JPH04166084A - ホスホリパーゼｄおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酷粟上■創囲分１ 本発明は、水中または各種有機溶媒を含有する反応系に
おいて高いホスファチジル基転移活性を有するホスホリ
パーゼＤおよびその製造法に関するものである。

ホスホリパーゼＤは、大豆や卵黄等に含まれるホスファ
チジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等のリ
ン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物から、
乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用な、
リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清中に
含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。

附米幻弦斐 ホスホリパーゼＤ　（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセ
ロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル
結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離
させる酵素であるが、その起源によっては加水分解反応
以外に、グリセロール、セリン、エタノール等のアルコ
ール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂
質のホスファチジル基を上記アルコール性水酸基を有す
る化合物に転移させ、新たなリン酸エステルを生成する
反応（ホスファチジル基転移反応）を生起させる。

この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実
等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス属、
ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチノマ
デューラ属、ノカルデイア属等の微生物を用いた発酵法
により製造できる（特公昭５　２−３　９　９　１　８
号、特公昭５８−５２６３３号、特開昭５８−６３３８
８号、特開昭５　８−６　７　１　８　３号、特開昭６
０−１６４４８３号）。また市販品では、植物起源のも
のとしてキャベツ、ビーナツツ、微生物起源のものとし
てＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕ
ｓ等がある。

しかしながら、これら従来の製造法により得られるホス
ホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、また
加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸が生
成するため、効率よく転移反応を行わせることができな
いという問題点があった。

最近、ホスホリパーゼＤの微生物利用製造法で、酵素の
安定性、生産性なとに関しては改良が試みられている例
もあるか、高いホスファチジル基転移活性を有するホス
ホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足できる
ものが無いのが現状である。

ｌかだンエしようと　る−ｒｌｒ申 本元本発明ホスファチジル基転移活性を有する従来のホ
スホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑み、
高いホスファチジル基転移活性を示し、反応生成物中に
ホスファチジン酸が全く無いかあるいは簡単な精製操作
で除去できる程度しか生成しないホスホリパーゼＤとそ
の効率良い製造法を提供しようとするものである。

肌凪炙邂裁ｊヌＪ３償１ｆ段 本発明者らは、自然界中の土壌より広く微生物を分離し
、多数のホスホリバーセＤ生産菌を得た。更に、それら
の生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホス
ファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産す
る菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取し
た土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する菌
株（ストレプトマイセス属Ｓ−１７０株と称する）がす
ぐれた性能を有することを知り本発明を完成するに至っ
た。

すなわち本発明は」二部ストレプトマイセス属Ｓ−１７
０株を用いるホスホリパーゼＤの製造法およびそれによ
り得られる高いホスファチジル基転移活性を有するホス
ホリパーゼＤを提供するものである。

本発明の製造において使われるストレプトマイセス属Ｓ
−１７０株は、次のような菌学的性質を示す。

■　細胞壁成分 ａ　アミノ酸：ＬＬ−ジアミノピメリン酸を含有する。

ｂ、脂肪酸組成：イソＣ１５゜、アンチイソＣ１５ｏ％
イソＣ１６：ｏ％イソＣＩ７：ＯｓアンチイソＣｌ７１
０が主である。

■　ミコール酸の生成：なし ■　胞子鎖（ｓｐｏｒｅ　ｃｈａｉｎ）の形態、螺旋状
が主である。

■　色調 ａ、気菌糸：灰色 す、可溶性色素の生産　なし ■　窒素源の利用性： Ｄ　Ｌ−α−アミノ−酪酸　　　− Ｌ−フェニルアラニン　　　　＋ Ｌ−システィン　　　　　　　− Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　＋ Ｌ−バリン　　　　　　　　− Ｌ−ヒドロキシプロリン　　　＋ ■　炭素源の利用性ニ スクロース　　士　ラフィノース　　＋アドニトール キシリトール　＋　Ｌ−ラムノース　ーメソーイノシト
ール　　＋ ■　各種物質に対する性質・ キザンチン　分解する アルブチン　分解する ペクチン　　分解しない エラスチン　分解しない 脂肪分解活性　　　あり レシチナーセ活性　なし 硝酸の還元　　　　なし 硫化水素の生成　　なし ■　生育阻害・　。

４５℃培養　　　　　　　　　　　十 アジ化ナトリウム（０．０１％Ｗ／Ｖ）　　　　−Ｎａ
Ｃｌ（７％Ｗ／Ｖ）　　　　　　　　　　−フェノール
（０１％ｌｌ’／Ｖ）　　　　　　　±ネオマイシン（
５０μｇ／ｍｌ）　　　　　　＋リフアンピシリン（５
０μｇ／ｍ１　）　　　　十オレアンドマイシン（１０
０μｇ／ｍ１．）　　十ペニシリンＧ　（１０ｉ．ｕ．
）　　　　　　　−■　他の微生物に対する抗生。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　　ＮＣＩＢ　３
６１０　　　　　−Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕ
ｓ　ＮＣＴＢ１６９　十Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ
ｎｓ　　ＣＢＳ　５６２　　　　　　−Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＣＢＳ　１１
７１　　＋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ
　　ＩＳＰ　５０９１　　　　＋Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ　　ＬＩＶ　１３１　　　　　　＋この
菌株がストレプトマイセス属に属することは、」二連の
性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第８版、第６５
７〜６５９頁、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　１ｓｔＴｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｃｅ　ｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｓ　、第４５７〜４７５頁等の各記載き照合することに
より確認された。また、上述■〜■の性質はＳ．Ｔ．Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓらの数値分類法［’Ｊ．ＧｅｎＭｉｃｒ
ｏｂｉｏ１．１２９，１８１５（１９８３）］に従い試
験したが、ソノ結果ニよしばｌｌ’ｉｌｌｃｏｘ　ｐｒ
ｏｂａｂｉｌｉｔｙ　０．９４３でストレプトマイセス
・アンチバイオティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）に分類されるものである。

ス１へレプトマイセス属Ｓ−１７０株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は
、１１４２２号である。

本発明のホスホリパーゼＤを製造するための」二部スト
レプトマイセス属Ｓ−１７０株の培養は放線菌一般の培
養に通常採用される方法に従って行うことができる。す
なわち、培地には炭素源として、例えばブドウ糖７果糖
、デンプン。

糖蜜、グリセリン等を単独で、または組み合わせて適宜
用いることができる。また窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス。

コーンスチープリカー、脱脂大豆粉、大豆蛋白等を用い
ることができる。培地には、ほかにリン酸、マグネシウ
ム、カリウム、鉄、アルミニウム、カルシウム等の塩類
や、各種ビタミン類。

消泡剤等、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有
効な物質を適宜添加することができる。

好ましい培地ｐＨは５〜８で、特に好ましくは６〜７で
ある。培養法としては通常液体培養で行うが、工業的に
は深部攪拌通気培養で行うのが有利である。培養温度は
、菌が生育し、ホスホリパーゼＤを生産する温度範囲で
適宜変更できるが、特に好ましいのは２５〜３５℃であ
る。

培養時間は条件により異なるが、ホスホリパーゼＤの生
産が最大になるまで培養すればよい。

液体培養では通常１〜５日程度である。

培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液体培養では
主として培養液中に存在するので培養終了液から固形物
を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。

濾液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮するにあたって
は、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜組
み合わせて使用できる。例えば塩析、有機溶媒沈殿、透
析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気泳
動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼＤの理
化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。

ストレプトマイセス属Ｓ−１７０株の生産する本発明の
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。

（ａ）作用 ■加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ ＣＨ２０Ｒ１ □ Ｒ２０ＣＨ○　　−・・・　［Ｔ］ ＣＴ−Ｉ□０ＰＯＸ □ 〇− （但し、式中Ｒ１，Ｒ２はアシル基またはアルキル基、
Ｘは水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残
る有機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、
ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる。

■ホスファチジル基転移反応 上記一般式［１］で表されるリン脂質のホスファチジル
基を下記一般式［Ｕ］ Ｒ３０Ｈ・・・　・・・［ＩＩＩ］ （但し、Ｒ３はアルコール性水酸基に結合した有機基を
示す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等
のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコ
ール性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般
式［ＴＩＩ］ ＣＨ２０ＰＯＲ３ 〇− （但し、Ｒ＋　、Ｒ２、Ｒａは前記と同様の基を示す）
で表されるリン脂質誘導体を生成する。

（ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００と
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し２３、スフィンゴミエリンに対しては０９である。

（Ｃ）至適ｐＨ：約５５ （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜８で安定 （ｅ）至適温度：５５〜６５°Ｃ （ｆ）熱安定性 ｐＩ−Ｔ５．！５において５０°Ｃ，３０分間の熱処理
で全く失活せず、７００Ｃ，３０分間でも約５０％の活
性が残存する。

（ｇ）種々の物質の影響 濃度１ｍＭの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
性は塩化セチルピリジニウムのとき若干阻害されるが、
Ｃａ　ＣＩ　２　。

ＦｅＣｌｓ、ＦｅＳＯ４，ＢａＣｌ２゜ＭｎＣ］□、　
Ｍｇｃ１２．ＣＬＩＣＩ２゜Ｚ　ｎ　ＣＩ　２　、　　
Ｓ　ｎ　Ｃ］　２　、　Ａ　Ｉ　ＣＩ　３　。

ＣｏＣ１２、ＣｄＣ１２、Ｌ　ｉＣｌ。

ＫＣＩ、ＮａＣｌ、　　コール酸すトリウム。

チオキンコール酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸
・ニナトリウムのときは阻害されない。

（ｈ）分子量 ６４万（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ法による）。

（ｉ）等電点 ｐ　Ｈ６、４〜６５（等電点電気泳動法による）。

なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は基質であるリン脂
質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分解
したときに生じる塩基を定量することによって求める。

この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジルコリ
ンを基質として用いる下記の方法により測定されたちの
「ホスファチジルコリン分解活性測定法」ホスファチジ
ルコリン　０．５ｇに対してジエチルエーテル１ｍｌ、
蒸留水１０ｍ１を添加し、超音波処理によって得られた
エマルジョン１００μｍと、０．１Ｍ塩化カルシウム溶
液５０μｍ、０　、１　Ｍ　　ｌ−ＩＪ　スー７　レイ
ン酸−水酸化すＩ・リウム緩衝液（ｐＨ５，５）　　１
００μｌ、７．５％Ｗ／ｖトリトンｘ−１ｏｏ水溶液１
５０　μｌとの混合液に酵素溶液１００μｍを加え５，
３７°Ｃで１０分間反応させる。その後、０．０５Ｍエ
チレンジアミン四酢酸・ニナトリウムを含む１．０ＭＭ
Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２００μｍを添加し、
直ちに１００℃で５分間煮沸して完全に反応を停止させ
る。室温まで冷却した後、コリン測定用試薬（コリンオ
キシダーゼ１００Ｕ、パーオキンターセ１００Ｕ、４−
アミノアンチピリン５０ｍｇ、フェノール２５ｍｇ、　
　ｌ−リドンＸ−１００５００ｍｇをｐＨ８０の０．Ｏ
ＩＭ　　トリス−塩酸緩衝液１００ｍ１に溶解したもの
）４ｍｌを添加し、３７°Ｃで２０分間反応させた後、
あらかじめ熱失活させた酵素を用いて同様に反応させた
ものを対照とし、５００ｎｍの吸光度を測定する。

夾−施一旬 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれによって制限されるものではない。

実施例　１ 培地として、ブドウ糖１０％、アスパラギン０．０５％
、リン酸二カリウム０．０５％、酵母エキス０７％、コ
ーンスチープリカー溶液（１０％Ｗ／Ｖコーンスチープ
リカー懸濁液をｐＨ７，０に調整し不純物を濾別したも
の）１０％を含むｐＨ７，２のものを用意し、その１０
０ｍｌヲ５００ｍｌ容の坂ロフラスコに入れ、蒸気滅菌
後Ｓ−１７０株の前培養液５ｍｌを植菌し、３０°Ｃで
３日間振とう培養した。

培養終了後菌体を濾別し、酵素活性が３８Ｕ／ｍｌの培
養濾液１００ｍ１を得た。次いで、」二部濾液に硫酸ア
ンモニウム６１ｇを攪拌しながら徐々に加え、生成した
沈殿を遠心分離により集め、得られた沈殿を０．０１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４、５）　　に溶解し、同緩衝液に
対して透析した。これを同緩衝液で平衡化した陽イオン
交換体ＣＭ−トヨパール６５０Ｍ［東ソー（株）製コを
加えて攪拌することによりホスホリパーゼＤをＣＭ−ト
ヨパールに吸着させた。ＣＭ−トヨバールを回収し、０
．５ＭＮａＣ１を含むＯ０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ５、
５）　　により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色
のホスホリパーゼＤ　　２２ｍｇ、３０２Ｕを得た。培
養濾液からのホスホリパーゼＤの活性回収率は７８％で
あった。

実施例　２ 実施例１で用いた培地５１で、実施例１と同様の操作を
経てＣＭ　−１−ヨバールから活性画分を溶出した。

この溶出液に２５％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、同じく２５％飽和とした０　０２Ｍ　トリス−
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７、５）で平衡化した疎水性クロマ
ト用担体ブチル−トヨバール６５０Ｍ［東ソー（株）製
コのカラムに通液し、ホスホリパーゼＤを吸着させた。

１５〜２５％飽和の０．０２Ｍ１−リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）　　を、硫酸アンモニウム濃度を段階的に
落として通液することにより洗浄し、硫酸アンモニウム
を含まない緩衝液で活性画分を溶出した。

限外濾過膜（１０ＰＭＩＯ）　［アミコン社製］により
ＯＯＩＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に置換し
、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換体ＤＥＡＥ−ｈヨ
バール６５０Ｍ［東ソー（株）製〕のカラムに通し、食
塩濃度勾配（０〜０．３Ｍ）　　により活性画分を溶出
した。

コロジオンバッグ［ザルトリウス社製］により溶出液を
濃縮し、０．０２５Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）　　で平衡化したゲル濾適用担体トヨパールＨＷ
−５５Ｆ［東ソー（株）製コのカラムに通し、活性画分
を回収した。

この溶出液を０．０２５Ｍイミダゾール−酢酸緩衝液（
ｐＨ７，４）　　に置換後、ポリバッファ交換体ＰＢＥ
”９４［ファルマ、シア・ファインケミカルス社製コの
カラムに通し、同社製ポリバッファ（ｐ　Ｉ（５、０）
　　を用いｐ　Ｈ勾配により溶出した。得られた活性画
分のポリバッファの除去はトヨパールＨＷ−５５Ｆのゲ
ル濾過を行った。

かくしてＳＤＳ電気泳動て単一なホスホリパーゼＤ　　
７４８６Ｕを得た。」二部精製操作におけるホスホリパ
ーゼＤの活性回収率は約３９％で、得られた精製品の比
活性は１４３７　Ｕ　／　ｍｇタンパクであった。

次に、精製品について下記のような理化学的性質の試験
を行った。

■至適ｐ　Ｉ−Ｔ 前述の酵素活性測定法における緩衝液を、他の種々の緩
衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素の
ｐ　Ｈ依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適ｐ　Ｔ−Ｔは５５イ」近にある。

■ｐ　Ｈ安定性 本酵素を０　、　Ｉ　Ｍ　ａ度の種々のｐ　Ｈの緩衝液
に溶解し、３７°Ｃで２時間静置した。その後、各ｐ■
−■の試料に対して２０倍８の０　、１　Ｍ　＋−リス
−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ５、５
）を加え、酵素活性を測定した。結果は第２図のとおり
てあり、本酵素はｐ　Ｈ４〜８で安定であることがわか
る。

■至適温度 前述の酵素活性測定法における酵素反応の温度を種々に
変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温度
依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、至
適温度は５５〜６５℃にある。

■熱安定性 本酵素を０．０５Ｍ１−リス−マレイン酸−水酸化すト
リウム緩衝液（ｐＨ５，５）　　中で、２５〜７５°Ｃ
に３０分間静置した後、残存する酵素活性を測定した。

その結果は第４図のとうりであり、５５°Ｃまで安定で
あることがわかる。

■種々の物質の影響 前述の酵素活性測定法において、塩化カルシウム溶液を
他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中の
物質濃度が１ｍＭになるようにして、゛酵素活性を測定
した。各種物質無添加のときの活性と比較すると、Ｃａ
　Ｃ］　２　。

ＦｅＣｌａ、ＦｅＳＯ４，ＢａＣｌ２゜Ｍ　ｎ　Ｃ］　
２　、　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２　、　　Ｃｕ　Ｃ］　２　。

ＺｎＣｌ＋、５ｎＣＩ２．ＡｌＣｌ’３゜Ｃｏ　ＣＩ　
２　、　　Ｃｄ　ＣＩ　２　、　　Ｌ　ｉＣＩ　、　　
ＫＣＩ　。

ＮａＣＩ、　　コール酸ナトリウム、デオキシコール酸
ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸・ニナトリウムで
は、活性の変化は認められなかった。塩化セチルピリジ
ニウムでは、若干の活性か阻害された。

■分子量 濃縮ゲル４５％Ｔ１　分離ゲル１０％Ｔの５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドで電気泳動をおこなった。分子量マーカ
ーとしてＡｌｂｕｍｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ）。

Ｃａｔａｌａｓｅ、　　Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、　　Ｇｌ
ｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　　Ｌａｃｔａｔｅ　ｄ
ｅｈｙｄｒｏ−ｇｅｎａｓｅも同時に泳動し、Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ　Ｇ−２５に
より染色した。各分子量マーカーの移動度と分子量の関
係から算出した結果、本酵素の分子量は６４万であった
。

■等電点 本酵素を、「干白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）■
　３７に従いゲル等電点電気泳動にかけ、泳動終了後テ
ィスフを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水による
抽出液について、ｐ　Ｉ−Ｉおよび酵素活性を測定した
。その結果、本酵素の等電点はｐ　Ｈ６、４〜６５であ
った。

実施例　３ 大豆製ホスファチジルエタノールアミン２．５ｍｇ、ジ
エチルエーテル１７０μｍ、グリセロール７９ｍｇ　、
ＬＭ　ＣａＣ１２６，８μｌ。

０．８Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）１７μｍ、実施例１
で得たホスホリパーゼＤ　　ＩＵ　を含む０１％牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）溶液８３５μｍを混合し、室温で
攪拌しながら１２時間反応した。ジエチルエーテル　エ
タノール（３：２）２１０μｍを添加してよく混合し、
」二層中のリン脂質組成を日本油化学協会編基準油脂分
析試験法２．２．８．４　ａ−８６に従い分析した。そ
の結果は第１表のとおりで、９６２％のホスファチジル
グリセロールを生成した。

また第１表には、キャベツ、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ（Ｓ、Ｃ，）、　Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｃｈｉｊｏｅｎ−ｓｉｓ（Ｓ、
Ｈ，）を起源とするホスホリパーゼＤを同条件下で用い
たときの分析値も合わせて示した。

第１表 ＰＧ　　・　ホスフγチシ′ルク゛リセロ四し、　　　
Ｐ　Ａ　：　ホスファチジン酸Ｐ　Ｅ　：　ホスフγチ
ソ゛ルエタノールアミン実施例　４ 大豆製ホスファチジルコリンＬｏｇ、ジエチルエーテル
６５０ｍ１、グリセロール６０２　ｇ’。

０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＩ（５，６）　　１３０ｍ１、
実施例１で得たホスホリパーゼＤ　　４０００Ｕ。

蒸留水４２ｍ１を混合し、攪拌しながら８時間反応した
。ジエチルエーテル８００ｍ１を添加して抽出し、エー
テル相を３ＭＮａＣ１、蒸留水で洗ａ１シた後、実施例
３と同様にリン脂質組成を分析した。その結果、反応生
成物中の９５４％がホスファチジルグリセロールであり
、ホスファチジン酸は検出されなかった。また、未反応
のホスファチジルコリン　０２％、不純物４４％が存在
した。

光匪■効課 本発明のホスホリパーゼＤは、」二連のように従来の製
造法により得られるものと比較して、高いホスファチジ
ル基転移活性を有している。

また本酵素によるホスファチジル基転移反応では、ホス
ファチジン酸はほとんと生成せず、リン脂質誘導体を効
率よく製造することができる。

＝２５− 本酵素を使用してホスファチジル基転移反応を行えば、
目的のリン脂質誘導体を、従来よりはるかに高い収率で
製造でき、極めて簡易な精製操作で製品の純度を向」ニ
させることができるという利点がある。

本発明に使用されるストレプトマイセス属Ｓ−１７０株
は、安価な培地成分で十分量の本酵素を生産することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせす、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。

また、本酵素はｐＨ，温度等に対する安定性が良好で、
工業的な利用に有利である。

以上のように、本発明は、ホスファチジル基転移反応で
リン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コストで
製造できるようにする優れたものである。

−２６＝

【図面の簡単な説明】

第１図二本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のｐ　Ｈ依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素の安定性に及はすｐＨの影響を示
すグラフ。　□ 第３図・本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図９本発明の酵素の安定性に及はす温度の影響を示
すグラフ。 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区大手町１丁目２番３号氏　名
　　株式会社　ホーネンコーポレーション４、補正命令
の日付　　平成２年　７月１６日第１１図 　Ｈ 第２図 ｐ■ｒ 第３図 第４図 ２０　　　／−１０ｂリ　　　ｄｌＪ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するホスホリパーゼＤ： （ａ）作用 （１）加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［Ｉ］ （但し、式中Ｒ＿１、Ｒ＿２はアシル基またはアルキル
   基、Ｘは水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後
   に残る有機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解
   し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる； （２）ホスファチジル基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジル
   基を下記一般式［II］ Ｒ＿３−ＯＨ・・・・・・・・・［II］ （但し、Ｒ＿３はアルコール性水酸基に結合した有機基
   を示す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール
   等のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下、 アルコール性水酸基にホスファチジル基 を転移させ、下記一般式［III］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［III
   ］ （但し、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３は前記と同様の基を示
   す）で表されるリン脂質誘導体を生成する； （ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００と
   した場合の相対活性は、 リゾホスファチジルコリンに対し２．３、スフィンゴミ
   エリンに対しては０．９である；（ｃ）至適ｐＨ：約５
   ．５ （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜８で安定 （ｅ）至適温度：５５〜６５℃ （ｆ）熱安定性 ｐＨ５．５において５０℃、３０分間の熱処理で全く失
   活せず、７０℃、３０分間でも約５０％の活性が残存す
   る； （ｇ）種々の物質の影響 濃度１ｍＭの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
   性は塩化セチルピリジニウムのとき若干阻害されるが、 ＣａＣｌ＿２、ＦｅＣｌ＿３、ＦｅＳＯ＿４、ＢａＣｌ
   ＿２、ＭｎＣｌ＿２、ＭｇＣｌ＿２、ＣｕＣｌ＿２、Ｚ
   ｎＣｌ＿２、ＳｎＣｌ＿２、ＡｌＣｌ＿３、ＣｏＣｌ＿
   ２、ＣｄＣｌ＿２、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、コー
   ル酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、エチレ
   ンジアミン四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない
   ； （ｈ）分子量 ６．４万（ＳＤＳ・ＰＡＧＥ法による）。 （ｉ）等電点 ｐＨ６．４〜６．５（等電点電気泳動法による）。 （２）ストレプトマイセス属に属するＳ−１７０株を培
   養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取することを特
   徴とするホスホリパーゼＤの製造法。