JPS58212783A - 発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法 - Google Patents
発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法Info
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- JPS58212783A JPS58212783A JP57097078A JP9707882A JPS58212783A JP S58212783 A JPS58212783 A JP S58212783A JP 57097078 A JP57097078 A JP 57097078A JP 9707882 A JP9707882 A JP 9707882A JP S58212783 A JPS58212783 A JP S58212783A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるホスホリパーゼＡの製造法に関す
る。さらに詳しくは、本発明はストレプトミセス属に属
し、ホスホリパーゼＡ生産能を有干る微生物を栄養培地
に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡを生成せしめ、
これを採取することを特徴とするホスホリパーゼＡの製
造法に関する。ホスホリパーゼ、ａ、 （Ｂ、ｃ、 ３
．１．１゜４）はグリセロリン脂質に作用し、１分子の
脂肪酸と対応するリゾリン脂質を生成する酵素である。
る。さらに詳しくは、本発明はストレプトミセス属に属
し、ホスホリパーゼＡ生産能を有干る微生物を栄養培地
に培養し、培養物中にホスホリパーゼＡを生成せしめ、
これを採取することを特徴とするホスホリパーゼＡの製
造法に関する。ホスホリパーゼ、ａ、 （Ｂ、ｃ、 ３
．１．１゜４）はグリセロリン脂質に作用し、１分子の
脂肪酸と対応するリゾリン脂質を生成する酵素である。
ホスホリパーゼＡは、リン脂質の代謝に関連する研究用
試薬やまた最近では種々の用途に用いられるリン脂質あ
るいは天然成分中に含まれているり／脂質の加工や修飾
に対する用途が着目され始めている。
試薬やまた最近では種々の用途に用いられるリン脂質あ
るいは天然成分中に含まれているり／脂質の加工や修飾
に対する用途が着目され始めている。
本酵素は小腸、肝臓、膵臓などの動物組織のホカ、微生
物ｆｔｉ酵ｆｔｔ （Ｌｉｐｉａｓ、 ｖｏｗ、 ２．
２７９（１９６７） ： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ｙｏＬ７０．３５１（１９６
３））ｌ大腸菌（Ｂｉｏｃｈｔｍ。
物ｆｔｉ酵ｆｔｔ （Ｌｉｐｉａｓ、 ｖｏｗ、 ２．
２７９（１９６７） ： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ｙｏＬ７０．３５１（１９６
３））ｌ大腸菌（Ｂｉｏｃｈｔｍ。
Ｂｉｏｐｈ７ｓ、Ａｃｔａ、’ｙｏＬｌ ４４１ １７
１ （１９６７）： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂ１０ｐｈｙ
ｓ、 Ａｃｔａ、 ＶＯｌ、 １７６ｔ １２０（１９
６９））ｌ ミコバクテリウム・フビイ（Ｍ２ＣＯ３
）ａ（！ｆ；ｅｒｌｕ！ｎ ｐｈｌｅｉ ） ［Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
１ （１９６７）： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂ１０ｐｈｙ
ｓ、 Ａｃｔａ、 ＶＯｌ、 １７６ｔ １２０（１９
６９））ｌ ミコバクテリウム・フビイ（Ｍ２ＣＯ３
）ａ（！ｆ；ｅｒｌｕ！ｎ ｐｈｌｅｉ ） ［Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
ＡＣｔａ、 ＶＯｌ、 １７６１ １１１ （１９６９
） ３などに見いだされている。
） ３などに見いだされている。
本発明者らは、ホスホリパーゼＡを生産する能力を有す
る微生物を広範囲にわたって検索した結果、ストレプト
ミセス属に属する菌株が培養物中、とくに菌株外（培養
液中）にホスホリパーゼＡを生産することを見いだし本
発明を完成した。
る微生物を広範囲にわたって検索した結果、ストレプト
ミセス属に属する菌株が培養物中、とくに菌株外（培養
液中）にホスホリパーゼＡを生産することを見いだし本
発明を完成した。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に使用される微生物は、ストレプトミセス属に属
し、ホスホリパーゼＡを生産する能力を有するものであ
れば、いずれの菌株でもよい。好適な菌株としては、ス
トレプトミセス・スカビエス（３ｔｒｅｐｔｏ釘ｃｅｓ
５ｃａｂｉｅｓ ）又はストレプトミセス・アクロモ
ゲネス・バラエティ・ストレプトミセス（ｓｔｒ＠ｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ’Ｖａｒ、
５ｔｒｅｐｔｏｚｏｔｉｃｕｓ）Ｋ属し、ホスホリパー
ゼＡを生産する能力を有する菌株があげられる。
し、ホスホリパーゼＡを生産する能力を有するものであ
れば、いずれの菌株でもよい。好適な菌株としては、ス
トレプトミセス・スカビエス（３ｔｒｅｐｔｏ釘ｃｅｓ
５ｃａｂｉｅｓ ）又はストレプトミセス・アクロモ
ゲネス・バラエティ・ストレプトミセス（ｓｔｒ＠ｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ’Ｖａｒ、
５ｔｒｅｐｔｏｚｏｔｉｃｕｓ）Ｋ属し、ホスホリパー
ゼＡを生産する能力を有する菌株があげられる。
具体的にはストレプトミセス・スカビエスＡＴＣＣ１！
１４８５＃ストレプトミセス・アクロモゲネス・バラエ
ティ・ストレプトゾチカスＮＲＲＬ２６９７等があげら
れる。
１４８５＃ストレプトミセス・アクロモゲネス・バラエ
ティ・ストレプトゾチカスＮＲＲＬ２６９７等があげら
れる。
本発明の培養においては、通常の放線菌の培養法が一般
に適用される。
に適用される。
培養のために用いられる炭素源としてはブドウ糖Ｉ釆糖
９Ｍ糖Ｉ乳糖−糖蜜Ｉ殿粉、デキストリノ、グリセリン
などが単独または組み合わせて用いられる。さらに菌の
資化性によっては炭化水素ｔアルコール類、有機酸、脂
肪酸、油脂・粗レシチンなども用いられる。窒ｆ源とし
ては無機もしくは有機窒素含有物、例えば塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝
酸ソーダなどが、また天然窒素含有物、例えばペプトン
、肉エキス、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー
、大豆粉−犬豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブル
ベジタブルプロテインなどが単ａ９：または組み合わせ
て用いられる。そのほか必要に応じて食塩。
９Ｍ糖Ｉ乳糖−糖蜜Ｉ殿粉、デキストリノ、グリセリン
などが単独または組み合わせて用いられる。さらに菌の
資化性によっては炭化水素ｔアルコール類、有機酸、脂
肪酸、油脂・粗レシチンなども用いられる。窒ｆ源とし
ては無機もしくは有機窒素含有物、例えば塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝
酸ソーダなどが、また天然窒素含有物、例えばペプトン
、肉エキス、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー
、大豆粉−犬豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブル
ベジタブルプロテインなどが単ａ９：または組み合わせ
て用いられる。そのほか必要に応じて食塩。
塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、
カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類が使用されるほ
か、本菌の生育やホスホリパーゼＡの生産を促進する有
機物や無機物を適当に添加することができる。
カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類が使用されるほ
か、本菌の生育やホスホリパーゼＡの生産を促進する有
機物や無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、液体培養法がよく、工業的には深部通
気攪拌培養法がもっとも適している。
気攪拌培養法がもっとも適している。
培養温度は２２〜４０℃の範囲で行なうことができるが
、２５〜３５℃が好適である。ｐＨは中性または微アル
カリ性の範囲にあることが望ましい。培養期間は条件に
よって変ってくるが、通常２〜６日程度であり、ホスホ
リパーゼＡの生成が確認されたとき、好ましくは生成が
最大に達したときに培養を停止する。本酵素は主として
培養液中に存在するので、培養終了液より菌体をｆ別し
て得られる培養浄液よシホスホリパーゼＡの採取を行な
う。
、２５〜３５℃が好適である。ｐＨは中性または微アル
カリ性の範囲にあることが望ましい。培養期間は条件に
よって変ってくるが、通常２〜６日程度であり、ホスホ
リパーゼＡの生成が確認されたとき、好ましくは生成が
最大に達したときに培養を停止する。本酵素は主として
培養液中に存在するので、培養終了液より菌体をｆ別し
て得られる培養浄液よシホスホリパーゼＡの採取を行な
う。
培養ｐ液よυホスホリパーゼＡの採取にあたっては通常
酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用できる。例え
ば、減圧濃縮、塩析、有機フィーあるいは凍結乾燥等の
方法が使用でき、さらにこれらの方法を適当に組み合わ
せることによってホスホリパーゼＡの精製を効果的に行
なうことができる。
酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用できる。例え
ば、減圧濃縮、塩析、有機フィーあるいは凍結乾燥等の
方法が使用でき、さらにこれらの方法を適当に組み合わ
せることによってホスホリパーゼＡの精製を効果的に行
なうことができる。
ホスホリパーゼＡの酵素活性の測定法は次の方法によっ
て行なった。
て行なった。
本測定法はホスホリパーゼＡ反応によって生成する遊離
脂肪酸を酵素法によって定量することを基本としている
。
脂肪酸を酵素法によって定量することを基本としている
。
ホスホリパーゼＡ水溶液［：０．０１〜１０％（Ｗ／ｖ
） ’ｉ ｏ、ｚｍｊ、 ０．１ Ｍ塩化カルシウム
水溶液０．１ｍ、０．２Ｍ）リスマレエイト−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，ｏ）ｏ、５ｍ、水０，２ｄか
らなる酵素液１ｄを、３７℃で５分間加温した後、同じ
く３７℃に加温した基質液（２ｔＩ６（Ｗ／Ｖ ） Ｓ
Ｌ Ｐ−ホワイト（ツルーレシチン株水溶液）１ｙを
加え、３７℃でホスホリパーゼＡ反応を進行させる。正
確に１０分間反応させた後、反応停止液（クロロホルム
２量とメタノール１量の混液）Ｏ，Ｓ−を加えホスホリ
パーゼＡ反応を停止させる。本液２．５ｄより２０Ｉを
採取し、デタミナ−ＮＥＦＡ〔遊離脂肪酸定量用の酵素
キット、協和メデックス■〕を用いて遊離脂肪酸の定量
を行なう。なお対照として、基質液１反応停止液、酵素
液の順に加えたものを用い酵素活性を求める。
） ’ｉ ｏ、ｚｍｊ、 ０．１ Ｍ塩化カルシウム
水溶液０．１ｍ、０．２Ｍ）リスマレエイト−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，ｏ）ｏ、５ｍ、水０，２ｄか
らなる酵素液１ｄを、３７℃で５分間加温した後、同じ
く３７℃に加温した基質液（２ｔＩ６（Ｗ／Ｖ ） Ｓ
Ｌ Ｐ−ホワイト（ツルーレシチン株水溶液）１ｙを
加え、３７℃でホスホリパーゼＡ反応を進行させる。正
確に１０分間反応させた後、反応停止液（クロロホルム
２量とメタノール１量の混液）Ｏ，Ｓ−を加えホスホリ
パーゼＡ反応を停止させる。本液２．５ｄより２０Ｉを
採取し、デタミナ−ＮＥＦＡ〔遊離脂肪酸定量用の酵素
キット、協和メデックス■〕を用いて遊離脂肪酸の定量
を行なう。なお対照として、基質液１反応停止液、酵素
液の順に加えたものを用い酵素活性を求める。
ホスホリパーゼＡの酵素活性は、上記条件下で１分間に
１マイク・ロモルの遊離脂肪酸を生成する酵素量を１ユ
ニツトとして定義する。
１マイク・ロモルの遊離脂肪酸を生成する酵素量を１ユ
ニツトとして定義する。
次に実施例２より得られたホスホリパーゼＡの性質を示
す。
す。
（１）最適ｐＨ
３７℃、１０分間の反応条件では、ホスホリパーゼＡ活
性はｐＨ５，０〜８，０の範囲で簡い酵素活性を示すが
（最適１） Ｈ５，５〜８．０）、ｐＨ５，０以丁では
急激に酵素活性は低下する（第１図）。
性はｐＨ５，０〜８，０の範囲で簡い酵素活性を示すが
（最適１） Ｈ５，５〜８．０）、ｐＨ５，０以丁では
急激に酵素活性は低下する（第１図）。
（２）最適温度
ｐＨ７，０，１０分間の反応条件では、ホスホリパーゼ
Ａ活性は筒い反応温度依存性を示し、最適温度は５０℃
前後である（第２図）。
Ａ活性は筒い反応温度依存性を示し、最適温度は５０℃
前後である（第２図）。
（３）耐熱性
ｐＨ７，０，３０分間、各温度で熱処理した場合、４０
℃までは安定であるが、５０℃では約２０チ活性は低下
し、６０℃以上ではホスホリパーゼＡ活性は不安定であ
る（第３図）。
℃までは安定であるが、５０℃では約２０チ活性は低下
し、６０℃以上ではホスホリパーゼＡ活性は不安定であ
る（第３図）。
（４）基質特異性
本酵素はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファデシン酸ｔホスファチジルイノシ
トール、ボスファチジルグリセロール、ホスファチジル
セリンなトホトんど全てのグリセロリン脂質に作用し、
対応するリゾリン脂質と遊離脂肪酸を生成する。
ールアミン、ホスファデシン酸ｔホスファチジルイノシ
トール、ボスファチジルグリセロール、ホスファチジル
セリンなトホトんど全てのグリセロリン脂質に作用し、
対応するリゾリン脂質と遊離脂肪酸を生成する。
以下に本発明の態様を実施例によって説明する０
実施例１゜
可溶性殿粉２−０１／／ｄｉ、大豆粕１．Ｑｇ／ｄｌ。
乾燥酵母１．５１ ／ ｄｌ１Ｍｇ８０４・７ＨｚＯＯ
，ＩＪｉｌ／仏ＫＨ２ＰＯ４０，３１／ ／ ｄｌｒ
ＮａＣｌ Ｏ３３１／ ／ ｄｌ−レシチン［豊年レシ
チン−ＡＹ、豊年製油ａｌ］０．２１１／ｄからなる培
地（１）Ｈ７，２）１００ｍを５ＱＱａＪ容坂ロフラス
コに分注し、殺菌後、この培地に球入培地に着生した第
１表に示す菌株の胞子をそれぞれ一白金耳接種した。
，ＩＪｉｌ／仏ＫＨ２ＰＯ４０，３１／ ／ ｄｌｒ
ＮａＣｌ Ｏ３３１／ ／ ｄｌ−レシチン［豊年レシ
チン−ＡＹ、豊年製油ａｌ］０．２１１／ｄからなる培
地（１）Ｈ７，２）１００ｍを５ＱＱａＪ容坂ロフラス
コに分注し、殺菌後、この培地に球入培地に着生した第
１表に示す菌株の胞子をそれぞれ一白金耳接種した。
培養は温度３０℃で５日間振盪することにより行った。
菌体を除去した培養ろ液中のホスホリパーゼＡの活性を
先に述べた方法によって測定した。第１表に培養Ｆ液中
のホスホリパーゼＡの活性を示す。
先に述べた方法によって測定した。第１表に培養Ｆ液中
のホスホリパーゼＡの活性を示す。
第１表
実施例２
実施例１に示す培地３００−を２１容三角フラスコに入
れたものを６本詞製し、１２０℃で２０分殺菌後、この
種培地にストレプトミセス・スカヒエスＡＴＣＣ１５４
８５を接種した。
れたものを６本詞製し、１２０℃で２０分殺菌後、この
種培地にストレプトミセス・スカヒエスＡＴＣＣ１５４
８５を接種した。
培養は温度３０℃、攪拌２４０回転／分で２日間撮盪培
養した。この培養液（６不全ｉｔ）を３０１容ジヤー・
ノアメンタ−中の下記組成の本培地−１８７に加えた。
養した。この培養液（６不全ｉｔ）を３０１容ジヤー・
ノアメンタ−中の下記組成の本培地−１８７に加えた。
本培地：可溶性殿粉３． ＯＪｉ’ ／ ｄｌ＋大豆粕
１．０１７７ｄｉ、乾燥酵母２．０１／ ／ ｄｉ ＋
Ｍｇ８０４・７Ｈ１００，０５９／ｄｉ、 ＫＨ＊Ｐ
Ｏ４０，３１１／ｄｌ、 ｔＪａｃｌ ０．２１ ／
ｄｉ ＊豊年レシチｙ−ＡＹ ０．２ 、！ｉｔ ／ｄ
ｌカらナル培地（ｐＨ７，２）約１８７を１２０℃で１
５分殺菌後、無菌水を加えて１８／としたもの。
１．０１７７ｄｉ、乾燥酵母２．０１／ ／ ｄｉ ＋
Ｍｇ８０４・７Ｈ１００，０５９／ｄｉ、 ＫＨ＊Ｐ
Ｏ４０，３１１／ｄｌ、 ｔＪａｃｌ ０．２１ ／
ｄｉ ＊豊年レシチｙ−ＡＹ ０．２ 、！ｉｔ ／ｄ
ｌカらナル培地（ｐＨ７，２）約１８７を１２０℃で１
５分殺菌後、無菌水を加えて１８／としたもの。
３０１容ジヤー・ファメンターでの培養は通気量１２１
／分、攪拌３５０回転／分、温度３０℃で、４日間行な
りた。培讐後、培養液から菌体を遠心分離によって除去
した液１６ Ｉ！（６５４ｍＵ／ｍ ）にアセトン２４
Ｉ！を加えた後、遠心分離を行なってホスホリパーゼＡ
を含む沈殿物を得た。この沈殿物を０．０５ Ｍ ）
！Ｊス緩衝液（１）Ｈ７，５）に溶解し、七ロノ・ンチ
ューブを透析膜として、同緩へ液で一夜（約１６時間）
、５℃で透析した。透析チューブ内液を０．０５ Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡にしたダイアイオン
ＨＰＡ７１５（合成吸着剤、三菱化成■〕カラム（２１
）に通塔し、０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ７．５
）にｏ、 ｏ ｓ ％ （ＶＶ ） ノ）リド７Ｘ−１
００（ポリオキシエチレン系界面活性剤、シグマ社）を
溶解した液に溶かした塩化す） ＩＪウムの０〜１．０
Ｍの濃度匂配で溶出を行なった０ホスホリパーゼＡの溶
出区分を集め、これにアセトンを添加し、６５ ％ （
Ｖ／Ｖ ）アセトン濃度にした後、遠心分離によって沈
殿物を得た。
／分、攪拌３５０回転／分、温度３０℃で、４日間行な
りた。培讐後、培養液から菌体を遠心分離によって除去
した液１６ Ｉ！（６５４ｍＵ／ｍ ）にアセトン２４
Ｉ！を加えた後、遠心分離を行なってホスホリパーゼＡ
を含む沈殿物を得た。この沈殿物を０．０５ Ｍ ）
！Ｊス緩衝液（１）Ｈ７，５）に溶解し、七ロノ・ンチ
ューブを透析膜として、同緩へ液で一夜（約１６時間）
、５℃で透析した。透析チューブ内液を０．０５ Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡にしたダイアイオン
ＨＰＡ７１５（合成吸着剤、三菱化成■〕カラム（２１
）に通塔し、０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐＨ７．５
）にｏ、 ｏ ｓ ％ （ＶＶ ） ノ）リド７Ｘ−１
００（ポリオキシエチレン系界面活性剤、シグマ社）を
溶解した液に溶かした塩化す） ＩＪウムの０〜１．０
Ｍの濃度匂配で溶出を行なった０ホスホリパーゼＡの溶
出区分を集め、これにアセトンを添加し、６５ ％ （
Ｖ／Ｖ ）アセトン濃度にした後、遠心分離によって沈
殿物を得た。
この沈殿物を０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（１）Ｈ７，
５）に溶解し、上に述べた方法と同様にして一夜透析し
た。透析内液は０．．０５ Ｍ ） ＩＪス緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衡にしたｐｌＡＥ−セファデックス（Ｂ
ｓｐｈａｄｓｘ） Ａ −５０（９Ａ塩基性イオン交換
体・ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ Ｉｎｃ、 、製）カラム（５００ｍ）に通塔し、ｏ
、 ０５ ％ （Ｗ／Ｖ ） ）リドンＸ−１００を含
む０．０ＩＳＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した
塩化ナトリウムのθ〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を行な
った。ホスホリパーゼＡの溶出区分な集め、これにアセ
トンを添加し、６０ ％ （Ｖ／’Ｊ ）アセトン濃度
にした後、遠心分離によって沈殿物を得た０この沈殿物
を０、０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐ Ｈ７，５）に溶解
した。
５）に溶解し、上に述べた方法と同様にして一夜透析し
た。透析内液は０．．０５ Ｍ ） ＩＪス緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衡にしたｐｌＡＥ−セファデックス（Ｂ
ｓｐｈａｄｓｘ） Ａ −５０（９Ａ塩基性イオン交換
体・ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ Ｉｎｃ、 、製）カラム（５００ｍ）に通塔し、ｏ
、 ０５ ％ （Ｗ／Ｖ ） ）リドンＸ−１００を含
む０．０ＩＳＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した
塩化ナトリウムのθ〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を行な
った。ホスホリパーゼＡの溶出区分な集め、これにアセ
トンを添加し、６０ ％ （Ｖ／’Ｊ ）アセトン濃度
にした後、遠心分離によって沈殿物を得た０この沈殿物
を０、０５ Ｍ ）リス緩衝液（ｐ Ｈ７，５）に溶解
した。
この溶解液をさらに同緩衝液で平衡にしたＤＥＡ］！！
セファデックスＡ−５０カラム（５ｏｏｍｚ）Ｋ通塔し
、ｏ、 ０５ ％ （ｗ、／ｖ ） トリドアＸ−１０
０を含む０．０５Ｍ）リス緩衝液（ＰＨ７，５）に溶解
した塩化ナトリウムの０〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を
行なった。溶出液をアンバーライトＸＡＤ−７（合成吸
着剤、 ＲＯｈｍ ＆ｌ Ｈａａ８ Ｃｏ、製）（２０
０ｙ）の力２ムに通してトリトンＸ−１００を吸着除去
した。この流出液にアセトンを添加し、６０％（ｖ／／
ｖ ）アセトン濃度にした後、遠ノし分離によって沈殿
物を得た。この沈殿物を０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（
ｐＨ７，５）Ｋ溶解し、上に述べた方法と同様にして一
夜透析した後この透析内液を、凍結乾燥した。培養液か
ら菌体を遠心分離によって除去した液を基準として約２
８％の活性収率でホスホリパーゼＡを採取した。比活性
は４８Ｕ／ｍ９蛋白質であった。
セファデックスＡ−５０カラム（５ｏｏｍｚ）Ｋ通塔し
、ｏ、 ０５ ％ （ｗ、／ｖ ） トリドアＸ−１０
０を含む０．０５Ｍ）リス緩衝液（ＰＨ７，５）に溶解
した塩化ナトリウムの０〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を
行なった。溶出液をアンバーライトＸＡＤ−７（合成吸
着剤、 ＲＯｈｍ ＆ｌ Ｈａａ８ Ｃｏ、製）（２０
０ｙ）の力２ムに通してトリトンＸ−１００を吸着除去
した。この流出液にアセトンを添加し、６０％（ｖ／／
ｖ ）アセトン濃度にした後、遠ノし分離によって沈殿
物を得た。この沈殿物を０．０５ Ｍ ）リス緩衝液（
ｐＨ７，５）Ｋ溶解し、上に述べた方法と同様にして一
夜透析した後この透析内液を、凍結乾燥した。培養液か
ら菌体を遠心分離によって除去した液を基準として約２
８％の活性収率でホスホリパーゼＡを採取した。比活性
は４８Ｕ／ｍ９蛋白質であった。
実施例３゜
ストレプトミセス・アクロモゲネス・バラエティ・スト
レプトミセスＮＲＲＬ２６９７を、可溶性殿粉２． Ｏ
Ｉ ／ ｄｌ ＊ ＭｇＢＯ４・７Ｈ２００，１ｇ／＃
、 ＫＨ！ＰＯ４０，３１／ ／ｄｊ、 ＮａＣｊ
０．３９７ｄＬ犬豆粕１．０．９／ｄｌ、粗レシチ
ン０．２．！９７ｄｌ、乾燥酵母１．５ｇ／ｄｊからな
る培地３００−を２１容三角フラスコに入れ１２０℃、
２０分殺菌したものに接種した。種培養は温度３０℃を
攪拌２４０回転／分で３日間行なった。仁の塊培養液を
可溶性殿粉３． ＯＥｌ ／ ｄＪ 、 ＭｇＢＯ４・
７Ｈ！００．１１ｉ ／ ｄｊ ｗ ＫＨｔＰＯ４０，
３ｆｉ ／ ｄｌ ＋ペプトン０．５１！／ａ、乾燥酵
母２．０ ！！／ｄＪ、 ＮａＣｊ ０．３．９ ／
ｄｉからなる培地（ＰＨ７，２）３／を５１容ジヤー・
ファーメンタ−に入れ１２０℃、４０分殺菌したものに
移した。本培養は通気ｉｋ３ノ／分。
レプトミセスＮＲＲＬ２６９７を、可溶性殿粉２． Ｏ
Ｉ ／ ｄｌ ＊ ＭｇＢＯ４・７Ｈ２００，１ｇ／＃
、 ＫＨ！ＰＯ４０，３１／ ／ｄｊ、 ＮａＣｊ
０．３９７ｄＬ犬豆粕１．０．９／ｄｌ、粗レシチ
ン０．２．！９７ｄｌ、乾燥酵母１．５ｇ／ｄｊからな
る培地３００−を２１容三角フラスコに入れ１２０℃、
２０分殺菌したものに接種した。種培養は温度３０℃を
攪拌２４０回転／分で３日間行なった。仁の塊培養液を
可溶性殿粉３． ＯＥｌ ／ ｄＪ 、 ＭｇＢＯ４・
７Ｈ！００．１１ｉ ／ ｄｊ ｗ ＫＨｔＰＯ４０，
３ｆｉ ／ ｄｌ ＋ペプトン０．５１！／ａ、乾燥酵
母２．０ ！！／ｄＪ、 ＮａＣｊ ０．３．９ ／
ｄｉからなる培地（ＰＨ７，２）３／を５１容ジヤー・
ファーメンタ−に入れ１２０℃、４０分殺菌したものに
移した。本培養は通気ｉｋ３ノ／分。
攪拌５５０回転／分、温度３０℃で５日間行なった。該
培養液より遠心分離によって菌体を除去した液２．６７
（３６７ｍＵ／ｓｕ）に硫酸アンモニウムを添加して６
０％（Ｗ／Ｖ ）濃度（飽和濃度である）とし、得られ
る沈殿物を遠心分離によって集めた。該沈殿物を０．０
５ Ｍ ） リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、それ
を同緩衝液で平衡にした１１のセファデックスＧ−２５
を含むカラムに通塔し、同緩衝液で溶出した。
培養液より遠心分離によって菌体を除去した液２．６７
（３６７ｍＵ／ｓｕ）に硫酸アンモニウムを添加して６
０％（Ｗ／Ｖ ）濃度（飽和濃度である）とし、得られ
る沈殿物を遠心分離によって集めた。該沈殿物を０．０
５ Ｍ ） リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、それ
を同緩衝液で平衡にした１１のセファデックスＧ−２５
を含むカラムに通塔し、同緩衝液で溶出した。
ホスホリパーゼＡの溶出区分を集め凍結乾燥を行った。
該凍結乾燥物を０．０５ Ｍ ） リス緩衝液（１）Ｈ
７，５）に溶解した後、同緩衝液で平衡にしたＤＦｉＡ
Ｅ−セファデックスＡ−５０のカフＡ（５００ｍ）に通
塔し、０．０５％（Ｗ／Ｖ ）トリトンＸ−１００を含
む０．０５ Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し
た塩化ナトリウムの０〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を行
なった。溶出したホスホリパーゼＡの活性区分に再び硫
酸アンモニウムを添加して６０チ濃度とし、ついで遠心
分離により沈殿物を得た。核沈殿物を０．０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、セロハンチー−ブを透
析膜として、同緩衝液で一夜５、℃で透析した。透析内
液は０．０５ Ｍ ） ＋７ス緩衝１（ｐＨｙ、ｓ）で
平衡にしたダイアイオンＨＰＡ７５カラム（ｚｏｏｍ）
に通塔し、０．０５％（Ｗ／Ｖ ） ）リド７Ｘ−１０
０を含む０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
した塩化ナトリウムのＯ〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を
行なった。
７，５）に溶解した後、同緩衝液で平衡にしたＤＦｉＡ
Ｅ−セファデックスＡ−５０のカフＡ（５００ｍ）に通
塔し、０．０５％（Ｗ／Ｖ ）トリトンＸ−１００を含
む０．０５ Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し
た塩化ナトリウムの０〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を行
なった。溶出したホスホリパーゼＡの活性区分に再び硫
酸アンモニウムを添加して６０チ濃度とし、ついで遠心
分離により沈殿物を得た。核沈殿物を０．０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、セロハンチー−ブを透
析膜として、同緩衝液で一夜５、℃で透析した。透析内
液は０．０５ Ｍ ） ＋７ス緩衝１（ｐＨｙ、ｓ）で
平衡にしたダイアイオンＨＰＡ７５カラム（ｚｏｏｍ）
に通塔し、０．０５％（Ｗ／Ｖ ） ）リド７Ｘ−１０
０を含む０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解
した塩化ナトリウムのＯ〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を
行なった。
溶出する活性区分に、硫酸アンモニウムを添加して６０
％（Ｗ／Ｖ ）濃度として、遠心分離により沈殿物を得
た。該沈殿物を０．０５ Ｍ ） リス緩衝液（１）Ｈ
７，５）に溶解し、セロハンチューブを透析膜として同
緩衝液で一夜５℃で透析した。
％（Ｗ／Ｖ ）濃度として、遠心分離により沈殿物を得
た。該沈殿物を０．０５ Ｍ ） リス緩衝液（１）Ｈ
７，５）に溶解し、セロハンチューブを透析膜として同
緩衝液で一夜５℃で透析した。
透析内液からトリトンＸ−１００を除去するために、該
透析内液をアンバーライトＸＡＤ−７（１０ｏ＊）に通
塔した。流出液中の活性区分を集め、凍結乾燥した。
透析内液をアンバーライトＸＡＤ−７（１０ｏ＊）に通
塔した。流出液中の活性区分を集め、凍結乾燥した。
培養液から遠心分離によって菌体を除去した液を基準と
して、約２３−の活性収率でホスホリパーゼＡを採取し
た。比活性は３７Ｕ／ＩＩｇ蛋白質であった。
して、約２３−の活性収率でホスホリパーゼＡを採取し
た。比活性は３７Ｕ／ＩＩｇ蛋白質であった。
第１図はホスホリパーゼＡの相対活性とｐＨとの関係を
示す。 第２図はホスホリパーゼＡの相対活性と温度との関係を
示す。 第３図はホスホリパーゼ六の熱安定性を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社ゝ之−
示す。 第２図はホスホリパーゼＡの相対活性と温度との関係を
示す。 第３図はホスホリパーゼ六の熱安定性を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社ゝ之−
Claims (1)
- ストレプトミセス属に属し、ホスホリパーゼＡ生産能を
有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にホスホリ
パーゼＡを生成せしめ、これを採取することを特徴とす
るホスホリパーゼ人の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57097078A JPS58212783A (ja) | 1982-06-07 | 1982-06-07 | 発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57097078A JPS58212783A (ja) | 1982-06-07 | 1982-06-07 | 発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58212783A true JPS58212783A (ja) | 1983-12-10 |
Family
ID=14182602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57097078A Pending JPS58212783A (ja) | 1982-06-07 | 1982-06-07 | 発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58212783A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5378623A (en) * | 1992-06-16 | 1995-01-03 | Sankyo Company, Limited | Phospholipase A1, process for its preparation and the use thereof |
| US6773731B2 (en) | 2002-10-18 | 2004-08-10 | James S. Campbell | Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein |
| WO2012104987A1 (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-09 | 国立大学法人福島大学 | 酵素及びその製造方法 |
-
1982
- 1982-06-07 JP JP57097078A patent/JPS58212783A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5378623A (en) * | 1992-06-16 | 1995-01-03 | Sankyo Company, Limited | Phospholipase A1, process for its preparation and the use thereof |
| US5521080A (en) * | 1992-06-16 | 1996-05-28 | Sankyo Company, Limited | Phospholipase A1, process for its preparation |
| US5538874A (en) * | 1992-06-16 | 1996-07-23 | Sankyo Company, Limited | Phospholipase A1, process for its preparation and the use thereof |
| US6773731B2 (en) | 2002-10-18 | 2004-08-10 | James S. Campbell | Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein |
| WO2012104987A1 (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-09 | 国立大学法人福島大学 | 酵素及びその製造方法 |
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