JPS5867183A - ホスホリパ−ゼｄの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるホスホリパーゼＤの製造法に関す
るものである。すなわち一本発明はアクチノマデューラ
（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　）属に属するホスホリパ
ーゼＤ生産菌を培地に培養し、培養物からホスホリパー
ゼＤを採取することを特徴とするホスホリパーゼＤの製
造方法である０ ホスホリパーゼＤ　（Ｅ、Ｃ，３，ｔ、ｔｔ、ｔｔ）は
−グリセロ燐脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解し一ホスファチジン酸と塩基とを遊離するｉ素
である０又、ホスホリ・（−ゼＤは一エタノール、りＩ
Ｊセロール、エタノールアミン等のアルコール基を有す
る化合物の共存下で、グリセロ燐脂質に作用させると、
ホスファチジン酸ヲアルコール基へ転移することも知ら
れている。

ホスホ１ＪハーゼＤは一キャベツ、ニンジン等の植物界
に広く存在することが古くより知られ一生としてキャベ
ツの組織中より抽出して製造されている。又、最近では
、微生物によるホスホリパーゼＤの製造方法として、ス
トレプトマイセス属（特公昭６２−３９９／ｇ号公報）
や−ミクロモノスポラ属（特開昭Ｊ−４−１ｌｌｏｑｌ
１号公報）に属する放線菌を用い一発酵法によ５ｇ造す
る方法が知られている。

ホスホリパーゼＤは、燐脂質の代謝に関連する研究用試
薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用試薬等に利用さ
れる他、各種リン脂質よりのホスファチジン酸製造にも
利用出来る。

本発り等は一自然界の土壌中より広く微生物を分離し、
ホスホリパーゼＤを生産する菌株を検索した。その結果
、東京都八王子市の土壌より分離した菌株（アクチノマ
デューラｆ４Ｎｏ　　３〜ｔ２と称する）を培地に培養
すると、培地中にグリセロ燐脂質に作用してホスファチ
ジン酸と塩基とを遊離する作用がある酵素が生産される
ことを確認し。

本菌がホスホリパーゼＤを生産することを見出した。ま
たこの酵素を、エタノール、ソルビトール、エタノール
アミン−グリセロール等の適当なアル゛　　　− コール基を有する化合物の共存下で一グリセロ燐脂質に
作用させた場合−ホスファチジン酸をアルコール基へ転
移することも認められた０上記菌株の菌学的性状は次に
示す通りである０（ａ）形　態 澱粉無機塩寒天、チロシン寒天、酵母・麦芽寒天、オー
トミール寒天培地等では良好に、またグリセリンアスパ
ラギン寒天では中程度に生−育して気菌糸の集落を着生
する。

胞子を着生した菌叢の色は培地の種類−観察時シューク
ロース硝酸塩寒天、栄養寒天−グルコースアスパラギン
寒天では気菌糸を着生しないか。

貧弱にしか着生しない。

寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観察すると一
気菌糸は巾００ｇ−１，２μで分枝し一一部ループ状又
は螺旋状をなし一屈曲を混じえながら主として直線状に
長（伸び、先端はループ状にゆる〈巻いている場合が多
い。

胞子は数／Ｑから１００以上の連鎖状をなして着生し、
はぼ気菌糸全体を形成する。

胞子の大きさは０１ｇ−／、２Ｘｊ、コ〜）、７μで一
短円筒又は卵形で−大きさ形ともやや不規則である。

基土菌糸は巾０．１〜１．Ｑμで、不規則な分枝なもっ
て屈曲しながら伸長し一遊走胞子一胞子のう、菌核等は
形成されない。

また通常−隔壁、菌糸の分断は見られないが一液体培養
により菌糸の分断が見られることもあ−る。

（ｂ）各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は、主としてイー・ビー、シャ
ーリング（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃ３ｅｒ
ｉｏｌ。

１６巻、３）３〜３ｑＯ１７９６６年）の方法にしたが
って行った。

色調は−「色の標準」（財団法人日本色彩研究所、１９
４１１年）を用いて決定し１色相名とともに括弧内に色
相名−彩度番号−明度番号の順に色相記号を記入した。

培養は２３Ｃで行い一最も生育の旺盛な一〜３週間目の
各培地上における観察結果を第１表に示した。但し第１
表中、生育項目に記載した基生菌糸表面の色は胞子着生
前の培養−週間目における観察結果を示しており、胞子
着生が早く基生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は記載していない。

（ｃ）生理的性質 ■生育温度：ｌＯ〜３７Ｃ附近で生育し一二〇〜３０Ｃ
で最もよ（生育する。

■ゼラチンの液化：液化しない（グルコースｅペプトン
・ゼラチン培地上、ユ、ｆＣ，３週間培養）０ ■スターチの加水分解：分解する（スターチ寒天培地上
−ユ−ｔＣ−３週間培養）。

■脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せず。

ペプトン化する（、３０Ｃ，３〜Ｑ、週間培養）。

■メラニン様色素の生成：ペプトンイースト鉄寒天−チ
ロジン寒天で生成する（ユｊ’ｌ：：、２〜ｑ日）。

（ｄ）炭素源の同化性（３０Ｃ，／　Ｑ−／６日培養）
Ｌ−アラビノース　＋　　シでクロース　−Ｄ−キシロ
ース　　＋　　イノシトール　±Ｄ−グルコース　　＋
　　Ｌ−ラムノース　−Ｄ−フラクトース　−　　ラフ
ィノース　−（ｅ）細胞の化学分析 本菌株のディアミノピメリン酸はメン型であリー細胞壁
の糖組成はアラビノース−キシロース−ラムノース等を
有せず、マデュロースーガラクトース、マンノース等を
有する０ 以上の分析結果についてＢｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第ｇ版、６Ｓ７頁〜６ｊざ頁（）
９７９年）や−レシエバリエ（Ｉｎｔｅｒ、　Ｊ、　Ｓ
ｙｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２Ｃ巻、’１３
３頁〜１１１１３頁、１９７０年）等の分類法にしたが
って判定すると、杢菌は細胞壁類型（ｃｅｌｌ　ｗａｌ
ｌｔｙｐｅ　）　ＩＩＩ型−糖組成類型（ｃｅｌｌ　ｗ
ａｌｌ　ｓｕｇａｒｐａｔｔｅｒｎ　）　Ｂ型となる。

以上本菌は−その細胞壁類型がＩＩＩ、糖組成類型がＢ
であることから、ミクロビスポラ属−ストレブトスボラ
ンギウム属、スピリロスポラ属、プラノモノスポラ属、
デルマドフィラス属−アクチノマデューラ属のいづれか
に属する。しかし１本菌はその形態において多数の胞子
から成る胞子連鎖を着生し一菌核一胞子嚢、遊走胞子が
見い出されないことより、アクチノマデューラ属（Ｇｅ
ｎｕｓＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　）に同定するのが分
類学上−最も以当である。

そこで本菌はアクチノマデューラ属Ｎ０３ｐ；ユ（Ａｃ
ｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｓｐ　ＮＯ、？　ｌ　２　）と
称することにした。そして本菌は工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されており−その受託番号は「微工研
菌寄第乙／３２号（ＦＥＢＭ　　Ｐ−乙１３コ）」であ
る。

本発明における使用菌としては一上記したアクチノマデ
ューラ属ＮＯＪ乙コ、及び本菌株を変異処理した変異株
だけでなく一アクチノマデューラ属に属しホスホリパー
ゼＤを生産する菌であれば全て用いる事が出来る。

本発明を実施するに当り、その培養形態としては、液体
培養一固体培養いづれも用いることが出来るが、工業的
には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。

また使用する培養源としては、一般に微生物培養に用い
られる炭素源、窒素源、無機塩−及びその他の微量栄養
素の他、アクチノマデューラ属に属する微生物の利用す
ることの出来る栄養源であればすべて使用することが出
来る。

培地の炭素源としては−例えばブドウ糖−果糖。

シヨ糖、乳糖−澱粉、グリセリン、デキストリン−糖蜜
、ンルビトール等の他−脂肪酸一油脂、粗レシチン−ア
ルコール、有機酸などが単独または組合せて用いられる
。

窒素源としては一無機窒素源一有機窒素源いづれでも利
用可能であり一無機窒素源としては１例えば硝酸アンモ
ニウム−硫酸アンモニウム−尿素。

硝酸ソーダ、燐酸１アンモニウム、燐酸２アンモニウム
−塩化アンモニウム等が挙げられ−また有機窒素源とし
ては、大豆−米、とうもろこし−綿実一菜種一小麦など
の粉−糠一説脂粕をはじめ一％ユチープリカー１、プ、
７．酵母エヤユ、肉エキス−カゼイン−アミノ酸等が用
いられる。

無機塩及び微量栄養素としては１例えばリン酸、マグネ
シウム−カリウム、鉄−アルミニウム、カパーゼＤの生
産を促進する物であれば必要に応じて使用できる。

培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌が発育し
−ホスホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更出来
るが−特に好ましいのは一〇〇〜ＪｊＣである。

培養時間は条件により異な、るが−ホスホリパーゼＤが
最高生成量に達するま゛で培養すればよい。

液体培養の場合は通常ｌ〜３日程度である。

培養物中に生成したホスホリパーゼＤは一液内培養では
主として培養液中に溶けているので一培養終了液より固
形物をＦ別して得られる培養ｒ液よりホスホリパーゼＤ
を採取する。

培養ｆ液中よりホスホリパーゼＤを採取するに当っては
、通常酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用出来る
。例えば硫安１食塩等による塩析−アセトン、エタノー
ル−メタノール等の有機溶剤沈澱、透析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過
−吸着剤一等電点沈澱等の方法が使用出来る。

“　さらにこれ等の方法を適当に組み合せることによっ
て一ホスホリパーゼＤの精製効果が上る場合には１組合
せて行うことが出来る。

これ等の方法により得られる酵素は一安定化剤として各
種塩類−糖質、蛋白質、脂質−界面活性剤等を加えるか
、もしくは加えることなく減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾
燥等の方法により液状又は固形のホスホリパーゼＤを採
取することが出来る。

ホスホリパーゼＤの酵素活性測定法は、基質グリセロ燐
脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル結合を
分解して生ずる塩基の量を測定して求める。ホスホリパ
ーゼＤの活性は、特に記載しないかぎり、以下に記載す
るコリンオキシダーゼ法により測定した。

力価測定法： ／’Ｉｚ卵黄精製レシチンエマルジョン（Ｑ、、１ｊｉ
ｌ−レシチン、１ｍｔ、エチルエーテル、１０ｍ１蒸留
水の超音波乳化液）ｏ、１ｒｎｌに−０，ユＭｐ）（７
，ｕトリス−塩酸緩衝液０　、　／ｍｅ、　ｏ　、）Ｍ
　ＣａＣｌ２水溶液ｏ、ｏオｍ６−蒸留水０．ｌｊｍ乙
を混合し、これに酵素液θ、１ｍｌを加え−３７０で２
０分反応後−−ｔ　ＯｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む／
−Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨｇ、ｏ）ｏ、ユｍｔを加
え−直ちに５分間煮沸して反応を完全に停止する。次に
コリンエステラーゼ測定用試薬〔日本商事（株）製造〕
のキットに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解し
た溶液１　ｍｌを加え、３７Ｃで一２θ分間反応させた
後−Ｊ−００ｆｉｍの吸光度を測定する。

対照としては−あらかじめ熱失活した酵素液を用いて同
様に反応させたものの吸光度を測定する。

そして１時間に７８モルのコリンを遊離する酵素活性を
７単位とする。

次に実施例３で示した方法により精製した酵素標品を用
いたホスホリパーゼＤの理化学的性質について述べる。

０作　用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解してホスファチジン酸と塩基を遊離する。

■基質特異性 基質としてレシチン−リゾレシチン、スフィンゴミエリ
ンのいづれか１つを０．１８モル含むエマルジョン０．
１ｍｌを用い、蒸留水の代りに／４Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ
　−／　ｏ　ｏを含む水溶液を用いる以外は一上記力価
測定法と同様にして反応させ遊離したコリン量を測定し
、各基質に対するホスホリパーゼＤ活性を測定した。そ
の結果、レシチンに対する活性なｉｏｏとした時の相対
活性は−リゾレシチン３．乙、スフィンコ゛ミニリン０
であった。

■至適ｐＨ 力価測定法において用いる緩衝液の代りにｐＨ３０〜４
．０では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液−ｐＨｔｔ、ｏ−ｒ、
ｓでは酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨ！、５〜ｇ、！で
はトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、ｐＨ７，０
〜９．θではトリス拳塩酸緩衝液、ｐＨ９，０〜／Ｑ、
Ｑではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を用いてホスホリパ
ーゼＤの活性を測定し至適ｐＨを求めた。また同測定法
で用いる蒸溜水０，１１ｍ１の代りに／　％　Ｔｒｉｔ
ｏｎ　Ｘ−ｔｏ。

（和光紬薬）水溶液ｏ、ｔ、ｒｍｂを用いた時の至適ｐ
Ｈについても求めた。

その結果は第７図に示す通りで一蒸溜水を用いた場合の
至適ｐＨは７．０付近であり、ｌ憾ＴｒｉｔｏｎＸ−７
ＯＯ水溶液を用いた場合の至適ｐＨは！、！付近に認め
られた。

■至適温度 Ｃで酵素活性を測定した。その結果は第２図に示す通り
であって、至適温度はｊｊＣからｇｏｃの範囲であると
認められる。

■ｐＨ安定性 酵素溶液ｏ、１ｍｌ；に０．ｑｍｌの０１１Ｍの各種緩
衝液、すなわちｐＨ３−０〜３．ｊではグリシン、塩−
緩衝液、ｐＨ３，ｊ〜７．０では酢酸・酢酸ソーダ緩衝
液−ＰＨ３、０〜ｇ、０ではトリス・マレイン酸・苛性
ソーダ緩衝液−ｐＨ７、０〜９．０ではトリス・塩酸緩
衝液、ｐＨ９，０〜９．ｆではグリシン・苛性ソーダ緩
衝液を夫々加え、２ｊ’７：でコ時間保った。その後−
これら酵素緩衝溶液に０．６Ｍトリス・塩酸衝液（ＰＨ
７，２）　ｑ　、　ｏｍｅを加え−ｐＨを７．０〜７．
３とした。この溶液０、’／ｍｌを用い一力価測定法に
従って力価を測定し一安定ｐＨ範囲を調べた結果−第３
図に示した通り本酵素の特に安定なｐＨ範囲はＰＨＩＩ
、　０−、ざ、Ｏであると認められた。

また力価測定法で用いる蒸溜水０．／！ＭＬの代りに／
　４Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−’　００水溶液０．／ｊｍ
ｌ；を用いる他は、上記と同様に操作してｐＩ（安定範
囲を調べたが一結果は第３図と殆んど変らなかった。

■熱安定性 酵素溶液０，１〜ｇに０１１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
）（７，２）　９　、９〜ｇを加え−ユＱ、　３０．．
７７゜ｌＩｏ、　ｒ　ｏ、乙ＯおよびｔＳＣに３０分間
放置した後−残存する酵素活性を測定したＯその結果は
第９図に示す通りで、３０Ｃ−’Ｑ、ＩＯ分の熱処理で
は殆んど失活せず−ｒｏ’６で３０分の熱処理で６０憾
の活性が残存した。

■各種物質による影響 力価測定法においてＣａＣ１２水溶液の代りに各種物質
の水溶液をｏ、ｏｓｍｌ加え一酵素反応系中で’ｍＭ＃
ｆに成るようにして活性を測定した。その結果、賦活作
用のあったものは１例えばＡｌＣｌ３−ＣａＣｌ２．　
ＦｅＣｌ３．　Ｆｅ５０．−　ＭｇＣｌ２−５ｎＣ１２
，デオキシコール酸ソーダ等であり、一方阻害作用のあ
ったものはセチルピリジニウムクロライドである。

■力価の測定法 前述したとおりである。

■精製方法 前述したとおりであり−その具体例は実施例３に記載の
とおりである。

［相］等電点 ６、ｑ±０．７（アンホライン電気泳動法によによって
本発明は限定されるものではない。

実施例　ｌ 脱脂小麦胚芽ＩＱｆに硫安Ｑ、ｌｆ、ペプトンＱ、／ｆ
−及び水ｇ　ｍｅをｓ　ｏ　ｏ　ｍｌ　容三角７−ラＸ
　ニアに入れ一ノーＩＣでｌｊ分間蒸気殺菌後、アクチ
ノマデューラ属ＮＯ，？４ｕの胞子水懸濁液λｍ乙を接
種した。そして培養温度−ＩＣで静置３ｏ日間培養した
。

培養終了後、１００ｍ１の水を加えてホスホリパーゼＤ
を抽出した後、固形物をＰ別し、Ｐ液中のホスホリパー
ゼＤの活性を測定した。その結果は７　、ｌ／−１１／
ｍｌであった。

実施例　２ シード培地として澱粉／　４．　（Ｎ１１（）ＩＩ、ｌ
’０．θ、−７嘔４、　ヘットｙｏ　、−１ｒ％、　Ｋ
２）ＬＰＯ＋　　０．２４−　Ｍｇ５０゜０．０１４を
含む水溶液培地（ｐＨ，ｇｊ’）／。Ｏｍｌをｒｏｏｍ
ｌ坂ロフラメロフラスコ蒸気殺菌後。

アクチノマデューラ属ＮＱ３ｔ２の胞子を一白金耳接種
し一培養温度３０７：、／コ０回転／分で一日間振盪培
養してシード培養液を得た。

つぎに本培地−すなわちグルコース１．θ＃Ｉ。

コーンスチープリ力−１．０４．ペプトンＯ０ｊ憾−粉
末酵母エキスＱ、ｌ憾、　ＮＨ４Ｎｏ３ｏ　、ｒ　＊。

Ｋ２ＨＰＯ４０、λ憾、　Ｍｇ５Ｏ，・　７Ｈ２００，
Ｏノ係からなる培！（ｐＨｔ　、ｏ　）　ｓ　ｏｍｅを
３００ｍ１容坂ロフラスコに入れ、１２１Ｃで１０分蒸
気殺菌、後、上記シード培養液ｒｍｅを移植し、ユ３Ｃ
でコロ間培養した。

培養後、遠心分離して固形物を除去し、培養ｆ液ｚＯｍ
ｂ（７７ｕ／ｍｅ）を得た。これに硫安２λ、２ノを攪
拌しながら徐々に加えてホスホリパーゼＤを沈澱させた
。遠心分離により義舎麺ま一沈澱を集め、０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ２，２）に溶解してホスホリパ
ーゼＤ活性を測定した。

この時の培養ｒ液に対するホスホリパーゼＤの活性回収
率は７ｇ％であった。

実施例　３ ＠　な粉３．０４−コーンスチーブリカ−１，０係、ペ
プトンｏ、ｓ％、粉末酵母エキスｏ、ｉ４゜グルコース
１．θ傷、　ＮＨ４Ｎ０３０　、月１．　Ｋ２ＨＰＯ４
θ、　４４．　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０θ、θｌ壬−ツウ
ィン（Ｔｗｅｅｎ）−ｇｓ　　ｏ、ｔ４から成る培地（
ｐＨ４，０）約ｌｊ！を３０Ｊｌジャーファーメンタ−
に入れ、ｌユＯＣでｌ、ｆ分間滅菌後、実施例２に記載
したシード培養液１．！！を植菌し、コアＣでａ□時間
培養を行った。

培養後−菌体固形物を遠心分離により除去し、遠心上清
／、？Ａ（／θθｕ／ｍ６）を得た。この遠心上清をｔ
Ｃに冷却した後−−２〇〇のアセトンを加えてアセトン
濃度３０〜７０％画分に相当するホスホリパーゼＤを含
む沈澱物を遠心分離により集めた。この沈澱物をｐ［ｄ
、ｊ）リス−マレイン酸に溶解し、０．０２Ｍの同緩衝
液に対して透析した後、同緩衝液で平衝化したＤＥＡＥ
−セルロースに通塔し１通過区分を集めた。次に堀内等
の方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｇ　／、　ｔｔ３ｑ（
／９７７）　）で調整したバルミトイルガーゼをカラム
に充填し一充分に水洗してから上記ＤＥＡＥ−セルロー
ス通過液を注入し、活性を吸着した。これをｏ、ｏｒＭ
トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，−２）で洗浄後−０，１
％　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−／　ｏ　ｏを含む同緩衝ｉ
　ヲ７ＪＯ、ｔ　活性を溶出した０活性区分を集めてバ
イオエンシェアリング社製の限外濾過膜（ＴｙｐｅＧ−
１０Ｔ）を用いて濃縮した後、ゲルｆ過担体としてトヨ
バールＨＷ　−ｊ　ｊ　Ｆ　（東洋曹達〔株）製〕充填
カラムに゛注入し一蒸留水を用いて通塔し、活性区分を
集めて凍結乾燥を行った。

この乾燥粉末を０．０２−ｔＭト＋）スー酢酸（ｐＨｇ
　、　、？　）　Ｋ溶解後、ファルマシア・ファインケ
ミカルス社創のポリバッファ交換体ＰＢＥ”９　ａ　（
２ｏｍε）充填カラムに通塔して活性を吸着後−同社製
の溶出用ポリバッファＣＰＨｊ、０）を用いてｐＨ勾配
により溶出した。溶出したホスホリパーゼＤの活性区分
を集めて限外ｒ過膜にて濃縮し一セファテックスＧ−２
３充填カラムに通塔し、ホスホリパーゼＤ活性区分を集
めて凍結乾燥した〇か＜Ｌ、て約ｕ３４の活性回収率で
ホスホリパーゼＤを回収し、この時の比活性は／Ｊ／。

Ｑ　ｕ　／Ｉｎ９蛋白質であった。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明方法によって得られるホスホリパーゼＤに
関するもので、第１図は至適ｐＨを示す曲線、第一図は
至適温度を示す曲線−第３図はｐｕ安定性を示す曲線−
第ｑ図は熱安定性を示す曲線である。 ヤ　１１図 −ｉ４４　ｐｌ＜ ｈｚｍ ０　　２０　　４０　　６０　　８０　　１００’Ｃｆ
　ろ国 ヤ７ｒ１５ｉＩ 手　　続　　補　　正　　書 昭和ｓｇ年７月ｇ臼 特評庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和Ｓ乙年特肝願第ｉ６３り２Ｓ号 ３、補正をする者′ ４、代理人 住所　郵便番号　／７１ 自発補正 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 （１）明細書簡ｉｇ頁第９行〜第１０行の「デオキシコ
ール酸ソーダ等であり、」を次のように訂正します。 「デオキシコール酸ソーダ、エタノール、インプロパツ
ール、ｔ−ブタノールの如きｍ１級、第２級、又は第３
級アルコール等であり、」（２）明＃ｌ書第７ざ頁第１
９行と第一θ行の間に次の文章を挿入します。 「０転位作用 キャベツのホスホリパーゼＤはレシチンからホスファチ
ジン酸を生成し、これを炭素数ｌがら≦までの直鎖の７
級アルコールに転位してエステルを形成することが知ら
れている。本酵素についても同様に転位作用を調べた結
果、本酵素では更に広範囲のアルコールに転位が起りエ
ステルが形成することが判明した。基質となるリン脂質
としでもレシチン以外のジアシルエステル型、モノアシ
ルエステル型、フラスマローゲン型、シクロアルキリデ
ン型、ジアルキルエーテル型、モノアルキルエーテル型
のα−グリセロリン脂暫、及Ｕβ−グリセロリン脂質が
用いられ、またスフィンゴリン脂質もよい基質となる。 転位の起るアルコールとしては次の分類ものがあげられ
る。 Ａ、　／級アルコール （１）炭素数ｌから２２までの脂肪族アルコール及びそ
れに第１級、第２級、第３級アミン、ハロゲン、水酸基
、カルボン酸とそのエステル、ニーチル、アルデヒド、
ケトン等の置換基を有するもの （２）ペントース、ヘキソース及びそれにアミン基、酸
アマイド等の置換基を有するもの（３）糖アルコール及
び多価アルコール（４）二糖類 （５）芳香族アルコール及びそれにアミン基、ハロゲン
、カルボン酸等の置換基を有するもの（６）脂環式アル
コール− （７）炭素多環式アルコール （８）フラン環、フタルイミド環、ビロール環、インド
ール環、ピリジン環、モルホリン環、ピリミジン環、ピ
ペラジン環、イミダゾピリミジン環等の複素環アルコー
ル Ｂ、第２級アルコール （１）炭素数７からｉｏまでの脂肪族アルコール及びそ
れに各種置換基を有するもの （２）芳香族アルコール （３）脂環式アルコール これらの基質とアルコールを組合わせて転位作用が起っ
たかどうかを調べた結果が第２表である〇第２表では、
転位物（エステル）の生成が認められたものを＋、少量
の生成があったものを士、生成の認められなかったもの
を−で示した。また各アルコールの前の記号は上記アル
コールの分類番号を示す。これと同様の検査を市販のキ
ャベツから得られたホメ、ホリパーゼＤを用いて行った
が、転位物（エステル）の生成したものは全（なかった
。 次に転位作用の実験方法を述べる。 ０　、ＩＩ　Ｍ、　ｐＨ３，７酢酸緩衝液ｏ、ｉｍｂ、
０−０７Ｍ　ＣａＣｌ２水溶液ｏ、ｏｓｍｔ、ホスホリ
パーセＤＪｓｏ単位を含む酵素液ｏ、ｉｍｐ、、ｌ優す
ン脂質エマルジョンｃｏ、ｔｙニリン脂ｆｒ　、　　／
　ｍｌ；　：ｒ−−テ／ｌ／、ｉｏｍｅ蒸留水の超音波
乳化液）０．ｉｍｂ及び１０憾アルコール溶液（溶解度
に応じて水、エーテルまたはアセトンを用ｒる）０．Ｉ
ｊｒｎｂを混合し、ｊ７Ｃで／−３時間反応させた。反
応終了後、ＳＯミリモルのＥＤＴＡを含む１モル、ｐＨ
ざ、０のトリス塩酸緩衝液０．２ｍｂとクロロホルム−
メタノール混液（λ：ｌ）３ｍｌ、を加え、混合して転
位生成物（エステル）を抽出した。静置後、下層を分取
し、減圧乾燥後少量のクロロホルム−メタノール混１１
ｆｆｌ（／：／）に溶かし、薄層クロマトグラフイーに
て転位生成物（エステル）の検出を行った。 その結果を第２表に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アクチノマデューラ属に属するホスホリパーゼＤ生産菌
   を培地に培養し、培養物からホスホリン（−ゼＤを採取
   することを特徴とするホスホリパーゼＤＦ）製造方法。