JPH04166083A - ホスホリパーゼｄの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酪粟上■皿凪分Ｍ 本発明は、水中または各種有機溶媒を含有する反応系に
おいて高いホスファチジル基転移活性を有するホスホリ
パーゼＤおよびその製造法に関するものである。

ホスホリパーゼＤは、大豆や卵黄等に含まれるホスファ
チジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等のリ
ン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物から、
乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用な、
リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清中に
含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。

随米公肢歪 ホスホリパーゼＤ　（ＥＣ３，１，４，４）は、グリセ
ロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル
結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離
させる酵素であるが、その起源によっては加水分解反応
以外に、グリセロ一ル、セリン、エタノール等のアルコ
ール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂
質のホスファチジル基を上記アルコール性水酸基を有す
る化合物に転移させ、新たなリン酸エステルを生成する
反応（ホスファチジル基転移反応）を生起させる。

この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実
等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス属、
ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチノマ
デューラ属、ツカルティア属等の微生物を用いた発酵法
により製造できる（特公昭５２−３９９１８号、特公昭
５８−５２６３３号、特開昭５８−６３３８８号、特開
昭５８−６７１８３号、特開昭６０−１６４４８３号）
。また市販品では、植物起源のものとしてキャベツ、ビ
ーナツツ、微生物起源のものとしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ等がある。

しかしながら、これら従来の製造法により得られるホス
ホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、また
加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸か生
成するため、効率よく転移反応を行わせることができな
いという問題点があった。

最近、ホスホリパーゼＤの微生物利用製造法で、酵素の
安定性、生産性なとに関しては改良が試みられている例
もあるが、高いホスファチジル基転移活性を有するホス
ホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足できる
ものが無いのが現状である。

一〇がηｌｌシようと　るＵ０題屯 本発明は、ホスファチジル基転移活性を有する従来のホ
スホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑み、
高いホスファチジル基転移−〇　− 活性を示し、反応生成物中にホスファチジン酸が全く無
いかあるいは簡単な精製操作で除去できる程度しか生成
しないホスホリパーゼＤとその効率良い製造法を提供し
ようとするものである。

’ａＭをＴ′、ｌ−１るためのニー 本発明者らは、自然界中の土壌より広く微生物を分離し
、多数のホスホリパーゼＤ生産菌を得た。更に、それら
の生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホス
ファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産す
る菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取し
た土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する菌
株（ストレプトマイセス属Ｄ−１２１すなわち本発明は
上記ストレプトマイセス属Ｄ−１２１株を用いるホスホ
リパーゼＤの製造法およびそれにより得られる高いホス
ファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤを提供
するものである。

本発明の製造において使われるストレプトマイセス属ｌ
ｌ−１２１株は、次のような菌学的性質を示す。

■　細胞壁成分 ａ、アミノ酸：ＬＬ−ジアミノピメリン酸を含有する。

ｂ、脂肪酸組成：イソＣ１５：ｏｓアンチイソＣ１５＋
ｏｓイソＣＩ６：ＯｓイソＣＩ□＋１、アンチイソＣ１
７：Ｏか主である。

■　ミコール酸の生成：なし Φ　胞子鎖（ｓｐｏｒｅ　ｃｈａｉｎ）の形態　直鎖状
が主である。

■　色調 ａ、気菌糸、灰色 す、基生菌糸：赤／オレンジ Ｃ可溶性色素の生産、なし ■　窒素源の利用性： Ｄ　Ｌ−α−アミノ−酪酸　　　− Ｌ−フェニルアラニン　　　　＋ Ｌ−システィン　　　　　　　− Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　＋ Ｌ−バリン　　　　　　　　− Ｌ−ヒドロキシプロリン 〇　炭素源の利用性・ スクロース　　ー　ラフィノース　　＋アドニトール　
ー　マンニトール　　＋キシリトール　ー　Ｌ−ラムノ
ース　ーメソーイノシト−ル　　＋ ■　各種物質に対する性質： キサンチン　分解する アルブチン　分解する ペクチン　　分解しない エラスチン　分解しない 脂肪分解活性　　　あり レシチナーゼ活性　あり 硝酸の還元　　　　なし 硫化水素の生成　　なし ■　生育阻害。

４５°Ｃ培養　　　　　　　　　　　十アン化ナトリウ
ム（００１％Ｗ／Ｖ）　　　　±ＮａＣＩ（７％Ｗ／Ｖ
　）　　　　　　　　　　＋フェノール（０１％Ｗ／Ｖ
）　　　　　　　−ネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）　
　　　　　＋リフアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）　　
　　−オレアンドマイシン（１００μｇ／ｍｌ）　　＋
ペニシリン（に　（１０ｉ．ｕ．）　　　　　　　−■
　他の微生物に対する抗生。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　　ＮＣＴＢ　３
６１０　　　　　＋Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅ
ｕｓ　　ＮＣＩＢ　１６９　　　　　−Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ　ＣＢＳ５６２　十Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＣＢＳ　１１７
１　　＋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ　
　ＩＳＰ　５０９１　　　　−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｎｉｇｅｒ　　ＬＩＶ　１３１　　　　　　−１−こ
の菌株がストレプトマイセス属に属することは、上述の
性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第８版、第６５
７−６５９頁、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　１ｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ　ｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｓ　、第４５７〜４７５頁等の各記載と照合することに
より確認された。また、」二連■〜■の性質はＳ．Ｔ．
Ｗｉｌｌｉａｍｓらの数値分類法［Ｊ．ＧｅｎＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．１２９．１８１５（１９８３）］に従い試
験したが、その結果によればＷｉｌｌｃｏｘ　ｐｒｏｂ
ａｂｉｌｉｔｙ　Ｏ．９９９でストレプトマイセス・リ
デイカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙその寄託番号は、１１４
２３号である。

本発明のホスホリパーゼＤを製造するための上記ストレ
プトマイセス属Ｄ−１２１株の培養は放線菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができる。すな
わち、培地には炭素源として、例えばブドウ糖、果糖、
デンプン。

糖蜜、グリセリン等を単独で、または組み合わせて適宜
用いることができる。また窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス。

コーンスチープリカー、脱脂大豆粉、大豆蛋白等を用い
ることができる。培地には、ほかにリン酸、マグネシウ
ム、カリウム、鉄、アルミニウム、カルシウム等の塩類
や、各種ビタミン類。

消泡剤等、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有
効な物質を適宜添加することができる。

好ましい培地ｐＨは５〜８で、特に好ましくは６〜７で
ある。培養法としては通常液体培養で行うが、工業的に
は深部攪拌通気培養で行うのが有利である。培養温度は
、菌が生育し、ホスホリパーゼＤを生産する温度範囲で
適宜変更できるが、特に好ましいのは２５〜３５°Ｃで
ある。

培養時間は条件により異なるが、ホスホリパーゼＤの生
産が最大になるまで培養すればよい。

液体培養では通常１〜５日程度である。

培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液体培養では
主として培養液中に存在するので培養終了液から固形物
を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。

濾液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮するにあたって
は、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜組
み合わせて使用できる。例えば塩析、有機溶媒沈殿、透
析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気泳
動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼＤの理
化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。

ストレプトマイセス属Ｄ−１２１株の生産する本発明の
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。

（ａ）作用 ■加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ ＣＨ２ＯＲ＋ Ｒ２０ＣＨＯ・−・−・−［Ｉ］ １］ｌ ＣＨ２０ＰＯＸ （但し、式中Ｒ，，Ｒ２はアシル基またはアルキル基、
Ｘは水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残
る有機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、
ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる。

■ホスファチジル基転移反応 」二部一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジ
ル基を下記一般式［ｎ］ Ｒ３−○Ｈ・・・・・・・・［Ｈ］ （但し、Ｒ３はアルコール性水酸基に結合した有機基を
示す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等
のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコ
ール性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般
式［ｍｌ ＣＨ２ＯＲ。

Ｒ２０ＣＨＯ・・　・　［■ｒ］ ｌ　　　　１１ ＣＨ２０ＰＯＲ３ に （但し、Ｒｓ　、Ｒ２、Ｒａは前記と同様の基を示す）
で表されるリン脂質誘導体を生成する。

（ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００と
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し１５、スフィンゴミエリンに対しては０８である。

（Ｃ）至適ｐＨ：約６０ （ｄ）ｐＨ安定性：　ｐＨ４〜８て安定（ｅ）至適温度
　約５５°Ｃ （ｆ）熱安定性 ｐ　Ｈ６、０において６０℃、３０分間の熱処理で全く
失活せず、７０℃、３０分間でも約５０％の活性が残存
する。

（ｇ）種々の物質の影響 濃度１ｍＭの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
性は塩化セチルピリジニウムのとき約４０％阻害される
が、 ＣａＣｌ□、ＦｅＣｌ３．ＦｅＳＯ４゜ＢａＣ１２、Ｍ
ｎＣ＋２　、ＭｇＣ＋２　。

ＣｕＣｌ□、ＺｎＣｌ２，５ｎＣＩ□。

ΔＩＣＬ、ＣｏＣＬ、ＣｄＣ１□。

ＬｉＣ１，ＫＣＩ、ＮａＣ１，ｍｌ−ル酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム。

エチレンジアミン四酢酸・ニナトリウムのときは阻害さ
れない。

（ｈ）分子量 ５６万（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ法による）。

（ｉ）等電点 ｐＨ７，４〜７５（等電点電気泳動法による）。

なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は基質であるリン脂
質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分解
したときに生じる塩基を定量することによって求める。

この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジルコリ
ンを基質として用いる下記の方法により測定されたもの
であって、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素
活性を１ユニツ１〜（Ｕ）としている。

［ホスファチジルコリン分解活性測定法］ホスファチジ
ルコリン　０５ｇに対してジエチルエーテル１ｍｌ、蒸
留水１０ｍ１を添加し、超音′波処理によって得られた
エマルジョン１００μｍと、０１Ｍ塩化カルシウム溶液
５０μｍ、０１Ｍ　トリス−マレイン酸−水酸化すトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，５）　　、ｔｏｏμｍ、７５％Ｗ
／Ｖ　）　ＩＪトンＸ−１００水溶液１５０μｍとの混
合液に酵素溶液１００μｍを加え、３７°Ｃで１０分間
反応させる。その後、０．０５Ｍエチレンジアミン四酢
酸・ニナトリウムを含む１．０Ｍ　　トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）２００μｍを添加し、直ちに１００°
Ｃで５分間煮沸して完全に反応を停止させる。室温まで
冷却した後、コリン測定用試薬（コリンオキシタ−セ１
ｏｏｕ、パーオキシダーゼ１００Ｕ、４−アミノアンチ
ピリン５０ｍｇ、フェノール２５ｍｇ、　　）リドンＸ
−１００５００ｍｇをｐ　Ｈ８０のＯＯＩＭ　トリス−
塩酸緩衝液１００ｍ１に溶解したもの）４ｍ１を添加し
、３７°Ｃで２０分間反応させた後、あらかじめ熱失活
させた酵素を用いて同様に反応させたものを対照とし、
５００ｎｍの吸光度を測定する。

夾−犯一胴 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれによって制限されるものではない。

実施例　１ 培地として、ブドウ糖０５％、酵母エキス０５％、コー
ンスチーブリカー溶液（１０％Ｗ／Ｖコーンスチープリ
カー懸濁液をｐＨ７，０に調整し不純物を濾別したもの
）２０％を含むｐ　Ｈ７、０のものを用意し、そ°の１
００ｍ１を５００ｍ１容の坂ロフラスコに入れ、蒸気滅
菌後Ｄ−１２１株の前培養液５ｍｌを植菌し、３０’Ｃ
て３日間振とう培養した。

培養終了後菌体を濾別し、酵素活性が９８Ｕ／ｍｌの培
養濾液１００ｍ１を得た。これを蒸留水で２倍に希釈し
、酢酸でｐ　Ｉ−Ｔ　４　、　Ｏとし、陽イオン交換体
ＣＭ−）ヨバール６５０Ｍ［東ソー（株）製］を加えて
攪拌することによりホスホリパーゼＤをＣＭ−トヨパー
ルに吸着させた。

ＣＭ−ト　１パールを回収し、０．３ＭＮａＣｌを含む
０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　Ｉ−Ｉ　４　、　Ｏ）　　
により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色のホスホ
リパーゼＤ　　４７ｍｇ、６１７Ｕを視た。

培養濾液からのホスホリパーゼＤの活性回収率は６３％
であった。

実施例　２ 実施例１で用いた培地５Ｉで、実施例１と同様の操作を
経てＣＭ−トヨパールから活性画分を溶出した。

この溶出液に１０％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、同じく１０％飽和とした０、０１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）で平衡化＝１８− した疎水性クロマト用担体ブチル−トヨパール６５０Ｍ
［東ソー（株）製］のカラムに通液し、ホスホリパーゼ
Ｄを吸着させた。

０、ＯＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で活性画分を
溶出し、限外濾過膜（１０ＰＭＩＯ）　［アミコン社製
］により同緩衝液に置換した。次に、同緩衝液で平衡化
した陰イオン交換体ＤＥＡＥ−１〜ヨバール６５０Ｍ［
東ソー（株）製］のカラムに通し、非吸着部を回収した
。これを、同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイ
トＨＡ−ウルトロゲル［ファルマシア・ファインケミカ
ルス社製］のカラムに通し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，８）　　で活性画分を溶出した。

この溶出液を０．０２５Ｍイミダゾール−酢酸緩衝液（
ｐＩ−＋７．４）　　に置換後、ポリバッファ交換体Ｐ
ＢＥＴＭ９４［ファルマシア・ファインケミカルス社製
］のカラムに通し、同社製ポリバッファ（ｐＨ６，０）
　　を用いｐ　Ｈ勾配により溶出した。

さらに活性画分をゲル濾適用担体トヨパールＨＷ−５５
Ｆ［東ソー（株）製］のカラムに通し、活性画分を回収
した。

かくしてＳＤＳ電気泳動で単一なホスホリパーゼＤ　　
１１５０Ｕを得た。」二部精製操作におけるホスホリパ
ーゼＤの活性回収率は約５％で、得られた精製品の比活
性は９５８Ｕ／ｍｇタンパクであった。

次に、精製品について下記のような理化学的性質の試験
を行った。

■至適ｐＨ 前述の酵素活性測定法における緩衝液を、他の種々の緩
衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素の
ｐ　Ｈ依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適ｐ　Ｈは６０付近にある。

■ｐＨ安定性 本酵素を０．１Ｍ濃度の種々ｐ　Ｉ（の緩衝液に溶解し
、３７°Ｃで２時間静置した。その後、各ｐＨの試料に
対して２０倍８の０．１Ｍ１−リス−マレイン酸−水酸
化すＩ・リン酸緩衝液（ｐＨ５６）を加え、酵素活性を
測定した。結果は第２図のとおりであり、本酵素はｐＨ
４〜８で安定であることがわかる。

■至適温度 前述の酵素活性測定法における酵素反応の温度を種々に
変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温度
依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、至
適温度は５５℃（１近にある。

■熱安定性 本酵素を０．０５Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）
　　中で、２５〜７５°Ｃに３０分間静置した後、残存
する酵素活性を測定した。その結果は第４図のとうりで
あり、５５℃まで安定であることがわかる。

■種々の物質の影響 前述の酵素活性測定法において、塩化カルシウム溶液を
他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中の
物質濃度が１ｍＭになるようにして、酵素活性を測定し
た。各種物質無添加のときの活性と比較すると、ＣａＣ
ｌ２゜ＦｅＣｌ３．ＦｅＳＯ４，ＢａＣ１□。

ＭｎＣ＋２　、ＭｇＣ１２、ＣｕＣ１２。

ＺｎＣｌ　２　、　５ｎＣ１２、ＡｌＣｌ　３　。

ＣＯＣｌ２．　　ＣｄＣ１ｔ、　　ＬｉＣ１，ＫＣＩ。

ＮａＣ１，コール酸すトリウム、デオキシコール酸すト
リウム、エチレンジアミン四酢酸・ニナトリウムでは、
活性の変化は認められなかった。塩化セチルピリジニウ
ムでは、約４０％の活性が阻害された。

■分子量 濃縮ゲル４５％Ｔ１　分離ゲル１０％′Ｆの５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドて電気泳動をおこなった。分子量マー
カーとしてＡｌｂｕｍｉｎ　（ｂｏｖｉｎｅ）　。

Ｃａｔａｌａｓｅ、　Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、　Ｇｌｙｃ
ｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　Ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙ
ｄｒｏ−ｇｅｎａｓｅも同時に泳動し、Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ　Ｇ−２５により染
色した。各分子量マーカーの移動度と分子量の関係から
算出した結果、本酵素の分子量は５６　万であった。

■等電□点 本酵素を、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）■
　３７に従いゲル等電点電気泳動にかけ、泳動終了後テ
ィスフを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水による
抽出液について、ｐ　Ｔ−Ｔおよび酵素活性を測定した
。その結果、本酵素の等重点はｐ　Ｈ７、４〜７５であ
った。

実施例　３ 大豆製ホスファチジルエタノールアミン２．５ｍｇ、ジ
エチルエーテル１７０μｍ、グリセロール７９ｍｇ　、
ＬＭ　ＣａＣ１２６，８μｍ、０．８Ｍ酢酸緩衝液（１
）Ｈ５，６）１７μｍ、実施例１で得たホスホリパーゼ
Ｄ、ＩＵを含む０１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液
８３５μｍを混合し、室温で攪拌しながら１２時間反応
した。ジエチルエーテル：エタノール（３：２）２１０
μｍを添加してよく混合し、」−層中のリン脂質組成を
日本油化学協会編基準油脂分析試験法２．２．８．４　
ａ−８６に従い分析した。その結果は第１表のとおりで
、９７３％のホスファチジルグリセロールを生成した。

また第１表には、キャベツ、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ（Ｓ、Ｃ，）、　Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｃｈｉｊｏｅｎ−ｓｉｓ（Ｓ、
Ｈ，）を起源とするホスホリパーゼＤを同条件下で用い
たときの分析値も合わせて示した。

第１表 Ｐ　Ｇ　：　ホスフ了チシ′ルク゛リセ叶ル、　　　Ｐ
Ａ　　　ホスファチジン酸Ｐ　Ｅ　：　ホスファチン゛
ルエタハルアミン実施例　４ 大豆製ホスファチジルコリン　２　、５　ｍｇ、ジエチ
ルエーテル１６３μｍ、グリセロール７９ｍｇ。

ＬＭ　ＣａＣ１２６，５μｌ　、０．８Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ５，５）１６．３μｍ、実施例１で得たホスホリパ
ーゼＤ　　ＩＵを含む０１％ＢＳＡ溶液８１２μｍを混
合し、攪拌しながら３時間反応した。以下、実施例３と
同様にリン脂質組成を分析した。その結果、９５８％の
ホスファチジルグリセロールが生成し、ホスファチジン
酸は０４％以下であった。

光肌■盆課 本発明のホスホリパーゼＤは、上述のように従来の製造
法により得られるものと比較して、高いホスファチジル
基転移活性を有している。

また本酵素によるホスファチジル基転移反応では、ホス
ファチジン酸はほとんど生成せず、リン脂質誘導体を効
率よく製造することができる。

本酵素を使用してホスファチジル基転移反応を行えば、
目的のリン脂質誘導体を、従来よりはるかに高い収率で
製造でき、極めて簡易な精製操作で製品の純度を向」ニ
させることができるという利点がある。

本発明に使用されるストレプトマイセス属Ｄ−１２１株
は、安価な培地成分で十分量の本酵素を生産することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせず、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。

また、本酵素はｐＨ％　７Ｍｒ度等に対する安定性が良
好で、工業的な利用に有利である。

以上のように、本発明は、ホスファチジル基転移反応で
リン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コストで
製造できるようにする優れたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のｐＨ依存性を示すグラフ。 第２図・本発明の酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示
すグラフ。 第３図・本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図・本発明の酵素の安定性に及はす温度の影響を示
すグラフ。 手続補正書（方式） 平成２年　８月１３３ １、事件の表示　　　平成２年特許願第１１８０５０号
２、発明の名称 ホスホリパーゼＤおよびその製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区大手町１丁目２番３号４、補
正命令の日付　　平成２年　７月１６日（発送臼　平成
２年　７月３１日） ５　補正の対象　　　　（１）図面 筒１−１図 Ｈ 第２図 Ｈ 第３図 Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　（０Ｃ） 第１ １５図　゛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するホスホリパーゼＤ： （ａ）作用 （１）加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［Ｉ］ （但し、式中Ｒ＿１、Ｒ＿２はアシル基またはアルキル
   基、Ｘは水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後
   に残る有機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解
   し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる； （２）ホスファチジル基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジル
   基を下記一般式［II］ Ｒ＿３−ＯＨ・・・・・・・・・［II］ （但し、Ｒ＿３はアルコール性水酸基に結合した有機基
   を示す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール
   等のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下、 アルコール性水酸基にホスファチジル基 を転移させ、下記一般式［III］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［III
   ］ （但し、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３は前記と同様の基を示
   す）で表されるリン脂質誘導体を生成する； （ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００と
   した場合の相対活性は、 リゾホスファチジルコリンに対し１．５、スフィンゴミ
   エリンに対しては０．８である；（ｃ）至適ｐＨ：約６
   ．０ （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜８で安定 （ｅ）至適温度：約５５℃ （ｆ）熱安定性 ｐＨ６．０において６０℃、３０分間、 の熱処理で全く失活せず、７０℃、３０分間でも約５０
   ％の活性が残存する； （ｇ）種々の物質の影響 濃度１ｍＭの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
   性は塩化セチルピリジニウムのとき約４０％阻害される
   が、 ＣａＣｌ＿２、ＦｅＣｌ＿３、ＦｅＳＯ＿４、ＢａＣｌ
   ＿２、ＭｎＣ１＿２、ＭｇＣｌ＿２、ＣｕＣｌ＿２、Ｚ
   ｎＣｌ＿２、ＳｎＣｌ＿２、ＡｌＣｌ＿３、ＣｏＣｌ＿
   ２、ＣｄＣｌ＿２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、コー
   ル酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、エチレ
   ンジアミン四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない
   ； （ｈ）分子量 ５．６万（ＳＤＳ・ＰＡＧＥ法による）。 （ｉ）等電点 ｐＨ７．４〜７．５（等電点電気泳動法に よる）。 （２）ストレプトマイセス属に属するＤ−１２１株を培
   養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取することを特
   徴とするホスホリパーゼＤの製造法。