JPH04182496A

JPH04182496A - Ａｎｐ関連新規ペプチド

Info

Publication number: JPH04182496A
Application number: JP2307918A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Tanaka; 正治田中; Yoshiharu Minamitake; 義春南竹; Yasuo Kitajima; 北島　安雄
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 1992-06-30
Anticipated expiration: 2013-09-21
Also published as: JP2801079B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮束上皇科朋立団本発明は、強い血管弛緩活性と、ｃＧＭＰ産生活性、並
びに活性型ＡＮＰ受容体に高い親和性を有する新規心房
性ナトリウム利尿ホルモン（以下ＡＮＰと略す）に関す
る。

災米■肢歪ヒト心房性ナトリウム利尿ホルモンは、２８個のアミノ
酸からなる環状ペプチドで、ナトリウム利尿、血管弛緩
、血圧降下、アルドステロン分泌抑制等の多様な生理活
性を有している。

ヒト以外にも、種々の動物、組織より、ナトリウム利尿
ホルモンが単離されている。図−１にそれらの一次構造
を示した。一方、臨床上の有用性から、特にヒト、ラッ
トのＡＮＰは興味がもたれており、前述した多様な生理
活性機構を明らかにするため、現在まで数多くのＡＮＰ
誘導体が合成されてきた。しかしながら、ＡＮＰ受容体
が複雑であることが原因し、従来のＡＮＰ誘導体、例え
ば、断片化誘導体、置換体、環状部修飾体等は、生理活
性に直接的には関与していないと考えられているＣ−受
容体に高い選択性を示し、かつ生理活性に直接関与して
いるとされるＢ−受容体に結合しなくなるものがほとん
どである。すなわち、ＡＮＰ活性発現を明らかにするた
め、あるいは高活性誘導体を作成するために重要な、Ｂ
−受容体選択的なＡＮＰ誘導体は得られていないのが現
状である。

８　（”　しよ゛と　る１従って、本発明の目的の一つは、Ｂ−レセプターに高い
親和性を有する新規α−ｈＡＮＰ誘導体を作成すること
である。さらには、第一の目的を通し、より高い活性の
ＡＮＰ誘導体を作成することである。

”　”　−の本発明者は、従来より指摘されている活性発現に重要な
アミノ酸残基を、１）疎水性が重要であると考えられる
残基と、２）電荷が重要であると考えられる残基の２つ
に分類し、それぞれに対して以下に述べるような種々の
修飾を加えた。

疎水性が重要だと考えられている残基には、８位フェニ
ルアラニン、１２位メチオニンが挙げられる。

本発明者はこれらの残基の持つ、疎水性、水素結合能、
かさ高さ、あるいは脂肪族性等の科学的性質を変化させ
た。電荷が重要であると考えられている残基には、１１
位アルギニン、１３位アスパラギン酸、１４位アルギニ
ン、及び２７位アルギニンが挙げられる。これらの残基
に対しては、荷電グループ（グアニシド基、カルボキシ
ル基）を残したまで、α−炭素とこれらの荷電グループ
との距離を変化させた。本発明で合成した新規α−ｈＡ
ＮＰ誘導体の生理活性検定を、血管平滑筋培養細胞にお
けるレセプター結合能とｃＧＭＰ産生能、及びラット摘
出血管を用いた血管弛緩活性を測定することにより行っ
た。また新規α−ｈＡＮＰ誘導体のレセプター選択性を
、既に５ｐｅａｒらによって報告されている基準（Ｓｐ
ｅａｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、ｃｈｅｍ、＋］　６
７、１９８９）に従って判定した。すなわち、Ｃ−レセ
プターの含有率が９８％をこえるとされる、血管平滑筋
培養細胞におけるレセプター結合能をＣ−レセプター親
和性とし、Ｂ−レセプターによって引き起こされると考
えられている血管弛緩活性を、Ｂ−レセプター親和性と
見なし、その比をもってＢ、あるいはＣ−レセプターへ
の選択性とした。α−ｈＡＮＰは両レセプターに対して
同程度の親和性を有し、これらレセプターに対する選択
性は１である。また従来の構造活性相関研究により、Ａ
ＮＰの活性発現は、環状部とそれに続くＣ束部に支配さ
れ、環外Ｎ束部を踪いても活性が保持されることが明ら
かになっている（Ｎｕｔｔ　Ｒ，Ｆ、ｅｔａｌ、、　Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆＮｏｒｔｈ　Ａｓｅｒｉｃ
ａ、　１６巻、　１９−４１１９８７）。

本発明者は、α−ｈＡＮＰと同等の活性を有するα−ｈ
ＡＮＰ　（７−２８）を基本とし、疎水性残基に関して
は８位フェニルアラニンをパラクロロフェニルアラニン
、１′−ナフチルアラニン、２′−ナフチルアラニン、
チロシン、○−メチルチロシン、ホモフェニルアラニン
、あるいはフェニルグリソンにそれぞれ弛緩した誘導体
、及び１２位メチオニンをＳ−メチルシスティン、エチ
オニン、ブチオニンに置換した誘導体を合成した。また
荷電残基に関しては、１１位、１４位、及び２７位のア
ルギニン残基のうち一残基、二残基、あるいは三残基と
もホモアルギニンに置換した誘導体、１３位アスパラギ
ン酸残基に関しては、グルタミン酸、α〜ルアミノアジ
ピンで置換した誘導体を作成した。これらの誘導体の活
性を、前記の方法を用いて測定した結果、疎水性アミノ
酸修飾誘導体に関しては、［ｐＣＩＰｈｅ”］−α−ｈ
ＡＮＰ　（７−２８）が標品の５倍のｃＧＭＰ産生活性
、及び４倍の血管弛緩活性を持つこと、さらにはＢ−レ
セプターに対する選択性が標品の４．４倍に上昇するこ
とを見いだした。

一方、荷電残基の修飾誘導体に関しては、３ケ所あるア
ルギニン残基中、２残基をホモアルギニンに置換した誘
導体、［ｈＡｒｇ”・１４１一体、［ｈＡ、８口、　２
？］一体、及び［ｈＡｒｇｌ　ｌ：　ｔｊ　］一体、が
評品と比べ、血管弛緩活性がそれぞれ、４．１倍、５．
３倍、２．５倍に上昇し、−置換体では［ｈＡｒｇ１４
）　−体、［ｈＡｒｇ”］一体がそれぞれ２．０倍、２
．２倍に上昇することを見いだした。また、Ｂ−レセプ
ターへの選択性に関しては、［ｈＡｒｇ”・２７］一体
が標品の５．９倍の値を示した。以上を手帖すると、強
い血管弛緩活性を有する新規ＡＮＰ誘導体として、ａ）
　［ｐＣｌ−Ｐｈｅ８１−ａ−ｈＡＮＰ（７−２８）、
　ｂ）　［Ｍｐｒ’、ｐｃｉ−ＰｈｅＩ′］　−α−ｈ
ＡＮＰ（７−２８）、　ｃ）　［ｈＡｒｇ”°１４］−
ｃｒ−ｈＡＮＰ（７−２８）、　ｄ）　［ｈＡｒｇ””
　］　−α−ｈＡＮＰ（７−２８）、　　ｅ）　　［ｈ
Ａｒｇ”２７］　−ａ−ｈＡＮＰ（７−２８）、　ｆ）
［ｈＡｒｇ”］　−ａ−ｈＡＮＰ（７−２８）、　ｇ）
　［ｈＡｒｇ”］　−ａ−ｈＡＮＰ（７−２８）がいず
れも２倍から５倍の活性を示すこと、及びＢ−レセプタ
ーへの選択性に関しては、［ｐＣｌ−Ｐｈｅ”］　−ｃ
ｒ−ｈＡＮＰ（７−２８）、　　［ｈＡｒｇ”°２７］
−α−ｈＡＮＰ　（７−２８）が各々４．４．５．９倍
の親和性を示すことを見いだし本発明を完成した。これ
らの化合物は、従来にない強い弛緩活性、すなわちＢ−
レセプターへの高い親和性を有するものであり、血圧降
下剤、あるいは活性発現機構の解明に非常に有用な化合
物である。

これらの化合物は、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸
、または有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、
クエン酸等の酸付加塩に転換できる。

なお、本発明においては具体的実施例としてα−ｈＡＮ
Ｐ　（７−２８）の誘導体について記すが、本発明の知
見からすれば、同様の誘導体の作製は、すでに構造が明
らかにされているα−ｈＡＮＰ様活性を示す他のペプチ
ド（第１図に示すペプチド）に適応できることは自明で
ある。

本発明のペプチドは、標準的なペプチド合成法によって
製造できる。例えば−船釣な総置として、「生化学実験
講座１、タンパク質の化学■、第■部２０７−４９５頁
」　（東京化学同人）［ペプチド合成の基礎と実験・泉
屋信夫他共著」　（丸善）がある。

また、ＡＮＰ関連ペプチドに関しては、「ペプチドケミ
ストリー１９８４２２９−２３４頁、２３５−２４０貫
、及び２４１−２４６頁、泉Ｍ編集」　（蛋白研発行）
などに、その合成法が詳細に記載されている。本発明ペ
プチドは、基本的には上記の文献に記載されている合成
法に準して合成できるものである。本発明ペプチドは、
保護基のついたアミノ酸を固相法と称せられる方法で縮
合、延長させ、弗化水素で全保護基を除去した後、ジス
ルフィド結合反応を経て製造されたものである。

本明細書において特に標記のないアミノ酸はＬ−体であ
り、試薬類を含め以下に示される略号を用いた。

Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸Ａｓｐ　（ＯｃＨｅｘ）　：β−シクロヘキシルアスパ
ラギン酸Ｓｅｒ：Ｌ−セリン５ｅｔ（Ｂｚｌ）　：Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリンＧｌｎ
：Ｌ−グルタミンＧｌｙニゲリシン＾１ａ：Ｌ−アラニンＣｙｓ：Ｌ−システィンＣｙｓ（４ＭｅＢｚｌ）：４−メチルヘンシル−し−シ
スティンＭｅｔ：Ｌ−メチオニン１１ｅ：Ｌ−イソロイシンＬｅｕ　：　Ｌ−ロイシンＴｙｒ：Ｌ−チロシンＴｙｒ（ＢｒＺ）　：０−２−プロモヘンジルオキンカ
ルボニルーし一チロシンＰｈｅ：Ｌ−フェニルアラニンＡｒｇ：Ｌ−アルギニンＡｒｇ（Ｔｏｓ）　：Ｇ−トシル−し−アルギニンＭｐ
ｒ＋メルカプトプロピオニルｐｃｌ　Ｐｈｅ：パラクロローＬ−フェニルアラニン（
１）Ｎａｌ：１−Ｌ−ナフチルアラニン（２）Ｎａｌ：
２−Ｌ−ナフチルアラニンｈＰｈｅ：Ｌ−ホモフェニル
アラニンＰｇｌｙ：Ｌ−フェニルグリンンＴｙｒ　（ＯＭｅ）　：　Ｏ−メチル−し−チロシンｈ
ＡＲＧ：Ｌ−ホモアルギニンＣｙｓ（Ｍｅ）：Ｓ−メチルシスティンＢｔ：Ｌ−ブチ
オニンＥｔ：Ｌ−エチオニンＡｄρ：α−アミノ−し−アジピン酸Ｂｏｃ−：ｔ−ブチルオキシカルボニルＴＦＡ：　）リ
フルオロ酢酸ＮＭＰ：Ｎ−メチルビロリドンＤＭＳＯニジメチルスルホキシドＨＯＢｔ＋Ｎ−ヒドロキンヘンヅトリアゾール最終物の
純度検定を、下に示す薄層クロマトグラフィー、分析用
高速液体クロマトグラフィー、及びアミノ酸分析にて実
施した。

１　クロマ　グーフィー担体；シリカゲル６０　Ｆ−２５４（メルク）展開溶媒
：Ｒｆ＋　ｎ−ブタノール：酢酸：ビリジン：水＝４：１
：１：２Ｒｈ　ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝３０：２
０：　６　：２４ゝ　　　゛クロマ　ブーツ　− 機器：島津ＬＣ−６Ａシステムカラム：　ＹＭＣ−Ｐａｃｋ＾−３０２００５４，６φ
Ｘ　１５０ｎｕ＋＋展開溶媒：１８χＣＨ３ＣＮ１０．
１χＴＦＡから１８χＣＨ，ＣＮ１０．１χＴＦＡまで
の３０分リニアグラジェントｌｓｙ儀」目元機器；日立アミノ酸分折機８３５型１　　ＡＮＰ憬　　のム本発明ペプチドは、すべてアブライドハイオノステム社
製ペプチド合成機４３１型を用いてペプチド樹脂を作成
した。

１−１：化合物番号１；ｆｌ−Ｃｙｓ−ｐＣＩＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−３
ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ（ジスルフィド型）の合成０．７　ｇ　（０，５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂ
ｒ−Ｚ）−０−ＣＨｚ−ＰＡＭ樹脂より出発し、５０％
ＴＦＡによる脱Ｂｏｃ、　ＤＴＥＡによる中和、及びＤ
ＣＣ／ＨＯＢｔによる保護アミノ酸縮合を順次繰り返し
、約１．７ｇの対応する保護ペプチド樹脂を得た。この
ものをバラ・クレゾール（１，５絨）存在下、−２°Ｃ
で６０分間、）ＩＰ（８，５ｄ）処理した。得られた遊
離ペプチドを３０ＩＲＱのＴＦＡで抽出後濃縮し、エー
テルで沈澱とし、６５にの粗ペプチドを得た。このもの
を３２ｄの８Ｍウレア水に溶かし、フェリシアン化カリ
ウム（１４７ｍｇ、　４４．８μｍｏｌ）を含む８Ｍウ
レア水（２８８ｄ、　ｐＨ７，４）中に撹拌下、滴下し
た。滴下終了後、反応液を酢酸でｐ）１５とした後、Ｉ
　Ｎ　ＡｃＯＨで平衡化したＡＣ３−Ｘ４Ａ　（１０１
Ｒ１，ＣＩ−型）と、）ＩＰ−２０（１５０ｄ）の連結
カラムに添加した。

Ｉ　Ｎ　Ａｃ０Ｈ（５００ｄりで洗浄後、）ｆＰ−２０
に吸着したペプチドを８０％Ｃ８３ＣＮ／Ｉ　Ｎ　ＡＣ
Ｏ）Ｉで溶出した。ニンヒドリン陽性の両分を濃縮後、
水（５０ｄ）を加え凍結乾燥し、粗環状ペプチド（６０
０■）を得た。

次に、水で平衡化したイオン交換カラム（ＣＭ−２５Ｗ
、２φＸ１５ｃｍ）に添加し、水から０．５Ｍ　ＮＨ＜
０Ａｃ（ｐＨ７，２）への６０分間のりニヤグラジェン
トをかけ、流速７ａｆ／＋ｉｎでペプチドを溶出した。

主画分を集め０．１％ＴＦＡで初期化した逆相ｃｕｅカ
ラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　Ｄ−００Ｓ２φＸ２５ｃｍ）
に添加し、３０χＣＬＣＮ１０．１χＴＦＡから６０χ
ＣＨ３ＣＮ１０．１χＴＦＡへの６０分間のりニヤグラ
ジェントをかけ、流速］　Ｏｔｔｒｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ
で溶出させた。９７％以上の純度をもつ画分を集め、凍
結乾燥し７８■の目的物を得た。本実施例に基づき、化
合物番号２から２０までのＡＮＰ誘導体（表−１に示し
た）を同様に作成した。これらの物性値を表−２に示し
た。

２　　　′　の′ ２−１：レセプター結合能及びｃＧＭＰ産生活性の測定本発明で合成した化合物の上記活性を旧ｒａ　ｔａら（
Ｂ、Ｂ、ｌ？、Ｃ，１２８５３８，１９８５）　、及び
Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈら（Ｊ、Ｂ、Ｃ，挺ｉ１１２９
６０．１９８６）の方法に従って測定した。用いた細胞
は、ラット大動脈由来の血管平滑筋培養細胞（以下ＶＳ
ＭＣと略す）をＲｏｓｓらの方法（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、、　　５０　１７２．１９７１）に従って培養し
た４〜１５代目のものである。結合活性は＋２５１ラヘ
ルしたα−ｈＡＮＰのＩＣ，。と比較し、比活性を産出
した。ｃＧＭＰ産生冗進活性は、１０−９〜１Ｏ−５門
のα−ｈＡＮＰ、及びペプチドをＶＳＭＣと共にインキ
ュベートし、産出したｃＧＭＰ量を測定した。

なお、α−ｈＡＮＰによる最大反応値を１００％とした
ときの各ペプチドのＥＣ，。を求め、活性の指標とした
。

２−２：血管弛緩活性の測定ｌ５ｈｉｄａら（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、４ｆｉ　１２５０
．１９８５）の方法に準し、ＳＤ系雄ラント大動脈ラセ
ン標本を２×１０−’？Ｉノルエピネフィリンで収縮さ
せ、収縮が一定となった後、本発明で合成したペプチド
をｃｕｍｕｌａｔｉｖｅに加え、弛緩活性を測定した。

なお、測定値はα−ｈＡＮＰによる弛緩を１００％とし
、各ペプチドのＥＣ，。を算出した。上記のアッセイ系
における測定結果を表−３に示した。

全肌辺ガ来本発明において、強い血管弛緩活性を有する化合物番号
Ｌ　２．１４．１５．１６．１８．１９、Ｂ−レセプタ
ーに対して高い選択性を有する化合物番号ｌ。

１８を見いだした。これらは、ＡＮＰ活性発現機構を解
明するための有用な誘導体である。

表−２新規ＡＮＰ誘導体の物性値ａ）ＴＬＣ溶媒：Ｒｆｌ、ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｐ
Ｙ−ＦｌｚＯ＝４：１：１：２；Ｒｆ２．３０：６：２
０：２４゜ｂ）測定値は計算値と一致した。

【図面の簡単な説明】

第１回は、各種ＡＮＰ様物質のアミノ酸配列を比較した
図である。７：’、”、４

Claims

【特許請求の範囲】一般式【遺伝子配列があります】で示される新規ペプチド、及びそれらの生理的に許容さ
れうる酸付加物。ただし、式中（Ａ）はＨ−、Ｈ−Ｓｅ
ｒ、Ｈ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｈ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
、Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｈ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、またはＨ−Ｓｅｒ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒで示される、
環外Ｎ末部アミノ酸を示し、（Ｂ）はＨ−Ｃｙｓ、また
は−ＳＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＯ、（Ｃ）は−Ｐｈｅ−、−
ｐＣｌＰｈｅ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、ｈＰｈｅ
、Ｐｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、（Ｄ）はＡｒ
ｇ、ｈＡｒｇ、（Ｅ）はＣｙｓ（Ｍｅ）、Ｂｔ、Ｅｔ、
Ｉｌｅ、（Ｆ）はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｄｐ、（Ｇ）はＡ
ｒｇ、ｈＡｒｇ、（Ｈ）は−ＯＨ、Ａｓｎ−ＯＨ、−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ
、−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ｈＡｒｇ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｐｈｅ−ｈＡｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ、を示す。一般式で…
はジスルフィド結合を示す。