JPH05261281A - 生理活性物質固定化担体とその製法 - Google Patents
生理活性物質固定化担体とその製法Info
- Publication number
- JPH05261281A JPH05261281A JP4097109A JP9710992A JPH05261281A JP H05261281 A JPH05261281 A JP H05261281A JP 4097109 A JP4097109 A JP 4097109A JP 9710992 A JP9710992 A JP 9710992A JP H05261281 A JPH05261281 A JP H05261281A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immobilized
- added
- carrier
- hours
- cellulose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 23
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 title abstract description 10
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 title abstract 6
- -1 poly (oxyethylene) Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 claims abstract description 20
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 41
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 30
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 30
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 24
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 21
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 17
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 12
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 12
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 12
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 10
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 10
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 9
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 8
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 8
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 8
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 238000003918 potentiometric titration Methods 0.000 description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 4
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000012151 protein quantification reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005057 Hexamethylene diisocyanate Chemical group 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical group ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N hexamethylene diisocyanate Chemical group O=C=NCCCCCCN=C=O RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FETMVLMRNGLVHX-UHFFFAOYSA-M sodium sulfuric acid periodate Chemical compound S(O)(O)(=O)=O.I(=O)(=O)(=O)[O-].[Na+] FETMVLMRNGLVHX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical group CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 生理活性を有する糖タンパク質あるいは糖
ペプチドにおける糖鎖部位を反応させることにより、活
性を失活させたり変性させたりすることのない水不溶性
担体への固定化方法および生理活性物質固定化担体を提
供する。 【構成】 糖鎖の結合した生理活性物質における糖鎖
のグリコール部位の開裂により形成されたアルデヒド基
を、重合度１０から５０である両末端にアミノ基を有す
るポリ（オキシエチレン）を親水性スペーサーとして結
合した水不溶性担体と、シッフ塩基を形成させた後これ
を還元することによる糖鎖の結合した生理活性物質の固
定化方法および生理活性物質固定化担体。
ペプチドにおける糖鎖部位を反応させることにより、活
性を失活させたり変性させたりすることのない水不溶性
担体への固定化方法および生理活性物質固定化担体を提
供する。 【構成】 糖鎖の結合した生理活性物質における糖鎖
のグリコール部位の開裂により形成されたアルデヒド基
を、重合度１０から５０である両末端にアミノ基を有す
るポリ（オキシエチレン）を親水性スペーサーとして結
合した水不溶性担体と、シッフ塩基を形成させた後これ
を還元することによる糖鎖の結合した生理活性物質の固
定化方法および生理活性物質固定化担体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生理活性を有する糖タン
パク質または糖ペプチドの水不溶性担体への固定化方法
および生理活性物質固定化担体に関するものであり、生
理活性物質における糖鎖のグリコール部位の酸化による
開裂により形成したアルデヒド基を、アミノ基を末端に
有する親水性スペーサーの結合した水不溶性担体とシッ
フ塩基を形成させ、さらにこれを還元することを特徴と
するものである。
パク質または糖ペプチドの水不溶性担体への固定化方法
および生理活性物質固定化担体に関するものであり、生
理活性物質における糖鎖のグリコール部位の酸化による
開裂により形成したアルデヒド基を、アミノ基を末端に
有する親水性スペーサーの結合した水不溶性担体とシッ
フ塩基を形成させ、さらにこれを還元することを特徴と
するものである。
【０００２】この方法はその生理活性の失活あるいは変
性を生ずることなく、また活性部位をブロックすること
のない効果的な固定化方法である。特定の物質を吸着除
去することを目的とした吸着材、特定の化学反応を利用
したバイオセンサーやエンザイムイムノアッセイによる
物質の定量、あるいは連続的に特定の化学反応を行なわ
せるバイオリアクターなど実に広範囲な領域において応
用が可能なものである。
性を生ずることなく、また活性部位をブロックすること
のない効果的な固定化方法である。特定の物質を吸着除
去することを目的とした吸着材、特定の化学反応を利用
したバイオセンサーやエンザイムイムノアッセイによる
物質の定量、あるいは連続的に特定の化学反応を行なわ
せるバイオリアクターなど実に広範囲な領域において応
用が可能なものである。
【０００３】
【従来の技術】酵素，抗体，ホルモン，レクチンなど生
理活性を有する種々の糖タンパク質や糖ペプチドを担体
に、場合によってはスペーサーを介して固定化を行なう
試みについては、特に酵素に関して古くから多くの報告
例がある。その大部分はタンパク質を構成しているアミ
ノ酸残基の官能基における反応に方法ものである。たと
えばリジンのεーアミノ基，Ｎ末端のアミノ基，システ
インのスルフヒドリル基，アスパラギン酸のβーカルボ
キシル基，グルタミン酸のγーカルボキシル基，Ｃ末端
のカルボキシル基，チロシンのフェノール性水酸基，セ
リンあるいはトレオニンの水酸基，アルギニンのグアニ
ジノ基，ヒスチジンのイミダゾリル基，トリプトファン
のインドリル基，メチオニンのメチルメルカプト基など
である。特に水酸基，カルボキシル基，アミノ基の含量
は多い。この場合、活性中心部位を形成しているアミノ
酸残基を修飾あるいは変性させる可能性があり、それに
伴い活性を低下あるいは失活させる場合が多い。
理活性を有する種々の糖タンパク質や糖ペプチドを担体
に、場合によってはスペーサーを介して固定化を行なう
試みについては、特に酵素に関して古くから多くの報告
例がある。その大部分はタンパク質を構成しているアミ
ノ酸残基の官能基における反応に方法ものである。たと
えばリジンのεーアミノ基，Ｎ末端のアミノ基，システ
インのスルフヒドリル基，アスパラギン酸のβーカルボ
キシル基，グルタミン酸のγーカルボキシル基，Ｃ末端
のカルボキシル基，チロシンのフェノール性水酸基，セ
リンあるいはトレオニンの水酸基，アルギニンのグアニ
ジノ基，ヒスチジンのイミダゾリル基，トリプトファン
のインドリル基，メチオニンのメチルメルカプト基など
である。特に水酸基，カルボキシル基，アミノ基の含量
は多い。この場合、活性中心部位を形成しているアミノ
酸残基を修飾あるいは変性させる可能性があり、それに
伴い活性を低下あるいは失活させる場合が多い。
【０００４】また一般にこうしたタンパク質系の生理活
性物質は、通常の化学合成において頻繁に用いられる
熱，酸，アルカリ，有機溶媒などの作用により変性を受
けやすい。したがってリガンドである生理活性物質が固
定化前と同等にできる限り近い物理的あるいは化学的性
質を保持できるようにするには、固定化反応条件におい
て様々な面で制約が多くなる。
性物質は、通常の化学合成において頻繁に用いられる
熱，酸，アルカリ，有機溶媒などの作用により変性を受
けやすい。したがってリガンドである生理活性物質が固
定化前と同等にできる限り近い物理的あるいは化学的性
質を保持できるようにするには、固定化反応条件におい
て様々な面で制約が多くなる。
【０００５】また固定化されたリガンドが種々の塩濃度
や広いｐＨ範囲においてもしっかりと固定化されリガン
ドの漏出が起らないことや、固定化されたリガンドが目
的とする物質と強固に結合できることなどが条件とな
る。種々の生理活性物質の固定化方法を原理的に大別す
ると担体結合法，架橋法，包括法の３種類である。これ
らの方法はそれぞれ長所，短所を有しており、リガンド
の種類や目的に応じて使い分けられている。
や広いｐＨ範囲においてもしっかりと固定化されリガン
ドの漏出が起らないことや、固定化されたリガンドが目
的とする物質と強固に結合できることなどが条件とな
る。種々の生理活性物質の固定化方法を原理的に大別す
ると担体結合法，架橋法，包括法の３種類である。これ
らの方法はそれぞれ長所，短所を有しており、リガンド
の種類や目的に応じて使い分けられている。
【０００６】タンパク質には反応性の強いアミノ酸残基
やイオン性のアミノ酸残基、疎水的な部分を含んでい
る。これらのうちで生理活性の発現に可能な限り悪影響
を与えない部分の特に水酸基，カルボキシル基，アミノ
基を選択して、担体に共有結合，イオン結合，疎水結
合，生化学的特異結合などを介して固定化するものが担
体結合法である。共有結合による固定化には臭化シアン
による活性化、カルボン酸のアジド誘導体化、カルボジ
イミド試薬やＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋなどによる縮合反
応、ジアゾカップリング反応、グルタルアルデヒドのよ
うな２つ以上の反応性に富む官能基を有する化合物によ
り架橋する方法などがある。これらの方法は結合が強固
であり、安定性を増す場合があるなどの長所があるが、
タンパク質の変性の恐れや、目的物質との相互作用が起
りにくくなる場合があるなどの短所がある。
やイオン性のアミノ酸残基、疎水的な部分を含んでい
る。これらのうちで生理活性の発現に可能な限り悪影響
を与えない部分の特に水酸基，カルボキシル基，アミノ
基を選択して、担体に共有結合，イオン結合，疎水結
合，生化学的特異結合などを介して固定化するものが担
体結合法である。共有結合による固定化には臭化シアン
による活性化、カルボン酸のアジド誘導体化、カルボジ
イミド試薬やＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋなどによる縮合反
応、ジアゾカップリング反応、グルタルアルデヒドのよ
うな２つ以上の反応性に富む官能基を有する化合物によ
り架橋する方法などがある。これらの方法は結合が強固
であり、安定性を増す場合があるなどの長所があるが、
タンパク質の変性の恐れや、目的物質との相互作用が起
りにくくなる場合があるなどの短所がある。
【０００７】特開昭５８ー５３７５７にはさらに炭水化
物部位を酸化切断し、アルデヒド基を有する抗体と側鎖
にアミノ基またはヒドラジド基を有する担体とが、−Ｃ
Ｈ2−ＮＨ−または−ＣＨ2−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−の構造
を介して固定化する方法が記載されている。しかしこの
方法においても、担体と抗体の結合が直接的であるた
め、抗体の機能を十分に保持し固定化することが困難で
ある。また他のタンパク質の非特異的吸着を防止できな
い。
物部位を酸化切断し、アルデヒド基を有する抗体と側鎖
にアミノ基またはヒドラジド基を有する担体とが、−Ｃ
Ｈ2−ＮＨ−または−ＣＨ2−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−の構造
を介して固定化する方法が記載されている。しかしこの
方法においても、担体と抗体の結合が直接的であるた
め、抗体の機能を十分に保持し固定化することが困難で
ある。また他のタンパク質の非特異的吸着を防止できな
い。
【０００８】またイオン結合による固定化は操作の簡便
さや再生の可能な点が有利であるが、反応液に用いる緩
衝液の種類，ｐＨ，イオン強度，温度などの影響を受け
やすい。物理的吸着による固定化では結合が一般に弱い
ことが多い。
さや再生の可能な点が有利であるが、反応液に用いる緩
衝液の種類，ｐＨ，イオン強度，温度などの影響を受け
やすい。物理的吸着による固定化では結合が一般に弱い
ことが多い。
【０００９】架橋法はグルタルアルデヒド，トルエンジ
イソシアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート，シ
アヌルクロリドなどの２つ以上の官能基を有する試薬と
リガンドを反応させて分子間で架橋させて巨大分子とす
る方法である。この方法は微生物菌体の固定化にはしば
しば用いられるが、タンパク質系の生理活性物質の固定
化にはあまり有効なものではない。
イソシアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート，シ
アヌルクロリドなどの２つ以上の官能基を有する試薬と
リガンドを反応させて分子間で架橋させて巨大分子とす
る方法である。この方法は微生物菌体の固定化にはしば
しば用いられるが、タンパク質系の生理活性物質の固定
化にはあまり有効なものではない。
【００１０】包括法は高分子ゲル内にリガンドを閉じ込
める方法である。これにはタンパク質や多糖類のような
天然高分子あるいは種々の合成高分子のゲルの内部にリ
ガンドを閉じ込める格子型，半透膜性の高分子被膜によ
りリガンドを包み込むマイクロカプセル型，リン脂質の
ような液体膜にリガンドを包み込むリポソーム型などが
ある。また中空子膜内や限外濾過膜で仕切られた空間中
にリガンドを閉じ込める方法もある。これらの方法は固
定化によりリガンドの修飾が起りにくく、自然な状態を
保ったままで固定化が可能である長所があるが、高分子
量の物質の作用を受けにくいことや条件により失活が起
こるなどの欠点がある。
める方法である。これにはタンパク質や多糖類のような
天然高分子あるいは種々の合成高分子のゲルの内部にリ
ガンドを閉じ込める格子型，半透膜性の高分子被膜によ
りリガンドを包み込むマイクロカプセル型，リン脂質の
ような液体膜にリガンドを包み込むリポソーム型などが
ある。また中空子膜内や限外濾過膜で仕切られた空間中
にリガンドを閉じ込める方法もある。これらの方法は固
定化によりリガンドの修飾が起りにくく、自然な状態を
保ったままで固定化が可能である長所があるが、高分子
量の物質の作用を受けにくいことや条件により失活が起
こるなどの欠点がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の従来技
術における種々の欠点を解決し、生理活性を有する糖タ
ンパク質あるいは糖ペプチドを効率よく、しかもその生
理活性を低下させたり変性させたりする可能性をできる
限り小さくした生理活性物質の固定化方法を提供しよう
とするものである。また本発明における固定化技術は極
めて広範囲な分野において適用されうるものである。
術における種々の欠点を解決し、生理活性を有する糖タ
ンパク質あるいは糖ペプチドを効率よく、しかもその生
理活性を低下させたり変性させたりする可能性をできる
限り小さくした生理活性物質の固定化方法を提供しよう
とするものである。また本発明における固定化技術は極
めて広範囲な分野において適用されうるものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明による固定化方法は生理活性を有する糖タンパク質あ
るいは糖ペプチドにおいてその糖鎖部分を修飾してアル
デヒド基を導入したものを、アミノ基を末端に有する親
水性スペーサーの結合した水不溶性担体とシッフ塩基を
形成させさらに還元することにより固定化反応を行なう
ことを要旨とするものである。本発明は結合している糖
鎖部分がその活性発現に強く関与しない糖タンパク質や
糖ペプチドであれば、酵素，抗体，ホルモンなどの種類
を問わずあらゆるタイプの物質への適用が可能である。
明による固定化方法は生理活性を有する糖タンパク質あ
るいは糖ペプチドにおいてその糖鎖部分を修飾してアル
デヒド基を導入したものを、アミノ基を末端に有する親
水性スペーサーの結合した水不溶性担体とシッフ塩基を
形成させさらに還元することにより固定化反応を行なう
ことを要旨とするものである。本発明は結合している糖
鎖部分がその活性発現に強く関与しない糖タンパク質や
糖ペプチドであれば、酵素，抗体，ホルモンなどの種類
を問わずあらゆるタイプの物質への適用が可能である。
【００１３】本発明における生理活性を有する糖タンパ
ク質あるいは糖ペプチドとは特にその種類は限定されな
いが、糖鎖の結合部位を有している酵素，抗体，ホルモ
ン，レクチン，受容体をはじめ生体内に存在する免疫現
象，細胞接着などに関与している様々なタンパク質系の
生理活性物質を含んでいる。これらの糖タンパク質や糖
ペプチドにおける糖鎖部分の生化学的な意義や役割は詳
細には解明されていないがそれぞれに特有で様々である
と考えられており、一般的には熱，各種変性剤，分解酵
素（プロテアーゼ）などに対する安定性を高めたり防御
したりする作用や、あるいは高次構造の維持に関与する
場合が多いとされている。しかしその生理活性の発現に
関しては、大きく影響していると考えらる場合はほとん
どなく、糖鎖部分を修飾することによる生理活性の変化
に対する影響はタンパク質部分を構成しているアミノ酸
残基を修飾する場合と比較すれば小さいものである。
ク質あるいは糖ペプチドとは特にその種類は限定されな
いが、糖鎖の結合部位を有している酵素，抗体，ホルモ
ン，レクチン，受容体をはじめ生体内に存在する免疫現
象，細胞接着などに関与している様々なタンパク質系の
生理活性物質を含んでいる。これらの糖タンパク質や糖
ペプチドにおける糖鎖部分の生化学的な意義や役割は詳
細には解明されていないがそれぞれに特有で様々である
と考えられており、一般的には熱，各種変性剤，分解酵
素（プロテアーゼ）などに対する安定性を高めたり防御
したりする作用や、あるいは高次構造の維持に関与する
場合が多いとされている。しかしその生理活性の発現に
関しては、大きく影響していると考えらる場合はほとん
どなく、糖鎖部分を修飾することによる生理活性の変化
に対する影響はタンパク質部分を構成しているアミノ酸
残基を修飾する場合と比較すれば小さいものである。
【００１４】また水不溶性担体としては、アミノ基と反
応性のあるたとえばアルデヒド基，エポキシ基のような
官能基を有しているか、あるいは修飾することによりこ
れらの官能基が導入されており、しかもその目的に応じ
たゲル強度，粒子径，細孔径などの特徴を有していれば
特に限定されるものではないが、たとえばセルロース，
架橋ポリアクリル酸，ポリビニルアルコール，ポリスチ
レンおよびその誘導体などが挙げられる。担体の形態に
関しても特に限定されるものではなく、その用途や目的
に応じてビーズ状，繊維状，膜状（中空糸膜を含む）な
どいずれにおいても適用できるものである。これらの担
体に親水性スペーサーとして後記の化１に示すような両
末端にアミノ基を有するポリ（オキシエチレン）（以下
ＰＥＯアミンと言う）を結合させたものに、さらに上記
のような生理活性物質をリガンドとして導入する。
応性のあるたとえばアルデヒド基，エポキシ基のような
官能基を有しているか、あるいは修飾することによりこ
れらの官能基が導入されており、しかもその目的に応じ
たゲル強度，粒子径，細孔径などの特徴を有していれば
特に限定されるものではないが、たとえばセルロース，
架橋ポリアクリル酸，ポリビニルアルコール，ポリスチ
レンおよびその誘導体などが挙げられる。担体の形態に
関しても特に限定されるものではなく、その用途や目的
に応じてビーズ状，繊維状，膜状（中空糸膜を含む）な
どいずれにおいても適用できるものである。これらの担
体に親水性スペーサーとして後記の化１に示すような両
末端にアミノ基を有するポリ（オキシエチレン）（以下
ＰＥＯアミンと言う）を結合させたものに、さらに上記
のような生理活性物質をリガンドとして導入する。
【００１５】担体におけるアミノ基の含量はある程度多
い方がリガンド導入率の向上に結びつくが、あまり多過
ぎるとゲル強度が低下するので適当ではない。したがっ
て０．０１ないし０．８０ｍｅｑ／ｇの範囲になるよう
に導入するのが望ましく、リガンドや目的物質の大きさ
に応じてその値を調整する必要がある。親水性スペーサ
ーの鎖長（化１のｎに相当する）についてもリガンドに
結合させる目的物質の大きさや性質に応じて適当に調整
する必要があるが、重合度が１０ないし５００の範囲、
好ましくは３０ないし４００、さらに好ましくは１００
ないし３００の両末端にアミノ基を有するポリ（オキシ
エチレン）を用いるのが適している。親水性スペーサー
を導入することにより立体障害が小さくなり、目的物質
との結合性を大きく向上させることができる。さらに親
水性スペーサーの排除体積効果および親水性の向上によ
り、非特異的な吸着を抑えることができる。
い方がリガンド導入率の向上に結びつくが、あまり多過
ぎるとゲル強度が低下するので適当ではない。したがっ
て０．０１ないし０．８０ｍｅｑ／ｇの範囲になるよう
に導入するのが望ましく、リガンドや目的物質の大きさ
に応じてその値を調整する必要がある。親水性スペーサ
ーの鎖長（化１のｎに相当する）についてもリガンドに
結合させる目的物質の大きさや性質に応じて適当に調整
する必要があるが、重合度が１０ないし５００の範囲、
好ましくは３０ないし４００、さらに好ましくは１００
ないし３００の両末端にアミノ基を有するポリ（オキシ
エチレン）を用いるのが適している。親水性スペーサー
を導入することにより立体障害が小さくなり、目的物質
との結合性を大きく向上させることができる。さらに親
水性スペーサーの排除体積効果および親水性の向上によ
り、非特異的な吸着を抑えることができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】一方リガンドである糖タンパク質や糖ペプ
チドにおける糖鎖部分へのアルデヒド基の導入は過ヨウ
素酸またはその塩で酸化して、グリコール部位を開裂し
てアルデヒド基を形成させることにより行なうのが好ま
しい。過ヨウ素酸による酸化反応はグリコール部位の隣
接する水酸基間で生ずるものであり、１モルのＩＯ4-が
ＩＯ3-に還元されことにより２モルのアルデヒド基が形
成される。得られる反応物の構造はグルコシド結合の種
類により異なってくるが、化２に示すようなものが考え
られる。
チドにおける糖鎖部分へのアルデヒド基の導入は過ヨウ
素酸またはその塩で酸化して、グリコール部位を開裂し
てアルデヒド基を形成させることにより行なうのが好ま
しい。過ヨウ素酸による酸化反応はグリコール部位の隣
接する水酸基間で生ずるものであり、１モルのＩＯ4-が
ＩＯ3-に還元されことにより２モルのアルデヒド基が形
成される。得られる反応物の構造はグルコシド結合の種
類により異なってくるが、化２に示すようなものが考え
られる。
【００１８】
【化２】
【００１９】過ヨウ素酸の量は酸化する物質と同モル以
上の過剰量を用いて反応させるのが望ましい。反応時の
ｐＨ値はリガンドとして導入する物質の安定性や副反応
の発生しやすさにより最適値は異なってくるが、ｐＨ３
ないし６で行なうのが好ましく、ｐＨ４ないし５で行な
うのがより好ましい。また反応液には０．１Ｍ程度の酢
酸あるいはクエン酸緩衝液を用いるのが適当である。反
応温度は室温あるいはそれ以下が好ましく、室温で不安
定な物質の場合は５℃で行なうのが理想的である。反応
時間は室温では１時間以内で十分であるが、５℃では１
２時間ないし２４時間程度行なう必要がある。
上の過剰量を用いて反応させるのが望ましい。反応時の
ｐＨ値はリガンドとして導入する物質の安定性や副反応
の発生しやすさにより最適値は異なってくるが、ｐＨ３
ないし６で行なうのが好ましく、ｐＨ４ないし５で行な
うのがより好ましい。また反応液には０．１Ｍ程度の酢
酸あるいはクエン酸緩衝液を用いるのが適当である。反
応温度は室温あるいはそれ以下が好ましく、室温で不安
定な物質の場合は５℃で行なうのが理想的である。反応
時間は室温では１時間以内で十分であるが、５℃では１
２時間ないし２４時間程度行なう必要がある。
【００２０】また酸化反応終了後にはエチレングリコー
ル，グリセリン，亜硫酸ナトリウムなどの物質を添加し
て過剰の酸化剤を除去する必要がある。また酸化反応の
際に用いた緩衝液を外液として、透析処理を５℃で１２
時間以上行なうことによりこれらの物質を除去するのが
より好ましい。
ル，グリセリン，亜硫酸ナトリウムなどの物質を添加し
て過剰の酸化剤を除去する必要がある。また酸化反応の
際に用いた緩衝液を外液として、透析処理を５℃で１２
時間以上行なうことによりこれらの物質を除去するのが
より好ましい。
【００２１】こうして得たアルデヒド基の導入されたリ
ガンドを、上記のようなＰＥＯアミンの結合した担体と
シッフ塩基を形成させて結合する。この反応は室温また
は５℃で１０時間ないし３０時間、ｐＨは６ないし１０
の範囲で行ないｐＨ８ないし９．５の範囲で行なうのが
より望ましい。反応液としては０．１Ｍ程度の炭酸緩衝
液を用いるのが好ましい。
ガンドを、上記のようなＰＥＯアミンの結合した担体と
シッフ塩基を形成させて結合する。この反応は室温また
は５℃で１０時間ないし３０時間、ｐＨは６ないし１０
の範囲で行ないｐＨ８ないし９．５の範囲で行なうのが
より望ましい。反応液としては０．１Ｍ程度の炭酸緩衝
液を用いるのが好ましい。
【００２２】こうして得られたシッフ塩基は安定性に乏
しく、特に酸性あるいはアルカリ性の条件下では分解を
受けやすい。そこで次式に示すように（Ｒ1を担体，Ｒ2
をリガンドとする）、還元反応を行なうことにより安定
化させるのが適当である。 Ｒ1Ｎ＝ＣＨＲ2 → Ｒ1ＮＨ−ＣＨ2Ｒ2
しく、特に酸性あるいはアルカリ性の条件下では分解を
受けやすい。そこで次式に示すように（Ｒ1を担体，Ｒ2
をリガンドとする）、還元反応を行なうことにより安定
化させるのが適当である。 Ｒ1Ｎ＝ＣＨＲ2 → Ｒ1ＮＨ−ＣＨ2Ｒ2
【００２３】シッフ塩基の還元反応は水素化ホウ素ナト
リウム（ＮａＢＨ4）あるいはシアノ水素化ホウ素ナト
リウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）の添加により行なうのが好ま
しい。反応は室温または５℃において、ｐＨ８ないし９
の炭酸緩衝液中で３時間ないし３０時間行なうのが望ま
しい。
リウム（ＮａＢＨ4）あるいはシアノ水素化ホウ素ナト
リウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）の添加により行なうのが好ま
しい。反応は室温または５℃において、ｐＨ８ないし９
の炭酸緩衝液中で３時間ないし３０時間行なうのが望ま
しい。
【００２４】本発明におけるアミノ基を末端に有する親
水性スペーサーの結合した水不溶性担体に、糖鎖にアル
デヒド基を導入した糖タンパク質あるいは糖ペプチドを
リガンドとして導入するには、上記のような方法を基本
とすれば特に限定されるのもではないが、たとえばセル
ロースを担体として抗体を導入する場合には、以下の方
法が好ましい。
水性スペーサーの結合した水不溶性担体に、糖鎖にアル
デヒド基を導入した糖タンパク質あるいは糖ペプチドを
リガンドとして導入するには、上記のような方法を基本
とすれば特に限定されるのもではないが、たとえばセル
ロースを担体として抗体を導入する場合には、以下の方
法が好ましい。
【００２５】（１）セルロースの改質 過ヨウ素酸ナトリウムを０．１ないし５．０規定、好ま
しくは０．５ないし１．５規定の硫酸に溶解した溶液に
平均粒子径が２０ないし２０００μｍ、平均細孔径が２
００ないし３００００※の粒状多孔質セルロースを添加
し、１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で５
時間から３０時間好ましくは１０時間から２４時間反応
させる。上記過ヨウ素酸ナトリウムー硫酸溶液の過ヨウ
素酸ナトリウム濃度は２重量％から１５重量％好ましく
は４重量％から１０重量％である。また上記粒状多孔質
セルロースの過ヨウ素酸ナトリウム溶液への浴比は１０
容量％から３０容量％好ましくは１５容量％から２５容
量％である。
しくは０．５ないし１．５規定の硫酸に溶解した溶液に
平均粒子径が２０ないし２０００μｍ、平均細孔径が２
００ないし３００００※の粒状多孔質セルロースを添加
し、１０℃から５０℃好ましくは２０℃から３０℃で５
時間から３０時間好ましくは１０時間から２４時間反応
させる。上記過ヨウ素酸ナトリウムー硫酸溶液の過ヨウ
素酸ナトリウム濃度は２重量％から１５重量％好ましく
は４重量％から１０重量％である。また上記粒状多孔質
セルロースの過ヨウ素酸ナトリウム溶液への浴比は１０
容量％から３０容量％好ましくは１５容量％から２５容
量％である。
【００２６】この反応混合物を濾過して生成物を回収
し、十分に洗浄して、膨潤状態でアルデヒド含量０．１
０ないし４．００ｍｅｑ／ｇ好ましくは０．２０ないし
１．００ｍｅｑ／ｇの［アルデヒド］ー［セルロース］
を得る。この［アルデヒド］ー［セルロース］は先に化
２に示したような一部のグルコースユニットが開環した
構造を有している。
し、十分に洗浄して、膨潤状態でアルデヒド含量０．１
０ないし４．００ｍｅｑ／ｇ好ましくは０．２０ないし
１．００ｍｅｑ／ｇの［アルデヒド］ー［セルロース］
を得る。この［アルデヒド］ー［セルロース］は先に化
２に示したような一部のグルコースユニットが開環した
構造を有している。
【００２７】（２）親水性スペーサーの導入 化１に示したような重合度が１０ないし５００、好まし
くは３０ないし４００、さらに好ましくは１００ないし
３００のＰＥＯアミンをｐＨ９．５の炭酸緩衝液に溶解
しておく。これに上記（１）で得た［アルデヒド］ー
［セルロース］を添加して攪拌しながら１０℃から５０
℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間
好ましくは１０時間から２４時間反応させる。上記ＰＥ
Ｏアミンの濃度は０．２重量％から５．０重量％好まし
くは０．４重量％から３．０重量％で、この溶液への
［アルデヒド］ー［セルロース］の浴比は３容量％から
２０容量％好ましくは５容量％から１５容量％である。
この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗して［Ｐ
ＥＯアミン］ー［セルロース］を得る。
くは３０ないし４００、さらに好ましくは１００ないし
３００のＰＥＯアミンをｐＨ９．５の炭酸緩衝液に溶解
しておく。これに上記（１）で得た［アルデヒド］ー
［セルロース］を添加して攪拌しながら１０℃から５０
℃好ましくは２０℃から３０℃で、５時間から３０時間
好ましくは１０時間から２４時間反応させる。上記ＰＥ
Ｏアミンの濃度は０．２重量％から５．０重量％好まし
くは０．４重量％から３．０重量％で、この溶液への
［アルデヒド］ー［セルロース］の浴比は３容量％から
２０容量％好ましくは５容量％から１５容量％である。
この反応混合物を濾過して生成物を回収、水洗して［Ｐ
ＥＯアミン］ー［セルロース］を得る。
【００２８】（３）抗体における糖鎖の改質 ウサギにヒトアルブミン（以下ｈＡｌｂと言う）を免疫
して得られた抗血清を硫安塩析により精製して得た抗ｈ
Ａｌｂ抗体１０ないし２０ｍｇを、２０ないし５０ｍｌ
のｐＨ４．０の酢酸緩衝液に溶解して、過ヨウ素酸ナト
リウム１ないし５ｍｇを添加して室温で攪拌して３０分
ないし１時間反応させる。さらにエチレングリコールを
０．１Ｍ濃度になるように添加して５℃で５時間ないし
１０時間反応させ、この反応液を上記酢酸緩衝液を外液
として５℃で１２時間ないし２４時間透析を行なった。
こうして［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得る。
して得られた抗血清を硫安塩析により精製して得た抗ｈ
Ａｌｂ抗体１０ないし２０ｍｇを、２０ないし５０ｍｌ
のｐＨ４．０の酢酸緩衝液に溶解して、過ヨウ素酸ナト
リウム１ないし５ｍｇを添加して室温で攪拌して３０分
ないし１時間反応させる。さらにエチレングリコールを
０．１Ｍ濃度になるように添加して５℃で５時間ないし
１０時間反応させ、この反応液を上記酢酸緩衝液を外液
として５℃で１２時間ないし２４時間透析を行なった。
こうして［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得る。
【００２９】（４）抗体の導入 上記（３）で得た［アルデヒド］ー［抗体］溶液にｐＨ
９．５の炭酸緩衝液を加えてｐＨを８．０ないし９．０
に調整した後に、上記（２）で得た［ＰＥＯアミン］ー
［セルロース］３ｇ（膨潤状態）を添加し、５℃で２０
時間ないし３０時間反応させてシッフ塩基を形成させ
る。この反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して、膨潤状態でｐＨ９．０の炭酸緩衝液を加え、
さらに水素化ホウ素ナトリウムを０．２ないし１ｇ添加
して５℃で５時間ないし１５時間攪拌により還元反応を
行なった。この反応混合物を濾過して生成物を回収し、
十分に洗浄することにより、抗ｈＡｌｂ抗体をＰＥＯア
ミンをスペーサーとして介してセルロースに固定化した
ものを得る。
９．５の炭酸緩衝液を加えてｐＨを８．０ないし９．０
に調整した後に、上記（２）で得た［ＰＥＯアミン］ー
［セルロース］３ｇ（膨潤状態）を添加し、５℃で２０
時間ないし３０時間反応させてシッフ塩基を形成させ
る。この反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して、膨潤状態でｐＨ９．０の炭酸緩衝液を加え、
さらに水素化ホウ素ナトリウムを０．２ないし１ｇ添加
して５℃で５時間ないし１５時間攪拌により還元反応を
行なった。この反応混合物を濾過して生成物を回収し、
十分に洗浄することにより、抗ｈＡｌｂ抗体をＰＥＯア
ミンをスペーサーとして介してセルロースに固定化した
ものを得る。
【００３０】
【実施例】以下実施例を用いて本発明を説明する。 ＜実施例１＞ インベルターゼの固定化 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉ
ｅ）由来であり、その培養液をゲル濾過、アニオンおよ
びカチオン交換カラムにより精製して凍結乾燥して得ら
れたインベルターゼ（βーＤーフルクトフラノシダー
ゼ）のセルロースへの固定化を次のようにして実施し
た。
ｅ）由来であり、その培養液をゲル濾過、アニオンおよ
びカチオン交換カラムにより精製して凍結乾燥して得ら
れたインベルターゼ（βーＤーフルクトフラノシダー
ゼ）のセルロースへの固定化を次のようにして実施し
た。
【００３１】過ヨウ素酸ナトリウム４００ｍｇを１Ｎ硫
酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セルロース（チッソ製セ
ルロファインＧＣＬー１０００ｍ）５ｇを添加し、攪拌
により２０時間反応させた後、反応混合物を濾過して生
成物を回収し、十分に洗浄して［アルデヒド］ー［セル
ロース］を得た。アルデヒド含量はオキシム法により定
量を行ない０．９７ｍｅｑ／ｇであった。
酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セルロース（チッソ製セ
ルロファインＧＣＬー１０００ｍ）５ｇを添加し、攪拌
により２０時間反応させた後、反応混合物を濾過して生
成物を回収し、十分に洗浄して［アルデヒド］ー［セル
ロース］を得た。アルデヒド含量はオキシム法により定
量を行ない０．９７ｍｅｑ／ｇであった。
【００３２】分子量６００のＰＥＯアミン２０ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定（平沼産業製ＣＯＭ
ＴＩＴＥ１０１を使用）により定量を行ない、０．３１
ｍｅｑ／ｇであった。
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定（平沼産業製ＣＯＭ
ＴＩＴＥ１０１を使用）により定量を行ない、０．３１
ｍｅｑ／ｇであった。
【００３３】一方上記インベルターゼ３０ｍｇをｐＨ
４．５のクエン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ
素酸ナトリウム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で
４５分反応させた。さらにグリセリンを０．１Ｍ濃度に
なるように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、
反応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行な
い［アルデヒド］ー［酵素］溶液を得た。
４．５のクエン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ
素酸ナトリウム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で
４５分反応させた。さらにグリセリンを０．１Ｍ濃度に
なるように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、
反応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行な
い［アルデヒド］ー［酵素］溶液を得た。
【００３４】上記［アルデヒド］ー［酵素］液を炭酸緩
衝液を添加してｐＨを８．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化インベル
ターゼを得た。インベルターゼ固定化量はシッフ塩基反
応の残液をトリクロロ酢酸溶液により沈殿させ、水酸化
ナトリウム水溶液に溶解したものをＢＣＡタンパク質定
量用試薬（ピアス社製）により残存量を定量することに
より算出したところ（以下ＴＣＡ−ＢＣＡ法と言う）、
１８．５ｍｇが固定化されていた。
衝液を添加してｐＨを８．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化インベル
ターゼを得た。インベルターゼ固定化量はシッフ塩基反
応の残液をトリクロロ酢酸溶液により沈殿させ、水酸化
ナトリウム水溶液に溶解したものをＢＣＡタンパク質定
量用試薬（ピアス社製）により残存量を定量することに
より算出したところ（以下ＴＣＡ−ＢＣＡ法と言う）、
１８．５ｍｇが固定化されていた。
【００３５】酵素活性の定量は０．１％濃度のスクロー
スークエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）溶液中にて、上記固
定化インベルターゼを固定化量が１ｍｇに相当するよう
に懸濁して３０℃で３０分間反応をさせることにより実
施した。反応液中の分解物であるグルコース，フルクト
ース濃度をアミノ基を有する順相系カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィ（島津製作所製ＬＣー６Ａシステ
ム）により定量した。結果は表１に示す通りである。な
お固定化していない遊離状態のインベルターゼ１ｍｇに
おける同様の実験結果におけるグルコースおよびフルク
トースの量を１００として表示している。
スークエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）溶液中にて、上記固
定化インベルターゼを固定化量が１ｍｇに相当するよう
に懸濁して３０℃で３０分間反応をさせることにより実
施した。反応液中の分解物であるグルコース，フルクト
ース濃度をアミノ基を有する順相系カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィ（島津製作所製ＬＣー６Ａシステ
ム）により定量した。結果は表１に示す通りである。な
お固定化していない遊離状態のインベルターゼ１ｍｇに
おける同様の実験結果におけるグルコースおよびフルク
トースの量を１００として表示している。
【００３６】
【表１】
【００３７】また本酵素の熱安定性に関する影響につい
て、上記固定化酵素懸濁液を５５℃で処理した際の残存
活性を上記と同様にして定量することにより検討した。
結果は図１に示す通りである。残存活性は遊離状態でｐ
Ｈ５．５における３０℃において反応させて生成したグ
ルコース量を１００％として表示した。
て、上記固定化酵素懸濁液を５５℃で処理した際の残存
活性を上記と同様にして定量することにより検討した。
結果は図１に示す通りである。残存活性は遊離状態でｐ
Ｈ５．５における３０℃において反応させて生成したグ
ルコース量を１００％として表示した。
【００３８】＜実施例２＞ 抗ｍＩｇＧ（マウス免疫グ
ロブリン）抗体の固定化 ｍＩｇＧ（カッペル社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｍＩｇＧ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。
ロブリン）抗体の固定化 ｍＩｇＧ（カッペル社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｍＩｇＧ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。
【００３９】過ヨウ素酸ナトリウム２００ｍｇを１Ｎ硫
酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セルロース（チッソ製セ
ルロファインＧＣＬー１０００ｍ）５ｇを添加し、攪拌
により２０時間反応させた後、反応混合物を濾過して生
成物を回収し、十分に洗浄して［アルデヒド］ー［セル
ロース］を得た。アルデヒド含量はオキシム法により定
量を行ない０．４３ｍｅｑ／ｇであった。
酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セルロース（チッソ製セ
ルロファインＧＣＬー１０００ｍ）５ｇを添加し、攪拌
により２０時間反応させた後、反応混合物を濾過して生
成物を回収し、十分に洗浄して［アルデヒド］ー［セル
ロース］を得た。アルデヒド含量はオキシム法により定
量を行ない０．４３ｍｅｑ／ｇであった。
【００４０】分子量１０００のＰＥＯアミン４ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．２２ｍｅｑ／ｇであった。
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．２２ｍｅｑ／ｇであった。
【００４１】一方上記抗体２０ｍｇをｐＨ３．８のクエ
ン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリウ
ム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応さ
せた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になる
ように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反応
液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行ない
［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得た。
ン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリウ
ム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応さ
せた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になる
ように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反応
液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析を行ない
［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得た。
【００４２】上記［アルデヒド］ー［抗体］液を炭酸緩
衝液を添加してｐＨを９．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得
た。抗体の固定化量は実施例１と同様にして、ＢＣＡタ
ンパク質定量用試薬により残存量を定量することにより
算出し、１７．１ｍｇが固定化されていた。
衝液を添加してｐＨを９．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得
た。抗体の固定化量は実施例１と同様にして、ＢＣＡタ
ンパク質定量用試薬により残存量を定量することにより
算出し、１７．１ｍｇが固定化されていた。
【００４３】上記抗体を固定化したセルロースゲル１ｍ
ｌをオープンカラム管に充填して、抗原であるｍＩｇＧ
をｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に０．２％濃度で
溶解して１０ｍｌをカラムに供した。カラム通過液の抗
体濃度をＴＣＡ−ＢＣＡ法により定量して、吸着しなか
ったｍＩｇＧ量からカラムへの吸着率を算出した。結果
は表２に示す通りである。
ｌをオープンカラム管に充填して、抗原であるｍＩｇＧ
をｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に０．２％濃度で
溶解して１０ｍｌをカラムに供した。カラム通過液の抗
体濃度をＴＣＡ−ＢＣＡ法により定量して、吸着しなか
ったｍＩｇＧ量からカラムへの吸着率を算出した。結果
は表２に示す通りである。
【００４４】
【表２】
【００４５】＜実施例３＞ 抗ｈＬＤＬ（ヒト低比重リ
ポタンパク質）抗体の固定化 ｈＬＤＬ（ケミコン社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｈＬＤＬ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。過ヨウ素酸ナト
リウム２００ｍｇを１Ｎ硫酸５０ｍｌに溶解して、多孔
質セルロース（チッソ製セルロファインＣＰＣｍ）５ｇ
を添加し、攪拌により２０時間反応させた後、反応混合
物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して［アルデ
ヒド］ー［セルロース］を得た。アルデヒド含量はオキ
シム法により定量を行ない０．５５ｍｅｑ／ｇであっ
た。
ポタンパク質）抗体の固定化 ｈＬＤＬ（ケミコン社製）を免疫したウサギ抗血清を硫
安塩析により精製して得た抗ｈＬＤＬ抗体のセルロース
への固定化を次のようにして実施した。過ヨウ素酸ナト
リウム２００ｍｇを１Ｎ硫酸５０ｍｌに溶解して、多孔
質セルロース（チッソ製セルロファインＣＰＣｍ）５ｇ
を添加し、攪拌により２０時間反応させた後、反応混合
物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して［アルデ
ヒド］ー［セルロース］を得た。アルデヒド含量はオキ
シム法により定量を行ない０．５５ｍｅｑ／ｇであっ
た。
【００４６】分子量５０００のＰＥＯアミン２ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．２０ｍｅｑ／ｇであった。
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．２０ｍｅｑ／ｇであった。
【００４７】一方上記抗体４０ｍｇをｐＨ３．８のクエ
ン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリウ
ム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応さ
せた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になる
ように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反応
液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析処理を行な
い［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得た。
ン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリウ
ム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応さ
せた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度になる
ように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反応
液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析処理を行な
い［アルデヒド］ー［抗体］溶液を得た。
【００４８】上記［アルデヒド］ー［抗体］液を炭酸緩
衝液を添加してｐＨを９．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得
た。抗体の固定化量は実施例１と同様にして、ＢＣＡタ
ンパク質定量用試薬により残存量を定量することにより
算出し、２７．９ｍｇが固定化されていた。
衝液を添加してｐＨを９．０に調整し、上記［ＰＥＯア
ミン］ー［セルロース］１ｇを加えて、５℃で３０時間
攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾過し
て生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩
衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加
えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体を得
た。抗体の固定化量は実施例１と同様にして、ＢＣＡタ
ンパク質定量用試薬により残存量を定量することにより
算出し、２７．９ｍｇが固定化されていた。
【００４９】上記抗体を固定化したセルロースゲル１ｍ
ｌをブタ血清（ＬＤＬ値１５０．５ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌ
と２０ｍｌのバイヤル中で混合して、３０℃で３０分間
振盪することによりインキュベートして、遠心上清のＬ
ＤＬ値をβリポ蛋白Ｃテストーワコー（和光純薬工業
製）により定量した。得られた残存ＬＤＬ値からＬＤＬ
吸着率を算出した結果を表３に示す。
ｌをブタ血清（ＬＤＬ値１５０．５ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌ
と２０ｍｌのバイヤル中で混合して、３０℃で３０分間
振盪することによりインキュベートして、遠心上清のＬ
ＤＬ値をβリポ蛋白Ｃテストーワコー（和光純薬工業
製）により定量した。得られた残存ＬＤＬ値からＬＤＬ
吸着率を算出した結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】＜実施例４＞ 小麦胚芽レクチン（ＷＧ
Ａ）の固定化 ＷＧＡ（ベクターラボラトリー社製）のセルロースへの
固定化を次のようにして実施した。過ヨウ素酸ナトリウ
ム１００ｍｇを１Ｎ硫酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セ
ルロース（チッソ製セルロファインＧＣＬー１０００
ｍ）５ｇを添加し、攪拌により２０時間反応させた後、
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
［アルデヒド］ー［セルロース］を得た。アルデヒド含
量はオキシム法により定量を行ない０．２２ｍｅｑ／ｇ
であった。
Ａ）の固定化 ＷＧＡ（ベクターラボラトリー社製）のセルロースへの
固定化を次のようにして実施した。過ヨウ素酸ナトリウ
ム１００ｍｇを１Ｎ硫酸５０ｍｌに溶解して、多孔質セ
ルロース（チッソ製セルロファインＧＣＬー１０００
ｍ）５ｇを添加し、攪拌により２０時間反応させた後、
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
［アルデヒド］ー［セルロース］を得た。アルデヒド含
量はオキシム法により定量を行ない０．２２ｍｅｑ／ｇ
であった。
【００５２】分子量１０００のＰＥＯアミン４ｇをｐＨ
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．１５ｍｅｑ／ｇであった。
９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上記の［アル
デヒド］ー［セルロース］全量を加えて攪拌により反応
させて、反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に
洗浄して［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］を得た。ア
ミノ基含量は塩酸による電位差滴定により定量を行な
い、０．１５ｍｅｑ／ｇであった。
【００５３】一方上記ＷＧＡ２０ｍｇをｐＨ４．５のク
エン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリ
ウム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応
させた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度にな
るように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反
応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析処理を行
ない［アルデヒド］ー［レクチン］を得た。上記［アル
デヒド］ー［レクチン］液を炭酸緩衝液を添加してｐＨ
を８．５に調整し、上記［ＰＥＯアミン］ー［セルロー
ス］１ｇを加えて、５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基
を形成させた。反応混合物を濾過して生成物を回収し、
十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素
化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて５℃で７時間還
元反応を行なった。反応混合物を濾過して生成物を回収
し、十分に洗浄して固定化レクチンを得た。レクチンの
固定化量は、ＢＣＡタンパク質定量用試薬により残存量
を定量することにより算出し、１３．７ｍｇが固定化さ
れていた。
エン酸緩衝液に５０ｍｌに溶解して、過ヨウ素酸ナトリ
ウム５０ｍｇを添加して、攪拌により室温で４５分反応
させた。さらにエチレングリコールを０．１Ｍ濃度にな
るように添加して、５℃で７時間攪拌して反応させ、反
応液を上記緩衝液を外液として５℃で一晩透析処理を行
ない［アルデヒド］ー［レクチン］を得た。上記［アル
デヒド］ー［レクチン］液を炭酸緩衝液を添加してｐＨ
を８．５に調整し、上記［ＰＥＯアミン］ー［セルロー
ス］１ｇを加えて、５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基
を形成させた。反応混合物を濾過して生成物を回収し、
十分に洗浄してｐＨ８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素
化ホウ素ナトリウム２００ｍｇを加えて５℃で７時間還
元反応を行なった。反応混合物を濾過して生成物を回収
し、十分に洗浄して固定化レクチンを得た。レクチンの
固定化量は、ＢＣＡタンパク質定量用試薬により残存量
を定量することにより算出し、１３．７ｍｇが固定化さ
れていた。
【００５４】上記ＷＧＡを固定化したセルロースゲル１
ｍｌをオープンカラム管に充填して、ｍＩｇＧをｐＨ
８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に０．２％濃度で溶解し
て１０ｍｌをカラムに供した。カラム通過液の抗体濃度
をＴＣＡ−ＢＣＡ法により定量して、吸着されなかった
ｍＩｇＧ量からカラムへの吸着率を算出した。結果は表
４に示す通りである。
ｍｌをオープンカラム管に充填して、ｍＩｇＧをｐＨ
８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に０．２％濃度で溶解し
て１０ｍｌをカラムに供した。カラム通過液の抗体濃度
をＴＣＡ−ＢＣＡ法により定量して、吸着されなかった
ｍＩｇＧ量からカラムへの吸着率を算出した。結果は表
４に示す通りである。
【００５５】
【表４】
【００５６】＜比較例１＞ インベルターゼの固定化 実施例１におけるインベルターゼ３０ｍｇをｐＨ８．０
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例１において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化インベルターゼを得た。インベルターゼ固定化量
は実施例１と同様にして求め、２１．３ｍｇが固定化さ
れていた。酵素活性およびその熱安定性について実施例
１と同様にして行なった。結果は表１および図１に示す
通りである。
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例１において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化インベルターゼを得た。インベルターゼ固定化量
は実施例１と同様にして求め、２１．３ｍｇが固定化さ
れていた。酵素活性およびその熱安定性について実施例
１と同様にして行なった。結果は表１および図１に示す
通りである。
【００５７】＜比較例２＞ 抗ｍＩｇＧ抗体の固定化 実施例２における抗ｍＩｇＧ抗体２０ｍｇをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例２において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化抗体を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様に
して求め、１８．３ｍｇが固定化されていた。実施例２
と同様のカラムを作製して、ｍＩｇＧ吸着率を求めた。
結果は表２に示す通りである。
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例２において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化抗体を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様に
して求め、１８．３ｍｇが固定化されていた。実施例２
と同様のカラムを作製して、ｍＩｇＧ吸着率を求めた。
結果は表２に示す通りである。
【００５８】＜比較例３＞ 抗ｈＬＤＬ抗体の固定化 実施例３における抗ｈＬＤＬ抗体４０ｍｇをｐＨ９．０
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例３において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化抗体を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様に
して求め、３５．１ｍｇが固定化されていた。実施例３
と同様にして、ブタ血清におけるＬＤＬ吸着率を求め
た。結果は表３に示す通りである。
の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、実施例３において調
整した［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて
５℃で３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応
混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ
８．０の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム
２００ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。
反応混合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して
固定化抗体を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様に
して求め、３５．１ｍｇが固定化されていた。実施例３
と同様にして、ブタ血清におけるＬＤＬ吸着率を求め
た。結果は表３に示す通りである。
【００５９】＜比較例４＞ 抗ｈＬＤＬ抗体の固定化 実施例３と同様にして、ＣＰＣｍ５ｇを酸化してアルデ
ヒド含量０．５０ｍｅｑ／ｇの［アルデヒド］ー［セル
ロース］を調製した。さらにこれに２８％アンモニア水
５０ｍｌを加えて室温で８時間反応させ、濾過して生成
物を回収し、十分に洗浄して［アミノ］ー［セルロー
ス］を得た。アミノ基含量は塩酸による電位差滴定によ
り定量を行ない、０．２８ｍｅｑ／ｇであった。
ヒド含量０．５０ｍｅｑ／ｇの［アルデヒド］ー［セル
ロース］を調製した。さらにこれに２８％アンモニア水
５０ｍｌを加えて室温で８時間反応させ、濾過して生成
物を回収し、十分に洗浄して［アミノ］ー［セルロー
ス］を得た。アミノ基含量は塩酸による電位差滴定によ
り定量を行ない、０．２８ｍｅｑ／ｇであった。
【００６０】一方実施例３における抗ｈＬＤＬ抗体４０
ｍｇをｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上
記［アミノ］ー［セルロース］１ｇを加えて５℃で３０
時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭
酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇ
を加えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物
を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体
を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様にして求め、
３５．１ｍｇが固定化されていた。実施例３と同様にし
て、ブタ血清におけるＬＤＬ吸着率を求めた。結果は表
３に示す通りである。
ｍｇをｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解して、上
記［アミノ］ー［セルロース］１ｇを加えて５℃で３０
時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物を濾
過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０の炭
酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇ
を加えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混合物
を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化抗体
を得た。抗体の固定化量は実施例２と同様にして求め、
３５．１ｍｇが固定化されていた。実施例３と同様にし
て、ブタ血清におけるＬＤＬ吸着率を求めた。結果は表
３に示す通りである。
【００６１】＜比較例５＞ ＷＧＡの固定化 実施例４におけるＷＧＡ２０ｍｇをｐＨ８．５の炭酸緩
衝液５０ｍｌに溶解して、実施例１において調整した
［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて５℃で
３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物
を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０
の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００
ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混
合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化
レクチンを得た。レクチンの固定化量は実施例２と同様
にして求め、１５．９ｍｇが固定化されていた。実施例
４と同様のカラムを作製して、ｍＩｇＧ吸着率を求め
た。結果は表４に示す通りである。
衝液５０ｍｌに溶解して、実施例１において調整した
［ＰＥＯアミン］ー［セルロース］１ｇを加えて５℃で
３０時間攪拌してシッフ塩基を形成させた。反応混合物
を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ８．０
の炭酸緩衝液５０ｍｌ，水素化ホウ素ナトリウム２００
ｍｇを加えて５℃で７時間還元反応を行なった。反応混
合物を濾過して生成物を回収し、十分に洗浄して固定化
レクチンを得た。レクチンの固定化量は実施例２と同様
にして求め、１５．９ｍｇが固定化されていた。実施例
４と同様のカラムを作製して、ｍＩｇＧ吸着率を求め
た。結果は表４に示す通りである。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、種々の糖鎖の結合した生
理活性物質をその活性を失活させたりあるいは変性させ
たりすることなく水不溶性担体に固定化することが可能
となり、固定化前に近い活性を維持した生理活性物質固
定化担体を提供することが可能となった。本発明は吸着
材，アフィニティクロマト用担体，バイオセンサー，エ
ンザイムイムノアッセイ，バイオリアクターなどをはじ
め広範囲な領域において有用なものである。
理活性物質をその活性を失活させたりあるいは変性させ
たりすることなく水不溶性担体に固定化することが可能
となり、固定化前に近い活性を維持した生理活性物質固
定化担体を提供することが可能となった。本発明は吸着
材，アフィニティクロマト用担体，バイオセンサー，エ
ンザイムイムノアッセイ，バイオリアクターなどをはじ
め広範囲な領域において有用なものである。
【図１】実施例１と比較例１の熱安定性を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 生理活性を有する糖タンパク質または糖
ペプチドが、水不溶性担体に親水性スペーサーを介し
て、糖鎖の部位において固定されていることを特徴とす
る生理活性物質固定化担体。 - 【請求項２】 生理活性を有する糖タンパク質または糖
ペプチドの糖鎖におけるグリコール部位の開裂により形
成されたアルデヒド基を、アミノ基を末端に有する親水
性スペーサーの結合した水不溶性担体とシッフ塩基を形
成させた後これを還元することを特徴とする生理活性物
質固定化担体の製法。 - 【請求項３】 親水性スペーサーが重合度１０ないし５
００である両末端にアミノ基を有するポリ（オキシエチ
レン）である請求項第２項記載の生理活性物質固定化担
体の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4097109A JPH05261281A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 生理活性物質固定化担体とその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4097109A JPH05261281A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 生理活性物質固定化担体とその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05261281A true JPH05261281A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=14183426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4097109A Pending JPH05261281A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 生理活性物質固定化担体とその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05261281A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1577293A4 (en) * | 2002-12-26 | 2007-08-01 | Shionogi & Co | METHOD FOR CLEANING / CONCENTRATING SUGAR CHAINS WITH SUGAR CHAIN INCOMPATIBLE MOLECULE AND AN ASSAY PROCESS FOR SUGAR CHAIN STRUCTURE |
| WO2010013833A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Fujifilm Corporation | Hazardous substance removing material and method for removing hazardous substance |
| JP2015514766A (ja) * | 2012-04-18 | 2015-05-21 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． | コンジュゲート試薬を製造するための化合物および方法 |
| CN112978940A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-06-18 | 广州市点滴生物科技有限公司 | 一种有机污水生物发酵处理剂及其制备方法 |
-
1992
- 1992-03-23 JP JP4097109A patent/JPH05261281A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1577293A4 (en) * | 2002-12-26 | 2007-08-01 | Shionogi & Co | METHOD FOR CLEANING / CONCENTRATING SUGAR CHAINS WITH SUGAR CHAIN INCOMPATIBLE MOLECULE AND AN ASSAY PROCESS FOR SUGAR CHAIN STRUCTURE |
| US9139607B2 (en) | 2002-12-26 | 2015-09-22 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Method of purifying/concentrating sugar chain with sugar chain-trapping molecule and method of analyzing sugar chain structure |
| US9683006B2 (en) | 2002-12-26 | 2017-06-20 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | Method of purifying/concentrating sugar chains with a sugar chain-trapping molecule and method of analyzing sugar chain structure |
| WO2010013833A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Fujifilm Corporation | Hazardous substance removing material and method for removing hazardous substance |
| JP2015514766A (ja) * | 2012-04-18 | 2015-05-21 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． | コンジュゲート試薬を製造するための化合物および方法 |
| CN112978940A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-06-18 | 广州市点滴生物科技有限公司 | 一种有机污水生物发酵处理剂及其制备方法 |
| CN112978940B (zh) * | 2021-04-22 | 2021-07-16 | 广州市点滴生物科技有限公司 | 一种有机污水生物发酵处理剂及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4822681A (en) | Activated polymer solid bodies and processes for the production thereof | |
| US5092992A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| Hearn | [7] 1, 1′-Carbonyldiimidazole-mediated immobilization of enzymes and affinity ligands | |
| US4560504A (en) | Carboxyl anchored immobilized antibodies | |
| US5766908A (en) | High-flux semipermeable membrane containing immobilized affinity ligands | |
| WO1994009148A1 (fr) | Procede pour produire une proteine d'antigenes majeurs d'hystocompatibilite classe ii et materiau sur lequel elle est immobilisee | |
| US8569463B2 (en) | Method of covalently modifying proteins with organic molecules to prevent aggregation | |
| US5085779A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| KR910004069B1 (ko) | 항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법 | |
| JPS5853757A (ja) | 免疫アフイニテイクロマトグラフイ−用吸着体及びその製法 | |
| US4072566A (en) | Immobilized biologically active proteins | |
| JPH08503066A (ja) | 固相への化学的結合方法 | |
| JPH05340948A (ja) | 鶏卵抗体固定化担体およびその固定化方法 | |
| JPH05261281A (ja) | 生理活性物質固定化担体とその製法 | |
| CA1332598C (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
| Margel | Affinity separation with polyaldehyde microsphere beads | |
| Comfort et al. | The influence of bond chemistry on immobilized enzyme systems for ex vivo use | |
| JPH0634633A (ja) | 鶏卵抗体固定化担体およびその製造方法 | |
| JPH05345022A (ja) | 生理活性物質固定化担体とその製法 | |
| JPH0415063A (ja) | ヒトトロンボモジュリンを固定化した抗血栓性材料 | |
| JPH0757760B2 (ja) | 生体由来物質の固定化方法 | |
| JPH0612992B2 (ja) | 固定化プロテア−ゼの製法 | |
| JPS599153B2 (ja) | 生物学的活性化合物の製造方法 | |
| JP3728757B2 (ja) | 蛍光標識抗体の製造方法 | |
| JPS61152634A (ja) | 固定化生理活性物質の製造法 |