リン酸緩衝液中で洗浄する。

１０分後に卵の融合を検定し、融合した卵はザイトカラ
シンＢ添加修正液中で１時間処理後、１０％牛脂児血清
添加修正液中で培養する。

次に、」二部］０％牛脂児血清添加修正液中で培養した
融合胚を４８時間後に検査する。分割した胚を寒天で２
重包埋した後、ウザギ結紮卵管に仮移植するが、あるい
は１０％牛脂児血清添加修「Ｅ液中で所定の濃度の顆粒
膜細胞などと共培養する。

仮移植して５日後に回収した胚、あるいは６〜７［１間
共培養した胚を検査して胚盤胞にまで発育した胚は凍結
保存ないし移植を行う。

尚、前記電極先端の電極面の大きさや融合条件は、融合
させる細胞の種類により異なり、細胞に合わせて適宜最
適な状態で行うべきである。例えば、牛の場合は、電極
の径が１．　Ｏ０μｍのとき、融合条件は、電圧１０〜
２０Ｖ、パルス幅１００μｓか適当であり、融合率９０
％１発生率（２〜８細胞期までの分割率）７０％の結果
を得ている。

この牛の場合、電圧か５Ｖでは融合さぜることが困難で
あり、２０Ｖ以−にでは融合後に破壊するものが多くな
り不適当と判１折される。

また、マウスの場合は、電極の径が１００　ｌｔ　ｍの
とき、融合条件は、電圧１．５　Ｖ前後、パルス幅２０
μｓが適当てあり、融合率７７％１発生宇９０％の結果
を得ている。このマウスの場合、電圧が６Ｖで融合率か
１３２６．２５Ｖて融合率か２４％であり、略中間の１
−５　Ｖて最高の融合率７７％か得られた。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の動物の胚細胞１独合方法
及び装置によれは、特殊形状の電極を用いて顕微鏡で対
象物を観察しながら細胞融合を行うので、１ヨ１的とす
る細胞同士を確実に融合させることが可能であり、しか
も低電圧で融合できるので融合胚の破損かなく、分割率
も高い。

従って、本発明は動物の胚細胞を容易にかつ確実に融合
することができ、羊や牛等の大型の産業動物における核
移植によるクローニング、核移植によるキメラの作出、
倍数体の作成なとを行うこ〜　１２　− とを可能とする。

さらに本発明は、実験小動物（例えばマウスなと）の各
種実験、発生学の基礎、例えば制球の分化機構を研究す
るためなどにも有効に利用することかできる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の胚細胞融合装置の一実施例を示すもので、
第１図は正面図、第２図は第１図の８部を拡大して示す
正面図である。１　・胚細胞融合装置　　２・・・対向電極　　２ａ・
・電極面　　３　容器　　３ａ・底面　　４・・ホルダ
ー　　Ｒ・直径特　許　出　願　人　　東京理化器械株式会社代理人　
　弁理士　　木　　戸　　傳一部間　　　　　　　　　
　　　　　　木　　　戸　　　−産量　　　　　　　　
　　　　　　　小　　　　川　　　　眞　　　−一　　
１３　−

Claims

【特許請求の範囲】１、一対の対向電極間に目的の融合細胞を挟持し、前記
電極間にパルス電圧を印加して細胞融合を行うにあたり
、前記一対の電極として、相対する電極面が互いに平行
で、かつその径が１００μｍ以下の電極を用いることを
特徴とする動物の胚細胞融合方法。２、前記電極をマイクロマニピュレーターにより操作す
ることを特徴とする請求項１記載の動物の胚細胞融合方
法。３　目的の融合細胞を挟持する一対の対向電極を備えた
動物の胚細胞融合装置であって、前記一対の電極が、相
対する電極面が互いに平行で、かつその径を１００μｍ
以下に形成したことを特徴とする動物の胚細胞融合装置
。４、前記電極をマイクロマニピュレーターに装着したこ
とを特徴とする請求項３記載の動物の胚細胞融合装置。