JPH04183392A - 生理活性物質を固定化した膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明ｊよ、生理活性物質を固定化した膜の製造方法に
関する。

（従来の技術） 酵素、補酵素、ホルモン、レセプター、阻害剤等の生理
活性物質を不溶性担体に固定化して得た固定化生理活性
物質は、バイオリアクター、バイオセンサー、アフィニ
ティークロマトグラフィー用材料などとして化学薬品・
食品・医薬品の製造、臨床診断、治療等に広く用いるれ
ている。これろの場合に於て、用いられている固定化生
理活性物質の形態としては粒子状のものと膜状のものと
があり、両者とも種々のグループによって研究されてい
る。

多孔質の粒子状の担体を用いた固定化生理活性物質につ
いては最も良く研究されているが、粒子内および粒子周
囲の非撹拌層に基く拡散制限により固定化生理活性物質
の効率が低下し、場合によって；よ、潜在活性のごく一
部しか利用されないことが指摘されている（例えば特公
昭５ｇ−３Ｄ６Ｔ３号）。

この問題点に対する対策として微孔性の膜ｊこ例えば酵
素を固定化し、基質水溶液を圧力を用□、）で膜中に透
過させる反応方法が開発されて−）る。

この１ｍな嘆固定住生理活性物質をバイオリアクター、
バイオセンサー、アフィニティー分離用材料、臨床診断
等に巾広く応用するためには、摸担体は蛋白質との非特
異的相互作用が極力小さ□、ハことが重要で、そのため
には親水性が高く、荷電を持たないセルロース等の多糖
類が材質として好ましい。

多孔質セルロース膜に酵素その他の生理活性物質を化学
結合により固定化する方法については既にいくつかの方
法が知られている。例えば特開昭５６−９７２３５号、
特公昭５８−４４３５７号、特公昭６２−３２９１９号
にはセルロース膜に酸化剤を作用させて活性化した後に
酵素を固定化する方法が開示されている。

又、英国特許第１．１８３．２６１）号にはセルロース
等の膜にトリアジン誘導体を作用させて活性化した後に
酵素を固定化する方法が開示されている。

これろの既知の方法ｊこよって生理１舌１生物質を固定
化したセルロース膜を得ることができるが、これるの方
法に：ままだ問題点があり、実用的ｊこ；よ満足できる
ものて；まな′、）。すなわち、酸化剤を用し）る活性
化法では、担体上に生成したアルデヒド基が生理活性物
質中の主にアミ７基と反応してンッフベースを形成する
ことにより固定化されると考えちれてｔハるが、ンッフ
ベースは不安定であるため：二面定住生理活性物質Ｏ脱
離がと１つやす：１８又、脱離を防くために＼ａ３Ｈ，
恒ＮａＢＨ郵＼等て還元する方法を、用゛、）ると、そ
の処理ｊ二より更ｊ：主理后牛が低下する。生理−百性
物質を！定住したあとて還元のような二段階目の反応を
要し−一し１方法としてトリアジン誘導体による生理活
性物質の固定化法が開発されたが、この方法で：ま！走
化反応の速度が遅いた於に固定化に比較的長′７１特開
を必要とし、不安定な生理活性物質の場合にはその開の
失活が問題となることがあるっ 又、英国特許第１．１８３．２６０号に；まトリアジン
誘導体による膜の活性化に際して膜（濾紙やコブトン布
）をアルカリに浸漬することが示されて□、）るが、セ
ルロース製の非対称膜（例えばミクロフィルター）の様
に細′、１繊維かみ成る非対称膜′こ二の方法を応用す
るとセルロースの加水分解ＯたＹか膜がかなり変形し、
又強度も劣化すると′、１う問題点がある。

そこで、活性化によってセルロース非対称膜の膜物性を
悪くすることなしに、しかも蛋白質に対して高い反応性
を持つ活性化手段を用−）だ固定化方法の開発が望まれ
ていた。

〈発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、流体に対する特性の優れたセルロース
製の非対称膜に対し、生理活性を極力維持したままで安
定な化学結合により生理活性物質を固定化する方法を提
供することにある。

（課題を解決するための手段）　　　　　　　　　　（
本発明の目的；まセルロース製非対称膜を下記−般式（
Ｉ）で表される化合物と反応させて活性化した後、生理
活性物質を化学結合により固定化することによって達成
された。

一般式（１） 本発明方法のプロセスは、次のスキームによりセルロー
ス＞　−［］Ｈ−Ｒ−ｃ−Ｒ→（セルロース）−且−Ｒ
口 （セルロース＞　−０−口−Ｒ−１１２Ｎ　−（生理活
性物質）□　（セルロース）−〇−ローＮＨ−（生理活
性物質）本発明で用いられるセルロース膜；ま膜の一方
Ｓ側に緻密な表面層を持ち、反対側の表面に比較的粗な
多孔質層を持つ、平膜または中空糸の形状の非対称膜で
ある。孔径が０．１μ〜１０μの範囲にある多孔質膜（
例えばミクロフィルター）や、更に孔径が小さく、分画
分子量で表わして１．０００〜１、０００．０００であ
る一ハわゆる眼外濾過膜が好ましく使用できる。これる
の膜の製造法については例えば特公昭４５−４６３３号
、特公昭６２−１５６４２号、特公昭６２−３４３４３
号に開示されている。、膵の草さ（中空糸の場合は壁部
分の厚さ）として；ｔｉｏμ以上のものが好ましく使用
できるが、１０μ〜３００μが更に好ましい。

次に、セルロース膜を前記一般式（Ｉ＞で表わされる化
合物と反応させて活性化する方法ｊこつし）で述べる。

粒子に対して同様な＠構に基づく活性化反応を行うこと
は公知（Ｓｔ、　Ｔ、　Ｗ、　Ｈｅａｖｎ　：　！Ｊｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　１
３５．１０２〜１１−．（１９８７））であり、その内
容：ま微小なアガロースまた：まセルロース粒子に１，
１′　−カルボニルイミダソール、Ｌ＋１′−カルボニ
ル−１，２，４−１−リアソール等を作用させて活性化
するものである。その標準的な活性化法１才、微小−；
アガロースまたはセルロース粒子０．３ｇに対して１，
１′−カルボニルイミダソールＱ、　７４ｍｍｏｌおよ
びジオキサン２０ｍ１を加え、室温で１５分間程度反応
させるものである。

しかし、膜につし）での活性化法は知ろれてＬハな―）
。

セルロース製非対称膜ｊ＝対して本発明者、１上記文献
ｊこ記載の反応条件で活性化を試みたがはＡとど活性化
されなかった。そこで反応条件を種々探索した結果、次
の条件でセルロース膜を活性化できることを見出した。

すなわち、セルロース膜０．３ｇに対して前言己一般式
（Ｉ）で表される化合物を５〜８０ＩＴＩＩＴｌｏβ、
好ましくは２０〜４ＱｍｍｏＡおよび溶媒１０〜１００
−１好ましくは５０ｍＩ！を加え、室温で５〜１５分間
反応させることにより活性化が行われた。ここで用いる
溶媒としては、アセトン、ジオキサン、ピリジン、アセ
トニトリル、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム等ヲ
挙げる二とができる。ユニで見出した反応方法：ま、一
般式（Ｉ）で表わされる化合物の１文が極めて高″、）
点て公知の方法と大きく異なる。

活性化反応により導入された活性基の量は、下ａ己のス
キーム：：示したようｊこエチレンジアミンを作用させ
ててミノ基を導入し、文Ｂ　（、Ａｎａｌ、［ｈｉｍ。

１へ：ｔａ、５８巻　２４８頁、１９７２年）に記載の
方法にしたがってピクリン酸とアミン基のイオン結合量
を測ることにより定量できる。

（セルｏ−ス）−０−［ニーＲ＝ｌｈ［’ＬＣＬＮＬ−
（セルＤ　−ス）　−０ＣＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２また
、セルロース膜を構成する全グルコースに対して、０．
１〜ｌＱｍｏβ％、より好ましくは０．５〜３．５ｍｏ
ｆ％導入されていることが生理活性物質の固定化には望
ましい。

次に活性化されたセルロース膜への生理活性物質の固定
化法につし）で述べる。まずｐＨ７〜９．５の範囲のバ
ッファーに画定化されるべき生理活（ｆｉ：物質を溶解
する。この時用□、）るバッファーはリン酸バッファー
、ホウ酸ハンファ−、モルフォリノエタンスルホンｉｌ
（ＭＥＳ＞バッファー、ヒト°ロキンエチルピペラジン
エタンスルポン ッファ−など１級アミン基を有しな一ハものが好ましヒ
１：又、必要により生理活性物質の安定化剤をさろに加
えてもよし１。圧力ｊ二よってセルロース膜中に二の溶
液を送り込み、４〜４０℃で１〜１２時間循謹させ反応
させる。固定化反応終了後、膜中にバッファー液を通過
させ、膜を洗浄する。さらにアルカリ又はエタノールア
ミン等のアミンの水溶液を通過させる二とにより、膜に
残存する活性基と反応させて不活性化し、最後：＝再び
バッファー液で洗浄する。

以上に述べた方法により、生理活性物質を非対称セルロ
ース膜に固定化することができる。

本発明によって固定化される生理活性物質は、酵素、補
酵素、抗体、ホルモン、レセプター、レクチン、阻害剤
等である。酵素としで；ま、例え；ビトリプンン、キモ
トリブンン、サーモライシン、パパイン、アスパラギナ
ーゼ、リバーセ、アミラーセ、セルラーセ、リソチーム
、ウレアーゼなとの加水分解酵素、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコース万キンダ
ーセ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキ
ンターセ、ベルオキシダーセ、カタラーゼ、スーパーオ
キントデイスムターゼなどの酸化還元酵素、ヘキソキナ
ーゼ、タレアチンキナーゼ、アラニントランスアミナー
ゼなどの転移酵素、フマラーゼ、アスパルテートアンモ
ニアリアーゼ、スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸デ
カルボキンラーゼなどのリアーゼ、グルコースリン酸イ
ソメラーセ、メチルマロニルＣＯ＾ムスターゼなどの異
性化酵素、グルタミンンンセターゼ、アセチルＣｏＡカ
ルボキシラーゼ、Ｄ　Ｎ　、Ａ　ＩＪガーゼなどのりガ
ーゼ等をあげることができる。その他の生理活性物質と
してはＮｇ−（６−アミノヘキシル）−Ａ〜ｆｐなどの
補酵Ｓ誘導体、免疫グロブリンおよびそのＦａｂフラグ
メント、プロティンＡ等のハクテリアルＦｃレセプター
、コンカナバリンＡや小麦胚芽アグルチニンなどのレク
チン、大豆トリブンン、インヒビターなとの阻害剤、フ
ェニルアラニン、トリアドファンなどのアミノ酸、フィ
ブロネクチン及びその部分配列などがあげられる。

（発明の効果） 活性化した担体に生理活性物質を固定化する段階て失活
が少なく、又、経時で生理活性物質が脱離しな□、）こ
と：ま固定化生理活性物質にとって極めて重要である。

この点：こ於てセルロース膜に関して公知の方法、即ち
、酸化剤による；活性化法およびトリアジン誘導体によ
る１活性化法にはまだ改良がなされなければなろなし）
。本発明に従って活性化されたセルロース膜：ま生理活
性物質との反応性が高く、又、ポンプを用いて生理活性
物質を膜内に送り込むため拡散に要する時間も必要な′
、）。その結果多くの生理活性物質の場合、４℃で１〜
数時間で固定化が完了し、安定な化学結合が構成される
。これ：ま前記の公知の方法での固定化が４℃で１２時
間かろ４０℃で一昼夜の条件で行なわれるの：二対して
、短時間で済むため生理活性の低下が少な′−）Ｃ また、セルロース膜および生理活性物質との結合部位が
親木的かつ非イオン性であるため、蛋白質等の非特異吸
着が無く、センサーやアフィニティ分離用材料への応用
にも適して５）る。

さる：＝、セルロース膜はほとんどのを殿溶媒にも耐え
るため、有機溶媒系で本発明の固定化生理活性物質を使
用することもできる。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に詳細：＝説胡するが、
本発駅はこれろに限定されるもので：よな−）。

実施例１．活性化膜の製造 セルロース製ミクロフィルターＦＲ−４ｏ　（ｘ±写真
フィルム■製、孔径０．４μ）０．３ｇに１゜１′−カ
ルボニルジイミダゾール４　ｇ　（２５ｍｍｏｌ）と無
水ジオキサン５０−を加えた。室温で１５分間振とうし
て活性化した後に、膜をメタノールおよびアセトンでよ
く洗浄した。これを乾燥して３．２ｍｏｌ　％の活性基
を導入した活性化セルロース膜を得た。

同様？；方法でミクロフィルターＦＲ−４０（０，３ｇ
）を室温で活性化したときの反応条件および活性化量を
表１：こ示す。また、粒子を活性化する場合の標準的−
一活性化法を膜に適用した比較例を表１に示す。

表１ 実施例５　トリプシン固定化膜の製造 実施例１に示した活性化嘆を用′、１て、トリプシンの
固定化を行った。

トリプシン５０ｍｇを、５０ｍ〜ＡＣａＣＲ，を含む、
ｐＨ７，３のＨＥＰＥＳハソファ−５０社に溶解した。

濾過用のフィルターホルダーにセットした；活性化セル
ロース膜にトリプシン溶液をポンプを用、）で４℃で透
過させ、５時間循環させることによ：つ固定化した。次
に、トリプシンと反応しなかった活性基を除くために０
．　Ｉ　Ｍエタノールアミン水溶液を４℃で５時間＠環
させエタノールアミンと反応させた。最後；こへソファ
ー液を透過させて十分に膜を洗浄した。酵素の固定化量
は溶液中に残った酵素をニンヒドリン反応により定量し
た。

このトリプシン固定化膜の活性測定を行った。

基質としてはＬ−ベンゾイルアルギニン−パラニトロア
ニリド（Ｌ−ＢＡＰＡ）を１０−’Ｍの濃度で、１０ｍ
ＭのＣａＣＲ２を含むｐｆ１８．２の０．０５　Ｎ・丁
トリスハンファーに溶解したものを用−）だ。トリプシ
ン固定化膜を′ａ通用フィルターホルダーにセットＬ２
５℃で基質溶液を透過させて透過液出の生成物濃度を定
量した。結果を表２に示すっ比較例２．　酸化剤を用し
）だ活性化法によるトリプシン固定化膜の構造 ＦＲ４０膜を０．５　Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウムに
浸漬し４０℃で５時間反応させた。この膜を純水で洗浄
した後、実施例１と同様のトリプシン溶液を４℃で５時
間循環させることにより固定化した。

次ｊこその酵素溶液に１■／ｍｌの濃度の水素化ホウ素
す）　ＩＪウムを加え４℃で２時間＠環した。その後、
実施例１と同様に活性測定を行った。結果を表２に示す
。

ｍ−り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 セルロース製非対称膜を下記一般式（ I ）で表される
   化合物と反応させて活性化した後、生理活性物質を化学
   結合により固定化することを特徴とする、生理活性物質
   を固定化した膜の製造方法。 一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
   、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等が
   あります▼ または▲数式、化学式、表等があります▼を表す。